CN105671056A - 一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，包括以下步骤：从切花大菊‘神马’中克隆CmTCP20基因；构建CmTCP20基因植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测证实CmTCP20内源基因已经整合到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的花瓣生长量明显变大。本发明通过转化内源CmTCP20转录因子并正常转录表达，从而调控了切花菊花瓣的生长，为利用基因工程技术提高切花菊观赏品质提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法。
背景技术
菊花(Chrysanthemummorifolium)是我国传统十大名花和世界四大切花之一，其栽培历史悠久。菊花具有丰富的花色、多样的花姿等特点，深受人们的喜爱，在世界范围内广为栽培。TCP家族是最近十几年来发现的植物特有的一类转录因子，因其在植物形态发育和进化中起着重要作用而受到广泛的关注。越来越多的研究表明，TCP基因家族参与花器官形态建成，如PsCYCs基因在豌豆花中呈不对称表达模式(王峥，2006)。目前TCP基因在花型中的研究多集中于花对称性发育。花对称性发育的分子机理首先在模式植物金鱼草中被发现，其花部对称的表型由CYCLOIDEA(CYC)和DICHOTOMA(DICH)基因共同控制(李交昆，唐璐璐，2012)。CYC和DICH基因同属TCP基因家族。因此，TCP基因家族与花瓣发育有着密切的关系。
近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达特定的内源基因以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。采用农杆菌介导法可以获得具有不同生物学特性的转基因菊花，如菊花花色、形状、高度、株型等园艺特征的改变，转基因技术为改良菊花品种提供了新的手段和途径。而利用农杆菌介导法提高植株抗性的研究报道也有很多，TCP14/TCP15:SRDX转基因植株会导致萼片、花瓣和心皮的发育畸形，几乎不形成花瓣(Kiefferetal.2011)。Narumi等(2011)在夏堇中沉默TCP3基因后发现，叶片变小且边缘呈波浪形，花瓣边缘也呈现出锯齿状，且花瓣颜色明显变浅。GhCYC2在管状花发生的部位几乎不表达，但其超表达会导致管状花发育成舌状花的形态(Broholmetal.2008)，且管状花花瓣更长，有明显的唇瓣结构，雄蕊发育中断且无花粉，舌状花的花瓣明显变短(Tahtiharjuetal.2012)，而GhCYC5的功能不同，其在非洲菊头状花序的膨大过程中能够促进更多花原基的发生，进而导致花托上产生更多的小花(Juntheikki-Palovaaraetal.2014)。以上研究表明，TCP基因家族参与植物花器官的生长发育调控，但在不同植物中发挥作用的TCP家族成员及其功能均存在差异，TCP调控花瓣的生长的具体机制还缺乏系统深入研究。因此通过农杆菌介导法将菊花的内源基因CmTCP20导入切花菊‘神马’调控花瓣生长是一种新的探索，为采用基因工程技术选育菊花观赏品种提供新颖而实用的方法。
参考文献：
李交昆,唐璐璐.花对称性的研究进展[J].生物多样性,20(3):280-285,2012.
王峥,豌豆花瓣发育的分子生物学研究(博士研究生学位论文).上海:中国科学院上海植物生理生态研究所,2006.
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发明内容
本发明的目的在于解决定向改良菊花观赏性状的问题，提供一种调控菊花花瓣生长的基因CmTCP20，该基因的序列为SEQIDNO.1。以及CmTCP20基因在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
本发明的另一目的在于提供一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法。本发明涉及的农杆菌介导遗传转化，转基因植物的分子检测及转基因植株后代表型观察用于本发明，为利用基因工程技术开展观赏性菊花分子育种提供方法和实例。
本发明的又一目的在于提供一种CmTCP20基因植物表达载体及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种调控菊花花瓣生长的基因CmTCP20，该基因的序列为SEQIDNO.1。
如SEQIDNO.1所示的CmTCP20基因在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
上述的应用，其在于将CmTCP20基因植物表达载体导入切花菊，促进菊花花瓣的生长，提高菊花观赏性。
上述的应用，其在于所述CmTCP20基因植物表达载体的构建方法为：以切花大菊‘神马’花瓣的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)。
一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，包括以下步骤：
(1)以切花大菊‘神马’为材料，提取花瓣的总RNA，进行反转录获得cDNA；
(2)构建CmTCP20基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)；
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的CmTCP20基因植物表达载体导入菊花，经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录；获得花瓣生长具有差异的转基因菊花植株。
所述的对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测的过程为：
(1)PCR检测
取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，设计引物，扩增出的片段长为263bp，引物序列为：
上游引物pMDC43-GFP-F：CGTCGTCCTTGAAGAAGATGG
下游引物pMDC43-GFP-R：TGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和pMDC43-GFP-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(2)荧光定量RT-PCR检测
提取潮霉素抗性筛选得到得的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为198bp，引物序列为：
上游引物CmTCP20-RT-F：GGGCCAGATGAGTTTTTCCT
下游引物CmTCP20-RT-R：TTTGAAGACTGCGGTTGTTG
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG，
下游引物EF1α-R：CCATTCAAGCGACAGACTCA。
一种CmTCP20基因植物表达载体，该植物表达载体采用以下方法制备：
以切花大菊‘神马’花瓣的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)。
上述的CmTCP20基因植物表达载体在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
上述的应用，其在于采用农杆菌介导法将所述的CmTCP20基因植物表达载体导入菊花，促进菊花花瓣的生长，提高菊花观赏性。
本发明所述的技术方案利用根癌农杆菌介导法，将CmTCP20基因导入切花菊，并经过潮霉素筛选抗性植株；经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株后代进行表型观察，最终获得花瓣生长具有差异的转基因菊花植株。CmTCP20基因从‘神马’中克隆得到，该基因的序列为SEQIDNO.1。
一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，该方法具体包括以下详细步骤：
(1)菊花CmTCP20基因的克隆
以切花大菊‘神马’花瓣为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物，结合PCR扩增目的基因的全长序列，
上游引物CmTCP20-F：5′-ATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.2)，
下游引物CmTCP20-R：5′-CTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.3)；
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，获得目的基因的序列为SEQIDNO.1。
(2)植物表达载体pMDC43-CmTCP20的构建
根据CmTCP20基因全长序列设计引物，以切花大菊‘神马’的cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)；
PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功，所述的CmTCP20基因序列为SEQIDNO.1。
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)构建的CmTCP20基因植物表达载体转入菊花‘神马’中，进行培养初步获得抗性植株。
制备感受态的农杆菌，将步骤(2)中构建的CmTCP20基因植物表达载体转入感受态的农杆菌中，挑选阳性克隆，摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基中培养3d，然后浸入上述备好的转入了pMDC43-CmTCP20的植物表达载体的农杆菌菌液中侵染8～10min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再将其接种到共培养培养基上，暗培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。所用的农杆菌菌株为EHA105。
菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；
预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；
共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；
筛选培养基：MS+潮霉素(Hyg)10mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：MS+潮霉素(Hyg)8mg/L。
详细操作过程为：
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mMCaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。
取10μLpMDC43-CmTCP20载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μLYEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。
以切花菊‘神马’叶片为外植体，取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cmⅹ0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染8～10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。
将转CmTCP20基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系。对通过PCR、荧光定量RT-PCR分子检测所获得转基因植株后代进行表型观察：
选取6-8叶龄的野生型菊花(WT)和转基因菊花(OX20)的扦插苗作为表型观察的材料，每个株系10株苗。统计每个株系的现蕾时间，盛花期时统计每个株系的花序数目、花序直径及最外轮花瓣长度。
本发明所提供的通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法具有如下优点:
本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，采用转基因技术，将CmTCP20基因整合到菊花基因组中，通过表型观察及分析获得具有花瓣生长差异的转基因菊花株系。结果发现，与未转基因植株相比，转入CmTCP20基因的植株花瓣生长量更大，利用本方法向菊花基因组中转入的CmTCP20基因可以显著促进花瓣的生长。
附图说明
图1pMDC43-CmTCP20植物载体构建路线图
图2为植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建过程的琼脂糖凝胶电泳图
M1：Marker2000；1：CmTCP20；M2：Marker15000；
2：pENTRTM1A质粒BamHI和NotI双酶切；
3：pMD19-CmTCP20质粒BamHI和NotI双酶切；
4：pENTRTM1A-CmTCP20质粒
5：pENTRTM1A-CmTCP20质粒PvuI单酶切；
6：pMDC43-CmTCP20表达载体质粒电泳图。
图3转CmTCP20基因菊花的转化和再生过程
a：转化叶盘分化出愈伤；b：转化叶盘分化出抗性苗；c：抗性苗生根筛选；
d：抗性苗生根；e：抗性苗生根长成完整植株。
图4转CmTCP20基因菊花特异引物检测电泳图
M：DL2000Marker1：阳性质粒；2：野生型植株；
3～12：转CmTCP20的菊花株系。
图5转基因及未转基因的菊花植株中CmTCP20基因的相对表达量水平
WT：野生型植株；OX20-n：转CmTCP20的株系。
图6转基因菊花表型观察
WT：野生型植株；OX20：转CmTCP20的株系；
a：WT现蕾期；b：WT破蕾期；c：WT初绽期；d：WT盛花期。
图7转基因菊花花瓣的表型观察
WT：野生型植株；OX20：转CmTCP20的株系；Bar＝1cm；
a：主枝花序及花瓣；b：侧枝花序及花瓣。
图8转基因菊花花瓣的表型数据统计
WT：野生型植株；OX20：转CmTCP20的株系；
A：转基因株系与非转基因株系的现蕾时间统计；
B：转基因株系与非转基因株系主茎与侧枝上花序直径统计；
C：转基因株系与非转基因株系主茎与侧枝上花瓣长度统计。
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.CmTCP20基因的克隆
以切花大菊‘神马’为材料，取花瓣0.15g，参照TrizolRNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取花瓣的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，根据菊花文库中该基因的序列信息，运用primer5软件设计特异引物扩增CmTCP20；
上游引物CmTCP20-F：5′-ATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.2)，
下游引物CmTCP20-R：5′-CTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.3)；
以花瓣的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCRBuffer5.0μL，CmTCP20-F、CmTCP20-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTPmix4.0μL(2.5mmol·L-1)，TaqDNAPolymerase0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O37.8μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，序列测定为SEQIDNO.1。
实施例2.植物表达载体pMDC43-CmTCP20的构建
根据CmTCP20全长基因序列设计引物进行PCR反应，在目的基因CmTCP20的上游和下游分别引入酶切位点BamHI和NotI，PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒用BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应(Invitrogen,USA)，转化，提取阳性质粒。
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)；
以切花大菊‘神马’花瓣cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTARTMHSDNAPolymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HSPCRBuffer5.0μL，CmTCP20-GATE-F、CmTCP20-GATE-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTPmix4.0μL(2.5mmol·L-1)，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O37.6μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-CmTCP20；
取gateway入门载体pENTRTM1A(Invitrogen,USA)和pMD19-CmTCP20用BamHI和NotI双酶切，双酶切体系(50μL)：10×HBuffer5μL，BSA5μL，质粒pENTRTM1A或pMD19-CmTCP2015μL，BamHI2μL，NotI2μL，ddH2O21μL；37℃反应1h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTRTM1A大片段和CmTCP20片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T4ligaseBuffer1μL，pENTRTM1A大片段2μL，pMD19-CmTCP20小片段6μL，T4DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTRTM1A-CmTCP20。
取质粒pENTRTM1A-CmTCP20用PvuI单酶切，酶切体系(20μL)：10×REBuffer2μL，AcetylatedBSA2μL，质粒pENTRTM1A-CmTCP2010μL，PvuI1μL，ddH2O5μL；37℃反应2h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTRTM1A-CmTCP20大片段。将回收的片段与pMDC43载体质粒进行LR重组反应，反应体系(5μL)：pENTRTM1A-CmTCP20大片段3μL，pMDC43质粒1μL，LRClonaseTMⅡenzymemix1μL；25℃反应1h，加入1μLProteinaseK，37℃反应10min；取5μL重组产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pMDC43-CmTCP20，电泳和测序验证。植物表达载体pMDC43-CmTCP20的构建成功(如图1、图2)。
实施例3.农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mMCaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μLpMDC43-CmTCP20载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μLYEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。
采用的农杆菌指包含CmTCP20基因的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为OX20-n，以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将‘神马’中克隆得到的CmTCP20基因导入菊花。取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cmⅹ0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株(图3)。
菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；筛选培养基：MS+潮霉素(Hyg)10mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：MS+潮霉素(Hyg)8mg/L。
实施例4.将转CmTCP20基因抗性植株进行分子检测(PCR、荧光定量RT-PCR)呈阳性，获得转基因菊花株系
1)PCR检测
取生根筛选得到的潮霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将GFP基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为263bp，引物序列为：
上游引物pMDC43-GFP-F：5′-CGTCGTCCTTGAAGAAGATGG-3′(SEQIDNO.6)，
下游引物pMDC43-GFP-R：5′-TGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG-3′(SEQIDNO.7)；
分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和pMDC43-GFP-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1μLDNA模板，2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，1.5μL2.5mmol·L-1MgCl2，5U·μL-1Taq酶0.2μL，pMDC43-GFP-F和pMDC43-GFP-R各1μL，去离子水补足体积至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转CmTCP20的植株均可扩增出与阳性对照相同的特异扩增带，野生型植株没有扩增出条带。
2)荧光定量RT-PCR检测
提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CmTCP20基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(GreenRealtimePCRMasterMix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物扩增出的片段长为198bp，引物序列为：
上游引物CmTCP20-RT-F：5′-GGGCCAGATGAGTTTTTCCT-3′(SEQIDNO.8)，
下游引物CmTCP20-RT-R：5′-TTTGAAGACTGCGGTTGTTG-3′(SEQIDNO.9)；
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：5′-TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG-3′(SEQIDNO.10)，
下游引物EF1α-R：5′-CCATTCAAGCGACAGACTCA-3′(SEQIDNO.11)；
根据荧光定量RT-PCR检测结果(图5)，与野生型相比，转CmTCP20的植株株系基因表达量有所提高，OX20-4、OX20-7、OX20-8、OX20-11株系表达量明显较高。证实内源源基因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。
实施例5.转基因植株后代的表型观察
选取6-8叶龄的野生型菊花(WT)和转基因菊花(OX20)的扦插苗作为表型观察的材料，定植于温室大棚。定植34天后，观察到转基因株系OX20-4、OX20-7、OX20-8、OX20-11开始现蕾，而野生型株系在定植55天后现蕾。相比于野生型株系，转基因株系的现蕾时间提前了21天。以野生型株系的花发育时间轴(现蕾期、破蕾期、初绽期、盛花期)为坐标轴，对野生型及转基因株系的花发育程度进行观察并拍照(图6)。
野生型株系盛花期时，野生型株系的平均花序数目为24.33，转基因株系OX20-4、OX20-7、OX20-8、OX20-11的平均花序数目为38.75、35.00、33.25、33.00，是野生型株系的1.59倍、1.44倍、1.37倍、1.36倍。对花序直径及最外轮花瓣长度进行观察并统计(图7、图8)，野生型株系的主枝花序直径为8.88cm，花瓣长度为5.03cm；侧枝花序直径为8.01cm，花瓣长度为4.35cm；转基因株系的主枝花序直径为9.67cm，花瓣长度为5.04cm；侧枝花序直径为9.28cm，花瓣长度为4.99cm。利用SPSS软件进行独立样本T检验发现野生型株系与转基因株系的主枝花序直径有显著性差异，但是花瓣长度没有显著性差异；侧枝花序直径及花瓣长度均有显著性差异。转基因株系与野生型株系相比，侧枝上的花序直径增加了15.8％，花瓣长度增加了14.8％。
转基因植株表型观察实验表明转基因植株的花瓣生长量明显大于野生型植株，转基因株系的花瓣明显变长，CmTCP20基因对菊花花瓣生长具有明显的调控作用。

Claims (9)

1.可调控菊花花瓣生长的基因CmTCP20，该基因的序列为SEQIDNO.1。
2.如SEQIDNO.1所示的CmTCP20基因在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将CmTCP20基因植物表达载体导入切花菊，促进菊花花瓣的生长，提高菊花观赏性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述CmTCP20基因植物表达载体的构建方法为：以切花大菊‘神马’花瓣的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)。
5.一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以切花大菊‘神马’为材料，提取花瓣的总RNA，进行反转录获得cDNA；
(2)构建CmTCP20基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)；
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的CmTCP20基因植物表达载体导入菊花，经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录；获得花瓣生长具有差异的转基因菊花植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测的过程为：
(1)PCR检测
取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，设计引物，扩增出的片段长为263bp，引物序列为：
上游引物pMDC43-GFP-F：CGTCGTCCTTGAAGAAGATGG
下游引物pMDC43-GFP-R：TGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和pMDC43-GFP-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(2)荧光定量RT-PCR检测
提取潮霉素抗性筛选得到得的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为198bp，引物序列为：
上游引物CmTCP20-RT-F：GGGCCAGATGAGTTTTTCCT
下游引物CmTCP20-RT-R：TTTGAAGACTGCGGTTGTTG
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG，
下游引物EF1α-R：CCATTCAAGCGACAGACTCA。
7.一种CmTCP20基因植物表达载体，其特征在于该植物表达载体采用以下方法制备：
以切花大菊‘神马’花瓣的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQIDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′(SEQIDNO.5)。
8.权利要求7所述的CmTCP20基因植物表达载体在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于采用农杆菌介导法将所述的CmTCP20基因植物表达载体导入菊花，促进菊花花瓣的生长，提高菊花观赏性。
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