WO2010122850A1 - 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法 - Google Patents

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尚信 野田
間　竜太郎
岸本　早苗
大宮　あけみ
田中　良和
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独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
サントリーホールディングス株式会社
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    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)
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    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling a flavonoid biosynthesis system in chrysanthemum plants using a perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase (3AT) gene, a method for modifying anthocyanins, and a chrysanthemum plant into which the gene is introduced or a progeny thereof. Or, it relates to a vegetative growth body or a part or tissue thereof, in particular, petals and cut flowers.
  • the present invention also relates to a transcriptional regulatory region derived from pansy flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase (hereinafter also referred to as F3′5′H) gene # 40 (hereinafter also referred to as BP40) and use thereof.
  • F3′5′H 5′-hydroxylase
  • a new trait can be imparted to a plant by expressing a useful gene in the target plant.
  • Genetically modified plants produced in this way have already been cultivated in a wide range. Regulation of gene expression is mainly controlled at the transcriptional stage, and transcriptional regulation is most important in regulating gene expression. That is, it is important for producing an industrially useful genetically modified plant that transcription is performed at an appropriate time and in an appropriate tissue with an appropriate strength. Transcription is often controlled by a DNA sequence 5 ′ to the translation region. A region on DNA that determines the initiation site of gene transcription and directly regulates its frequency is called a promoter.
  • the promoter may be present several tens of bp 5 ′ of the start codon and often includes a sequence such as a TATA box. Furthermore, on the 5 'side, there are cis elements to which various transcription regulatory factors bind, and their presence controls the timing of transcription, the tissue in which transcription is performed, and the strength of transcription. Transcriptional regulators are classified into many families by amino acid sequences. For example, a Myb type transcriptional regulatory factor and a bHLH (basic helix loop helix) type transcriptional regulatory factor are well-known families. Actually, the transcription control region and the promoter are often used in the same meaning.
  • Anthocyanins the main component of flower color, are members of secondary metabolites collectively referred to as flavonoids.
  • the color of anthocyanins depends on its structure. That is, when the number of hydroxyl groups on the B ring of anthocyanidin, which is an anthocyanin chromophore, increases, the color becomes blue.
  • aromatic acyl groups coumaroyl groups, caffeoyl groups, etc.
  • the color of anthocyanins turns blue (that is, the absorption maximum shifts to longer wavelengths) and the stability of anthocyanins increases. Is known (see Non-Patent Document 1 below).
  • Enzymes involved in anthocyanin biosynthesis and genes encoding the enzymes have been well studied (see Non-Patent Document 1). For example, enzyme genes that catalyze the reaction of transferring an aromatic acyl group to anthocyanins are obtained from gentian, lavender, petunia, and the like (hereinafter, see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • Promoters responsible for gene transcription in plants are so-called constitutive promoters that function in any tissue or any stage of development, and function only in specific organs and tissues. There are organ- and tissue-specific promoters, and time-specific promoters that are expressed only at specific times in the developmental stage. Constitutive promoters are often used as promoters for expressing useful genes in transgenic plants.
  • a cauliflower mosaic virus 35S hereinafter also referred to as CaMV35S
  • CaMV35S cauliflower mosaic virus 35S
  • Non-Patent Document 3 a promoter constructed based on the promoter
  • Non-Patent Document 4 hereinafter Non-Patent Document 4). See).
  • tissue / organ-specific or time-specific manner in plants, many genes are expressed in a tissue / organ-specific or time-specific manner. This suggests that it is necessary for plants to express genes in a tissue / organ-specific or time-specific manner.
  • tissue / organ-specific or time-specific transcriptional regulatory regions There is an example of genetic recombination of plants using such tissue / organ-specific or time-specific transcriptional regulatory regions.
  • proteins are accumulated in seeds using a seed-specific transcriptional regulatory region.
  • plants can blossom in a variety of colors, but there are few species that can blossom in all colors because of the genetic limitations of the species. For example, varieties that bloom blue and purple flowers in roses and carnations do not exist naturally. This is because roses and carnations do not have the F3'5'H gene required to synthesize anthocyanidins called delphinidin, which is synthesized by many blue and purple flowers. By introducing F3'5'H genes such as petunia and pansy which are blue and purple flowers to bloom into these species, the color of the flowers could be made blue in these species.
  • the transcriptional regulatory region of the chalcone synthase gene derived from snapdragon or petunia is used to transcribe the heterologous F3′5′H gene.
  • plasmids pCGP485 and pCGP653 plasmids containing constitutive transcriptional regulatory regions described in Patent Document 3 below
  • plasmid pCGP628 Mac1 promoter
  • the plasmid pSPB130 described in the following Patent Document 4 (including the CaMV35S promoter with an enhancer added).
  • chrysanthemum plants account for about 30% of the wholesale price (summary of the results of the 2007 survey of wholesale flowering in agriculture, forestry and fisheries statistics) in Japan, and about 9% of roses. It is also an important work compared to about 7% of carnations. Chrysanthemum has flower colors such as white, yellow, orange, red, peach, and purple red, but not blue flowers such as purple or blue. Therefore, the breeding of blue flowers is considered as one of the goals to stimulate new demand. Chrysanthemum flower color is expressed by a combination of anthocyanins and carotenoids.
  • Anthocyanins can express a variety of colors depending on the structure of anthocyanidins, which are the basic skeleton, and modifications by sugars and organic acids.
  • anthocyanins responsible for chrysanthemum flower color cyanidin 3-O- (6 "-O-monomalonyl- ⁇ -glucopyranoside and cyanidin 3-O- (3 ", 6" -O-dimalonyl- ⁇ -glucopyranoside) is known (see Non-Patent Document 6 below), and their structure is relatively simple (see Fig. 1). Therefore, the variation in coloration due to anthocyanins in chrysanthemum is a very small factor.
  • chrysanthemum is the most important flower in Japan, but it has hexaploidy and high-order ploidy and has a large genome size. Silencing (inactivation) may occur, and it is not easy to obtain transgenic chrysanthemum that stably expresses the transgene.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • the activity of GUS gene is about 1/10 compared to tobacco introduced with the same gene, and the activity is 12 months after transformation. It has been reported that it decreases in most individuals after the passage (see Non-Patent Document 7).
  • Non-patent Document 10 an example in which the mutated ethylene receptor gene is expressed in chrysanthemum to extend the flower life (hereinafter referred to as Non-patent Document 10), and an example in which the expression of chrysanthemum AGAMOUS gene is suppressed and the shape of the flower is changed (hereinafter referred to as non-patent document 10).
  • Non-Patent Document 11 an example of increasing expression of a foreign gene in chrysanthemum using a 5′-untranslated region (hereinafter also referred to as tobacco ADH-5′UTR) of tobacco alcohol dehydrogenase gene (hereinafter referred to as non-patent document 11).
  • Patent Document 12 an example of increasing expression of a foreign gene in chrysanthemum using a 5′-untranslated region (hereinafter also referred to as tobacco ADH-5′UTR) of tobacco alcohol dehydrogenase gene (hereinafter referred to as non-patent document 11).
  • Non-Patent Document 13 a report that suppresses the gene of chalcone synthase (CHS) by the co-suppression method and makes the pink color white
  • CCD4a carotenoid-degrading enzyme
  • Patent Document 5 Non-Patent Document 15
  • delphinidin produced by the action of the introduced F3′5′H gene accumulates in the lingual petals, and there is no report that blue chrysanthemum was produced.
  • delphinidin production is not observed even when F3′5′H is expressed by the CaMV35S promoter (see Non-Patent Document 15).
  • Non-Patent Document 7 examples of promoters that can efficiently and stably express foreign genes in chrysanthemum with chrysanthemum include potato Lhca3.St.1 promoter (hereinafter referred to as Non-Patent Document 16), chrysanthemum UEP1 promoter (hereinafter referred to as Non-Patent Document 17), The tobacco EF1 ⁇ promoter (see Patent Document 6 and Non-Patent Document 9) has been developed.
  • the problem to be solved by the present invention is that flavonoid production in chrysanthemum plants using the transcriptional regulatory region of perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase (3AT) gene, which is a promoter useful for changing the color of flowers of chrysanthemum plants.
  • 3AT perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase
  • the present invention also relates to a processed product (cut flower processed product) using the cut flower.
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a promoter useful for changing the color of flowers of chrysanthemum plants and plants other than chrysanthemum.
  • the transcriptional regulatory region of perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase (3AT) gene has the structure of anthocyanin in the petals of chrysanthemum.
  • 3AT perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase
  • the promoter is useful for changing the color of the flowers of chrysanthemum plants, and its usefulness was confirmed by experiments to complete the present invention.
  • the present inventors have also found that the transcriptional regulatory region of the pansy-derived F3′5′H gene is useful for changing the color of flowers of chrysanthemum plants or plants other than chrysanthemum plants, and to complete the present invention. It came. That is, the present invention is as follows.
  • nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • It can function as a transcriptional regulatory region of a sisanthanthocyanin 3-acyltransferase gene, and one or several nucleotide sequences are added to, deleted from and / or deleted from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid comprising a base sequence modified by substitution
  • nucleic acid capable of functioning as a transcriptional regulatory region of a soyanthocyanin 3-acyltransferase gene, and having at least 90% sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Having nucleic acid,
  • the method for transferring the nucleic acid is a method for controlling the flavonoid synthesis system by transferring a nucleic acid related to the flavonoid synthesis system.
  • the method for transferring the nucleic acid is a method for modifying an anthocyanin by transferring a nucleic acid involved in anthocyanin modification.
  • [10] A processed cut flower product using the cut flower according to [9].
  • nucleic acid that can function as a transcriptional regulatory region of the pansy F3′5′H gene and has at least 90% sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 ,
  • [12] A method for expressing a nucleic acid in a chrysanthemum plant or a plant other than chrysanthemum using the expression vector or expression cassette containing the nucleic acid according to [11].
  • the method for expressing the nucleic acid is a method for controlling the flavonoid synthesis system by expressing a nucleic acid related to the flavonoid synthesis system.
  • the method for expressing the nucleic acid is a method for modifying an anthocyanin by expressing a nucleic acid involved in anthocyanin modification.
  • Plasmid pSPB3311 used (see FIG. 3). 1: cyanidin 3-malonyl glucoside, 2: cyanidin 3-dimalonyl glucoside, 3: cyanidin 3-aromatic acyl glucoside. Absorption spectrum detected from petals of chrysanthemum transformants. In the absorption spectrum of No. 3, an absorption maximum is observed around 326 nm seen in anthocyanins modified with aromatic organic acids, and further, the absorption maximum of anthocyanins is compared to the absorption spectrum of malonylated (1, 2). It shifts to the long wavelength side (about 5 nm from 518 nm to 522 nm).
  • the present invention relates to the 5 ′ region (Pf3ATpro) of a gene encoding the perilla hydroxycinnamoyl CoA: anthocyanin 3-glucoside acyltransferase (Pf3AT) (herein, the term “sisoanthocyanin 3-acyltransferase gene”).
  • Pf3ATpro a gene encoding the perilla hydroxycinnamoyl CoA: anthocyanin 3-glucoside acyltransferase (herein, the term “sisoanthocyanin 3-acyltransferase gene”).
  • Methods for transferring nucleic acids in chrysanthemum plants methods for controlling flavonoid synthesis systems by transferring nucleic acids related to flavonoid synthesis systems, methods for modifying anthocyanins by transferring nucleic acids related to anthocyanin modification, and methods for producing petals produced by such methods Chrysanthemum plants with modified anthocyanin composition and / or chrysanthemum plants with modified flower color or It relates to its progeny or its vegetative growth or its parts or tissues, in particular petals and cut flowers.
  • the present invention relates to the production of flavonoids such as F3'5'H by the 5 'region of the pansy F3'5'H gene (also referred to herein as "the transcriptional regulatory region of the pansy F3'5'H gene").
  • a method of transcribing nucleic acids in chrysanthemum plants and plants other than chrysanthemum comprising transforming chrysanthemum plants and plants other than chrysanthemum with a vector containing a gene cassette for expressing a synthetic gene (see FIGS.
  • a method for controlling a flavonoid synthesis system by transferring a nucleic acid related to a flavonoid synthesis system a method for modifying an anthocyanin by transferring a nucleic acid related to anthocyanin modification, a plant in which the anthocyanin composition of a petal produced by such a method has been modified
  • the present invention also relates to a processed product (cut flower processed product) using the cut flower.
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • “method for controlling flavonoid synthesis system” means a flavonoid synthesis system by controlling the expression of a gene encoding a protein involved in the flavonoid synthesis system, for example, 3AT gene or F3′5′H gene The method of controlling.
  • An example of the anthocyanin 3-acyltransferase gene is perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase gene.
  • the F3′5′H gene for example, there is an F3′5′H gene derived from pansy.
  • an acyltransferase such as 3AT functions to transfer an aromatic acyl group to anthocyanin, thereby making it possible to shift the absorption maximum of anthocyanin to the long wavelength side, and to make the existing flower color bluish.
  • 3AT functions to transfer an aromatic acyl group to anthocyanin, thereby making it possible to shift the absorption maximum of anthocyanin to the long wavelength side, and to make the existing flower color bluish.
  • 3AT gene by expressing the perilla 3AT gene with the Pf3AT promoter and the Pf3AT terminator, 34-50% of chrysanthemum anthinins can be aromatically acylated (see FIGS. 4 and 6).
  • the glycoside of delphinidin can be modified with an aromatic acyl group (see Fig. 6).
  • the transcription control region according to the present invention include a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15. However, several (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) base additions, deletions and / or deletions in the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 Alternatively, a promoter composed of a base sequence modified by substitution is considered to maintain the same activity as the original promoter.
  • the transcriptional regulatory region according to the present invention functions as a transcriptional regulatory region in chrysanthemum petals or other plants, one or several nucleotide sequences are added to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15. It can also be a nucleic acid consisting of a base sequence modified by deletion and / or substitution.
  • the transcriptional regulatory region according to the present invention can further function as a transcriptional regulatory region of a thysoanthocyanin 3-acyltransferase gene and hybridizes with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions.
  • the transcriptional regulatory region according to the present invention can function as a transcriptional regulatory region of the pansy F3′5′H gene, and can hybridize to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 under high stringency conditions.
  • nucleic acids can be hybridized under stringency conditions with a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15, and preferably about 70 with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15. %, More preferably about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, and most preferably nucleic acids consisting of a base sequence having base sequence identity of about 99%.
  • the stringency conditions are hybridization conditions that are easily determined by those skilled in the art, and are generally determined empirically depending on the probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the temperature. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment close to but below its melting point.
  • the filter may be washed in a 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS solution at a temperature of 37 ° C. to 42 ° C. in the filter washing step after hybridization.
  • Examples of the high stringency condition include washing in a washing step at 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the transcriptional regulatory region according to the present invention is included in an expression vector or an expression cassette, and these expression vectors or expression cassettes are shown in, for example, SEQ ID NO: 2 or the pansy F3′5′H gene described in WO 04/020637.
  • the present invention provides an aromatic acylation produced as a result of using the method according to the present invention, a chrysanthemum plant or a plant other than chrysanthemum, or a progeny thereof, or a part or tissue thereof, into which the transcriptional regulatory region (nucleic acid) is introduced. It also relates to chrysanthemum plants or plants other than chrysanthemum or their descendants or their vegetative growth bodies or parts or tissues thereof, particularly petals, cut flowers, which contain anthocyanins and / or delphinidin.
  • Asteraceae also referred to simply as“ Asteraceae ” means a plant belonging to the genus Chrysanthemum of the Asteraceae family.
  • yellowwood Dendranthema grandiflorum Kitam
  • western chrysanthemum large chrysanthemum, middle chrysanthemum, small chrysanthemum and the like can be mentioned, and representative examples include chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium).
  • Plants other than chrysanthemum are not particularly limited, but can preferably be roses.
  • Example 1 Cloning of a lysoanthocyanin 3-acyltransferase chromosomal gene
  • a lysoanthocyanin 3-acyltransferase chromosomal gene There are known red varieties that accumulate anthocyanins in leaves and green varieties that do not accumulate.
  • the chromosomal DNA was prepared from the former leaves by the reported method (see Plant Mol Biol. December 1997; 35 (6): 915-27). This chromosomal DNA was partially decomposed with Sau3AI (manufactured by TOYOBO), and a fraction containing a DNA fragment of 10 to 15 kb was collected by a sucrose density gradient method.
  • a chromosomal DNA library was prepared by inserting this fragment into the BamHI site of EMBL3 (Promega), which is a kind of lambda phage vector, using a known method.
  • the obtained library was screened using pSAT208 (Plant Cell Physiol. April 2000; 41 (4): 495-502) which is a cDNA of anthocyanin 3-acyltransferase derived from perilla as a probe.
  • the screening of the library was based on the method already reported (see Plant Cell Physiol. July 1996; 37 (5): 711-6).
  • the plaque hybridized with the probe was purified and cultured, and DNA was prepared from the obtained phage.
  • Example 2 The DNA10 ⁇ g obtained in sequencing said mint anthocyanin 3-acyltransferase chromosomal gene was digested with XbaI, after separation on a 0.7% agarose gel, blotted onto Hybond N (Amersham). When this membrane was hybridized in the same manner as described above, it was found that an about 6.8 kb DNA fragment hybridized with the probe. After digesting 20 ⁇ g of the same DNA with XbaI and separating with 0.7% agarose gel, a DNA fragment of about 6.8 kb was purified using Gene Clean (Funakoshi Co., Ltd.) and ligated with pBluescriptSKII- digested with XbaI.
  • the obtained plasmid was designated as pSPB513.
  • the perilla-derived DNA sequence contained in this plasmid was determined by the primer walking method.
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • This sequence has a region highly homologous to pSAT208, an anthocyanin 3-acyltransferase cDNA, and the amino acid sequence of the protein encoded by this region (SEQ ID NO: 6) is compared with the amino acid sequence encoded by pSAT208. There were 19 amino acid residue substitutions and 2 amino acid deletions, and no introns were observed.
  • sequence containing a region showing high homology with pSAT208 contained a sequence of 3438 bp upstream of ATG considered to be the start codon and a sequence of 2052 bp downstream of TAA considered to be the stop codon.
  • ORF open reading frame
  • Example 3 Amplification of transcriptional regulatory region of Sisoanthocyanin 3-acyltransferase gene Using 1 ng of pSPB513 as a template, two primers (5'- AAGCTT AACTATTATGATCCCACAGAG-3 '(SEQ ID NO: 7, underlined is a recognition sequence for HindIII) ), 5'- GGATCC GGCGGTGTTGAACGTAGC-3 ' ( SEQ ID NO: 8, underlined with a recognition sequence) of BamHI, after PCR (95 ° C. 1 minute hold, 52 ° C. 1 min, 72 ° C. 2 min, 95 ° C. 1 minute The amplified DNA fragment of about 1.1 kb was digested with HindIII and BamHI.
  • Plasmid pSPB567 described in Patent Document 4 (F3'5'H gene derived from pansy is linked to the 3 'side of the cauliflower mosaic 35S promoter to which an enhancer has been added, and the terminator of nopaline synthase is further linked to the 3' side.
  • was digested with PacI and a DNA fragment containing the pansy F3′5′H gene was cloned into the PacI site of pBin + (see TransgenicTransResearch 4, 288-290, 1995).
  • the plasmid in which the cauliflower mosaic 35S promoter to which the enhancer was added was present near the AscI site of pBin + was designated as pSPB575.
  • This plasmid was digested with HindIII and BamHI, and a DNA fragment obtained by digesting an approximately 1.1 kb DNA fragment containing the transcriptional regulatory region of the above-mentioned soyanthocyanin 3-acyltransferase with HindIII and BamHI was inserted into this plasmid.
  • the obtained plasmid was designated as pSFL205.
  • PSFL205 was digested with HindIII and SacI to recover a DNA fragment of about 100 bp.
  • This DNA fragment, an about 4 kb DNA fragment obtained by digesting pSPB513 with SacI and XbaI, and plasmid pBin + digested with HindIII and XbaI were ligated to obtain plasmid pSPB3311.
  • This plasmid pSPB3311 is a binary vector comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and comprises the transcriptional regulatory region of the thysoanthocyanin 3-acyltransferase gene, the translated region of the gene, and the 3 ′ untranslated region. Including.
  • Example 4 Construction of pSPB3323
  • the transcriptional regulatory region of pansy F3'5'H gene BP # 40 was amplified as follows using TaKaRa LA PCR TM in vitro Cloning Kit.
  • Chromosomal DNA was prepared from leaves of pansy using DNA easy plant kit (QIAGEN).
  • 3 ⁇ g of chromosomal DNA was digested with the restriction enzyme HindIII.
  • the digested DNA was reacted with HindIII terminal DNA (included in TaKaRa LA PCR TM in vitro Cloning Kit) using Ligation High (TOYOBO) for 40 minutes at 16 ° C. and ligated.
  • reaction solution was diluted 10 times with water.
  • 5 pmol primer C2 (5′-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 ′, SEQ ID NO: 11, a partial sequence of HindIII cassette sequence included in Kit)
  • 5 pmol primer BP40-i7 (5 ′ -Reaction with 25 ⁇ l of a reaction solution containing -GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3 ', SEQ ID NO: 12) was performed at 98 ° C for 5 minutes, and then the reaction at 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 15 minutes was repeated 30 times.
  • the obtained DNA fragment was introduced into plasmid pCR2.1 (Invitrogen).
  • plasmid pCR2.1 Invitrogen
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was determined, there was a portion where the sequence did not match the cDNA sequence of BP # 40. This is probably because an error occurred during PCR.
  • the following operation was performed.
  • the amplified DNA fragment was inserted into pCR2.1.
  • This DNA fragment contained an approximately 2.1 kb 5 ′ untranslated region and a 200 bp translated region.
  • This plasmid was designated as pSFL614.
  • the nucleotide sequence of the plasmid pSFL614 sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the approximately 2.1 kb 5 'untranslated region (BP40pro, SEQ ID NO: 15) contained in pSFL614 was used to transcribe the BP # 40 gene. At this time, the BamHI site was changed to NheI.
  • 50 pmol of primer BP40pro-HindIII-F 5'-AAG CTT GTG ATC GAC ATC TCT CTC C-3 ', SEQ ID NO: 16
  • 50 pmol of primer BP40pro-NheI-R 5'- CGA GGC TAG CTA AAC ACT TAT-3 ', SEQ ID NO: 17
  • Ex-Taq DNA polymerase was added, and the mixture was kept at 25 ° C for 5 minutes at 98 ° C, followed by reaction at 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 15 minutes.
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR2.1. It was determined by confirming the base sequence that there was no error due to PCR in this sequence. This plasmid was digested with HindIII and NheI to obtain a 470 bp DNA fragment. This DNA fragment was designated as fragment A.
  • primer BP40pro-NheI-F 5'-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3 ', SEQ ID NO: 18
  • primer BP40pro-BamHI-R 5'-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3 ', SEQ ID NO: 19
  • Ex-Taq DNA polymerase 5'-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3 ', SEQ ID NO: 19
  • Ex-Taq DNA polymerase 5'-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3 ', SEQ ID NO: 19
  • the larger fragment of DNA fragments generated by digesting plasmid pSPB567 described in Patent Document 4 with BamHI and HindIII was recovered, and the above-mentioned fragment A and fragment B were ligated to obtain pSFL620.
  • pSFL620 After digesting pSFL620 with PacI, a DNA fragment of about 3.2 kb was recovered. This DNA fragment was inserted into the PacI site of pBin +.
  • the obtained plasmid was designated as pSPB3317.
  • a fragment obtained by digesting pSPB3311 with AscI and XbaI was introduced into the AscI and XbaI sites of pSPB3317, and the resulting plasmid was designated as pSPB3323.
  • Example 5 Expression of Chrysoanthocyanin 3-Acyltransferase Chromosomal Gene in Chrysanthemum pSPB3311 prepared in Example 3 was introduced into Agrobacterium, and Chrysanthemum cultivar 94-765 (Seikoen) was used with this Agrobacterium. , Not yet released) was transformed by a known method. Chrysanthemum transformation is described, for example, in Non-Patent Document 8, but the transformation method is not limited thereto. Six transformed lines were obtained. The tongue-shaped petals were crushed after freezing, and 50-100 mg of the crushed petals were extracted with 500 ⁇ L of 50% aqueous acetic acid and filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • An anthocyanin contained in this extract was diluted 5-fold with distilled water as an analysis sample, and analyzed using high performance liquid chromatography under the following conditions.
  • the column was Inertsil ODS-2 (particle size 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, GL Sciences), the flow rate was 0.8 ml / min, the mobile phase contained 1.5% phosphoric acid, 4% acetic acid, 5% acetonitrile to 20% acetic acid, After a 40% linear gradient of 25% acetonitrile, isocratic elution was performed for 10 minutes with 25% acetonitrile containing 1.5% phosphoric acid and 20% acetic acid.
  • an Agilent 1100 series diode array detector GL Science
  • anthocyanins in the analysis lines 1275-13, 1275-14, 1275-15, and 1275-17 that are transformants, 23%, 1%, 17%, and 34%, respectively, have a retention time of 20 minutes or more. It was suggested that these anthocyanins were modified with aromatic acyl groups. The absorption maximum of anthocyanins eluted at a retention time of 20 minutes or more has been shifted to the longer wavelength side, and the above-described transformation has allowed existing flower colors to have a bluish color. On the other hand, none of the anthocyanins in the petals of the original chrysanthemum variety 94-765 had a retention time of more than 20 minutes.
  • Anthocyanins in recombinant chrysanthemum 1275-17 were analyzed by LC-FT-ICR-MS method (J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77: 94-102 (2008), Plant J. 54: 949-962) . Using this technique, an accurate mass spectrum of anthocyanin can be measured, and an MS / MS spectrum can be obtained by tandem mass spectrometry.
  • chrysanthemum 1275-17 a peak of a compound corresponding to cyanidin (coumaroyl) glucoside not detected in the host (detection m / z: 595.146259), MSMS fragment detected only m / z 287.1 corresponding to cyanidin was detected.
  • Example 6 Expression of lysoanthocyanin 3-acyltransferase chromosomal gene and pansy F3'5'H gene in chrysanthemum pSPB3323 prepared in Example 4 was introduced into Agrobacterium and chrysanthemum was used. Variety 94-765 (Seikoen, unreleased) was transformed by a known method. Six transformed lines were obtained. The anthocyanins contained in the petals were analyzed by high performance liquid chromatography by the method described in Example 5.
  • anthocyanidins extracted by the following method were analyzed. Tongue petals were crushed after freezing, 50-100 mg of crushed petals were extracted with 500 ⁇ L of 1% hydrochloric acid methanol, 500 ⁇ L of 4N hydrochloric acid (HCl) was added to this extract, mixed, and water was added at 100 ° C. for 1 hour. Decomposition was performed. After cooling the decomposed solution, 1 ml of 0.05 M trifluoroacetic acid (TFA) was added and mixed. Next, this solution was added to Sep-Pak C18 (Millipore) to adsorb the hydrolysis product.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Sep-Pak C18 was washed with 80% acetonitrile (MeCN) in advance and equilibrated with 0.05M TFA. After the hydrolyzate adsorbed on Sep-Pak C18 was washed with 0.05M TFA, and further washed with 20% MeCN and 0.05M TFA, the hydrolyzate was eluted with 80% MeCN and 0.05M TFA to obtain an analysis sample. .
  • the analysis sample was analyzed under the following conditions using high performance liquid chromatography.
  • the column was Inertsil ODS-2 (particle size 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, GL Science), the flow rate was 0.8 ml / min, the mobile phase contained 1.5% phosphoric acid, 5% acetic acid, 6.25% acetonitrile to 20% acetic acid, After a 20% linear gradient of 25% acetonitrile, isocratic elution was performed for 5 minutes with 25% acetonitrile containing 1.5% phosphoric acid and 20% acetic acid.
  • an Agilent 1100 series diode array detector (GL Science) was used to detect the wavelength region of 250 nm to 600 nm, and the abundance ratio of each anthocyanidin was determined from the area of absorbance at 530 nm.
  • delphinidin was detected in 0.9%, 0.8%, 1.4%, and 0.6% of the total anthocyanidins in the analysis lines 1300-3, 1300-4, 1300-5, and 1300-6, respectively. It was. This suggests that the pansy BP40 transcriptional regulatory region was responsible for BP40 transcription.
  • Example 7 Preparation of pBI121-Perilla 3ATpro :: ADHNF-Pansie F3'5'H # 40 :: Perilla 3ATter Using the plasmid pSPB3311 obtained in Example 3 as a template, HAP_gPf3ATpro_long_Fd (5'-AAGCTTGGCGCGCCGTTTAAACAACTATTATGATCCCACAG-3 ' No.
  • pCR-Pf3ATpro X-gPf3ATpro-Rv (5′-TCTAGAGGCGGTGTTGAACGTAGCTGTGG-3 ′, SEQ ID NO: 21) were used as primers, and PCR was performed with Prime Star DNA polymerase (Takara) to obtain about 1.1 kbp of soyanthocyanin 3-acyl group.
  • the promoter region (Pf3ATpro) of the transferase gene (Pf3AT) was amplified.
  • SSS-gPf3ATter-Fd (5′-GAGCTCACTAGTGTCGACTAAATGTATGTAATTAAACTAAT-3 ′, SEQ ID NO: 22) and ESS-gPf3ATter-Rv (5′-GAATTCAGGCCTGCCCGGGCTATCTTTATCATATTTCGTCTAC-3 ′, SEQ ID NO: 23 using primer)
  • the 3 ′ untranslated region (Pf3ATter) of the approximately 1.5 kbp cysoanthocyanin 3-acyltransferase gene was amplified by PCR using Prime Star DNA polymerase (Takara).
  • a plasmid obtained by cloning the PCR product into pCR-BluntII-TOPO was designated as pCR-Pf3ATter.
  • a Pf3ATter DNA fragment obtained by digesting pCR-Pf3ATter with SacI and EcoRI was inserted into SacI and EcoRI of pBI121-ADHNF.
  • the obtained plasmid was digested with HindIII and XbaI, and the binary vector obtained by ligating the Pf3ATpro DNA fragment obtained by digesting pCR-Pf3ATpro with HindIII and XbaI was transformed into pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATt. It was.
  • a Hermanus chromosomal DNA library was prepared using ⁇ BlueSTAR TM Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242) as follows. Chromosomal DNA was prepared from young leaves of Hermanus using Nucleon Phytopure [Registered] (TEPNEL Life Sciences). About 100 ⁇ g of chromosomal DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI. This DNA fragment was partially filled in with DNA polymerase I Klenow fragment (TOYOBO) in the presence of dGTP and dATP, and fractionated by sucrose density gradient centrifugation. DNA was recovered to a size of about 13 kb and concentrated by ethanol precipitation.
  • This plasmid had a base sequence showing homology to F3H.
  • primer RrF3H-F 5′-AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3 ′, SEQ ID NO: 26
  • primer RrF3H 5′-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTTC-3 ′, SEQ ID NO: 27
  • Ex-Taq DNA Polymerase Takara
  • the reaction conditions for PCR were 94 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and further maintained at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained DNA fragment was inserted into pCR-TOPO (INVITROGEN) to obtain plasmid pSPB811. From this plasmid, an approximately 1.2 kb F3H 5′-untranslated region can be recovered using HindIII and BamHI.
  • the promoter part of pSPB567 described in Patent Document 4 (CaMV35S promoter with El2 enhancer added, pansy F3'5'HBP40, plasmid pUC containing nopaline synthase terminator) is approximately 1.2 kb of F3H using HindIII and BamHI.
  • the plasmid pSFL814 (including R. rugosa F3H 5 ′: BPF3′5′H # 40: nos 3 ′) was obtained by substituting the 5′-untranslated region.
  • tobacco ADH-5'UTR 94bp is converted into pansy F3'5 by PCR.
  • a DNA fragment directly linked to the start codon of 'H # 40 was obtained.
  • pBinPLUS Hermanus F3Hpro :: ADHNF-pansy F3'5'H # 40 :: NOSter was obtained.
  • pBINPLUS Hermanus F3Hpro :: ADHNF-Pansie F3'5'H # 40 :: NOSter as a template, SpeISmaI-ADH-Fd (5'-ACTAGTCCCGGGGTCTATTTAACTCAGTATTCAG-3 ', SEQ ID NO: 24) and SacI-BP40-Rv (5'- ADHNF-pansy F3'5'H # 40 DNA fragment was amplified by PCR using Prime Star DNA polymerase using GAGCTCTCAGGTTGCGTACGGGTTTGAGG-3 'as a primer.
  • a plasmid obtained by cloning this DNA fragment into pCR-BluntII-TOPO was designated as pCR-ADHBP40-SpeSac.
  • Example 8 pSFL535 (described in WO2008 / 156206) was partially digested with PacI, and a DNA fragment from which the expression cassette containing the pansy F3′5′H gene was removed was recovered. This DNA fragment and a DNA fragment of about 3.2 kb obtained by digesting pSFL620 described in Example 4 with PacI were ligated to obtain a plasmid pSFL635 having the structure shown in FIG.
  • T-DNA of this plasmid When T-DNA of this plasmid is introduced into a plant, the Torenia-derived flavone synthase gene and Torenia-derived anthocyanin methyltransferase are constitutively expressed, and the pansy F3'5'H gene is expressed in a petal-specific manner Is expected to be.
  • This plasmid was introduced into Agrobacterium using the method described in WO2008 / 156206 and introduced into rose variety WKS124 to obtain 83 strains of transformants. These petals contained malvidin, petunidin and delphinidin not found in WKS124. Of these total anthocyanidins, these totaled 73% on average and up to 85%.
  • pansy BP40-derived promoter region (about 2.1 kb 5 ′ untranslated region (BP40pro, SEQ ID NO: 15, see Example 4) contained in pSFL514) obtained in this experiment is used to convert foreign genes into plants, particularly roses. It is suitable for expression.
  • a promoter region that is thought to be responsible for transcription of the enzyme gene in red radish leaves, that is, the transcriptional regulatory region of the soyanthocyanin 3-acyltransferase gene can function as a transcriptional regulatory region in the petal of chrysanthemum, which is heterogeneous. I understood. Therefore, it is possible to cause transcription of a foreign gene specifically in tissues where anthocyanins accumulate, such as flowers, by using the transcriptional regulatory region of the sisanthanthocyanin 3-acyltransferase gene. Examples of foreign genes to be transcribed include, but are not limited to, genes related to flower color and fragrance. It has also been found that the transcriptional regulatory region of the pansy F3′5′H gene is useful for changing the color of flowers of chrysanthemum plants or plants other than chrysanthemum.

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Abstract

　本発明により、花の色を変えるために有用な転写調節領域を用いて遺伝子組換え技術によりキク植物又はキク以外の植物においてフラボノイド合成系を制御する方法、アントシアニンを修飾する方法、修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物又はキク以外の植物を生産する方法、及び該調節領域が導入されたキク植物又はキク以外の植物、若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織が提供される。本発に係る方法においては、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域、例えば、配列番号１に示す塩基配列を含む核酸、又はパンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域、例えば、配列番号１５に示す塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター又は発現カセットが使用される。

Description

修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
　本発明は、シソ由来アントシアニン３－アシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子を用いてキク植物においてフラボノイド生合成系を制御する方法、アントシアニンを修飾する方法、及び該遺伝子が導入されたキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花に関する。
　本発明は、また、パンジー由来フラボノイド3',5'-水酸化酵素（以下、F3'5'Hともいう）遺伝子＃40（以下、BP40ともいう。）由来の転写調節領域及びその使用にも関する。
　遺伝子組換え技術を利用すると、有用な遺伝子を目的の植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を植物に付与することができる。このようにして作製された遺伝子組換え植物は既に広範囲で栽培されている。遺伝子の発現の調節は、主に転写の段階で制御されていて、転写調節は遺伝子の発現を調節する上で最も重要である。すなわち、適切な時期に、適切な組織で、適切な強さで転写をさせることが、産業上有用な遺伝子組換え植物を作製するために重要である。転写は多くの場合、翻訳領域の5'側にあるＤＮＡ配列により制御されている。遺伝子の転写の開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をプロモーターという。プロモーターは、開始コドンの5'側数十ｂｐに存在することがあり、ＴＡＴＡボックスなどの配列を含むことが多い。そのさらに5’側には様々な転写調節因子が結合するシスエレメントがあり、これらの存在は、転写の時期、転写が行われる組織、転写の強さを制御している。転写調節因子はアミノ酸配列により多くのファミリーに分類される。例えば、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ（basic helix loop helix）型転写調節因子などは有名なファミリーである。実際には、転写制御領域とプロモーターは同じような意味で用いられることが多い。
　花の色の主成分であるアントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物の一員である。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのB環の水酸基の数が増加すると青くなる。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり（すなわち吸収極大値が長波長にシフトする）、アントシアニンの安定性が増すことが知られている（以下、非特許文献１参照）。
　アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている（同非特許文献１参照）。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子はリンドウ、ラベンダー、ペチュニアなどから得られている（以下、特許文献１、特許文献２参照）。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン（マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin）（以下、非特許文献２参照）の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン３－グルコシド－芳香族アシル基転移酵素（３ＡＴ）の遺伝子｛以下、単に「シソアントシアニン３－アシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子」ともいう。｝を始め既に報告されている（同特許文献１参照）。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写制御（調節）についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写調節領域の中には、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Ｍｙｂ型転写調節因子とｂＨＬＨ型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている（同非特許文献１参照）。
　植物において遺伝子の転写を担っているプロモーター（以下、転写調節領域ともいう。）には、どの組織でも又は発育段階のどの時期にでも機能するいわゆる構成的プロモーターと、特定の器官・組織でのみ機能する器官・組織特異的プロモーターや、発育段階の特定時期にのみ発現する時期特異的プロモーターとがある。遺伝子組換え植物で有用遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、構成的プロモーターがよく用いられる。代表的な構成的プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス35S（以下、CaMV35Sともいう。）プロモーターやそれを元に構築されたプロモーター（以下、非特許文献３参照）、Mac1プロモーター（以下、非特許文献４参照）などがある。しかしながら、植物において、多くの遺伝子は、組織・器官特異的又は時期特異的に発現している。これは遺伝子を組織・器官特異的又は時期特異的に発現することが植物にとっては必要であることを示唆している。このような組織・器官特異的又は時期特異的な転写調節領域を利用して植物の遺伝子組換えを行った例がある。例えば、種子特異的な転写調節領域を用いて蛋白質を種子で蓄積させた例がある。
　ところで、植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は、その種がもつ遺伝的な制約から、少ない。例えば、バラ、カーネーションなどには青や紫色の花を咲かせる品種は自然には存在しない。なぜなら、バラやカーネーションは、多くの青や紫色の花を咲かせる種が合成するデルフィニジンというアントシアニジンを合成するために必要なF3'5'H遺伝子を持っていないからである。これらの種に、青や紫色の花を咲かせる種であるペチュニア、パンジーなどのF3'5'H遺伝子を導入することにより、これらの種で、花の色を青くすることができた。カーネーションの場合、異種由来のF3'5'H遺伝子を転写させるために、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域が用いられている。例えば、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域を含むプラスミドとして、以下の特許文献３に記載されたプラスミドpCGP485、pCGP653、構成的な転写調節領域を含むプラスミドとして、プラスミドpCGP628（Mac1プロモーターを含む）、以下の特許文献４に記載されたプラスミドpSPB130（エンハンサーが付加されたCaMV35Sプロモーターを含む）が挙げられる。
　しかしながら、このようなプロモーターが組換え植物において、どの程度強く機能して目的の表現型をもたらすことができるかどうかは、予測することは困難である。また、複数の外来遺伝子を発現させるために同じプロモーターを繰り返して使うことは遺伝子のサイレンシングを引き起こすことがあるので、避けるべきであると考えられている（以下、非特許文献５参照）。
　したがって、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてきたが、目的の宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが未だ必要とされている。
　特に、キク植物（単に、「キク」ともいう。）は、日本全国の卸売価格(農林水産統計平成19年花き卸売市場調査結果の概要)の内の約30％を占め、バラの約9％、カーネーションの約7％と比較しても重要な作目である。キクには、白・黄・橙・赤・桃・紫赤などの花色はあるものの、紫や青といった青色系の花色はない。従って、青色花の育種は新たな需要を喚起するための目標の一つとされている。キクの花色は、アントシアニンとカロテノイドの組み合わせにより発現している。アントシアニンは基本骨格であるアントシアニジンの構造の違いや、糖や有機酸による修飾の違いなどにより、多様な色を発現できる。しかしながら、キクの花色を担うアントシアニンは、シアニジンの3位がグルコースとマロン酸により修飾された二種類（cyanidin 3-O-(6"-O-monomalonyl-β-glucopyranosideとcyanidin 3-O-(3",6"-O-dimalonyl-β-glucopyranoside)のみであることが知られている（以下、非特許文献６参照）。また、それらの構造は比較的単純である（図１参照）。これにより、キクのアントシアニンによる発色のバリエーションが極めて小さい要因になっている。
　前記したように、キクは日本で最も重要な花きであるが、六倍体と高次倍数性を有し、かつゲノムサイズも大きいことから、形質転換効率が低いのに加えて、導入遺伝子のサイレンシング（不活化）が起こることもあり、安定に導入遺伝子を発現する遺伝子組換えキクを得ることは容易ではない。CaMV35Sプロモーターに連結したβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を導入したキクでは、同じ遺伝子を導入したタバコに比べ、GUS遺伝子の活性は10分の１程度であり、かつ、その活性は形質転換後12ヶ月経過するとほとんどの個体で低下することが報告されている（以下、非特許文献７参照）。キクで外来遺伝子を安定に発現させるために、キクで良好に機能するクロロフィルa/b結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターを得た報告があるが、同プロモーターは、クロロフィルが余り存在しない花弁で遺伝子を発現させるためには適していない（以下、非特許文献８参照）。タバコのelongation factor 1αプロモーターに連結したGUS遺伝子をキクに導入すると、20ヶ月以上経過しても、葉や花弁でGUS遺伝子が発現したという報告がある（以下、非特許文献９参照）。さらに、変異型のエチレンレセプター遺伝子をキクで発現させ花の寿命を延長した例（以下、非特許文献１０参照）、キクのAGAMOUS遺伝子の発現を抑制して花の形を変化させた例（以下、非特許文献１１参照）、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'-非翻訳領域（以下、タバコADH-5'UTRともいう）を用いてキクにおける外来遺伝子の発現を上昇させた例（以下、非特許文献１２参照）がある。
　一方、遺伝子組換えによるキクの花色改変の成功例として、カルコン合成酵素（CHS）の遺伝子をコサプレッション法により抑制して、ピンク色を白色にした報告（以下、非特許文献１３参照）と、カロテノイド分解酵素（CCD4a）の遺伝子をRNAi法により抑制して、白色を黄色にした報告（以下、非特許文献１４参照）があるが、いずれも内在性の遺伝子の発現抑制による花色改変であり、外来遺伝子の過剰発現による花色改変の成功例はないし、アントシアニンの構造やそれに伴う花色の変化を実現した例もない。
　外来遺伝子の過剰発現による花色改変の試みは、デルフィニジンが合成されるために必要な酵素であるF3'5'Hをコードする遺伝子を導入した報告があるが（以下、特許文献５、非特許文献１５参照）、導入したF3'5'H遺伝子の働きにより生産されたデルフィニジンが舌状花弁に蓄積し、青色系のキクが作出されたという報告はない。キクでは、CaMV35SプロモーターでF3'5'Hを発現させても、デルフィニジンの生産は認められない（非特許文献１５参照）。また、CaMV35Sプロモーターで発現させた遺伝子の発現は、キク形質転換体の成長に伴って消失するなど、安定的な発現には不適切である（非特許文献７参照）。キクで外来遺伝子を舌状花弁で効率的かつ安定的に発現できるプロモーターとして、ポテトLhca3.St.1プロモーター（以下、非特許文献１６参照）、キクUEP1プロモーター（以下、非特許文献１７参照）や、タバコEF1αプロモーター（以下、特許文献６、非特許文献９参照）等が開発されている。しかしながら、これらのプロモーターを用いた外来遺伝子の過剰発現によるキクの花色改変は報告がない。以上のことから、花の色が変化したキクを遺伝子組換えにより作出するために、キクに適したプロモーターの開発を含むフラボノイド生合成系遺伝子の発現制御技術を確立する必要がある。
WO 96/25500 WO 01/72984 WO 94/28140 WO 05/17147 米国特許第５９４８９５５号 特開２００４－６５０９６号公報
Plant J. 54, 737-749, 2008 Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800, 1989 Plant Cell Physiology 1996, 37, 49-59 Plant Molecular Biology 1990, 15, 373-381 Annals of Botany 1997, 79, 3-12 Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 81, 728-734, 2006 Plant Biotechnology, 17, 241-245, 2000 Breeding Science, 54, 51-58, 2004 Japan Agricultural Research Quarterly, 39：269-274, 2005 Postharvest Biology and Technology, 37, 101-110, 2005 Plant Biotechnology, 25:55-59, 2008 Plant Biotechnology, 25:69-75,2008 Bio/Technology 12:268, 1994 Plant Physiology 142:1193, 2006 J. Plant Biol., 50:626, 2007 Mol Breed 8: 335, 2001 Transgenic Res 11: 437, 2002
　本発明が解決しようとする課題は、キク植物の花の色を変えるために有用なプロモーターであるシソ由来アントシアニン３－アシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子の転写調節領域を用いてキク植物においてフラボノイド生合成系を制御する方法、アントシアニンを修飾する方法、修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法、及び該調節領域が導入されたキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花を提供することである。
　本発明は、上記切り花を用いた加工品（切り花加工品）にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　本発明が解決しようとする課題は、キク植物及びキク以外の植物の花の色を変えるために有用なプロモーターを提供することでもある。
　本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、シソ由来のアントシアニン３－アシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子の転写調節領域が、キクの花弁においてアントシアニンの構造を変化させ、その結果、キク植物の花の色を変えるために有用なプロモーターであることを発見し、その有用性を実験により確認して、本願発明を完成するに至った。
　本発明者らは、パンジー由来のF3’5’H遺伝子の転写調節領域がキク植物又はキク植物以外の植物の花の色を変えるために有用であることをも見出し、本願発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］以下の：
　（１）配列番号１に示す塩基配列を含む核酸、
　（２）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
　（３）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
　（４）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、遺伝子組換え技術によりキク植物において核酸を転写させる方法。
　［２］前記核酸を転写させる方法が、フラボノイド合成系に関わる核酸を転写させることによるフラボノイド合成系の制御方法である、前記［１］に記載の方法。
　［３］前記核酸を転写させる方法が、アントシアニン修飾に関わる核酸を転写させることによるアントシアニンの修飾方法である、前記［１］に記載の方法。
　［４］前記［１］に定義する核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素をキク植物において発現させて、芳香族アシル化アントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法。
　［５］前記発現ベクター又は発現カセットが配列番号２に示す塩基配列を含む、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］前記［１］に定義する核酸が導入されているか又は前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法により生産された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［７］芳香族アシル化アントシアニンを含む、前記［６］に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［８］デルフィニジンを含む、前記［６］又は［７］に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体若しくは又はその部分若しくは組織。
　［９］切り花である、前記［６］～［８］のいずれかに記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［１０］前記［９］に記載の切り花を用いた切り花加工品。
　［１１］以下の：
　（１）配列番号１５に示す塩基配列を含む核酸、
　（２）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
　（３）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
　（４）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。
　［１２］前記［１１］に記載の核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、キク植物又はキク植物以外の植物において核酸を発現させる方法。
　［１３］前記核酸を発現させる方法が、フラボノイド合成系に関わる核酸を発現させることによるフラボノイド合成系の制御方法である、前記［１２］に記載の方法。
　［１４］前記核酸を発現させる方法が、アントシアニン修飾に関わる核酸を発現させることによるアントシアニンの修飾方法である、前記［１２］に記載の方法。
　［１５］前記［１１］に定義する核酸が導入されているか又は前記［１２］～［１４］のいずれかに記載の方法により生産された、キク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［１６］芳香族アシル化アントシアニンを含む、前記［１５］に記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［１７］デルフィニジンを含む、前記［１５］又は［１６］に記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体若しくは又はその部分若しくは組織。
　［１８］切り花である、前記［１５］～［１７］のいずれかに記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
　［１９］前記［１８］に記載の切り花を用いた切り花加工品。
　アカジソの葉で酵素遺伝子の転写を司っていると考えられる転写調節領域、すなわち、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素の転写調節領域が異種であるキクの花弁で転写調節領域として機能しうることが分かった。したがって、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素の転写調節領域を利用して、花などのアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色、香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。
キクのフラボノイドの生合成経路の概略図、並びにシアニジン３－O－(６’’－O－モノマロニル－β－グルコピラノシド及びシアニジン３－O－(３’’，６’’－O－ジマロニル－β－グルコピラノシドの構造。 形質転換されたキクのフラボノイド生合成産物の例。 シソ３ＡＴ遺伝子導入用バイナリーベクターｐＳＰＢ３３１１及びｐＳＰＢ３３２３の概略図。 アントシアニンの組成が変化した形質転換キクのＨＰＬＣクロマトグラム。芳香族アシル化アントシアニンを３４％含む形質転換体１２７５－１７。使用プラスミドｐＳＰＢ３３１１（図３参照）。１：シアニジン３－マロニルグルコシド、２：シアニジン３－ジマロニルグルコシド、３：シアニジン３－芳香族アシルグルコシド。 キク形質転換体の花弁から検出された吸収スペクトル。３の吸収スペクトルには、芳香族有機酸で修飾されたアントシアニンに見られる３２６ｎｍ付近に吸収極大が観察され、さらに、マロニル化されたもの吸収スペクトル（１、２）に対し、アントシアニンの吸収極大は（５１８ｎｍから５２２ｎｍまで約５ｎｍほど）長波長側にシフトしている。 アントシアニンの組成が変化した形質転換キクのＨＰＬＣクロマトグラム。芳香族アシル化アントシアニンを５０％、デルフィニジン配糖体を０．８％含む形質転換体１３００－４。使用プラスミドｐＳＰＢ３３２３（図３参照）。１：シアニジン３－マロニルグルコシド、２：シアニジン３－ジマロニルグルコシド、３：シアニジン３－芳香族アシルグルコシド、４：デルフィニジン３－マロニルグルコシド。 プラスミドpSFL635の概略図。
　本発明は、シソのヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン３－グルコシドアシル基転移酵素（Pf3AT）をコードする遺伝子の5'領域（Pf3ATpro）（本明細書中、「シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域」ともいう。）により、3ATやF3'5'H等のフラボノイド生合成系遺伝子を発現させる遺伝子カセットを含有するベクターで（図３参照）、キク植物を形質転換することを含む、キク植物において核酸を転写させる方法、フラボノイド合成系に関わる核酸を転写させることによるフラボノイド合成系の制御方法、アントシアニン修飾に関わる核酸を転写させることによるアントシアニンの修飾方法、かかる方法によって作出された花弁のアントシアニン組成が改変されたキク植物及び／又は花色が改変された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花に関する。
　本発明は、パンジーのF3’5’H遺伝子の5’領域（本明細書中、「パンジーF3’5’H遺伝子の転写調節領域」ともいう。）により、F3'5'H等のフラボノイド生合成系遺伝子を発現させる遺伝子カセットを含有するベクターで（図３、図７参照）、キク植物及びキク以外の植物を形質転換することを含む、キク植物及びキク以外の植物において核酸を転写させる方法、フラボノイド合成系に関わる核酸を転写させることによるフラボノイド合成系の制御方法、アントシアニン修飾に関わる核酸を転写させることによるアントシアニンの修飾方法、かかる方法によって作出された花弁のアントシアニン組成が改変された植物及び／又は花色が改変された、キク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花に関する。
　本発明は、上記切り花を用いた加工品（切り花加工品）にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　本明細書中、「フラボノイド合成系を制御する方法」とは、フラボノイド合成系に関与するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、3AT遺伝子やF3’5’H遺伝子の発現を制御することによりフラボノイド合成系を制御する方法をいう。上記アントシアニン3－アシル基転移酵素遺伝子としては、例えば、シソ由来のアントシアニン3－アシル基転移酵素遺伝子がある。また、F3’5’H遺伝子としては、例えばパンジー由来のF3’5’H遺伝子がある。
　本発明により、3AT等のアシル基転移酵素を機能させて芳香族アシル基をアントシアニンに転移させることで、アントシアニンの吸収極大を長波長側にシフトさせることが可能になり、既存の花色に青みを持たせることが可能になった（図４、図５、図６参照）。
　また、Pf3ATプロモーター及びPf3ATターミネーターでシソの3AT遺伝子を発現させることにより、キクのアントシニンの３４％～５０％を芳香族アシル化することができており（図４、図６参照）、このプロモーターを様々な遺伝子の発現に用いることで、キクの舌状花弁で効率的かつ安定的に外来遺伝子を機能させることができる。また、F3'5'H遺伝子と3AT遺伝子を同時に発現させることで、青色アントシアニンの基本骨格であるデルフィニジンの配糖体を、芳香族アシル基により修飾することができ（図６参照）、青いキクを作出することが可能になる。
　本発明に係る転写制御領域としては、例えば、配列番号１又は配列番号１５に示す塩基配列から成る核酸が挙げられる。しかしながら、配列番号１又は配列番号１５に示す塩基配列から成る核酸において数個（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の塩基の付加、欠失及び／又は置換によって修飾された塩基配列から成るプロモーターも、元のプロモーターと同様の活性を維持していると考えられる。従って、本発明に係る転写調節領域は、キク花弁又は他の植物で転写調節領域として機能する限り、配列番号１又は配列番号１５に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸であることもできる。
　本発明に係る転写調節領域は、さらに、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、又はシソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸であることもできる。
　本発明に係る転写調節領域は、パンジーF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、又はパンジーF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸であることもできる。
　これらの核酸として、配列番号１又は配列番号１５に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号１又は配列番号１５に示す塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の塩基配列同一性を有する塩基配列から成る核酸が挙げられる。
　ここで、ストリンジェンシー条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存して経験的に求められるものである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。
　具体的には、例えば、低ストリンジェンシー条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃～４２℃の温度条件下、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェンシー条件としては、例えば、洗浄段階において、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェンシー条件をより高くすることにより、相同性又は同一性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
　本発明に係る転写調節領域は、発現ベクター又は発現カセットに含まれ、これらの発現ベクター又は発現カセットは、例えば、配列番号２、又はWO 04/020637に記載のパンジーF3’5’H遺伝子に示す塩基配列を含む。
　本発明は、上記転写調節領域（核酸）が導入された、キク植物又はキク以外の植物又はその子孫又はその部分若しくは組織、本発明に係る方法を用いた結果として作出された、芳香族アシル化アントシアニン、及び／又はデルフィニジンを含む、キク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花にも関する。
　本明細書中、用語「キク植物（単に「キク」ともいう）」とは、キク科（Asteraceae）のキク属（Chrysanthemum）の植物を意味する。例えば、イエギク（Dendranthema grandiflorum Kitam）、西洋菊、大菊、中菊、小菊などが挙げられ、代表的な種としては、キク（Chrysanthemum morifolium）が挙げられる。キク以外の植物は、特に問わないが、好ましくはバラであることができる。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
　分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cloning（Sambrook and Russell, 2001）に依った。
実施例１：シソアントシアニン3－アシル基転移酵素染色体遺伝子のクローニング
　シソにはアントシアニンを葉に蓄積する赤い変種と蓄積しない緑色の変種が知られている。前者の葉から、その染色体ＤＮＡを、報告されている方法（Plant Mol Biol. December 1997; 35(6):915-27参照）で調製した。この染色体ＤＮＡをSau3AI（ＴＯＹＯＢＯ社製）で部分分解し、ショ糖密度勾配法により10～15ｋｂのＤＮＡ断片を含む画分を回収した。この断片を、公知の方法を用いてラムダファージベクターの一種であるEMBL3（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。得られたライブラリーをシソに由来するアントシアニン３－アシル基転移酵素のcDNAであるpSAT208（Plant Cell Physiol. April 2000; 41(4):495-502参照）をプローブとして用いてスクリーニングした。ライブラリーのスクリーニングは、既に報告されている方法（Plant Cell Physiol. July 1996; 37(5):711-6参照）に拠った。プローブとハイブリダイズしたプラークを純化後、培養し、得られたファージからＤＮＡを調製した。
実施例２：シソアントシアニン３－アシル基転移酵素染色体遺伝子の塩基配列決定
　上記で得たＤＮＡ10μｇをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、ハイボンドN（アマシャム社製）にブロットした。この膜を上記と同じようにハイブリダイズしたところ、約６．８ｋｂのDNA断片がプローブとハイブリダイズすることが分かった。同じＤＮＡ20μｇをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、約６．８ｋｂのDNA断片を、ジーンクリーン（フナコシ株式会社）を用いて精製し、XbaIで消化したpBluescriptSKII-と連結した。得られたプラスミドをpSPB513とした。このプラスミドに含まれるシソ由来のＤＮＡ配列をプライマーウォーキング法により決定した。その塩基配列を配列番号４に示す。この配列には、アントシアニン３－アシル基転移酵素cDNAであるpSAT208と高い相同性を示す領域があり、この領域がコードする蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）は、pSAT208のコードするアミノ酸配列と比べて１９個のアミノ酸残基の置換と２個のアミノ酸の欠失が見られ、イントロンは観察されなかった。また、上記pSAT208と高い相同性を示す領域を含む配列は、その開始コドンと考えられるATGの上流に３４３８ｂｐの配列と、その終止コドンと考えられるTAAの下流に２０５２ｂｐの配列を含んでいた。上記３４３８ｂｐの配列内には、アントシアニン３－アシル基転移酵素ではない別のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、配列番号５）が存在した。この部分を除く、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を増幅するために、以下の実験を行った。
実施例３：シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域の増幅
　1ngのpSPB513を鋳型として2種のプライマー（5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’（配列番号７、下線部はHindIIIの認識配列）、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’（配列番号８、下線部はBamHIの認識配列）を用いて、PCR（95℃1分間保持後、52℃1分間、72℃2分間、95℃1分間からなる反応を25サイクル）を行なった。増幅された約1.1ｋｂのＤＮＡ断片をHindIIIとBamHIで消化した。
　特許文献４に記載されたプラスミドｐSPB567（エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Ｓプロモーターの3'側にパンジー由来のF3'5'H遺伝子が連結され、さらにその3'側にノパリンシンターゼのターミネーターが連結されている）をPacIで消化し、パンジー由来のF3'5'H遺伝子を含むDNA断片をｐBin＋(Transgenic Research 4, 288-290, 1995参照)のPacI部位にクローニングした。得られたプラスミドの内、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35ＳプロモーターがｐBin+のAscI部位近くに存在するところのプラスミドをpSPB575とした。このプラスミドをHindIIIとBamHIで消化し、これに、前記したシソアントシアニン３－アシル基転移酵素の転写調節領域を含む約1.1kbのＤＮＡ断片をHindIIIとBamHIで消化したDNA断片を、挿入した。得られたプラスミドをpSFL205とした。
　pSFL205をHindIIIとSacIで消化して、約100bpのDNA断片を回収した。このDNA断片と、pSPB513をSacIとXbaIで消化して得られる約4kbのDNA断片と、HindIIIとXbaIで消化したプラスミドpBin+とを連結して、プラスミドpSPB3311を得た。このプラスミドpSPB3311は、配列番号２に示す塩基配列を含むバイナリーベクターとなっていて、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域と該遺伝子の翻訳領域とその3'側の非翻訳領域を含む。
実施例４：pSPB3323の構築
　パンジーのF3'5'H遺伝子BP＃４０（WO 04/020637参照）の転写調節領域をTaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitを用いて、以下のように増幅した。
　パンジーの葉からDNA easy plant kit (QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製した。3μｇの染色体DNAを制限酵素HindIIIにより消化した。消化したDNAを、HindIII末端DNA（TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitに含まれる）と、Ligation High (TOYOBO)を用いて、16℃で40分間反応させ、連結した。反応液4μlを10μlの水で薄め、連結したDNAを94℃10分間の処理により変性させた後、氷中で冷却した。5pmolのプライマーC1 (5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’、配列番号９、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる)と5pmolのプライマーBP40-i5 (5’-AGGTGCATGATCGGACCATACTTC-3’、配列番号１０、BP＃40の翻訳領域の相補鎖に相当する)を加え、キットのプロトコールに従い、25μlの反応液で、98℃20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。反応液を水で10倍に希釈した。このうち、0.5μlを鋳型として、5pmolのプライマーC2（5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’、配列番号１１、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる）と5pmolのプライマー BP40-i7 (5’-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3’、配列番号１２)を含む25μlの反応液で、98℃で5分間反応後、98℃で20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。
　得られたDNA断片を、プラスミドpCR2.1 （Invitrogen社）に導入した。挿入されたDNAの塩基配列を決定したところ、その配列はBP#40のcDNA塩基配列と一致しない箇所が見られた。これはPCRの際にエラーが起こったためと考えられる。エラーのない配列を増幅するために以下の操作を行なった。
　約2kbのBP#40の5’非翻訳領域と200bpの翻訳領域を増幅するために、200ngのパンジーの染色体DNAを鋳型として、50pmolのプライマー BP40-i7 (配列番号１２)と50pmolのプライマーBP40 pro-F (5’-ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3’、配列番号１３、BP#40遺伝子の5’非翻訳領域にある配列）を用いて、25μlの反応液でPCRを行なった。98℃5分間処理した後、98℃20秒間と68℃15分間からなる反応を30回繰り返した。増幅されたDNA断片をpCR2.1に挿入した。このDNA断片には約2.1kbの5’非翻訳領域と200bpの翻訳領域が含まれていた。このプラスミドをpSFL614とした。プラスミドpSFL614配列の塩基配列を配列番号１４に示す。
　ｐSFL614に含まれる約2.1kbの5’非翻訳領域（ＢＰ４０ｐｒｏ，配列番号１５）をBP#40遺伝子を転写させるために用いた。この際にBamHI部位をNheIに変更した。1ngのpSFL614プラスミドを鋳型とし、50pmolのプライマーBP40pro-HindIII-F (5’-AAG CTT GTG ATC GAC ATC TCT CTC C-3’、配列番号１６)と50pmolのプライマーBP40pro-NheI-R (5’-CGA GGC TAG CTA AAC ACT TAT-3’、配列番号１７)、Ex-Taq DNAポリメラーゼを加え、25μlの反応液で98℃5分間保持した後、98℃20秒間、68℃15分間の反応を25回繰り返した。増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングした。この配列にPCRによるエラーがないことを、塩基配列を確認することにより決定した。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化し、470bpのDNA断片を得た。このDNA断片を断片Ａとした。
　1ngのpSFL614プラスミドを鋳型とし、50pmolのプライマーBP40pro-NheI-F (5’-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3’、配列番号１８)と50pmolのプライマーBP40pro-BamHI-R (5’-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3’、配列番号１９)、Ex-Taq DNAポリメラーゼを加え、25μlの反応液で98℃5分間保持した後、98℃20秒間、68℃15分間の反応を25回繰り返した。増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングした。この配列にPCRによるエラーがないことを、塩基配列を決定することにより確認した。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化し、630bpのDNA断片を得た。このDNA断片を断片Ｂとした。
　特許文献４に記載されたプラスミドpSPB567をBamHIとHindIIIで消化して生じるDNA断片のうち大きいほうの断片を回収し、上述の断片Ａと断片Ｂとを連結し、pSFL620とした。
　ｐSFL620をPacIで消化後、約3.2kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をpBin+のPacI部位に挿入した。得られたプラスミドをpSPB3317とした。上述のpSPB3311をAscIとXbaIで消化して得られた断片を、pSPB3317のAscIとXbaI部位に導入し、得られたプラスミドをpSPB3323とした。
実施例５：シソアントシアニン３－アシル基転移酵素染色体遺伝子のキクでの発現
　実施例３で調製したpSPB3311をアグロバクテリウムに導入し、このアグロバクテリウムを用いてキク品種94-765（精興園、未発売）を公知の方法により形質転換した。キクの形質転換は、例えば、非特許文献８に記載されているが、形質転換の方法はこれに限定されない。６系統の形質転換系統を取得した。この舌状花弁を凍結後に粉砕し、粉砕した花弁50～100mgを500μLの50%酢酸水溶液で抽出し、0.45μmのフィルターで濾過した。この抽出液に含まれるアントシアニンを蒸留水で５倍に希釈したものを分析サンプルとし、高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2（粒径5μm、4.6×250mm、ジーエルサイエンス）を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、4%酢酸、5%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配40分間の後、1.5%リン酸及び20%酢酸を含む25%アセトニトリルで10分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100シリーズ・ダイオードアレイ検出器（ジーエルサイエンス）を用い、250nm～600nmの波長領域を検出し、530nmの吸光度の面積により各アントシアニンの存在比を求めた。
　形質転換体である分析系統1275-13、1275-14、1275-15、及び1275-17におけるアントシアニンの内、それぞれ、23%、1%、17%、及び34％は、保持時間20分以上であり、これらのアントシアニンは芳香族アシル基により修飾されていることが示唆された。保持時間20分以上に溶出されるアントシアニンの吸収極大は長波長側にシフトされており、上記形質転換により、既存の花色に青みを持たせることが可能になった。一方、元のキク品種９４－７６５の花弁中のアントシアニンには、保持時間20分以上のものはなかった。
　LC-FT-ICR-MSの手法（J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77:94-102 (2008), Plant J. 54:949-962）により組換えキク1275-17のアントシアニンを分析した。この手法を用いるとアントシアニンの精密マススペクトルを測定でき、タンデム質量分析によりMS/MSスペクトルを得ることができる。キク1275-17には、宿主には検出されないシアニジン（クマロイル）グルコシドに相当する化合物（検出m/z：595.146259)、MSMSによるフラグメントはシアニジンに相当するm/z 287.1のみ）のピークが検出された。
　以上の結果から、異種であるシソの３ATの転写調節領域がキク植物において機能したこと、シソの３ATもキクにおいて機能し、アントシアニンの構造と花の色を変化させたことが明らかとなった。また、本発明により、3AT等のアシル基転移酵素を機能させて芳香族アシル基をアントシアニンに転移させることで、アントシアニンの吸収極大を長波長にシフトさせることが分った（図４、図５、図６参照）。
実施例６：シソアントシアニン３－アシル基転移酵素染色体遺伝子とパンジーF3’5’H遺伝子のキクでの発現
　実施例４で調製したpSPB3323をアグロバクテリウムに導入し、このアグロバクテリウムを用いてキク品種94-765（精興園、未発売）を公知の方法により形質転換した。６系統の形質転換系統を取得した。この花弁に含まれるアントシアニンを、実施例５に記載の方法で高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。
　形質転換体である分析系統1300-2、1300-3、及び1300-４のそれぞれにおけるアントシアニンの20％、2％、及び50％は、保持時間20分以上であり、これらのアントシアニンは芳香族アシル基により修飾されていることが示唆された。宿主のアントシアニンには、保持時間20分以上のものはなかった。以上のことから、異種であるシソの３ATの転写調節領域がキク植物において機能したこと、シソの３ATがキクのなかで機能して、アントシアニンの構造と花の色を変化させたことが明らかとなった。したがって、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を、様々な遺伝子の発現に用いることで、キクの舌状花弁で効率的かつ安定的に外来遺伝子を機能させることができるようになる。
　また、以下の方法で抽出したアントシアニジンの分析を行った。舌状花弁を凍結後に粉砕し、粉砕した花弁50～100mgを500μLの１%塩酸メタノールで抽出し、この抽出液に500μLの4N 塩酸（HCl）を加えて混合し、100℃で１時間、加水分解を行った。分解後の溶液を冷却後、1mlの0.05M トリフルオロ酢酸（TFA）を添加して混合した。次に、この溶液をSep-Pak C18（ミリポア）に添加して加水分解産物を吸着させた。Sep-Pak C18は予め80%アセトニトリル（MeCN）で洗浄後、0.05M TFAで平衡化した。Sep-Pak C18に吸着した加水分解産物を0.05M TFAで洗浄後、さらに20％MeCN, 0.05M TFAで洗浄した後に、80％MeCN, 0.05M TFAで加水分解産物を溶出し、分析サンプルとした。
　分析サンプルは、高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2（粒径5μm, 4.6×250mm, ジーエルサイエンス）を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、5%酢酸、6.25%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配20分間の後、1.5%リン酸及び20%酢酸を含む25%アセトニトリルで5分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100シリーズ・ダイオードアレイ検出器（ジーエルサイエンス）を用い、250nm～600nmの波長領域を検出し、530nmの吸光度の面積により各アントシアニジンの存在比を求めた。
　分析の結果、形質転換体である分析系統1300-3、1300-4、1300-5、及び1300-6において、それぞれ、デルフィニジンが全アントシアニジンの0.9%、0.8％、1.4%、及び0.6%検出された。これは、パンジーのBP40転写調節領域がBP40の転写を司ったことを示唆する。デルフィニジン及び芳香族アシル基で修飾されていることが示唆されるアントシアニンが検出された1300-3及び1300-4においては、芳香族アシル基で修飾されたデルフィニジン型アントシアニンをも含むことが示唆された。このようにF3'5'Hと3ATを同時に発現させることでフラボノイド合成系を制御することができ、青色アントシアニンの基本骨格であるデルフィニジンの配糖体を、芳香族アシル基により修飾することができ、青いキクを作出することが可能になる。
　実施例７：pBI121-シソ3ATpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::シソ3ATterの作製
　実施例３で得られたプラスミドpSPB3311を鋳型に、HAP_gPf3ATpro_long_Fd（5'-AAGCTTGGCGCGCCGTTTAAACAACTATTATGATCCCACAG-3'、配列番号２０）とX-gPf3ATpro-Rv（5'-TCTAGAGGCGGTGTTGAACGTAGCTGTGG-3'、配列番号２１）をプライマーとして用い、Prime Star DNAポリメラーゼ（Takara）でPCRを行って、約1.1kbpのシソアントシアニン3-アシル基転移酵素遺伝子(Pf3AT)のプロモーター領域（Pf3ATpro）を増幅した。得られたPCR産物をpCR-BluntII-TOPO（Invitrogen）にクローニングして得られたプラスミドをpCR-Pf3ATproとした。
　次に、pSPB3311を鋳型に、SSS-gPf3ATter-Fd（5'-GAGCTCACTAGTGTCGACTAAATGTATGTAATTAAACTAAT-3'、配列番号２２）、及びESS-gPf3ATter-Rv（5'-GAATTCAGGCCTGCCCGGGCTATCTTTATCATATTTCGTCTAC-3'、配列番号２３）をプライマーとして用い、Prime Star DNAポリメラーゼ（Takara）で、約1.5kbpのシソアントシアニン3-アシル基転移酵素遺伝子の3'側非翻訳領域（Pf3ATter）をPCRにより増幅した。PCR産物をpCR-BluntII-TOPO（Invitrogen）にクローニングして得られたプラスミドをpCR-Pf3ATterとした。
　pCR-Pf3ATterをSacIとEcoRIで消化して得られるPf3ATter DNA断片を、pBI121-ADHNF のSacIとEcoRIに挿入した。次に、得られたプラスミドを、HindIIIとXbaIで消化し、pCR-Pf3ATproをHindIIIとXbaIで消化して得られるPf3ATpro DNA断片を連結して得られたバイナリーベクターを、pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATtとした。
　ハマナスの染色体DNAライブラリーを、λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242)を用いて、以下のように作製した。ハマナスの若い葉から、Nucleon Phytopure [Registered] (TEPNEL Life Sciences)を用いて染色体DNAを調製した。約100μgの染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した。
　このDNA断片をdGTP とdATPの存在下においてDNA polymerase I Klenow fragment (TOYOBO)で部分的にフィルインをし、ショ糖密度勾配遠心により分画した。約13kbの大きさにDNAを回収し、エタノール沈殿により濃縮した。約180ngのDNAを1μL の λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kitと4℃で15時間連結した後、in vitro packaging反応を行ない、染色体ライブラリーを得た。
　このハマナス染色体DNAライブラリーをトレニアのフラバノン3-水酸化酵素(F3H) cDNA (NCBI No. AB211958)によりスクリーニングし、シグナルを示すプラークを得た。そのうち1プラークから、製造者(Novagen)が推奨する方法を用いてin vivoの切り出しを行い、プラスミドに変換した。これを制限酵素SpeIで消化し、2.6kbのDNA断片を回収し、pBluescript SKII- (STRATAGENE)のSpeI部位にサブクローングすることにより、プラスミドpSPB804を得た。このプラスミドはF3Hに相同性を示す塩基配列を有していた。
　F3Hの5'-非翻訳領域を増幅するために、1ngのpSPB804を鋳型に、プライマーRrF3H-F (5’-AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3’、配列番号２６)、プライマーRrF3H (5’-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTTC-3’、配列番号２７)、及びEx-Taq DNA Polymerase (Takara)を用いて50μLの反応液でPCRを行なった。PCRの反応条件は、94℃5分間反応後、94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を１サイクルとする反応を30回繰り返し、さらに72℃で7分間保持した。得られたDNA断片をpCR-TOPO (INVITROGEN)に挿入し、プラスミドpSPB811を得た。このプラスミドからは、HindIIIとBamHIを用いて約1.2kbのF3Hの5'-非翻訳領域を回収できる。
　特許文献４に記載されたpSPB567（El2エンハンサーが付加されたCaMV35Sプロモーター、パンジーのF3'5'HBP40、ノパリンシンターゼターミネーターを含むプラスミドpUC）のプロモーター部分をHindIIIとBamHIを用いて約1.2kbのF3Hの5'-非翻訳領域に置き換えて、プラスミドpSFL814 (R. rugosa F3H 5': BPF3'5'H#40: nos 3'を含む)を得た。
　pSFL814を鋳型に、ADH-BP40-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTAGTCACCGAC-3'、配列番号２８）とNcoI-BP40-Rv（5'-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3'、配列番号２９）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、及びpBI221 ADH-221を鋳型にBamHI-ADH-Fd（5'-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号３０）とBP40-ADH-Rv（5'-TAGAATTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号３１）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片を混合して鋳型に用い、BamHI-ADH-FdとNcoI-BP40-Rvをプライマーに用いて、PCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがパンジーF3'5'H#40の開始コドンに直結したDNA断片を得た。
　このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、BamHI及びNcoIで消化して得られる約600bpのDNA断片と、pSFL814をBamHI及びNcoIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結させることにより、pBinPLUS ハマナスF3Hpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40:: NOSterを得た。
　pBINPLUSハマナスF3Hpro:: ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterを鋳型に、SpeISmaI-ADH-Fd（5'-ACTAGTCCCGGGGTCTATTTAACTCAGTATTCAG-3'、配列番号２４）とSacI-BP40-Rv（5'-GAGCTCTCAGGTTGCGTACGGGTTTGAGG-3'、配列番号２５）をプライマーとして用い、Prime Star DNA polymeraseを用いたPCRによりADHNF-パンジーF3'5'H #40 DNA断片を増幅した。このDNA断片をpCR-BluntII-TOPOにクローニングして得られたプラスミドをpCR-ADHBP40-SpeSacとした。
　pCR-ADHBP40-SpeSacをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるADHNF-パンジーF3'5'H #40 DNA断片を、pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATtをSalIで消化した後、Blunting High（TOYOBO）を用いて平滑末端化し、さらにXbaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片に、連結することにより、pBI121-シソ3ATpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::シソ3ATterを得、これを、Agrobacterium tumefaciens EHA105株に形質転換した。
　この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種大平由来の組換えキク7系統を得た。このうち5系統でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は17.7%に達した。
　また、pBI121-シソ3ATpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::シソ3ATterから得たシソ3ATpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::シソ3ATterの発現カセットをpWTT2132（WO96/36716）に導入することによりpSPB3718を構築し、Agrobacterium tumefaciens Agl0株に形質転換した。これを用いてキク品種Improved Regan（精興園）を形質転換した。25系統の形質転換キクを取得し、そのうち７系統で花色変化が見られた。デルフィニジン含有率は最高20％であった。
実施例８
　pＳＦＬ535（WO2008/156206に記載）をPacIで部分消化し、パンジーF3'5’H遺伝子を含む発現カセットを除去したDNA断片を回収した。このDNA断片と、実施例４に記載のpSFL620をPacIで消化して得られる約3.2ｋｂのDNA断片とを連結し、図７に示す構造をもつプラスミドpSFL635を得た。このプラスミドのT-DNAが植物に導入されると、トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子とトレニア由来のアントシアニンメチル基転移酵素が構成的に発現し、パンジーF3'5’H遺伝子が花弁特異的に発現されることが期待される。このプラスミドをWO2008/156206に記載に方法を用いてアグロバクテリウムに導入し、バラ品種WKS124に導入し、83系統の形質転換体を得た。これらの花弁にはWKS124には見られないマルビジン、ペチュニジン、デルフィニジンが含まれていた。総アントシアニジンのうちこれらの合計は平均73%、最高85％であった。この結果は本実験で得たパンジーBP40由来のプロモーター領域（pSFL514に含まれる約2.1kbの5'非翻訳領域（ＢＰ４０ｐｒｏ、配列番号１５、実施例４参照）は、外来遺伝子を植物、特にバラで発現させるのに適していることを示す。
　アカジソの葉で酵素遺伝子の転写を司っていると考えられるプロモーター領域、すなわち、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域が異種であるキクの花弁で転写調節領域として機能しうることが分かった。したがって、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を利用して、花などのアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色、香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。
　また、パンジー由来のF3’5’H遺伝子の転写調節領域が、キク植物又はキク以外の植物の花の色を変えるために有用であることも分かった。

Claims (19)

  1. 　以下の：
    　（１）配列番号１に示す塩基配列を含む核酸、
    　（２）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
    　（３）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
    　（４）シソアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
    から成る群から選ばれる核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、遺伝子組換え技術によりキク植物において核酸を転写させる方法。
  2. 　前記核酸を転写させる方法が、フラボノイド合成系に関わる核酸を転写させることによるフラボノイド合成系の制御方法である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記核酸を転写させる方法が、アントシアニン修飾に関わる核酸を転写させることによるアントシアニンの修飾方法である、請求項１に記載の方法。
  4. 　請求項１に定義する核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、シソアントシアニン３－アシル基転移酵素をキク植物において発現させて、芳香族アシル化アントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法。
  5. 　前記発現ベクター又は発現カセットが配列番号２に示す塩基配列を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　請求項１に定義する核酸が導入されているか又は請求項１～５のいずれか１項に記載の方法により生産された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  7. 　芳香族アシル化アントシアニンを含む、請求項６に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  8. 　デルフィニジンを含む、請求項６に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  9. 　切り花である、請求項６に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  10. 　請求項９に記載の切り花を用いた切り花加工品。
  11. 　以下の：
    　（１）配列番号１５に示す塩基配列を含む核酸、
    　（２）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
    　（３）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
    　（４）パンジーF3'5'H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１５に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
    から成る群から選ばれる核酸。
  12. 　請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター又は発現カセットを用いて、キク植物又はキク以外の植物において核酸を発現させる方法。
  13. 　前記核酸を発現させる方法が、フラボノイド合成系に関わる核酸を発現させることによるフラボノイド合成系の制御方法である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記核酸を発現させる方法が、アントシアニン修飾に関わる核酸を発現させることによるアントシアニンの修飾方法である、請求項１２に記載の方法。
  15. 　請求項１１に定義する核酸が導入されているか又は請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により生産された、キク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  16. 　芳香族アシル化アントシアニンを含む、請求項１５に記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  17. 　デルフィニジンを含む、請求項１５に記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体若しくは又はその部分若しくは組織。
  18. 　切り花である、請求項１５に記載のキク植物又はキク以外の植物又はその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
  19. 　請求項１８に記載の切り花を用いた切り花加工品。
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