CN102421904A

CN102421904A - 生产花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法

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Publication number: CN102421904A
Application number: CN2010800182813A
Authority: CN
Inventors: 野田尚信; 间竜太郎; 佐藤早苗; 大宫明美; 田中良和
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2030-03-09
Also published as: US8871998B2; CO6460697A2; EP2423313A9; EP2602324B1; CA2759261A1; KR101318414B1; JP5697041B2; CN102421904B; WO2010122850A1; EP2602324A1; EP2423313A1; US20120073017A1; EP2423313A4; KR20120008509A; JPWO2010122850A1

Abstract

本发明提供使用用于改变花色的有用的转录调控区域并通过基因重组技术在菊花植物或除菊花以外的植物中控制类黄酮合成系统的方法、修饰花色素苷的方法、生产在花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物或除菊花以外的植物的方法、及导入了该调控区域的菊花植物或除菊花以外的植物、或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织。本发明所涉及的方法中，使用紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域，例如含有序列号1所示的碱基序列的核酸，或使用三色堇F3’5’H基因的转录调控区域，例如包含含有序列号15所示碱基序列的核酸的表达载体或表达盒。

Description

生产花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法

技术领域

本发明涉及使用来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因而在菊花植物中控制类黄酮生物合成系统的方法、修饰花色素苷的方法、及导入该基因的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。

本发明还涉及来自三色堇的类黄酮3′，5′-羟化酶(以下也称为F3′5′H)基因#40(以下也称为BP40。)的转录调控区域及其使用。

背景技术

通过利用基因重组技术，使有用的基因在目的植物中表达，可将新的性状赋予该植物。如此制作的基因重组植物已被大范围栽培。基因表达的调控主要在转录阶段进行控制，所以转录调控在调控基因表达上最为重要。即为制作产业上有用的基因重组植物，在适当时期、用适当组织、以适当强度转录非常重要。转录在很多情况下通过位于转录区域的5’侧的DNA序列来控制。将确定基因转录的起始位点、直接调控其频率的DNA上的区域称为启动子。启动子有时存在于起始密码子的5’侧数十bp处，多含有TATA盒等的序列。其还在5’侧具有结合各种转录调控因子的顺式作用元件，这些顺式作用元件的存在控制着转录的时期、进行转录的组织、转录的强度。转录调控因子根据氨基酸序列的不同分为很多家族。例如，Myb型转录调控因子、bHLH(碱性/螺旋-环-螺旋(basichelix loop helix))型转录调控因子等是有名的家族。实际上，很多情况下，转录控制区域与启动子在同样意义上使用。

作为花的颜色的主要成分的花色素苷为总称为类黄酮的次级代谢产物之一。花色素苷的颜色依赖于其结构。即作为花色素苷的发色团的花色素B环的羟基数增加时颜色变蓝。且还已知修饰花色素苷的芳香族酰基(香豆酰基、咖啡酰基等)的数量增加时，花色素苷的颜色变蓝(即最大吸收波长向长波长移动)，花色素苷的稳定性增加(以下参照非专利文献1)。

与花色素苷的生物合成有关的酶及编码该酶的基因被广泛研究(参照相同非专利文献1)。例如，催化向花色素苷转移芳香族酰基的反应的酶基因可从龙胆、薰衣草、矮牵牛等中获得(以下参照专利文献1、专利文献2)。与红紫苏叶中积累的花色素苷(丙二酰基紫苏宁、3-O-(6-O-(E)-p-香豆酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-(6-O-丙二酰基-β-D-glucopyranosyl)-花青素(3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin))(以下参照非专利文献2)的合成有关的酶基因以羟基肉桂酰辅酶A：花色素苷3葡萄糖苷-芳香族酰基转移酶(3AT)的基因{以下简称“紫苏花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因”。}为代表已有报道(参照相同专利文献1)。而且也获得了关于花色素苷的生物合成酶基因转录控制(调控)的知识和见解。这些基因的位于起始密码子5’侧的转录调控区域中，具有Myb型转录调控因子、bHLH型转录调控因子结合的顺式作用元件序列。还已知Myb型转录调控因子和bHLH型转录调控因子控制矮牵牛、玉米、紫苏等的花色素苷的合成(参照相同非专利文献1)。

在植物中负责基因转录的启动子(以下称转录调控区域)中，有无论在何种组织或发育阶段的何种时期均发挥功能的所谓组成型启动子、和仅在特定器官·组织中发挥功能的器官·组织特异性启动子、及仅在发育阶段的特定时期表达的时期特异性启动子。作为用于使有用基因在基因重组植物中表达的启动子，常用的是组成型启动子。作为代表性的组成型启动子，有花椰菜花叶病毒35S(以下也称为CaMV35S)启动子、以此为基础构建的启动子(以下参照非专利文献3)、Mac1启动子(以下参照非专利文献4)等。但是，在植物中，很多基因均为组织·器官特异性或时期特异性表达。这说明使基因进行组织·器官特异性或时期特异性表达对植物来说是必需的。有利用此种组织·器官特异性或时期特异性的转录调控区域进行植物的基因重组的例子。例如，有使用种子特异性的转录调控区域使蛋白质在种中积累的例子。

但是，植物虽可开出多种颜色的花，但由于种所具有的遗传性限制，所以能开出所有颜色的花的种很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能开蓝色、紫色花的品种。原因是月季、康乃馨不具有用于合成许多开蓝色、紫色花的种所合成的称为花翠素的花色素时所必需的F3’5’H基因。通过在这些种中导入作为开蓝色、紫色花的种的矮牵牛、三色堇等的F3’5’H基因，可使这些种的花色变蓝。为康乃馨的情况下，为使来自不同种的F3’5’H基因转录，使用来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域。例如，作为包含来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域的质粒，可例举以下专利文献3中记载的质粒pCGP485、pCGP653，作为包含组成型转录调控区域的质粒，可例举质粒pCGP628(包含Mac1启动子)、以下专利文献4中记载的质粒pSPB130(包含附加有增强子的CaMV35S启动子)。

但是，很难预测这样的启动子在重组植物中可在何种程度上发挥作用，是否可带来目的表达型。且为使复数的外源基因表达而反复使用相同启动子有时会引起基因的沉默，所以应考虑避免(以下参照非专利文献5)。

因此，虽然一些启动子被用于改变花的颜色，但还进一步需要与目的宿主植物的目的相符合的有用的启动子。

特别是菊花植物(也简称“菊花”。)约占日本全国批发价格(农林水产省统计的平成19年花卉批发市场调查结果概要)中的30％，与月季约占9％、康乃馨约占7％相比，可见其重要性。菊花中虽有白色·黄色·橙色·红色·粉色·紫红色等的花色，但还没有紫色、蓝色等蓝色系的花色。因此，蓝色系的育种成为用于唤起新需求的目标之一。菊花的花色通过花色素苷和类胡萝卜素的组合来体现。花色素苷由于作为基本骨架的花色素的结构不同、通过糖、有机酸而进行的修饰的不同等，可出现多种颜色。但是，已知负责菊花花色的花色素苷仅有花青素的3位被葡萄糖和丙二酸修饰的两种即cyanidin 3-O-(6″-O-monomalonyl-β-glucopyranoside和cyanidin 3-O-(3″，6″-O-dimalonyl-β-glucopyranoside(以下参照非专利文献6)。且其结构比较单纯(参照图1)。由于上述原因，菊花的花色素苷成为使显色范围极小的主要原因。

如上所述，菊花在日本是最重要的花卉，但因具有六倍体这样的多倍性，且基因组尺寸大，所以不仅转化效率低，还会引起导入基因的沉默(钝化)，因而不易得到稳定表达导入基因的基因重组菊花。有如下报道，导入连接在CaMV35S启动子上的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的菊花与导入相同基因的烟草相比，GUS基因的活性为10分之1左右，且在转化后经过12个月以后，在几乎所有的个体中其活性均降低(以下参照非专利文献7)。有报道指出，已经得到了用于使外源基因在菊花中稳定表达的编码在菊花中发挥良好功能的叶绿素a/b结合蛋白质的基因的启动子，但该启动子不适合使基因在基本不存在叶绿素的花瓣中表达(以下参照非专利文献8)。还有如下报道，将连接在烟草的延伸因子(elongation factor)1(EF1α)启动子上的GUS基因导入菊花时，即使经过20个月以上GUS基因还会在叶、花瓣中表达(以下参照非专利文献9)。而且，有使突变型乙烯受体基因在菊花中表达从而延长花的寿命的例子(以下参照非专利文献10)，有抑制菊花的AGAMOUS基因表达而使花形改变的例子(以下参照非专利文献11)，有使用烟草的乙醇脱氢酶基因的5′-非翻译区域(以下也称为烟草ADH-5′UTR)而提高外源基因在菊花中表达的例子(以下参照非专利文献12)。

另一方面，作为通过基因重组改变菊花花色的成功例，有通过共抑制法抑制查耳酮合成酶(CHS)的基因而使粉色变为白色的报道(以下参照非专利文献13)，和通过RNAi法抑制类胡萝卜素分解酶(CCD4a)的基因而使白色变为黄色的报道(以下参照非专利文献14)，但其均为通过内源性基因的表达抑制来改变花色，还没有通过外源基因的过表达而改变花色的成功例，也没有实现花色素苷的结构及由其结构而形成的花色变化。

通过外源基因过表达而改变花色的尝试，有导入编码用于合成花翠素所需要的酶即F3’5’H的基因的报道(以下参照专利文献5、非专利文献15)，但还没有因导入的F3’5’H基因的作用而产生的花翠素在舌状花瓣中积累，从而培育出蓝色系菊花的报道。在菊花中，即使用CaMV35S启动子使F3’5’H表达，也未发现花翠素的产生(参照非专利文献15)。且利用CaMV35S启动子进行表达的基因的表达会随菊花转化体的生长发育而消失等，因而不适合稳定的表达(参照非专利文献7)。作为可使外源基因在菊花的舌状花瓣中高效且稳定地表达的启动子，已开发出马铃薯Lhca3.St.1启动子(以下参照非专利文献16)、菊花UEP1启动子(以下参照非专利文献17)、烟草EF1α启动子(以下参照专利文献6、非专利文献9)等。但是，还没有因使用了这些启动子的外源基因的过表达而改变菊花花色的报道。由上所述，为了通过基因重组而培育出改变了花色的菊花，需要确立包括开发适用于菊花的启动子在内的类黄酮生物合成系统基因的表达控制技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1 WO 96/25500公报

专利文献2 WO 01/72984公报

专利文献3 WO 94/28140公报

专利文献4 WO 05/17147公报

专利文献5美国专利第5948955号

专利文献6日本特开2004-65096号公报

非专利文献

非专利文献1 Plant J.54，737-749，2008

非专利文献2 Agricultural and Biological Chemistry，53，797-800，1989

非专利文献3 Plant Cell Physiology 1996，37，49-59

非专利文献4 Plant Molecular Biology 1990，15，373-381

非专利文献5 Annals of Botany 1997，79，3-12

非专利文献6 Journal of Horticultural Science & Biotechnology，81，728-734，2006

非专利文献7 Plant Biotechnology，17，241-245，2000

非专利文献8 Breeding Science，54，51-58，2004

非专利文献9 Japan Agricultural Research Quarterly，39：269-274，2005

非专利文献10 Postharvest Biology and Technology，37，101-110，2005

非专利文献11 Plant Biotechnology，25：55-59，2008

非专利文献12 Plant Biotechnology，25：69-75，2008

非专利文献13 Bio/Technology 12：268，1994

非专利文献14 Plant Physiology 142：1193，2006

非专利文献15 J.Plant Biol.，50：626，2007

非专利文献16 Mol Breed 8：335，2001

非专利文献17 Transgenic Res 11：437，2002

发明内容

本发明欲解决的课题如下，提供使用作为用于改变菊花植物花色的有用的启动子的来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因的转录调控区域，从而在菊花植物中控制类黄酮生物合成系统的方法、修饰花色素苷的方法、生产在花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法及导入了该调控区域的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。

本发明还涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作为切花加工品，包括使用该切花的押花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但不限于这些。

本发明欲解决的课题为提供用于改变菊花植物及除菊花以外的植物花色的有用的启动子。

本申请发明人为解决上述课题锐意研究，反复实验，结果发现来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因的转录调控区域可改变菊花花瓣中花色素苷的结构，其结果，发现用于改变菊花植物花色的有用的启动子，并通过实验确认其有用性，完成了本申请发明。

本发明人还发现来自三色堇的F3’5’H基因的转录调控区域在用于改变菊花植物或菊花植物以外的植物花色上有用，从而完成了本申请发明。

即本发明如下：

[1]一种方法，其特征在于，其为使用包含选自以下(1)～(4)中的核酸的表达载体或表达盒，通过基因重组技术在菊花植物中转录核酸的方法：

(1)核酸，其含有序列号1所示的碱基序列，

(2)核酸，其可作为紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域而发挥功能，且含有通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号1所示的碱基序列进行修饰后的碱基序列，

(3)核酸，其可作为紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与由序列号1中所示的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在高严谨条件下杂交的核酸，及

(4)核酸，其可作为紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域而发挥功能，且为与序列号1中所示的碱基序列有至少90％序列同一性的核酸。

[2]根据所述[1]中所述的方法，其特征在于，所述转录核酸的方法为通过转录与类黄酮合成系统有关的核酸从而控制类黄酮合成系统的方法。

[3]根据所述[1]中所述的方法，其特征在于，所述转录核酸的方法为通过转录与花色素苷修饰有关的核酸从而修饰花色素苷的方法。

[4]一种方法，其特征在于，使用包含所述[1]中定义的核酸的表达载体或表达盒，使紫苏花色素苷3-酰基转移酶在菊花植物中表达，从而生产在花瓣中含有芳香族酰基化花色素苷的菊花植物。

[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的方法，其特征在于，所述表达载体或表达盒包含序列号2所示的碱基序列。

[6]一种菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，导入了所述[1]中定义的核酸或通过所述[1]～[5]中任一项所述的方法生产。

[7]根据所述[6]中所述的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，含有芳香族酰基化花色素苷。

[8]根据所述[6]或[7]中所述的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或或其部分或组织，其特征在于，含有花翠素。

[9]根据所述[6]～[8]中任一项所述的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，其为切花。

[10]一种切花加工品，其特征在于，使用所述[9]中所述的切花。

[11]一种核酸，其特征在于，选自以下(1)～(4)：

(1)核酸，其含有序列号15所示的碱基序列，

(2)核酸，其可作为三色堇F3’5’H基因的转录调控区域而发挥功能，且含有通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号15所示的碱基序列进行修饰后的碱基序列，

(3)核酸，其可作为三色堇F3’5’H基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与由序列号15中所示的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在高严谨条件下杂交的核酸，及

(4)核酸，其可作为三色堇F3’5’H基因的转录调控区域而发挥功能，且为与序列号15中所示的碱基序列有至少90％序列同一性的核酸。

[12]一种方法，其特征在于，使用包含所述[11]中所述的核酸的表达载体或表达盒，在菊花植物或除菊花以外的植物中使核酸表达。

[13]根据所述[12]中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表达的方法为通过使与类黄酮合成系统有关的核酸表达从而控制类黄酮合成系统的方法。

[14]根据所述[12]中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表达的方法为通过使与花色素苷修饰有关的核酸表达从而修饰花色素苷的方法。

[15]一种菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，导入了所述[11]中定义的核酸或通过所述[12]～[14]中任一项所述的方法生产。

[16]根据所述[15]中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，含有芳香族酰基化花色素苷。

[17]根据所述[15]或[16]中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或或其部分或组织，其特征在于，含有花翠素。

[18]根据所述[15]～[17]中任一项所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，其为切花。

[19]一种切花加工品，其特征在于，使用了所述[18]中所述的切花。

已知认为在红紫苏叶中控制酶基因转录的启动子区域、即紫苏花色素苷3-酰基转移酶的转录调控区域可在作为不同种的菊花花瓣中作为转录调控区域而发挥功能。因此，利用紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域，可在花等花色素苷积累的组织内特异性地启动外源基因的转录。作为进行转录的外源基因，有与花色、香味有关的基因，但不限于这些。

附图说明

图1表示菊花的类黄酮生物合成途径的示意图、以及花青素3-O-(6″-O-monomalonyl-β-glucopyranoside和花青素3-O-(3″，6″-O-dimalonyl-β-glucopyranoside的结构。

图2表示经过转化的菊花的类黄酮生物合成产物的例子。

图3表示紫苏3AT基因导入用双元载体pSPB3311及pSPB3323的示意图。

图4表示花色素苷的组成发生变化的转化菊花的HPLC色谱。含有34％芳香族酰基化花色素苷的转化体1275-17。使用质粒pSPB3311(参照图3)。1：花青素3-malonylglucoside、2：花青素3-dimalonylglucoside、3：花青素3-芳香族酰基葡萄糖苷。

图5表示从菊花转化体的花瓣中检测出的吸收光谱。3个吸收光谱中，可观察到用芳香族有机酸修饰的花色素苷中存在的326nm附近的最大吸收，进而对于经过丙二酰化的吸收光谱(1、2)来说，花色素苷的最大吸收波长(从518nm到522nm的约5nm左右)向长波长方向移动。

图6表示花色素苷的组成发生变化的转化菊花的HPLC色谱。含有50％芳香族酰基化花色素苷、0.8％花翠素糖苷的转化体1300-4。使用质粒pSPB3323(参照图3)。1：花青素3-malonylglucoside、2：花青素3-dimalonylglucoside、3：花青素3-芳香族酰基葡萄糖苷、4：花翠素3-malonylglucoside。

图7表示质粒pSFL635的示意图。

具体实施方式

本发明涉及如下内容，包括使用以下载体转化菊花植物的在菊花植物中转录核酸的方法、通过转录与类黄酮合成系统有关的核酸从而控制类黄酮合成系统方法、通过转录与花色素苷修饰有关的核酸从而修饰花色素苷的方法、通过所涉及的方法培育出的改变了花瓣花色素苷组成的菊花植物及/或改变了花色的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。其中，上述载体为含有通过编码紫苏的羟基肉桂酰辅酶A：花色素苷3-葡萄糖苷酰基转移酶(Pf3AT)的基因的5′区域(Pf3ATpro)(本说明书中，也称为“紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域”。)，而使3AT、F3′5′H等的类黄酮生物合成系统基因表达的基因盒的载体(参照图3)。

本发明涉及如下内容，包括使用以下载体转化菊花植物及除菊花以外的植物的在菊花植物及除菊花以外的植物中转录核酸的方法、通过转录与类黄酮合成系统有关的核酸从而控制类黄酮合成系统方法、通过转录与花色素苷修饰有关的核酸从而修饰花色素苷的方法、通过所涉及的方法培育出的改变了花瓣花色素苷组成的植物及/或改变了花色的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。其中，上述载体为含有通过三色堇的F3’5’H基因的5’区域(本说明书中，也称为“三色堇F3’5’H基因的转录调控区域”。)，而使F3′5′H等的类黄酮生物合成系统基因表达的基因盒的载体(参照图3)。

本说明书中，“控制类黄酮合成系统的方法”是指通过控制编码与类黄酮合成系统有关的蛋白质的基因、例如3AT基因、F3’5’H基因的表达，从而控制类黄酮合成系统的方法。作为上述花色素苷3-酰基转移酶基因，例如有来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶基因。且作为F3’5’H基因，例如有来自三色堇的F3’5’H基因。

根据本发明，通过使3AT等酰基转移酶发挥功能并使芳香族酰基向花色素苷转移，可使花色素苷的最大吸收波长向长波长方向移动，并可使已有的花色带有蓝色(参照图4、图5、图6)。

此外，通过使用Pf3AT启动子及Pf3AT终止子而使紫苏的3AT基因表达，可使菊花花色素苷的34％～50％发生芳香族酰基化(参照图4、图6)，通过将该启动子用于各种基因的表达，可使外源基因在菊花的舌状花瓣中高效且稳定地发挥功能。此外，通过使F3′5′H基因和3AT基因同时表达，可将作为蓝色花色素苷基本骨架的花翠素的糖苷用芳香族酰基进行修饰(参照图6)，并可培育出蓝色的菊花。

作为本发明中所涉及的转录控制区域，例如可例举由序列号1或序列号15中所示的碱基序列组成的核酸。但是，认为在由序列号1或序列号15中所示的碱基序列组成的核酸中，由数个(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基发生附加、缺失及/或取代而进行修饰的碱基序列所组成的启动子也维持与原有启动子同样的活性。因此，本发明所涉及的转录调控区域只要在菊花花瓣或其他植物中作为转录调控区域发挥功能，也可为由通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号1或序列号15中所示的碱基序列进行修饰的碱基序列组成的核酸。

本发明中所涉及的转录控制区域还进一步可作为紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与序列号1所示的碱基序列在高严谨条件下杂交的核酸，或可作为紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域而发挥功能，且也可为与序列号1中所示的碱基序列有至少90％序列同一性的核酸。

本发明中所涉及的转录控制区域可作为三色堇F3’5’H基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与序列号15所示的碱基序列在高严谨条件下杂交的核酸，或可作为三色堇F3’5’H基因的转录调控区域而发挥功能，且也可为与序列号15中所示的碱基序列有至少90％序列同一性的核酸。

作为这些核酸，可例举为可与含有序列号1或序列号15中所示的碱基序列的多核苷酸在严谨条件下杂交，由与序列号1或序列号15中所示的碱基序列优选有约70％以上、更优选有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最优选有约99％的碱基序列同一性的碱基序列所组成的核酸。

在此，严谨条件是指由本领域技术人员很容易确定的杂交条件，通常依赖探针长度、洗涤温度及盐浓度并可凭经验实现。通常，探针越长，用于适合退火的温度越高，探针越短退火温度越低。杂交通常依赖于互补链存在于接近但低于其熔点的环境中时变性DNA的再退火能力。

具体地说，例如作为低严谨条件，可例举在杂交后的筛选的洗涤阶段中，在37℃～42℃的温度条件下，在5×SSC及0.1％SDS溶液中洗涤等。此外，作为高严谨条件，例如可例举在洗涤阶段，在65℃、0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤等。通过将严谨条件提高到更高，可得到同源性或同一性高的多核苷酸。

本发明所涉及的转录调控区域包含在表达载体或表达盒中，这些表达载体或表达盒例如包含序列号2或WO 04/020637中记载的三色堇F3’5’H基因所示的碱基序列。

本发明涉及导入了上述转录调控区域(核酸)的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其部分或组织，及作为使用本发明所涉及的方法的结果而培育出的芳香族酰基化花色素苷、及/或含有花翠素的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。

本说明书中，用语“菊花植物(也简称为“菊花”)”指菊科(Asteraceae)菊属(Chrysanthemum)的植物，例如可例举栽培菊花(Dendranthema grandiflorum Kitam)、西洋菊、大菊、中菊、小菊等，作为代表种可例举菊花(Chrysanthemum morifolium)。除菊花以外的植物虽无特别限制，但优选为月季。

实施例

以下，通过实施例，具体说明本发明。

在无特殊要求的情况下，分子生物学的方法按照Molecular Cloning(Sambrook and Russell，2001)进行。

实施例1：紫苏花色素苷3-酰基转移酶染色体基因的克隆

已知紫苏中有叶中积累花色素苷的红色变种和不积累花色素苷的绿色变种。从前者的叶中，将其染色体DNA用所报道的方法(参照Plant Mol Biol.December 1997；35(6)：915-27)进行制备。将该染色体DNA用Sau3AI(TOYOBO公司制)进行部分酶切，通过蔗糖密度梯度法回收含有10～15kb的DNA片段的组分。通过将该片段使用公知的方法插入作为λ噬菌体载体的一种的EMBL3(Promega公司制)的BamHI位点，制作染色体DNA文库。将所得到的文库以来自紫苏的作为花色素苷3-酰基转移酶的cDNA的pSAT208(参照Plant Cell Physiol.April 2000；41(4)：495-502)为探针使用来进行筛选。文库的筛选根据已报道的方法(参照Plant Cell Physiol.July 1996；37(5)：711-6)进行。将探针和杂交了的噬菌斑纯化后进行培养，从所得到的噬菌体中制备DNA。

实施例2：紫苏花色素苷3-酰基转移酶染色体基因的碱基序列确定

用XbaI酶切上述得到的DNA10μg，用0.7％琼脂糖凝胶分离后，在High Bond N(Amersham公司制)上转膜。将该膜用如上所述相同的方法杂交时，可知有约6.8kb的DNA片段与探针杂交。用XbaI酶切该DNA 20μg，用0.7％琼脂糖凝胶分离后，将约6.8kb的DNA片段用Gene Clean(funakoshi株式会社)进行精制，与用XbaI酶切的pBluescriptSKII-连接。将所得到的质粒作为pSPB513。将该质粒中所含有的来自紫苏的DNA序列通过引物步查法确定。其碱基序列如序列号4中所示。该序列中有与作为花色素苷3-酰基转移酶cDNA的pSAT208显示高同源性的区域，该区域编码的蛋白质的氨基酸序列(序列号6)与pSAT208的编码氨基酸序列相比，发现有19个氨基酸残基的取代和2个氨基酸的缺失，未观察到内含子。另外，包含与上述pSAT208显示高同源性的区域的序列，包含在认为是其起始密码子ATG上游的3438bp的序列和在认为是其终止密码子TAA下游的2052bp的序列。在上述3438bp的序列中，存在不是花色素苷3-酰基转移酶的其他开放阅读框(ORF，序列号5)。除了该部分以外，为扩增紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域进行如下实验。

实施例3：紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域的扩增

以1ng的pSPB513为模板，使用2种引物(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’(序列号7，下线部为HindIII的识别序列)、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’(序列号8，下线部为BamHI的识别序列)进行PCR(95℃保持1分钟后，25个循环的52℃1分钟、72℃2分钟、95℃1分钟的反应)。用HindIII和BamHI酶切所扩增的约1.1kb的DNA片段。

用PacI酶切专利文献4中所记载的质粒pSPB567(在附加有增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子的3’侧连接来自三色堇的F3’5’H基因，进而在其3’侧连接胭脂碱合成酶的终止子)，将包含来自三色堇的F3’5’H基因的DNA片段克隆到pBin+(参照Transgenic Research 4，288-290，1995)的PacI位点。将在所得到的质粒中附加有增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子在pBin+的AscI位点附近存在时的质粒作为pSPB575。用HindIII和BamHI酶切该质粒，向其中插入用HindIII和BamHI酶切包含所述紫苏花色素苷3-酰基转移酶转录调控区域的约1.1kb DNA片段后的DNA片段。将所得到的质粒作为pSFL205。

用HindIII和SacI酶切pSFL205，回收约100bp的DNA片段。将该DNA片段、与用SacI和XbaI酶切pSPB513而得到的约4kb的DNA片段、和用HindIII和XbaI酶切的质粒pBin+连接，得到质粒pSPB3311。该质粒pSPB3311成为包含序列号2中所示的碱基序列的双元载体，包含紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域和该基因的翻译区域及其3’侧的非翻译区域。

实施例4：pSPB3323的构建

将三色堇的F3’5’H基因BP#40(参照WO 04/020637)的转录调控区域使用TaKaRa LA PCR^TM in vitro Cloning Kit，如下进行扩增。

从三色堇的叶中使用DNA easy plant kit(QIAGEN公司)制备染色体DNA。用限制酶HindIII酶切3μg的染色体DNA。将酶切的DNA使用HindIII末端DNA(在TaKaRa LA PCR^TM in vitro Cloning Kit中含有)和Ligation High(TOYOBO)，16℃下反应40分钟，进行连接。将反应液4μl用10μl的水稀释，将连接后的DNA在94℃下处理10分钟变性后，在冰中冷却。加入5pmol的引物C1(5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’，序列号9，为HindIII盒序列的一部分序列，包含在Kit中)和5pmol的引物BP40-i5(5’-AGGTGCATGATCGGACCATACTTC-3’，序列号10，相当于BP#40翻译区域的互补链)，根据试剂盒中的实验方法，在25μl的反应液中重复进行30次98℃20秒、68℃15分钟的反应。将反应液用水稀释到10倍。其中，以0.5μl为模板，在包含5pmol的引物C2(5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’，序列号11，为HindIII盒序列的一部的序列，包含在Kit中)和5pmol的引物BP40-i7(5’-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3’，序列号12)的25μl的反应液中进行98℃5分钟的反应后，重复进行30次98℃20秒、68℃15分钟的反应。

将所得到的DNA片段导入质粒pCR2.1(Invitrogen公司)中。在确定所插入的DNA的碱基序列时，发现有其序列与BP#40的cDNA碱基序列不一致之处。认为这是因为在进行PCR时会引起错误。为扩增没有错误的序列，进行以下操作。

为扩增约2kb的BP#40的5’-非翻译区域和200bp的翻译区域，以200ng的三色堇的染色体DNA为模板，使用50pmol的引物BP40-i7(序列号12)和50pmol的引物BP40 pro-F(5’-ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3’，序列号13，BP#40基因的5’-非翻译区域中的序列)，在25μl的反应液中进行PCR。在98℃处理5分钟后，重复进行30次包括98℃20秒和68℃15分钟的反应。将所扩增的DNA片段插入到pCR2.1中。在该DNA片段中含有约2.1kb的5’-非翻译区域和200bp的翻译区域。将该质粒作为pSFL614。质粒pSFL614序列的碱基序列如序列号14中所示。

为了转录BP#40基因，使用pSFL614中所含有的约2.1kb的5’-非翻译区域(BP40pro，序列号15)。此时，将BamHI位点变更为NheI。以1ng的pSFL614质粒为模板，加入50pmol的引物BP40pro-HindIII-F(5’-AAG CTT GTG ATCGAC ATC TCT CTC C-3’，序列号16)和50pmol的引物BP40pro-NheI-R(5’-CGA GGC TAG CTA AAC ACT TAT-3’，序列号17)、Ex-TaqDNA聚合酶，在25μl的反应液中98℃下保持5分钟后，重复进行25次98℃20秒、68℃15分钟的反应。将扩增的DNA片段克隆到pCR2.1上。通过确认碱基序列，确定该序列中没有因PCR引起的错误。将该质粒用HindIII和NheI酶切，得到470bp的DNA片段。将该DNA片段作为片段A。

以1ng的pSFL614质粒为模板，加入50pmol的引物BP40pro-NheI-F(5’-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3’，序列号18)和50pmol的引物BP40pro-BamHI-R(5’-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3’，序列号19)、Ex-TaqDNA聚合酶，在25μl的反应液中98℃保持5分钟后，重复进行25次98℃20秒、68℃15分钟的反应。将扩增DNA片段克隆到pCR2.1上。通过确认碱基序列，确定该序列上没有因PCR引起的错误。用HindIII和NheI酶切该质粒，得到630bp的DNA片段。将该DNA片段作为片段B。

回收用BamHI和HindIII酶切专利文献4中所记载的质粒pSPB567后产生的DNA片段中大的片段，连接上述的片段A和片段B，作为pSFL620。

用PacI酶切pSFL620后，回收约3.2kb的DNA片段。将该DNA片段插入pBin+的PacI位点。将所得到的质粒作为pSPB3317。将用AscI和XbaI酶切上述pSPB3311而得到的片段导入pSPB3317的AscI和XbaI位点，将所得到的质粒作为pSPB3323。

实施例5：紫苏花色素苷3-酰基转移酶染色体基因在菊花中的表达

将实施例3中制备的pSPB3311导入土壤杆菌中，使用该土壤杆菌将菊花品种94-765(精兴园，未发售)通过公知的方法转化。菊花的转化例如非专利文献8中所记载，但转化方法不限于此。获得6个系统的转化系统。将该舌状花瓣冷冻后粉碎，将粉碎后的花瓣50～100mg用500μl的50％乙酸水溶液提取，用0.45μm的过滤器过滤。将该提取液中所含有的花色素苷用蒸馏水稀释到5倍后作为分析样品，使用高效液相色谱法用以下条件分析。色谱柱使用InertsilODS-2(粒径5μm，4.6×250mm，GL Sciences)，流速为0.8ml/min，流动相用从含有1.5％磷酸的4％乙酸、5％乙腈到20％乙酸、25％乙腈的直线浓度梯度洗脱40分钟后，用含有1.5％磷酸及20％乙酸的25％乙腈进行10分钟的等度洗脱。检测使用Agilent 1100系列二极管阵列检测器(GL Sciences)，检测出从250nm到600nm的波长区域，由530nm吸光度的面积求出各花色素苷的存在比。

在作为转化体的分析系统1275-13、1275-14、1275-15、及1275-17中的花色素苷中，分别有23％、1％、17％及34％的花色素苷的保留时间为20分钟以上，表明这些花色素苷已被芳香族酰基修饰。保留时间为20分钟以上时被洗脱出的花色素苷的最大吸收波长向长波长方向移动，通过上述转化，可使已有的花色中带有蓝色。另一方面，原有菊花品种94-765的花瓣中的花色素苷中，不存在保留时间为20分钟以上的花色素苷。

通过LC-FT-ICR-MS的方法(J.Japan.Soc.Hort.Sci.77：94-102(2008)，Plant J.54：949-962)分析重组菊花1275-17的花色素苷。使用该方法时，可测定花色素苷的精密质谱，可通过串联质谱分析得到MS/MS谱。在菊花1275-17中，检测出了在宿主中检测不到的相当于花青素(香豆酰)葡萄糖苷的化合物(检测m/z：595.146259)，检测出了MSMS碎片相当于花青素的(仅为m/z 287.1)的峰。

以上结果说明了作为不同种的紫苏的3AT转录调控区域在菊花植物中发挥了功能，紫苏的3AT也在菊花中发挥了功能，并使花色素苷的结构和花的颜色发生了变化。且通过本发明，可知通过使3AT等的酰基转移酶发挥功能并使芳香族酰基转移到花色素苷中，可使花色素苷的最大吸收波长向长波长移动(参照图4、图5、图6)。

实施例6：紫苏花色素苷3-酰基转移酶染色体基因和三色堇F3’5’H基因在菊花中的表达

将实施例4中制备的pSPB3323导入土壤杆菌中，使用该土壤杆菌将菊花品种94-765(精兴园，未发售)通过公知的方法转化。获得6个系统的转化系统。将该花瓣中所含有的花色素苷用实施例5中所述的方法并使用高效液相色谱仪进行分析。

在各个作为转化体的分析系统1300-2、1300-3、及1300-4中，有20％、2％及50％的花色素苷的保留时间为20分钟以上，表明这些花色素苷已被芳香族酰基修饰。宿主的花色素苷中不存在保留时间为20分钟以上的花色素苷。以上结果说明了作为不同种的紫苏的3AT转录调控区域在菊花植物中发挥了功能，紫苏的3AT也在菊花中发挥了功能，并使花色素苷的结构和花的颜色发生了变化。因此，通过将紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域用于各种基因的表达，可使外源基因在菊花的舌状花瓣中高效且稳定地发挥功能。

此外，将用以下方法提取的花色素进行分析。将舌状花瓣冷冻后粉碎，将粉碎后的花瓣50～100mg用500μl的1％盐酸甲醇提取，在该提取液中加入500μl的4N盐酸(HCl)并混合，100℃下进行1小时水解。将水解后的溶液冷却后，添加1ml的0.05M三氟乙酸(TFA)并混合。而后，将该溶液添加到Sep-Pak C18(MILLIPORE)中吸附水解产物。Sep-Pak C18预先用80％乙腈(MeCN)洗涤后，用0.05M TFA平衡。将吸附在Sep-Pak C18上的水解产物用0.05M TFA洗涤后，进一步用20％MeCN、0.05M TFA洗涤，而后用80％MeCN、0.05M TFA洗脱水解产物，作为分析样品。

分析样品使用高效液相色谱仪用以下条件分析。色谱柱使用Inertsil ODS-2(粒径5μm，4.6×250mm，GL Sciences)，流速为0.8ml/min，流动相用从含有1.5％磷酸的5％乙酸、6.25％乙腈到20％乙酸、25％乙腈的直线浓度梯度洗脱20分钟后，用含有1.5％磷酸及20％乙酸的25％乙腈进行5分钟的等度洗脱。检测使用Agilent 1100系列二极管阵列检测器(GL Sciences)，检测出从250nm到600nm的波长区域，由530nm吸光度的面积求出各花色素的存在比。

分析的结果，在作为转化体的分析系统1300-3、1300-4、1300-5、及1300-6中，检测出花翠素分别占总花色素的0.9％、0.8％、1.4％及0.6％。这表明三色堇的BP40转录调控区域控制BP40的转录。表明在检测出花翠素及证明已被芳香族酰基修饰的花色素苷的1300-3及1300-4中，也包含被芳香族酰基修饰的花翠素型花色素苷。这样，通过使F3′5′H和3AT同时表达即可控制类黄酮合成系统，可通过用芳香族酰基修饰作为蓝色花色素苷基本骨架的花翠素糖苷，从而培育出蓝色菊花。

实施例7：pBI121-紫苏3ATpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::紫苏3ATter的制作

以实施例3中所得到的质粒pSPB3311为模板，将HAP_gPf3ATpro_long_Fd(5′-AAGCTTGGCGCGCCGTTTAAACAACTATTATGATCCCACAG-3′，序列号20)和X-gPf3ATpro-Rv(5′-TCTAGAGGCGGTGTTGAACGTAGCTGTGG-3′，序列号21)作为引物使用，通过使用Prime Star DNA聚合酶(Takara)进行PCR，扩增约1.1kbp的紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因(Pf3AT)的启动子区域(Pf3ATpro)。将所得到的PCR产物克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)上，将所得到的质粒作为pCR-Pf3ATpro。

而后，以pSPB3311为模板，将SSS-gPf3ATter-Fd(5′-GAGCTCACTAGTGTCGACTAAATGTATGTAATTAAACTAAT-3′，序列号22)、及ESS-gPf3ATter-Rv(5′-GAATTCAGGCCTGCCCGGGCTATCTTTATCATATTTCGTCTAC-3′，序列号23)作为引物使用，使用Prime Star DNA聚合酶(Takara)，通过PCR，扩增约1.5kbp的紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的3′侧非翻译区域(Pf3ATter)。将PCR产物克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)上，将所得到的质粒作为pCR-Pf3ATter。

将用SacI和EcoRI酶切pCR-Pf3ATter而得到的Pf3ATter DNA片段插入pBI121-ADHNF的SacI和EcoRI位点。而后，将用HindIII和XbaI酶切所得到的质粒后与用HindIII和XbaI酶切pCR-Pf3ATpro而得到的Pf3ATpro DNA片段连接得到双元载体，将所得到的双元载体作为pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATt。

将Rosa rugosa Thunb.ex Murray的染色体DNA文库使用λBlueSTAR^TM Xho I Half-Site Arms Kit(Novagen，http://www.merckbiosciences.com/product/69242)如下制作。由Rosa rugosa Thunb.ex Murray的嫩叶中使用Nucleon Phytopure[Registered](TEPNEL Life Sciences)制备染色体DNA。将约100μg的染色体DNA用限制酶Sau3AI进行部分酶切。

将该DNA片段在dGTP和dATP的存在下用DNA聚合酶I Klenow fragment(TOYOBO)进行部分Fill-In，通过蔗糖密度梯度离心进行分离。回收约13kb大小的DNA，通过乙醇沉淀进行浓缩。将约180ng的DNA与1μl的λBlueSTAR^TMXho I Half-Site Arms Kit在4℃下进行15小时连接后，进行体外包装(in vitro packaging)反应，得到染色体文库。

将该Rosa rugosa Thunb.ex Murray染色体DNA文库通过蓝猪耳的黄烷酮3-羟化酶(F3H)cDNA(NCBI No.AB211958)进行筛选，得到表示信号的噬菌斑。从其中的1噬菌斑中，使用制造者(Novagen)推荐的方法进行体内切割，转换为质粒。通过用限制酶SpeI酶切该质粒，回收2.6kb的DNA片段，亚克隆到pBluescript SKII-(STRATAGENE)的SpeI位点，得到质粒pSPB804。该质粒具有与F3H显示同源性的碱基序列。

为扩增F3H的5′-非翻译区域，以1ng的pSPB804为模板，使用引物RrF3H-F(5’-AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3’，序列号26)、引物RrF3H(5’-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTTC-3’，序列号27)及Ex-Taq DNA聚合酶(Takara)，在50μl的反应液中进行PCR。PCR的反应条件为94℃下反应5分钟后，重复进行30次94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒为1循环的反应，进而在72℃下保持7分钟。将所得到的DNA片段插入pCR-TOPO(INVITROGEN)中，得到质粒pSPB811。从该质粒中，用HindIII和BamHI可回收约1.2kb的F3H的5′-非翻译区域。

将专利文献4中所记载的pSPB567(包含附加有El2增强子的CaMV35S启动子、三色堇的F3′5′HBP40、胭脂碱合成酶终止子的质粒pUC)的启动子部分使用HindIII和BamHI置换成约1.2kb的F3H的5′-非翻译区域，得到质粒pSFL814(包含R.rugosa F3H 5′：BPF3′5′H#40：nos 3′)。

将以pSFL814为模板、将ADH-BP40-Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTAGTCACCGAC-3′，序列号28)和NcoI-BP40-Rv(5′-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3′，序列号29)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221为模板、将BamHI-ADH-Fd(5′-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′，序列号30)和BP40-ADH-Rv(5′-TAGAATTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′，序列号31)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段进行混合，将混合后的片段用作模板，将BamHI-ADH-Fd和NcoI-BP40-Rv作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH-5′UTR 94bp与三色堇F3’5’H#40的起始密码子直接连接的DNA片段。

将该DNA片段TA克隆到pCR2.1上后，通过将用BamHI及NcoI酶切而得到的约600bp的DNA片段与用BamHI及NcoI酶切pSFL814而得到的双元载体片段连接，得到pBinPLUS Rosa rugosa Thunb.ex MurrayF3Hpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::NOSter。

以pBINPLUS Rosa rugosa Thunb.ex MurrayF3Hpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::NOSter为模板，将SpeISmaI-ADH-Fd(5′-ACTAGTCCCGGGGTCTATTTAACTCAGTATTCAG-3′，序列号24)和SacI-BP40-Rv(5′-GAGCTCTCAGGTTGCGTACGGGTTTGAGG-3′，序列号25)作为引物使用，使用Prime Star DNA聚合酶，通过PCR，扩增ADHNF-三色堇F3′5′H#40 DNA片段。将该DNA片段克隆到pCR-BluntII-TOPO上，将所得到的质粒作为pCR-ADHBP40-SpeSac。

将用SpeI及EcoICRI酶切pCR-ADHBP40-SpeSac而得到的ADHNF-三色堇F3′5′H#40 DNA片段与用SalI酶切pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATt后用BluntingHigh(TOYOBO)进行末端平滑化进而用XbaI酶切而得到的双元载体的片段进行连接，通过这样，得到pBI121-紫苏3ATpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::紫苏3ATter，将其转化到Agrobacterium tumefaciens EHA105株中。

使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种大平的重组菊花7个系统。其中的5个系统中检测出花翠素，花翠素含有率达17.7％。

此外，通过将由pBI121-紫苏3ATpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::紫苏3ATter得到的紫苏3ATpro::ADHNF-三色堇F3′5′H#40::紫苏3ATter的表达盒导入pWTT2132(WO96/36716)中而构建pSPB3718，转化到Agrobacterium tumefaciens Agl0株中。使用该转化体转化菊花品种Improved Regan(精兴园)。得到25个系统的转化菊花，其中7个系统中可发现有花色变化。花翠素含有率最高为20％。

实施例8

将pSFL535(如WO2008/156206中所记载)用PacI部分酶切，回收除去包含三色堇F3′5’H基因的表达盒的DNA片段。将该DNA片段与用PacI酶切实施例4中所述的pSFL620而得到的约3.2kb的DNA片段连接，得到具有图7所示结构的质粒pSFL635。该质粒的T-DNA导入植物中时，可期待来自蓝猪耳的黄酮合成酶基因和来自蓝猪耳的花色素苷甲基转移酶进行组成型表达，三色堇F3′5’H基因在花瓣中特异性表达。将该质粒用WO2008/156206中记载的方法导入土壤杆菌中，再导入月季品种WKS124中，得到83个系统的转化体。在这些花瓣中，含有WKS124中不存在的二甲花翠素、矮牵牛苷配基及花翠素。这些物质在总花色素中的合计量平均为73％，最高为85％。该结果表明，本实验中得到的来自三色堇BP40的启动子区域(pSFL514中所含有的约2.1kb的5′非翻译区域(BP40pro，序列号15，参照实施例4)适用于使外源基因在植物、特别是在月季中表达。

已知认为在红紫苏的叶中控制酶基因转录的启动子区域、即紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域可在作为不同种的菊花的花瓣中作为转录调控区域而发挥功能。因此，利用紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域，可在花等花色素苷积累的组织内特异性地启动外源基因的转录。作为进行转录的外源基因，有与花色、香味有关的基因，但不限于这些。

此外，还可知来自三色堇的F3’5’H基因的转录调控区域在用于改变菊花植物或除菊花以外的植物花色时有用。