JP5582504B2 - 遺伝子改変キク - Google Patents
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Description
本願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる2007年11月15日出願の米国仮特許出願第60/988,331号と関連しており、それに基づく優先権を主張するものである。
本発明は、一般に、遺伝子改変植物の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物の所望の部分において、選択された色表現型を発現する、遺伝子改変された鑑賞用の顕花植物に関する。さらに具体的には、本発明は、変更されたまたは所望の花部を発現する遺伝子改変キク植物を提供する。
本明細書中に提供される参照の書誌の詳細は、本明細書の最後に列挙される。
本明細書の全体にわたって、文脈上特記されない限り、「を含む(comprise)」という単語、または「を含む(comprises)」もしくは「を含む(comprising)」のような変形は、明示された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を意味し、その他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味するものではないことが理解される。
(i)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hをコードするヌクレオチド配列;
(ii)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列;
(iii)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のF3'Hをダウンレギュレートする遺伝物質;
(iv)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のDFRをダウンレギュレートする遺伝物質;ならびに
(v)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のF3'Hをダウンレギュレートする遺伝物質、ならびに固有のDFRをダウンレギュレートする遺伝物質。
文脈上特記されない限り、本明細書において使用される単数形には複数の局面も含まれる。従って、例えば、「植物」なる言及には、単一の植物のみならず複数の植物も含まれ;「F3'5'H酵素」なる言及には、単一の酵素のみならず複数の酵素も含まれ;「本発明」なる言及には、発明の単一の局面のみならず複数の局面も含まれ、他も同様である。
(i)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hをコードするヌクレオチド配列;
(ii)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列;
(iii)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のF3'Hをダウンレギュレートする遺伝物質;
(iv)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のDFRをダウンレギュレートする遺伝物質;ならびに
(v)選択されたプロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたF3'5'Hならびに異種DFRをコードするヌクレオチド配列、ならびに固有のF3'Hをダウンレギュレートする遺伝物質、ならびに固有のDFRをダウンレギュレートする遺伝物質。
使用した大腸菌株は、以下の通りであった。
M15大腸菌は大腸菌K12に由来し、表現型NalS、StrS、RifS、Thi-、Ara+、Gal+、Mtl-、F-、RecA+、Uvr+、Lon+を有する。大腸菌株の形質転換は、Inoueら(Gene 96:23-28,1990)の方法に従って実施した。
使用した無毒化(disarmed)アグロバクテリウム・ツメファシエンス株は、AGL0(Lazo et al,Bio/technology 9:963-967,1991)であった。
DNAライゲーションは、製造業者によって推奨された手法に従って、Amersham LigationキットまたはPromega Ligationキットを使用して実施した。
断片は、一般に、1%(w/v)アガロースゲル上に単離され、製造業者によって推奨された手法に従い、QIAEX II Gel Extractionキット(Qiagen)またはBresacleanキット(Bresatec,Australia)を使用して精製された。
突出5'末端は、標準的なプロトコル(Sambrook et al,1989(前記))に従って、DNAポリメラーゼIクレノウ断片を使用して修復した。突出3'末端は、標準的なプロトコル(Sambrook et al,1989(前記))に従って、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼを使用して修復した。
再環化を防止するため、クローニングベクターからリン酸基を除去するために、典型的には、シュリンプアルカリホスファターゼ(SAP)[USB]を、製造業者の推奨に従って使用した。
特記しない限り、鋳型としてプラスミドDNAを使用したPCR条件は、全容量50μLでの、2ngのプラスミドDNA、100ngの各プライマー、2μLの10mM dNTP混合物、5μLの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、0.5μLのTaq DNAポリメラーゼの使用を含んだ。サイクリング条件は、94℃5分の初期変性工程、それに続く、94℃20秒、50℃30秒、および72℃1分の35サイクル、72℃10分間の最終処理を含み、その後、4℃で保管した。
DNA断片は、製造業者によって推奨された方法に従って、Gigaprimeキット(Geneworks,AUSTRALIA)またはDecaprimeキット(AMBION,USA)を使用して、50μCiの[α-32P]-dCTPにより放射標識した。未取り込みの[α-32P]-dCTPは、Sephadex G-50(Fine)カラムまたはMicrobiospin P-30 Trisクロマトグラフィカラム(BioRad)でのクロマトグラフィにより除去した。
適切な抗生物質選択(例えば、100μg/mLアンピシリンまたは10〜50μg/mLテトラサイクリン等)を含むLBブロス(Sambrook et al,1989(前記))を接種し、振とうしながらおよそ16時間37℃(大腸菌の場合)または29℃(A.ツメファシエンスの場合)で液体培養物をインキュベートすることにより、単一コロニーをインサートについて分析した。アルカリ溶解法(Sambrook et al,1989(前記))を使用するか、またはWizardPlus SV minipreps DNA精製系(Promega)もしくはQiagen Plasmid Miniキット(Qiagen)を使用して、プラスミドDNAを精製した。インサートの存在が決定された後、アルカリ溶解法(Sambrook et al,1989(前記))またはQIAfilter Plasmid Midiキット(Qiagen)を使用して、製造業者によって推奨された条件に従って、大量のプラスミドDNAを50mLの一夜培養物から調製した。
DNA配列決定は、Applied BiosystemsのPRISM(商標)Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencingキットを使用して実施された。製造業者によって供給されたプロトコルに従った。サイクル配列決定反応は、Perkin Elmer PCR機(GeneAmp PCR System 9600)を使用して実施された。配列決定の実行は、一般に、University of Queensland,St Lucia,Brisbane,Australia、およびThe Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (Melbourne,Australia)において、Australian Genome Research Facilityにより実施された。
植物形質転換は、選択可能マーカー遺伝子カセットに依る適切な選択計画を使用した、国際特許出願PCT/US91/05805、米国特許第251,392号(米国登録第5,567,599号)に記載されたようなものである。nptII選択可能マーカー遺伝子のためのカナマイシン選択およびSuRB選択可能マーカー遺伝子のためのクロルスルフロン選択。その他の方法も利用され得る。例えば、Aida et al,Breeding Science,54:51-58,2004;Dolgov et al,Acta Hort 447,329-334,1997;Toguri et al,Plant Biotechnology,20:121-127,2003;Ledger et al,Plant Cell Reports,10:195-199,1991;da Silva,Biotechnology Advances 21,715-766,2003。
色コード決定
観察された色の説明を提供するため、英国王立園芸協会のカラーチャート第3版および/または第5版(London,UK)(1995年および/または2007年)を使用した。それらは、観察された色表現型を記載するための代替的な手段を提供する。しかしながら、指定された数字は、知覚された色についての案内としてのみ解釈されるべきであり、入手され得る可能性のある色を限定するものと見なされるべきではない。
薄層クロマトグラフィ(TLC)および高速液体クロマトグラフィ(HPLC)分析は、一般に、Bruglieraら(Plant J.5:81-92,1994)に記載されたようにして実施された。これらの技術は、デルフィニジンのようなデルフィニジンベースのフラボノイド分子の検出を可能にする。
HPLC分析前に、花弁および雄ずいの抽出物中に存在するアントシアニンおよびフラボノール分子を、アントシアニジンまたはフラボノールコアからグリコシル部分を除去するために酸加水分解した。アントシアニジンおよびフラボノールの標準物を、花抽出物中に存在する化合物の同定を補助するために使用した。
キク花部は、以下のように定義された発達段階において採集した。
段階1:芽は閉じている、花弁は可視でない。
段階2:花芽が開き始める:花弁の先端が可視となる。
段階3:ほぼ全ての花弁の先端が露出される。
段階4:外側の花弁が茎に対して45°の角度となる。
段階5:花部が完全に開く。
移された遺伝子の転写は、RNAを単離し、予想された転写物の量およびサイズを推定することによりモニタリングされた。ノーザンブロット分析を用いて、花弁における特定の転写物の定常状態レベルをモニタリングした。転写物は、使用された遺伝子から予想される推定サイズに基づき、完全または全長であることが決定された。一般に、cDNAがコーディング配列として使用された場合には、予想される転写物のサイズは、cDNAのサイズ+融合したプロモーター断片の5'非翻訳成分+融合したターミネーター断片に由来する3'非翻訳配列であろう。cDNA領域が推定ポリアデニル化部位を含有しており、ターミネーター領域が推定ポリアデニル化部位を含有している場合には、二種の転写物が検出されるであろう。一つは、cDNA配列内のポリアデニル化部位から直ぐ下流で起こるポリアデニル化と一致するサイズのものであろう。第二の転写物は、より大きく、ターミネーター断片内のポリアデニル化部位の後にポリアデニル化された転写物と一致しているであろう。
キメラF3'5'H遺伝子のキクへの導入
アントシアニジン分子のB環のヒドロキシル化のパターンは、花弁色の決定において重要な役割を果たす。ジヒドロフラボノールDHMの産生は、ペチュニアのような植物において、紫色/青色のデルフィニジンベースの色素の産生をもたらす。F3'5'H活性の欠如は、ローザ(例えば、バラ)、ガーベラ(Gerbera)(例えば、ガーベラ)、アンチリナム(例えば、キンギョソウ)、ダイアンサス(例えば、カーネーション)、およびデンドランセマ(例えば、キク)のような多くの植物種における青色花の欠如と相関している。
形質転換ベクターpCGP90(Mac:petHf1:mas 3')
形質転換ベクターpCGP90は、アグロバクテリウムのマンノピンシンターゼ(mas)遺伝子に由来するターミネーター断片(mas 3')と組み合わせられた、アグロバクテリウムのmas遺伝子に由来するプロモーター断片およびCaMV 35Sエンハンサー領域の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向にある[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]。形質転換ベクターpCGP90の構築は、Holton et al,1993(前記)に記載されている。
プラスミドpCGP1452は、ペチュニアリン脂質転移タンパク質(PLTP)遺伝子に由来するターミネーター断片(petD8 3')[Holton,1992(前記)]と組み合わせられた、アンチリナム・マジュスカルコンシンターゼ遺伝子(CHS)に由来するプロモーター断片[Sommer and Saedler,1986(前記)]の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNA Plant Technologies,USA = DNAP)(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB遺伝子に対してタンデム方向にある。pCGP1452の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
キメラゲノムペチュニアF3'5'H Hf1(ゲノムpetHf1)クローンは、下記のような様々なペチュニアF3'5'Hのゲノムクローン断片およびcDNAクローン断片を使用して構築された。
まず、ペチュニア栽培品種V23から単離されたゲノムDNAを、制限エンドヌクレアーゼEcoRVにより完全に消化した。消化されたDNAを、ショ糖密度勾配を使用してサイズ分画した。製造業者によって推奨されたような方法に従い、1〜3kbの画分を含有しているDNAを、EcoRIアダプターとライゲートさせ、次いで、λZAPII EcoRI(Stratagene)とライゲートさせ、ペチュニアV23サブゲノムライブラリーを与えるためにパッケージングした。
3'非コーディング領域を含む完全ペチュニアF3'5'H(petHf1)cDNAクローン(Holton et al,1993(前記))を含有しているpCGP602(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)由来のEcoRI-KpnI断片の32P標識断片によっても、ライブラリーをスクリーニングした。一つのハイブリダイズしたクローンを、pCGP1354と名付けた。それは、ペチュニアF3'5'H Hf1のコーディング領域および二つのイントロンを含有していた。pCGP1355およびpCGP1356(いずれも、1.3kbのインサートを含む)と名付けられた、さらに二つのハイブリダイズしたクローンは、ペチュニアF3'5'H Hf1遺伝子の3'非コーディング領域と共に、タンパク質のC末端部分を表す配列を含有していた。
pCGP1352(上記)に由来するおよそ2.4 kbのBstX1断片(ペチュニアF3'5'H Hf1遺伝子のプロモーター領域、およびF3'5'Hタンパク質のN末端部分を表す配列を含有している)を、pCGP176(Holton et al,1993(前記))に由来するBstXI断片(3'非コーディング領域と共にペチュニアF3'5'H Hf1 cDNAクローンのコーディング領域を含有している)とライゲートさせた。得られたプラスミドをpCGP1358と名付けた。
完全ゲノムペチュニアF3'5'H Hf1クローンを、以下の断片をライゲートさせることにより構築した:pCGP1354(上記)に由来するEcoRI(その認識配列は最初のイントロンに位置している)-PvuII断片、pCGP176(Holton et al,1993(前記))に由来するPvuII-HindIII断片(ペチュニアF3'5'H Hf1コーディング領域の大部分を含有している)、およびpCGP176(Holton et al,1993(前記))のHindIII-EcoRI断片(3'非コーディング配列およびクローニングベクターpBluescript SK-(Stratagene)と共に、タンパク質のC末端部分を表す配列を保持している)。得られたプラスミドをpCGP1359と名付けた。
ゲノムHf1配列を保有している2.5kbの産物を、以下のプライマー:
および鋳型としてのP.ハイブリダ栽培品種Th7から単離されたゲノムDNAを使用して増幅した。増幅産物を、pBluescript(STRATAGENE)のEcoRV ddT充填部位へクローニングし、プラスミドpCGP649を得た。
制限エンドヌクレアーゼBstXIによるプラスミドpCGP1352(上記)の消化により、断片(プロモーター領域およびF3'5'Hタンパク質のN末端部分を表す配列を保持している)を放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP649(P.ハイブリダ栽培品種Th7を鋳型として使用して増幅されたHf1ゲノム配列をpBluescript SK-骨格ベクターの中に保持している)(上記)のBstXI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP1360を得た。
pCGP1360(Hf1プロモーター領域、タンパク質のN末端部分をコードする配列、および第一イントロンのセクションを保持している)(上記)のおよそ2.5 kbのEcoRI断片を、プラスミドpCGP1359(上記)のEcoRI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP1361(完全ゲノムHf1配列を含有している)を得た。
RE SacIおよびBstBIによる消化により、プラスミドpCGP1361(上記)から4.5kbの断片を放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP1356(上記)のSacI末端およびBstBI末端とライゲートさせ、pCGP1363を得た。
RE ApaIおよびSacIによる消化により、ペチュニアゲノムF3'5'H Hf1クローンを保持している6kbの断片を、プラスミドpCGP1363から放出させた。末端を修復し、断片を精製し、プラスミドpWTT2132のSmaI末端とライゲートさせた。選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのペチュニアゲノムF3'5'H Hf1クローンの正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した。得られたプラスミドをpCGP1455と名付けた。
プラスミドpCGP1457は、ペチュニアPLTP遺伝子に由来するターミネーター断片(petD8 3')と組み合わせられた、ペチュニアPLTP遺伝子に由来するプロモーター断片(petD8 5')の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]の35S 5':SuRB遺伝子に対してタンデム方向にある。pCGP1457の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
形質転換ベクターpCGP1476は、アグロバクテリウムのマンノピンシンターゼ遺伝子に由来するターミネーター断片(mas 3')(Janssen and Gardner,1989(前記))と組み合わせられた、P.ハイブリダCHS-A遺伝子に由来するプロモーター断片(PetCHS 5')[Koes,1988(前記)]の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]の35S 5':SuRB遺伝子に対してタンデム方向にある。
PetCHS 5'プロモーター断片を保持しているおよそ800bpの産物を、以下のプライマー:
および鋳型としてのP.ハイブリダcv.V30から単離されたゲノムDNAを使用して増幅した。
まず、プラスミドpCGP669(上記)を、RE EcoRIによる消化により直鎖化した。突出末端を修復した後、直鎖化されたプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼHindIIIにより消化し、PetCHS 5'プロモーター断片を保持しているおよそ800bpの断片を放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP293(Mac 5':mas 3'発現カセットを含有している形質転換ベクター)[Brugliera et al,1994(前記)に記載されている]のXbaI(修復された末端)/HindIII末端とライゲートさせた。Mac 5'プロモーター断片のPetCHS 5'プロモーター断片への正確な交換を、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。PetCHS 5':mas 3'発現カセットを含有している得られたプラスミドを、pCGP672と名付けた。
翻訳開始部位の5'側にある1.2kbのアンチリナム・マジュスCHS遺伝子断片(Sommer and Saedler,1986(前記))と、推定終止コドンの3'側にあるpCGP13ΔBam(Holton,1992(前記))由来の0.7 kbのSmaI/XhoI PLTP断片(petD8 3')との間に、pCGP601(国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている)由来の1.6 kbのBclI/FspIペチュニアF3'5'H(petHf1)断片をクローニングすることにより、ペチュニアPLTPターミネーター(petD8 3')と組み合わせられたアンチリナム・マジュスCHS(AmCHS 5')プロモーターの制御下にあるキメラペチュニアF3'5'H遺伝子を構築した。得られたpBluescribe(STRATAGENE)骨格ベクター内のプラスミドを、pCGP483と名付けた。
制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIによる消化により、petHf1 cDNAクローンを保有している1.6kbの断片を、プラスミドpCGP483(上記)から放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP672(上記)のXbaI/BamHI末端とライゲートさせた。AmCHS 5'プロモーター断片とpetD8 3'ターミネーター断片との間へのpetHf1 cDNAクローンの正確な挿入を、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドを、pCGP1471と名付けた。
まず、プラスミドpCGP1471を、制限エンドヌクレアーゼHindIIIにより部分消化した。突出末端を修復し、部分消化されたプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼPstIによりさらに消化した。PetCHS 5':petHf1:mas 3'発現カセットを保有している3.2kbの断片を精製し、TiプラスミドpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]のSmaI/PstI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向での発現カセットの正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP1476と名付けた。
形質転換ベクターpCGP1616は、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するターミネーター断片(nos 3')(Depicker,et al,1982(前記))と組み合わせられた、P.ハイブリダ3RT遺伝子に由来するプロモーター断片(petRT 5')[Brugliera,1994(前記)]の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]の35S 5':SuRB遺伝子に対してタンデム方向にある。pCGP1616の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
形質転換ベクターpCGP1627は、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ(nos)遺伝子に由来するターミネーター断片(nos 3')と組み合わせられた、キクのカルコンシンターゼ(CHS)遺伝子に由来するプロモーター断片の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向にある。
キクCHSゲノムクローンの単離、およびchrysCHS 5':GUS:nos 3'発現カセットを含有している中間プラスミドpCGP1622の調製は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
制限エンドヌクレアーゼBspHIおよびXmaIによる消化により、ペチュニアF3'5'H(petHf1)cDNAクローンを、プラスミドpCGP1303(国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている)から放出させた。ペチュニアF3'5'H(petHf1)cDNAクローンを含有している1.6kbの断片を精製し、pCGP1622のNcoI/XmaI末端とライゲートさせた。断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。chrysCHS 5':petHf1:nos 3'発現カセットを含有している得られたプラスミドを、pCGP1624と名付けた。
chrysCHS 5':petHf1:nos 3'遺伝子を含有している4.5kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼPstIおよびBglIIによる消化により、プラスミドpCGP1624から放出させた。精製された断片を、pWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]のPstI/BamHI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのchrysCHS 5':petHf1:nos 3'遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP1627と名付けた。
プラスミドpCGP1633は、ペチュニア・ハイブリダの3RT遺伝子(Brugliera,1994(前記))に由来するターミネーター断片(petRT 3')と組み合わせられた、キクのカルコンシンターゼ(CHS)遺伝子に由来するプロモーター断片の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向にある。
制限エンドヌクレアーゼSacIおよびBamHIによる消化により、petRT 3'ターミネーター断片を、プラスミドpCGP1610(Brugliera,1994(前記))から放出させた。2.5kbの断片を精製し、pCGP1624(上記)のSacI/BglII末端とライゲートさせた。断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。chrysCHS 5':petHf1:petRT 3'発現カセットを含有している得られたプラスミドを、pCGP1630と名付けた。
chrysCHS 5':petHf1:petRT 3'遺伝子を含有している6.6kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼPstIによる消化により、プラスミドpCGP1630から放出させた。精製された断片を、pWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]のPstI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのchrysCHS 5':petHf1:petRT 3'遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。プラスミドをpCGP1633と名付けた。
形質転換ベクターpCGP1638は、オクトピンシンターゼターミネーター(ocs 3')と組み合わせられた、CaMV 35Sプロモーター(35S 5')の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。ペチュニアクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子(Cab 22遺伝子)[Harpster et al,1988(前記)]由来のおよそ60bpの5'非翻訳リーダー配列が、CaMV 35Sプロモーター断片とペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンとの間に含まれている。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、TiプラスミドベクターpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向にある。形質転換ベクターpCGP1638の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
形質転換ベクターpCGP1860は、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するターミネーター断片(nos 3')と組み合わせられた、ローザ・ハイブリダのカルコンシンターゼ遺伝子に由来するプロモーター断片(RoseCHS 5')の制御下で、キメラペチュニアF3'5'H(petHf1)遺伝子を含有している。キメラペチュニアF3'5'Hカセットは、プラスミドpWTT2132(DNAP)[国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと]の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向にある。形質転換ベクターpCGP1860の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
形質転換ベクターpCGP2119は、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向で、キメラCaMV 35S:salvia F3'5'H:ocs 3'遺伝子カセットを含有している。pCGP2119の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
形質転換ベクターpCGP2205(図2)は、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向で、キメラcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子カセットを含有している。
Sau3A部分消化物を使用して、EMBL 3ラムダベクター(STRATAGENE)において、ダイアンサス・カリオフィルスcv.ラグナ(Laguna)DNAからゲノムDNAライブラリーを構築した。消化されたゲノムDNAを、グリセロール密度勾配でサイズ分画し、15〜20kbの範囲のDNA断片を含有している画分をプールし、EMBL3λベクターのBamHI末端とライゲートさせた。ライゲーション混合物を、Gigapack XL Gold(PROMEGA)を使用してパッケージングした。ライブラリーの全サイズは、1×106組換え体であった。
カーネーションANS遺伝子由来のプロモーター領域を含有しているおよそ2.5 kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIによる消化により、pCGP787(上記)から放出させた。断片を精製し、pBluescript KSのEcoRI/BamHI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP793を得た。この2.5kbの断片は、ANS遺伝子の5'コーディング配列の200bpも含有していた。次いで、ATGコドンから5'上流にXbaI部位を導入するプライマーを使用したPCRにより、プロモーター領域の3'末端を増幅した。次いで、増幅された700bpのPCR断片を、NdeI/XbaIにより消化し、pCGP793のNdeI/XbaI末端とライゲートさせ、コーディング配列の200bpを含まずにANSプロモーターを保持している2.3kbの断片を作製した。この新しいプラスミドをpCGP1274と名付けた。
プラスミドpCGP795(上記)を、制限エンドヌクレアーゼEcl136II/XbaIにより消化し、0.7kbのANSターミネーター保持断片を放出させた。断片を精製し、pCGP1274のApaI(平滑末端化)/XbaI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP1275(カーネーションANS遺伝子のプロモーター断片およびターミネーター断片を含有しており、クローニングを容易にするためにマルチクローニング部位が二つの断片を分断している)[carnANS 5':carnANS 3']を作製した。
プラスミドpCGP1959(BPF3'5'H#18 cDNAクローンを含有している)[国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている]を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718により消化した。末端を修復し、精製されたBPF3'5'H#18断片を、pCGP1275(carnANS 5':carnANS 3'を含有している )の修復されたPstI/XbaI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP2150(carnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'発現カセットを含有している )を作製した。
キメラcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼClaIによる消化により、pCGP2150(上記)から放出させた。およそ4.8kbの断片のClaI末端を修復し、断片を単離し、精製し、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の修復されたAsp718I末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。形質転換ベクターをpCGP2205と名付けた(図2)。
形質転換ベクターpCGP2217は、TiプラスミドpCGP1988の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、RoseCHS:Viola F3'5'H#18:nos 3'発現カセットを含有している(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)。
バラCHSゲノムクローンの単離、ならびにバラ由来のCHS遺伝子の2.7〜3.0kbのプロモーター断片を含有しているプラスミドpCGP1116およびpUC18骨格の中にRoseCHS 5':GUS:nos 3'発現カセットを含有しているpCGP197の調製は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
バラカルコンシンターゼ(CHS)プロモーターを保持しているおよそ3.0 kbの断片(RoseCHS 5')を、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびAsp718による消化により、プラスミドpCGP1116から放出させた。断片を精製し、ベクター骨格、β-グルクロニダーゼ(GUS)断片、およびnos 3'断片を含有している、pJB1(Bodeau,Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes.Dissertation,Stanford University,USA,1994)由来のHindII/Asp718断片とライゲートさせた。GUSコーディング配列の上流へのバラCHSプロモーター断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP197と名付けた。
まず、プラスミドpCGP197(pUC18骨格の中にRoseCHS 5':GUS:nos 3'を含有している)を、制限エンドヌクレアーゼHindIIIによる消化により直鎖化した。突出HindIII末端を修復し、次いで、バラCHSプロモーター断片を、制限エンドヌクレアーゼSalIによる消化により放出させた。およそ2.8kbの断片を精製し、プラスミドpCGP1986(pBluescript骨格の中にnosターミネーター断片を含有している)のXhoI(修復された末端)/SalI末端とライゲートさせた。nosターミネーター断片の前へのバラCHSプロモーター断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP2201と名付けた。
制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718による消化により、BPF3'5'H#18 cDNAクローンを、プラスミドpCGP1959(pBluescript骨格の中にBPF3'5'H#18を含有している[国際特許出願PCT/AU03/01111の中に記載されている]から放出させた。突出末端を修復した後、BPF3'5'H#18を含有している1.6kbの断片を精製し、pCGP2201(上記)のSalI(修復された末端)とライゲートさせた。Rose CHS 5'断片とnos 3'断片との間へのBPF3'5'H#18 cDNAクローンの正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP2203と名付けた。
まず、プラスミドpCGP2203を、制限エンドヌクレアーゼSpeIによる消化により直鎖化した。突出末端を修復し、Rose CHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'発現カセットを含有している断片を、制限エンドヌクレアーゼBglIIによる消化により放出させた。およそ5kbの断片を精製し、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)のSalI(修復された末端)/BamHI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのRose CHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。形質転換ベクターをpCGP2217と名付けた(図3)。
形質転換ベクターpCGP2788は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、CaMV 35S:BPF3'5'H#40:35S 3'発現カセットを含有している。pCGP2788の構築は、国際特許出願PCT/AU03/00079に記載されている。
形質転換ベクターpCGP3141は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、シネラリアF3'5'H遺伝子(日本特許出願第2008-276029号を参照のこと)を含有している。
日本特許出願第2008-276029号に記載されるようにして、シネラリアF3'5'Hゲノムクローンを単離した。シネラリアgF3'5'Hクローン(SEQ ID NO:12)を保持しているおよそ4.6kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよびEcoRVによる消化により、プラスミドgCi01(pBluestarベクター骨格(NOVAGEN)の中のシネラリアF3'5'H遺伝子)から放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP1988のSmaI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してコンバージェント(convergent)方向でのシネラリアgF3'5'H遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。プラスミドをpCGP3141と名付けた(図5)。
形質転換ベクターpCGP3149は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、35S 5':BPF3'5'H#40:SuRB 3'発現カセットを含有している。
形質転換ベクターpCGP3409は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、BPF3'5'H#40 5':BPF3'5'H#40:nos発現カセットを含有している。
製造業者によって推奨された手法に従い、DNA easy plantキット(QIAGEN)を使用して、ビオラcv.ブラックパンジーの葉からゲノムDNAを単離した。3μgのゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼHindIIIにより消化した。消化されたDNAを、製造業者のプロトコルを使用して、16℃で40分間、Ligation High(TAKARA)を使用して、[インビトロクローニングキットTAKARAに含有されていた]TaKaRa LA PCR(商標)のHindIII末端とライゲートさせた。
プライマー
[カセットに対して設計され、キットに含有されていた]
プライマー
[BPF3'5H#40のコーディング領域(逆方向)に対して設計された]を、14μLのライゲートさせられたgDNAに添加した。製造業者によって推奨されたプロトコル(98℃20秒、次いで68℃15分のインキュベーションの30サイクル)に従って、25μLでPCRを実施した。
プライマー
[カセットに対して設計され、キットに含有されていた]
プライマー
[BPF3'5H#40のコーディング領域(逆方向)に対して設計された]
を、25μLの全反応容量でPCRに供した。PCR条件は、98℃5分の変性工程、それに続く、98℃20秒、次いで68℃15分のインキュベーションの30サイクルを含んでいた。
プライマーBP40-i7(上記)および
プライマー
[BPF3'5H#40遺伝子のプロモーター領域に対して設計された]
と共に、鋳型としての200ngのパンジーゲノムDNAを使用したPCRにより、BPF3'5'H#40遺伝子のプロモーター領域を、コーディング配列の200bpと共に増幅した。使用された条件は、98℃5分の初期変性工程、それに続く、98℃20秒および68℃15分のインキュベーションの30サイクルであった。
pSFL614(上記)の中のゲノム配列の5'上流領域の約1.1kbを、以下に記載されるようなBPF3'5'H#40コーディング配列の発現を制御するために使用した。その領域のBamHI部位を、構築の簡便のためNheIに変換した。
プライマー
およびプライマー
と共に、鋳型としての1ngのpSFL614プラスミドを使用して増幅した。
プライマー
およびプライマー
と共に、鋳型としての1ngのプラスミドpSFL614(上記)を使用したPCRにより増幅した
3.1kbのBPF3'5'H#40 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを、制限エンドヌクレアーゼPacIを使用して、中間プラスミドpSFL620(上記)から切り出し、pBINPLUS(van Engelen et al,Transgenic Research 4,288-290,1995)のPacI末端とライゲートさせた。nos 5':nptII:nos 3'選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのBPF3'5'H#40 5':BPF3'5'H#40:nos 3'キメラ遺伝子の正確な挿入を、カナマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpSFL622と名付けた。
BPF3'5'H#40 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを、制限エンドヌクレアーゼPacIによる消化により、pSFL622(上記)から放出させた。3.1kbの断片を精製し、プラスミドpCGP1988のPacI末端とライゲートさせた(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのBPF3'5'H#40 5':BPF3'5'H#40:nos 3'キメラ遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP3408と名付けた。
形質転換ベクターpCGP3409は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、R.rugosa DFR 5':BPF3'5'H#40:nos発現カセットを含有している。
λBlueSTAR(商標)XhoI Half-Site Armsキット(Novagen,http://www.merckbiosciences.com/product/69242)を使用して調製されたR.ルゴサゲノムライブラリーから、ローザ・ルゴサDFRゲノムクローンを単離した。
を、鋳型pSFL710(上記)およびExTaq DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を含有している混合物[最終容量50μL]に添加した。PCR条件は、94℃5分の変性工程、それに続く、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒のインキュベーションの30サイクル、それに続く72℃7分の最終インキュベーションを含んでいた。350bpのDNA断片を増幅し、断片Cと名付けた。
を使用して実施した。PCR条件には、94℃5分の変性工程、それに続く、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒のインキュベーションの30サイクル、それに続く、72℃7分の最終インキュベーションが含まれていた。600bpのDNA断片を増幅し、断片Dと名付けた。
R.rugosa DFR 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを保持している3.11kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼPacIを使用して、中間プラスミドpSFL721(上記)から切り出し、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)のPacI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのR.rugosa DFR 5':BPF3'5'H#40:nos 3'キメラ遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP3409と名付けた。
形質転換ベクターpCGP3410は、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、R.rugosa F3H 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを含有している。
ローザ・ルゴサのゲノムライブラリー(上記)を、トレニアフラバノン3-ヒドロキシラーゼ(F3H)cDNA(NCBI番号AB211958)のDIG標識断片によりスクリーニングした。選択されたハイブリダイズしたプラークを精製し、プラスミドを(製造業者によって推奨された方法を使用して)切り出した。クローンのうちの一つ#5を、さらなる研究のために選択した。プラスミドを制限エンドヌクレアーゼSpeIにより消化し、約2.6kbのサイズの得られた断片のうちの一つを単離し、精製した。断片をpBluescript SKII-(STRATAGENE)のSpeI末端へサブクローニングし、得られたプラスミドを名付けた。pSPB804に含有されていた断片の配列分析は、プラスミドがF3H様の配列を含有していることを明らかにした。
PCR条件には、94℃5分のインキュベーション、それに続く、94℃30秒、次いで50℃30秒、および72℃30秒のインキュベーションの30サイクル、さらに、72℃7分の最終インキュベーションが含まれていた。増幅された断片を、pCR-TOPOベクター(INVITROGEN)へとサブクローニングし、プラスミドpSPB811を得た。
R.rugosa F3H 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを保持しているおよそ3.2kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼPacIおよびAscIを使用して、中間プラスミドpSFL814(上記)から切り出し、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)のPacI/AscI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのR.rugosa F3H 5':BPF3'5'H#40:nos 3'キメラ遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP3410と名付けた。
形質転換ベクターpCGP3424は、内因性キクF3'Hの発現をダウンレギュレートするための35S 5':ds chrysF3'H:ocs 3'カセット(下記pCGP3134由来)と共に、形質転換ベクターpCGP2217(上記)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'発現カセットを含有している。
ベクターλ2001(Holton,1992(前記))において、ペチュニア・ハイブリダcv.オールドグローリーブルーDNAからゲノムライブラリーを作成した。およそ200,000 pfuをNZYプレートに播種し、隆起をNENフィルターに採り、フィルターに400,000cpm/mLの32P標識ペチュニアDFR-A cDNA断片(Brugliera et al,The Plant Journal 5(1):81-92,1994に記載されている)をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたクローンを精製し、各々からDNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化によりマッピングした。これらのクローンのうちの一つの13kbのSacI断片を単離し、pBluescriptIIのSacI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP1472を作出した。より詳細なマッピングは、およそ5.3kbのBglII断片がペチュニアDFR-A遺伝子(Beld et al,.Plant Mol.Biol.13:491-502,1989)全体を含有していることを示した。
ペチュニアDFR-Aイントロン1の180bpを保持している断片を、鋳型としてのプラスミドpCGP1472(上記)および以下のプライマーを使用して、PCRにより増幅した。
部分キクF3'H配列(全長キクF3'H cDNAクローンの配列はSEQ ID NO:44に示される、国際PCT出願PCT/AU97/00124を参照のこと)を含有している1.2kbの断片を、キク花弁cDNAライブラリー(Klondike)を鋳型として使用したPCRにより増幅した。Klondike花弁cDNAライブラリーは、国際PCT出願PCT/AU97/00124に記載された方法に従って、花段階1〜3から単離されたRNAから調製された。以下のプライマーをPCRにおいて使用した。
プラスミドpCGP3133は、両端にXbaI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を組み入れるPCRにより生成された部分キクF3'Hクローンを含有している。キクF3'H cDNAクローンのおよそ1.1kbの断片を、以下のプライマーおよび鋳型としてのプラスミドpCGP3369(上記)を使用して増幅した。
得られたおよそ1.1kbのPCR産物を、T/AベクターpCR2.1(INVITROGEN)とライゲートさせた。pCR2.1ベクターへのPCR断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体の制限エンドヌクレアーゼおよび配列分析により確認した。得られたプラスミドをpCGP3133と名付けた。
部分キクF3'H cDNAを含有しているおよそ1kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびBamHIによる消化により、中間プラスミドpCGP3369(上記)から切り出した。得られた断片を精製し、プラスミドpCGP3127(上記)のNcoI/BglII末端とライゲートさせた。35S 5'プロモーター断片とペチュニアゲノムDFR-Aイントロン1断片との間へのセンス方向でのキクF3'H断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。さらなる確認を、正確にマッピングされた形質転換体の配列分析により入手した。得られた中間プラスミドをpCGP3129と名付けた。
中間プラスミドpCGP3134は、pCR2.1(INVITROGEN)骨格の中に35S 5':ds chrysF3'H:ocs 3'カセットを含有している。キクF3'H部分cDNA断片を、制限エンドヌクレアーゼXbaIによる消化により、プラスミドpCGP3133(上記)から放出させた。得られたおよそ1.1kbの断片を精製し、pCGP3129(上記)のXbaI末端とライゲートさせた。ペチュニアDFR-Aイントロン1断片とocs 3'ターミネーター断片との間へのアンチセンス方向でのキクF3'H断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。得られたプラスミドをpCGP3134と名付けた。
発現カセット35S 5':ds chrysF3'H:ocs 3'を、制限エンドヌクレアーゼSmaIおよびPvuIIによる消化により、プラスミドpCGP3134(上記)から放出させた。得られた3.5kbの断片を精製し、形質転換ベクターpCGP2217(上記)のPmeI SAP処理末端とライゲートさせた。RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'および35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向での35S 5':ds chrysF3'H:ocs 3'カセットの正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。得られた形質転換ベクターをpCGP3424と名付けた(図4)。
形質転換ベクターpCGP3429は、内因性キクF3'Hの発現をダウンレギュレートするためのRoseCHS 5':ds chrysF3'H*:ocs 3'カセットと共に、35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向で、RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'発現カセットを含有している。
RoseCHS 5'プロモーター領域を保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびSmaIによる消化により、pCGP2203(上記)から放出させた。およそ2.7kbの断片を精製し、pBINPLus(van Engelen et al.,1995(前記))のHindIII/SmaI末端とライゲートさせた。断片の正確な挿入を、カナマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpSPB3349と名付けた。
キクF3'H cDNAクローンの部分領域を保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびHindIIIによる消化により、プラスミドpRm6i(国際特許出願PCT/AU97/00124)から放出させた。キクF3'H cDNAの5'部分を含有している0.83kbの断片を精製し、プラスミドpSPB176のHindIII/SalI末端とライゲートさせた(pSPB176はpBINPlusの中にe35S 5':GUS:nos 3'を含有しており、国際特許出願PCT/AU03/00079に記載されている)。nos 3'ターミネーター断片に対してアンチセンス方向での断片の正確な挿入を、カナマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpSPB3350と名付けた。
RoseCHS 5'プロモーター領域を保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼAscIおよびKpnIによる消化により、プラスミドpSPB3349(上記)から放出させた。断片を精製し、断片A(AscI/KpnI RoseCHS 5'断片)と名付けた。
RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'発現カセットを保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼPacIによる消化により、プラスミドpSPB459(国際特許出願WO2005-017147に記載)(pUCベースの骨格の中にRoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'を含有している)から放出させた。断片を精製し、プラスミドpSPB3351(上記)のPacI末端とライゲートさせた。RoseCHS 5':ds chrysF3'H*:nos 3'発現カセットに対してタンデム方向でのRoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'キメラ遺伝子を保持している断片の正確な挿入を、カナマイシン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpSPB3352と名付けた。
RoseCHS 5':ds chrys F3'H*:nos 3'キメラ遺伝子を保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼAscIおよびPacIによる消化により、プラスミドpSPB3352(上記)から放出させた。断片を精製し、TiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)のAscI/PacI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向でのRoseCHS 5':ds chrysF3'H*:nos 3'キメラ遺伝子を保持している断片の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP3426と名付けた。
RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'キメラ遺伝子を保持している断片を、制限エンドヌクレアーゼPacIによる消化により、プラスミドpSPB3352(上記)から放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP3426(上記)のPacI末端とライゲートさせた。RoseCHS 5':ds chrysF3'H*:nos 3'キメラ遺伝子および35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してタンデム方向でのRoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'を保持している断片の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP3429と名付けた(図6)。
形質転換ベクターpCGP3434は、RoseCHS 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットおよびTiプラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)の35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットを含有している。
BPF3'5'H#40 cDNAクローンを保持している1.6kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718を使用して、プラスミドpCGP1961(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)から切り出した。断片の末端を修復し、次いで、プラスミドpCGP2201(上記)の修復されたSalI末端とライゲートさせた。RoseCHS 5'断片とnos 3'断片との間へのBPF3'5'H#40 cDNAクローンの正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。得られたプラスミドをpCGP3425と名付けた。
RoseCHS 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを保持している4.9kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼSpeIおよびBglIIによる消化により、プラスミドpCGP3425(上記)から放出させた。断片を精製し、pUCAP/AscIクローニングベクターのXbaI/BamHI末端とライゲートさせた。(プラスミドpUCAP/AscIは、追加のクローニング部位、特に、マルチクローニング部位の両端にAscI認識部位を有する、pUC19ベースのクローニングベクターである。)RoseCHS 5':BPF3'5'H#40:nos 3'保持断片の正確な挿入を、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。得られたプラスミドをpCGP3438と名付けた。
RoseCHS 5':BPF3'5'H#40:nos 3'発現カセットを保持している4.9kbの断片を、制限エンドヌクレアーゼAscIによる消化により、プラスミドpCGP3438(上記)から放出させた。断片を精製し、プラスミドpCGP1988(国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと)のAscI末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカーカセットに対してコンバージェント方向でのRoseCHS 5':BPF3'5'H#40:nos 3'カセットの正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。得られた形質転換ベクターをpCGP3434と名付けた。
栽培品種=形質転換されたキク栽培品種
構築物=形質転換実験において使用された形質転換ベクター
カセット=形質転換ベクターの中に含有されていた遺伝子発現カセット
#tg=現在までに作製され顕花したトランスジェニックの総数
#CC=非形質転換植物のものと比較して有意な色のシフトを有する花部を生じた個々のトランスジェニック事象の数
TLC=分析された個々の事象の総数に対する(TLCにより決定されたように)デルフィニジンが花弁において検出された個々の事象からの花部の数
*=TLCのために使用された抽出物は、きわめて少ない量のデルフィニジンを検出するため濃縮(20倍)された
HPLC=花弁抽出物中に検出された全アントシアニジンに対する割合として示された、HPLCにより検出されたデルフィニジン量の範囲。分析された総数から検出されたデルフィニジンを有する事象の数が、括弧内に表される。
ノーザン=分析された事象の総数に対する、特異的な完全なF3'5'H、ALS(SuRB)、またはnptIIの転写物が、ノーザンブロット分析により、花弁から単離された全RNAの中に検出された個々の事象の数
nd=未実施
Hf1=ペチュニアF3'5'H Hf1 cDNAクローン
cinF3'5'H=標識のために鋳型として使用されたコーディング領域の3'末端を保持している(SEQ ID NO:12由来の)576bpのBglII/HindIIIシネラリアF3'5'H断片
栽培品種=形質転換されたキク栽培品種
構築物=形質転換実験において使用された形質転換ベクター
フラボノイド経路カセット=形質転換ベクター構築物の中に含有されていたフラボノイド遺伝子発現カセット
RHS色コード=対照花弁と比較して最も有意な色変化を有するトランスジェニックキクの花部からの花弁色コード
RHS色群=英国王立園芸協会(London)による花弁色に関連した色群
栽培品種=形質転換されたキク栽培品種
構築物=形質転換実験において使用された形質転換ベクター
#tg=現在までに作製され顕花したランスジェニックの総数
#CC=非形質転換植物のものと比較して変更された花色を有する花部を生じた個々のトランスジェニック事象の数
RHS色コード=対照花弁と比較して最も有意な色変化を有するキクの花部からの花弁色コード
RHS色群=英国王立園芸協会(London)による花弁色に関連した色群
Claims (17)
- 紫色、スミレ色、赤紫色又は紫スミレ色の花弁を有する遺伝子改変キク植物であって、選択されたプロモーター及びターミネーターに機能的に連結されたフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ(F3'5'H)酵素をコードする発現された遺伝物質を含み、該選択されたプロモーターと該F3'5'H酵素の遺伝子との組み合わせは、配列番号9に示す配列をもつRoseCHS 5'プロモーターと配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18との組み合わせ、配列番号10に示す配列をもつCarnANS 5'プロモーターと配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18との組み合わせ、又は、配列番号12に示す配列をもつCineraria gF3'5'Hクローンに由来するCineraria gF3'5'Hプロモーターと配列番号12に示す配列をもつCineraria gF3'5'Hとの組み合わせ、の内のいずれかである、前記遺伝子改変キク植物。
- 固有のフラボノイド3'ヒドロキシラーゼ(F3'H)をダウンレギュレートする発現された遺伝物質をさらに含む、請求項1記載の遺伝子改変植物。
- 固有のジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ(DFR)をダウンレギュレートする発現された遺伝物質をさらに含む、請求項1又は2に記載の遺伝子改変植物。
- 異種ジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ(DFR)をコードする発現された遺伝物質をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 遺伝子改変されていないキク植物には存在しない、TLC又はHPLCにより決定されるデルフィニジンベースのフラボノイド分子を蓄積する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- ブルーリッジ(BlueRidge)、マデリン(Madeline)、マネーメーカー(Moneymaker)、マンディアル(Mundial)、インプルーブドリーガン(Improved Reagan)、ダークスプレンディッドリーガン(Dark Splendid Reagan)、セイフィガロ(Sei Figaro)、セイフロレア(Sei Florea)、セイチタン(Sei Titan)、セイチタン406、セイノーマ(Sei Norma)、及びセイアメリー(Sei Amelie)より選択されるキク栽培品種の遺伝的背景を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 前記ターミネーターが、配列番号11に示す配列をもつcarnANS 3'ターミネーターである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 配列番号9に示す配列をもつRoseCHS 5'プロモーターと、配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefacienns)のノパリンシンターゼ(nos)遺伝子からのターミネータとが連結されたnos 3'RoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 配列番号10に示す配列をもつCarnANS 5'プロモーターと、配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18と、配列番号11に示す配列をもつcarnANS 3'ターミネーターとが連結されたcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 前記プロモーター及び前記ターミネーターの配列が、配列番号12に示す配列をもつCineraria gF3'5'Hクローンに由来する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 二種以上のフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ(F3'5'H)酵素及び/又はジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ(DFR)酵素をコードする発現された遺伝物質をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子改変植物に由来する、子孫、生殖物質、切り花、組織培養可能な細胞、又は再生可能な細胞。
- 以下の工程:
選択されたプロモーター及びターミネーターに機能的に連結されたフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ(F3'5'H)酵素をコードする発現された遺伝物質を、キク植物の再生可能な細胞へ導入する工程、ここで、該選択されたプロモーターと該F3'5'H酵素の遺伝子との組み合わせは、配列番号9に示す配列をもつRoseCHS 5'プロモーターと配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18との組み合わせ、配列番号10に示す配列をもつCarnANS 5'プロモーターと配列番号1に示す配列をもつBPF3'5'H#18との組み合わせ、又は、配列番号12に示す配列をもつCineraria gF3'5'Hクローンに由来するCineraria gF3'5'Hプロモーターと配列番号12に示す配列をもつCineraria gF3'5'Hとの組み合わせ、の内のいずれかである;並びに
そこから植物を再生させる工程、又はその遺伝子改変子孫を選択する工程;
を含む、紫色、スミレ色、赤紫色又は紫スミレ色の花弁を有するキク植物を生産する方法。 - 固有のフラボノイド3'ヒドロキシラーゼ(F3'H)をダウンレギュレートする遺伝物質をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 異種のジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ(DFR)をコードする遺伝物質をさらに含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 固有のDFRをダウンレギュレートする遺伝物質をさらに含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子改変を有する植物の子孫を選択する工程をさらに含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
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