JPH0970290A - アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents

アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子

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JPH0970290A
JPH0970290A JP8046534A JP4653496A JPH0970290A JP H0970290 A JPH0970290 A JP H0970290A JP 8046534 A JP8046534 A JP 8046534A JP 4653496 A JP4653496 A JP 4653496A JP H0970290 A JPH0970290 A JP H0970290A
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俊彦 芦刈
Yoshikazu Tanaka
良和 田中
Hiroyuki Fujiwara
裕之 藤原
Masahiro Nakao
正宏 中尾
Yuko Fukui
祐子 福井
Keiko Yonekura
圭子 米倉
Masako Mizutani
正子 水谷
Takaaki Kusumi
高章 久住
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子
及びその利用を提供する。 【解決手段】 リンドウ（Ｇｃｎｔｉａｎａｔｒｉｆｌ
ｏｒａ ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の花弁からアシル
基転移酵素を精製してそのアミノ酸配列の一次構造を決
定し、当該アミノ酸配列の情報に基づき、遺伝子組換え
技術を用いてリンドウ由来のアシル基転移酵素に係るｃ
ＤＮＡを単離した後、構造遺伝子の塩基配列を決定する
ことにより目的のアシル基転移酵素をコードする遺伝子
を得た。更に、遺伝子組換え技術を用いて別のリンド
ウ、ぺチュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル基転
移酵素をコードする遺伝子を提供する。 【効果】 本発明に係るアシル基転移酵素をコードする
遺伝子を用いてアントシアン系色素をアシル化すること
により花色を変化させることができ、アントシアンの安
定性を増すことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物由来の芳香族
アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子及
びその利用に関するものである。更に詳しくは、リンド
ウ（ Ｇｅｎｔｉａｎａｔｒｉｆｌｏｒａ ｖａｒ．ｊ
ａｐｏｎｉｃａ）、ぺチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙ
ｂｒｉｄａ)、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｏｃｉｍｏｉｄ
ｅｓ）及びサイネリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｒｕｅｎｔ
ｕｓ）由来の芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子及びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】花産業は新規かつ種々の品種を開発する
ことに努力している。新規な品種の育成のための有効な
方法の一つとして花の色を変えることがあり、古典的な
育種方法を用いて、ほとんどの商業的品種について広範
囲な色を作出することに成功している。しかしながら、
この方法では種ごとで遺伝子プールが制限されているこ
とから、単一の種が広範囲の種類の着色品種を有するこ
とは稀である。
【０００３】花の色は主として２つのタイプの色素、即
ちフラボノイド及びカロチノイドに基づき、フラボノイ
ドは黄色から赤ないし青色の範囲に寄与し、カロチノイ
ドはオレンジ又は黄色の色調に寄与する。花色に主たる
寄与をするフラボノイド分子はシアニジン、デルフィニ
ジン、ぺチュニジン、ぺオニジン、マルビジン及びぺラ
ルゴニジンの配糖体であるアントシアンであり、異なる
アントシアンが顕著な花の色の変化をもたらす。さらに
花の色は無色のフラボノイドの補助発色、金属錯体形
成、グリコシル化、アシル化、メチル化及び液胞のｐＨ
により影響される（Ｆｏｒｋｍａｎｎ，Ｐｌａｎｔ Ｂ
ｒｅｅｄｉｎｇ１０６：１，１９９１）。
【０００４】アシル化されたアントシアンは、サイネリ
ア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）由来のシネラ
リン（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ２５：６０２１，１９８４）、ツユクサ（Ｃｏｍｍｅ
ｌｉｎａｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のアオバニン（Ｇｏｔ
ｏ ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：１７，１９９１）及びオヤ
マリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ Ｍａｋｉｎｏｉ）由来
のゲンチオデルフィン（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔａｌ．，
Ｔｃｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８：４３１３，１９９２）を
始め、自然界からの数多くの分離例が報告されている
（タイマツバナ：Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ２６：５８７９，１９８５；シソ、パン
ジー：Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ２７：２４１３，１９８７；シマフムラサキツユク
サ：Ｉｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ２８： １９０１， １９８７；ヤマノイモ：Ｓｈｏ
ｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ２９：２９９９，１９９０；アカキヤベツ、キキヨ
ウ、ロベリア、ラークスパー、チヨウマメ：Ｇｏｔｏ
ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．
Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：１７，１９９１；ニンジン：Ｇ
ｌａｂｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ３１：１５９３，１９９２；アサガオ：Ｌｕ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２；６５
９，１９９２； キランソウ、トウバナ、オドリコソ
ウ、ラベンダー、イヌハッカ、オオキセワタ、プレクト
ランサス、ウツボグサ、ヒゴロモソウ、ネジリイモ：Ｓ
ａｉｔｏ ａｎｄ Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｐｈｙｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ３１：３００９，１９９２；オオオニバ
ス：Ｓｔｒａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ３１：９８９，１９９２；カンパニュラ：Ｂ
ｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，３３：２０９，１９９
３）。
【０００５】これらのアントシアンを含むフラボノイド
を修飾するアシル基は構造的に２種類に分けられる。一
つはハイドロキシ桂皮酸を中心とする芳香族アシル基で
あり、もう一つはマロニル基のような脂肪族アシル基で
ある。これらのアシル基転移反応のうち、グルコースを
介して芳香族アシル基、好ましくはクマル酸やコーヒー
酸が結合したアントシアンはその吸収極大が長波長側に
移動することがアサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉ
ｌ）のアントシアン系色素を用いた実験により観察され
た（Ｄａｎｇｌｅｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ３４：１１１９，１９９３）。
【０００６】さらに、サイネリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃ
ｒｕｅｎｔｕｓ）由来のシネラリンは１個の脂肪族アシ
ル基と３個の芳香族アシル基を有するが、シネラリンか
らの芳香族アシル基の解離により、中性の水溶液中で色
素の安定性が低下することが報告されている（Ｇｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ２５： ６０
２１，１９８４）。また、リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ
ｍａｋｉｎｏｉ）に由来するゲンチオデルフィンはその
分子内に存在する２つの芳香族アシル基により、サンド
イッチ型の分子内スタッキングが起こり、水溶液中で色
素が安定化されることが報告されている（Ｙｏｓｈｉｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８：４３
１３，１９９２）。さらに、吉田らは、リンドウのアン
トシアニンにはアントシアニンの５位のグルコースと
３’位のグルコースのそれぞれにアシル基が結合してい
ることを明らかにした（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８，
４３１３，１９９２）。また、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ
ｏｃｉｍｏｉｄｅｓ）の葉のアントシアニンはシアニジ
ン３，５−ジグルコシドの３位のグルコースにクマール
酸が結合したシソニンであることも報告されている（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２７，２４１３−
２４１６，１９７８）。
【０００７】しかしながら、これらの研究は有機化学的
側面から天然色素の構造学的研究においてなされてお
り、アシル基を転移する酵素を単離するなどの生化学的
側面からの研究はなされていない。
【０００８】また、植物におけるアントシアン系色素へ
のアシル基転移酵素のうち、脂肪族アシルであるマロニ
ル基転移酵素についてはパセリの培養細胞（Ｍａｔｅｒ
ｎｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．２０８：２３３，１９８１；Ｍａｔｅｒｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．２２６：２０６，１９８３；Ｍａｔｅｒｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｃｍ．１３３：４３
９，１９８３）やＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｎｔｉｕｍの実
生（Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３４：５１３，１９８４）
からのものを始めとして多くの報告が為されている。
【０００９】また、芳香族アシル基転移反応は１９８０
年にナデシコ科の植物であるＳｉｌｅｎｅ（Ｋａｍｓｔ
ｅｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．Ｐｆｌａｎｚｅｎ１７５：４０３，１９８０）で初
めて示され、Ｍａｔｔｈｉｏｌａ の可溶化酵素画分に
も同様の芳香族アシル基転移酵素活性が見い出されてい
る（Ｔｅｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ２６：９９１，１９８６）。
【００１０】しかしながら、これらの報告では酵素活性
の存在を示したのみに留まっており、対応する酵素蛋白
質を特定したり、その一次構造やさらにはそれをコード
する遺伝子についてはなんら知見が得られていない。そ
れ以外の芳香族アシル基転移酵素についても蛋白質や遺
伝子の一次構造を明らかにした報告はなく、さらにこの
アントシアン系色素のアシル化反応を花色幅の拡大に積
極的に利用して花を育種した例や、アシル化を用いてア
ントシアンの安定化をはかった報告もない。
【００１１】一方、ぺチュニア（Ｐｃｔｕｎｉａ ｈｖ
ｂｒｉｄａ）のアントシアニンの生合成経路はよく研究
されており （Ｗｉｅｒｉｎｇ，Ｈ．ａｎｄ ｄｅ Ｖ
ｌａｍｉｎｇ，Ｐ．Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆｐｉｇｍｅｎｔｓ．Ｐ
ｅｔｕｎｉａ，Ｐ４９−６５，（１９８４）、Ｇｒｉｅ
ｓｂａｃｈ，Ｒ．Ｊ．，ａｓｅｎ，Ｓ．ａｎｄＬｅｏｎ
ｈａｒｄｔ，Ｂ．Ａ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，３０，１７２９−１７３１，１９９１）、アシル基
を含むアントシアニンが存在することが知られている。
ぺチュニアのアントシアニンのアシル基はクマル酸ある
いはカフェ酸が知られており、アントシアニンの３位の
ルチノシドに一分子のクマル酸又はカフェ酸が結合して
いて、化学構造はアントシアニジンがマルビジンの場
合、それぞれ３−０−（６−０−（４−０−クマロイ
ル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−５−０−β−Ｄ−
グルコピラノシル−マルビジン、３−０−（６−０−
（４−０−カフェオイル）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−５−０−β−Ｄ−グルコピラノシル−マルビジン
であるとされていた。しかし、アシル基を２つ持つアン
トシアニンについての報告例はなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物由来の
芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺
伝子及びその利用に関するものである。即ち、当該利用
に関しては、植物において、フラボノイド、好ましくは
アントシアンへのアシル基転移反応を制御する方法が挙
げられ、それにより単一種が広範囲の花色を発現する可
能性を提供する。特に、芳香族アシル基の転移により、
アントシアンの吸収極大が長波長側に移動することか
ら、既存の花色に青味を持たす場合に有効であると考え
られる。
【００１３】これらの技術を実現化させるためには芳香
族アシル基転移反応をつかさどる酵素を明らかにし、そ
の酵素をコードするｃＤＮＡを分離する必要がある。更
に、一つのアシル基転移酵素のｃＤＮＡから遺伝子の相
同性を利用して他のアシル基転移酵素遺伝子の分離が可
能となる。また、アシル化によりアントシアンの安定性
が増すことから、安定なアントシアン色素の生産も可能
となる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リンドウ
の花弁からアシル基転移酵素を精製し、その一次構造を
決定した。更には、遺伝子組換え技術を用いてリンド
ウ、ぺチユニア、シソ及びサイネリアのアシル基転移酵
素のｃＤＮＡを単離し、構造遺伝子の塩基配列を決定し
た。即ち、本発明はリンドウ、ぺチュニア、サイネリア
の花弁及びシソの葉に存在するアシル基転移酵素をコー
ドしているＤＮＡ配列を提供するものである。また、本
発明に係る酵素を用いてアントシアン系色素をアシル化
することにより花色を変化させることができ、アントシ
アンの安定性を増すことができる。
【００１５】アシル基転移酵素をコードする遺伝子は例
えば次のようにして得ることが出来る。即ち、まず、リ
ンドウの花弁よりアシル基転移酵素を精製する。従来、
本発明が成される以前に、芳香族アシル基転移酵素の精
製に成功した例はなく、本発明者らは各種のクロマトグ
ラフィー法、特にシバクロンブルー３ＧＡ（Ｃｉｂａｃ
ｒｏｎＢｌｕｅ３ＧＡ）を固定した樹脂（例えば、ブル
ーセファロース（登録商標）樹脂等）を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー法を行うことにより初めて当
該酵素の精製に成功した。次に、常法に従ってアシル基
転移酵素の部分アミノ酸配列を解明し、それらのアミノ
酸配列に対応する合成ヌクレオチドを作製する。
【００１６】一方、同じリンドウの花弁よりｐｏｌｙ
Ａ＋ＲＮＡを抽出し、常法により、２本鎖ｃＤＮＡを合
成し、更にｃＤＮＡライブラリーを作製する。前述の２
本鎖ｃＤＮＡを鋳型にし、前述の合成ＤＮＡとｃＤＮＡ
を合成する際に使用した合成ＤＮＡプライマーを用い、
ＰＣＲ法により、アシル基転移酵素遺伝子に特異的なＤ
ＮＡ断片を取得する。次に、このＤＮＡ断片をプローブ
にして、前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、陽性クローンを得る。そして、このクローンから回
収されるプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ塩基配列を
決定する。更に精製したアシル基転移酵素の分析により
得られたアミノ酸配列とＤＮＡ塩基配列から推定したア
シル基転移酵素のアミノ酸配列とを比較することによ
り、陽性クローンが求めるｃＤＮＡクローンであること
を確認する。
【００１７】また、このクローンを大腸菌及び酵母での
遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定するこ
とにより、得られた遺伝子がアシル基転移酵素をコード
していることを確認し、アシル基転移酵素遺伝子の翻訳
領域を明らかにすることにより本発明に係るアシル基転
移酵素をコードする遺伝子が得られ、更に、当該遺伝子
を発現させることにより遺伝子産物である目的のアシル
基転移酵素蛋白を得ることができる。
【００１８】また、本発明者らは、ぺチュニア品種サフ
ィニアパープル（サントリー（株））の花色が通常の赤
紫から紫に変化した変異株（ＶＭ）を見いだし、アント
シアニンの構造決定を、例えば吉田らの文献（Ｙｏｓｈ
ｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８；
４３１３，１９９２）に記載の方法に従って行った。
【００１９】なお、本明細書においてはリンドウ、ぺチ
ュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル基転移酵素に
ついて述べているが、当該酵素の精製法をそのまま又は
一部を改変して、他の植物のアシル基転移酵素を精製
し、当該酵素に係るアミノ酸配列を決定することによ
り、当該酵素をコードする遺伝子をクローニングするこ
とができる。更に、本発明に係るリンドウ由来のアシル
基転移酵素のｃＤＮＡをプローブとして用いることによ
り、リンドウから別のアシル基転移酵素のｃＤＮＡ）ぺ
チュニアから別のアシル基転移酵素のｃＤＮＡを得るこ
とができた。従って、アシル基転移酵素の遺伝子の一部
または全部を用いると、他のアシル基転移酵素遺伝子を
得ることができる。また、これらのアミノ酸配列を比較
したところ、保存されているアミノ酸配列があった。こ
の領域を用いて、シソ及びサイネリア由来のアシル基転
移酵素のｃＤＮＡを得ることに成功したが同様の手法を
用いることにより、他の植物に応用し、類似のアシル基
転移酵素のｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡクローンを得るこ
とが可能である。
【００２０】また、本明細書において示したように、リ
ンドウ、ぺチュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル
基転移酵素を精製し、常法に従って当該酵素に対する抗
体を得ることにより、その抗体と反応する蛋白質を作る
ｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡをクローニングすることがで
きる。従って、本発明はリンドウ、ぺチュニア、シソ及
びサイネリア由来のアシル基転移酵素の遺伝子のみに限
定されるものではなく、広く芳香族アシル基転移酵素に
関するものである。
【００２１】また、本明細書においてはアントシアンを
含むフラボノイドのアシル基転移反応において、アシル
基の供与体としてｐ−クマロイル−ＣｏＡ又はカフェオ
イル−ＣｏＡ等のＣｏＡエステルを挙げたが、ｐ−クマ
ロイル、フェルロイル又はシナポイル−１−Ｏ−グルコ
ースといったハイドロキシシンナモイル−１−Ｏ−グル
コースも芳香族アシル基の供与体としての利用が可能で
あるので（Ｇｌａｓｓｇｅｎａｎｄ Ｓｅｉｔｚ，Ｐｌ
ａｎｔａ１８６：５８２，１９９２）、本発明に係る酵
素を用いた利用が可能である。
【００２２】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明
する。実験の手順は特に記述しない限りＳａｍｂｒｏｏ
ｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従った。実施例１ 植物からのアシル基転移酵素の検索 （１）基質の調製 デルフィニジン３，５−ジグルコシドおよびシアニジン
３，５−ジグルコシドはバーべナ（Ｖｃｒｂｅｎａ ｈ
ｙｂｒｉｄａ）の一品種であるタピアンバイオレット
（サントリー（株）より購入可能）の花弁からそれぞれ
のジアセチル体を抽出し、脱アセチル化することにより
取得した。タピアンバイオレットの花弁（３４８ｇ）を
液体窒素とともにホモジナイザーで摩砕し、５０％（ｖ
／ｖ）アセトニトリル、０．２％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）溶液１．５Ｌに浸して３日間放置した。
【００２３】濾紙上にケイソウ土（＃１００）を敷き詰
めて吸引ろ過し、ロータリーエバポレーターで約半分量
に濃縮して、ＨＰ−２０（ファルマシア社）にて、ゲル
濾過を行った。８００ｍｌの蒸留水で洗浄後、５０％ア
セトニトリル、０．１％ＴＦＡ ８００ｍｌで色素画分
を溶出した。エバポレーターで濃縮後、凍結乾燥して、
粗色素（７．３ｇ）を得た。
【００２４】タピアンの主色素はデルフィニジン及びシ
アニジンの３，５−ジアセチルグルコシドであるため、
以下の脱アセチル化操作を行った。粗色素１ｇをメタノ
ール５０ｍｌに溶解し、窒素ガスを１５分間通気して溶
存酸素を除いた後、氷冷した。
【００２５】一方で、１Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍｌか
ら同様に溶存酸素を除き、氷冷下で先の色素溶液に撹拌
しながら滴下し、更に３０分間撹拌して加水分解反応を
させた。６Ｎ塩酸１ｍｌを加えて反応を停止させ、蒸留
水５ｍｌを加えてエバポレーターで約半量に濃縮し、終
濃度１０％になるようにメタノールを加えて２ｍｌずつ
Ｓｅｐ Ｐａｃ Ｃ１８カラム（ウォーターズ アソシ
エーション社）にアプライし．、蒸留水５ｍｌで洗浄し
た後、３０％アセトニトリル、０．６％ＴＦＡ２ｍｌで
溶出させた。
【００２６】溶出液をすべて集めてエバポレーターで濃
縮し、ＨＰＬＣによる分取を行った。ＤＥＶＥＬＯＳＩ
Ｌ ＯＤＳ−１０／２０（５０×３００ｍｍ；野村化学
（株））カラムを用い、１２０分間でＴＦＡが０．１％
から０．３％、アセトニトリルが１０％から３０％の直
線濃度勾配によって溶出させた。毎分３２ｍｌの流速で
０．５分毎に分取し、各画分の色素画分の吸収スペクト
ルを測定して、デルフィニジン３，５−ジグルコシドお
よびシアニジン３，５−ジグルコシドを分離してそれぞ
れを濃縮、凍結乾燥した（デルフィニジン３，５−ジグ
ルコシド ７５ｍｇ、シアニジン３，５−ジグルコシド
５０ｍｇ）。各々を１．５ｍｇ／ｍｌになるように
０．５％ＴＦＡに溶解して、使用するまで−８０℃に保
存した。
【００２７】もう一方の基質であるヒドロキシシンナモ
イル−ＣｏＡの合成は以下の方法で行った。最初に、文
献（Ｓｔｏｃｋｉｇｔ ａｎｄ Ｚｅｎｋ，Ｚ．Ｎａｔ
ｕｒｆｏｒｓｃｈ．３０：３５２，１９７５）に従って
カフェ酸（ナカライテスク社）とＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）よりエステルを合
成した。このエステル０． ５ｍｍｏｌを２ｍｌのアセ
トンに溶解し、一方でコエンザイムＡ（ＣｏＡ：ＫＯＨ
ＪＩＮ）０．１ｍｍｏｌと炭酸水素ナトリウム１ｍｍｏ
ｌとを２０ｍｌの水に溶解して、これに先のエステル溶
液を１滴ずつ加えた。
【００２８】撹拌しながら窒素ガスの下で室温で一晩反
応させた後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、遠心
（２７０００×ｇ、１０分）によって不溶物を除いて、
ＨＰＬＣで目的の生成物を分取した。ＤＥＶＥＬＯＳＩ
Ｌ ＯＤＳ−１０／２０（５０×３００ｍｍ；野村化学
（株））カラムを用い、０．１％ＴＦＡ存在下でアセト
ニトリルが４０分間で１８％から３６％の直線濃度勾配
によって溶出させた。毎分３２ｍｌの流速で０．８分毎
に分取し、各画分の吸光スペクトル（２００〜４００ｎ
ｍ）を調べて３４４〜３４８ｎｍに極大吸収を持つ画分
をカフェオイルＣｏＡ画分として集めた。それらをロー
タリーエバポレーターで濃縮した後、同じカラムで再び
分離した。
【００２９】但し、アセトニトリル１８％、ＴＦＡ０．
１％の等濃度クロマトグラフィーで分離を行い、同様に
吸光スペクトルを調べて、目的の化合物を含む画分をロ
ータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥した。この
方法で３５μｍｏｌの生成物が得られた。また、上記の
方法中カフェ酸のかわりにクマル酸を用いることにより
ｐ−クマロイル−ＣｏＡが合成でき２ｍｇ／ｍｌになる
ように蒸留水に溶解して、使用するまで−８０℃に保存
した。
【００３０】（２）粗酵素液の抽出方法 酵素を抽出する植物組織（花弁や食用部分等）３ｇを液
体窒素で凍結させて乳鉢上で磨砕した。１０ｍｌの抽出
用緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１４ｍＭ２−メルカ
プトエタノール）を加えて更に磨砕し、ガーゼ３層で濾
過した。ＤＯＷＥＸ（１−Ｘ２、１００−２００ｍｅｓ
ｈ；室町化学工業（株））３ｇを添加して１０分間撹拌
した後に吸引ろ過によって樹脂を除去し、遠心分離（２
７０００×ｇ、２０分）によって植物体残査を除いた。
７０％飽和硫安で塩析を行い、タンパク質を沈殿させ
た。沈殿を１ｍｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル）に懸濁し、遠心分離（２７０００×ｇ、５分）によ
って不溶物を除去した後、溶解用緩衝液で平衡化させた
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０；フ
ァルマシア社）を用いて脱塩した溶液を粗酵素液として
用いた。
【００３１】（３）酵素活性の測定方法 １００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、デルフィニ
ジン３，５−ジグルコシド ２４ｎｍｏｌ、カフェオイ
ル−ＣｏＡ ２１．５ｎｍｏｌ、及び酵素液２０μｌを
含む反応液５０μｌを３０℃で１０分間反応させた。１
３．８％（ｖ／ｖ）酢酸を含むアセトニトリル５０μｌ
を加えて反応を停止させ、遠心分離（１８０００×ｇ、
５分）によって不溶物を除いた後、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。分析はＣ１８逆相カ
ラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、６．０×１５０
ｍｍ；ワイエムシィ社）を用い、２１．６％アセトニト
リル、０．１％トリフルオロ酢酸を毎分１ｍｌの流速で
流し、反応液２０μｌを分析した。化合物の検出には三
次元クロマトグラフィーシステム（ＣＬＡＳＳ−ＬＣ１
０；（株）島津製作所）を使用し、生成物は，基質には
ない３３０ｎｍ付近に極大吸収をもつこと、及び可視部
の吸収極大値が５１９ｎｍから５２５ｎｍへと約６ｎｍ
長波長側に移動していることから、アシル基（カフェ
酸）が結合し、デルフィニジン３−グルコシル５−カフ
ェオイルグルコシドが生成していることを確認した。
【００３２】５２０ｎｍの波長で検出し、基質（デルフ
ィニジン３，５−ジグルコシド）と生成物（デルフィニ
ジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシド）との
ピーク面積の和に対する生成物のピーク面積の比を求
め、生成物のモル数を計算して酵素活性（ｋａｔ）とし
た。このＨＰＬＣ分析における各化合物の展開時間は次
の通りである。カフェオイル−ＣｏＡ：６．３分、デル
フィニジン３，５−ジグルコシド：３．３分、デルフィ
ニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシド：
５．３分。
【００３３】但し、この反応条件下においては反応液中
のデルフィニジン３，５−ジグルコシドがアシル基転移
酵素により、カフェ酸で修飾されることにより、反応液
の色が濃青色から赤紫色に変化するため、簡便な方法と
して、マイクロタイタープレート中にて反応を行い、色
の変化によって酵素活性を調べることができる。なお、
反応後のプレートを室温で長期間（１日〜１週間）放置
すると、アシル化されていないデルフィニジン３，５−
ジグルコシドは無色化するのに対して、酵素の働きによ
ってアシル化されたデルフィニジン３，５−ジグルコシ
ドでは赤紫色が残ることから、デルフィニジン３，５−
ジグルコシドがアシル化されることによって中性からア
ルカリ性の水溶液中での安定化が認められた。同様にシ
アニジン３，５−ジグルコシドを基質とした場合も反応
液の色が赤紫色から濃青色に変化し、色素が安定化する
ことから、簡易的酵素アッセイ方法での酵素活性の検出
が可能である。
【００３４】一方、カフェオイル−ＣｏＡのかわりにｐ
−クマロイル−ＣｏＡを基質とした場合もアシル化によ
る色の変化及びアントシアニンの安定化が認められる
が、色調の変化の度合いはカフェオイル−ＣｏＡの場合
に比べ少ない。
【００３５】（４）アシル基転移酵素の検索 各種の植物（リンドウ、アイリス、デルフィウム、スト
ック、トルコキキョウ、ナデシコ、スイーピー、ラーク
スパー、パンジー（以上、花弁）、赤キャベツ、赤タマ
ネギ、金時ニジン、西洋ニンジン、ムラサキイモ（以
上、食用部分）及びナス（果実上皮部分））から上記の
方法によって粗酵素液を抽出し、酵素活性を測定したと
ころ、トルコキキョ、ナデシコ及び、リンドウに各々
０．６３、０．００１２及び２１．８ｎｋａｔ／ｍｇ蛋
白質のアシル基転移活性が認められた。抽出タンパク質
当たりのアシル基転移酵素活性が最も高いリンドウを酵
素精製の材料として用いることにした。なお、タンパク
質濃度の定量にはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
ｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。
【００３６】実施例２ リンドウ由来のアシル基転移酵
素の精製 （１）酵素の精製 エゾリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ
ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の花弁から酵素の精製を行
った。以下の実験は記載がない限り、０〜４℃で行っ
た。エゾリンドウの花弁３ｋｇを液体窒素存在下でエク
セル・オート・ホモジナイザー（ＤＸ−３；日本精機製
作所）を用い磨砕した。８Ｌの抽出用緩衝液（１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭアスコルビン酸ナ
トリウム、１０ｍＭ ｐ−アミジノフェニルフッ化メタ
ンスルフォル塩酸塩（ｐ−ＡＰＭＳＦ；和光純薬工業
（株））、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ；ナカラ
イテスク社））とポリクラールＳＢ−１００（和光純薬
工業（株））５００を加えてポリトロンで完全に粉砕し
た。
【００３７】粉砕液をガーゼ４層で搾ったのち、さらに
遠心分離（１１０００×ｇ、３０分）して細胞残査を除
去した。４０％飽和硫安で塩析を行い、不溶物を除去し
た後に７０％飽和硫安で再び塩析を行った。沈殿を２５
０ｍｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
０）、１０ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）に
懸濁し、遠心分離によって不溶物を除去した後、同緩衝
液で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（９５×
１１０ｍｍ；ファルマシア社）のカラムを用いて脱塩し
た。蛋白質を含む画分を集め（８６０ｍｌ）、以下のク
ロマトグラフィーに供した。なお、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ及
びＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅの各クロマトグラフ
ィーは室温でＦＰＬＣシステム（ファルマシア社）を用
いて行った。
【００３８】まず、溶解用緩衝液で平衡化させたＱ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（２６×１００
ｍｍ；ファルマシア社）にアプライし、同じ緩衝液で十
分に洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を６０分間で０Ｍ
から０．４Ｍに変化させる直線勾配により溶出させた
（８ｍｌ／ｍｉｎ）。酵素活性のある画分を集めた（１
３０ｍｌ）後、アフィニティクロマトグラフィーを行っ
た。溶解用緩衝液で平衡化させたＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕ
ｅ（５ｍｌ、１、６×２５ｍｍ；ファルマシア社）を３
本直列に繋いだカラムにアプライし、同緩衝液で十分に
洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出
させた。活性画分を７０％飽和の硫安で塩析し、蛋白質
の沈殿を得た。
【００３９】この沈殿物を１ｍｌの溶解用緩衝液に懸濁
して遠心分離によって不溶物を除いた後、溶解用緩衝液
で平衡化させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（２５
×１１５０ｍｍ；ファルマシア社）にアプライした。毎
分０．２ｍｌの流速で、約３ｍｌずつ分取し、再び活性
画分を集めて（２７ｍｌ）、１Ｍになるように硫安を加
えた。十分に撹拌した後、遠心分離（３９０００×ｇ、
１０分）により不溶物を除去し、１Ｍ硫安を含む溶解用
緩衝液で平衡化させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ
５／５（５．０×５０ｍｍ；ファルマシア社）にアプ
ライした。
【００４０】毎分０．５ｍｌの流速で、十分に洗浄した
後、硫安濃度を６０分間で１Ｍから０Ｍに直線的に下げ
ることにより蛋白質を流出させた。０．５ｍｌずつ分取
した各画分の酵素活性を測定し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（１０％アクリルアミドゲル；第一
化学（株））で分析した結果、ほぼ単一の蛋白質として
分子量約５０，０００のバンドが認められ、且つこの蛋
白量と活性との相関が認められることから、この蛋白質
が目的のアシル基転移酵素であると断定した。更に単一
標品を得るために活性を持つ画分（１２ｍｌ）を逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製した。
【００４１】カラムはＤＥＶＥＬＯＳＩＬ ３００Ｃ４
−ＨＧ−５（４．６×２５０ｍｍ；野村化学（株））を
用い、毎分１ｍｌの流速で、トリフルオロ酢酸０．１％
存在下、３０分でアセトニトリル濃度を４０．５％から
５６．７％の直線濃度勾配で変化させることにより溶出
させた。２８０ｎｍの吸収をモニターしながら１ｍｌず
つ分画し、さらに各画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析して分子量約５０，０００の蛋白質
を含む画分を集めた。このＨＰＬＣ操作を３０回繰り返
し、スピードバック（サバント社）で濃縮することによ
り約０．２ｍｇの単一蛋白質標品を得ることができた。
【００４２】（２）精製蛋白質の分析 ５００ｐｍｏｌの精製標品をアミノ酸シークエンサー
（ＰＳＱ−１；（株）島津製作所）に供したところ、エ
ドマン分解の第一段目で２００ｐｍｏｌのグルタミン
酸、更に第二段でも９０ｐｍｏｌのグルタミン酸が検出
されたが、三段目以降は判読不能であったため、本酵素
のＮ末端は何らかの形でブロックされていると考えられ
た。
【００４３】しかしながら、Ｎ末端がグルタミン酸であ
る場合にはピログルタミル基が生じ、エドマン分解によ
るシークエンスでは上述のような結果を示すことが知ら
れていることから本酵素のＮ末端はグルタミン酸である
可能性が高い。
【００４４】残りの沈殿を８０μｌの４５ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．５）、３．６Ｍ尿素、０．０９％ＳＤＳを
含む溶液に溶解し、リシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ
ｙｌＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ：Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
ｃｔｏｒ ｌｙｔｉｃｕｓ由来；和光純薬工業（株））
１６ｐｍｏｌを加えて、３７℃で６時間反応させた。反
応液をそのままＤＥＶＥＬＯＳＩＬ ３００Ｃ４−ＨＧ
−５カラムで分離した。
【００４５】分離条件は、０．１％トリフルオロ酢酸の
もと、７０分でアセトニトリル濃度が０％から８０％の
直線濃度勾配、毎分０．７ｍｌの流速で、２１０ｎｍの
吸収をモニターしながら吸収のピーク画分のみを分取し
た。得られた１３本のピーク画分のうち、アセトニトリ
ル濃度が３２％から４０％の時点で溶出されたピーク画
分の３本を、スピードバックによる濃縮後、さらにＯＤ
Ｓカラム（ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ ３０００ＤＳ−ＨＧ−
５；野村化学（株））を用い、先と同じ条件で分離及び
精製を行った。
【００４６】各ピーク画分をスピードバックで濃縮・乾
固させ、４０％アセトニトリル３０μｌに溶解させ、ア
ミノ酸シークエンサーに供した。その結果６本のぺプチ
ドのアミノ酸配列を判読することができた。以下に、各
々のぺプチドのアミノ酸配列を示す（アミノ末端からカ
ルボキシル末端の方向に示す）。
【００４７】アミノ酸配列（ＡＴ７３）；
【化１】
【００４８】アミノ酸配列（ＡＴ７２）；
【化２】
【００４９】アミノ酸配列（ＡＴ７４１−１）；
【化３】
【００５０】アミノ酸配列（ＡＴ７４１−２）；
【化４】
【００５１】アミノ酸配列（ＡＴ９）；
【化５】
【００５２】アミノ酸配列（ＡＴ８３）；
【化６】
【００５３】実施例３ リンドウ由来のアシル基転移酵
素のｃＤＮＡクローニング（１） （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 市販されているリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆ
ｌｏｒａ ｖａｒ．ｊａｎｏｎｉｃａ）から花弁を集
め、液体窒素中で乳鉢で磨砕した。この磨砕物から、グ
アニジンチオシアネート／塩化セシウムを用いる方法に
よりＲＮＡを得、オリゴテックス（日本ロッシュ）を用
い、製造者が推奨する方法にて、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを
得た。グアニジンチオシアネート／塩化セシウムを用い
る方法は、Ｒ．ＭｃＧｏｏｋｉｎ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．
Ｓｌａｔｅｒらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ２，（Ｈｕｍａｎａ
ＰｒｅｓｓＩｎｃ．１９８４）に詳細に示されている方
法に従った。
【００５４】得られたｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡを鋳型と
し、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン杜
製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、フアージベクタ
ーλＺＡＰＩＩへのクロ−ニングを行った。更に、同社
のＧｉｇａｐａｃｋＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇ Ｅｘｔｒａｃｔキットを用いて、当該キットに記載
された方法でｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５５】（２）合成ＤＮＡプライマーの設計 実施例２で得られた部分アミノ酸配列のうち、
【００５６】
【化７】 で示される配列は、リジルエンドペプチダーゼの特異性
を考えると、
【００５７】
【化８】 であると考えられる。この配列の中の
【００５８】アミノ酸配列；
【化９】 で示される部分を用いて、以下のオリゴヌクレオチドを
合成した。
【００５９】ヌクレオチドの配列（オリゴ１）；
【化１０】
【００６０】但し、特に記載のないかぎり、核酸の配列
はＩＵＰＡＣ−ＩＢＵ準拠の核酸コード表に従って一文
字で表記する。即ち、Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、
Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン、Ｙ：Ｃ又はＴ、Ｒ：Ａ又は
Ｇ、Ｍ：Ａ又はＣ、Ｈ：Ａ又はＣ又はＴ、及びＩはイノ
シンを示す。また、先に述べたｃＤＮＡライブラリー作
製時に使用したプライマーをもとに以下の他のオリゴヌ
クレオチドも合成した。
【００６１】ヌクレオチドの配列（オリゴ２）；
【化１１】
【００６２】（３）アシル基転移酵素遺伝子断片のクロ
ーニング リンドウの花弁のＲＮＡに由来する２本鎖ｃＤＮＡ約
０．１μｇを鋳型にオリゴ１とオリゴ２をプライマーと
して、ＰＣＲ反応を行った。反応はポリメラーゼチェイ
ン反応キットＧｅｎｅ Ａｍｐ（宝酒造（株））を用い
て、９５℃１分、４５℃１分、７２℃２分を１サイクル
とし、３５サイクル行い、得られた反応物を１％アガロ
ース電気泳動したところ、約４００ｂｐの特異的なＤＮ
Ａ断片が観察された。このＤＮＡ断片を回収し、その１
０ｎｇをＤＩＧ−ヌクレオチド混合液（ベーリンガー
社）と合成ヌクレオチドＩとＩＩを用いて、前述のＰＣ
Ｒ反応を２５サイクル行い、ＤＩＧで標識したＤＮＡ断
片を得た。
【００６３】（４）アシル基転移酵素のｃＤＮＡのクロ
ーニング 上記のようにして得られたλファージライブラリーを大
腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ストラタジーン社）に感染さ
せ、１プレート当りプラーク５万個を含む５枚のプレー
ト（直径１３．５ｃｍ）をスクリーニングした。
【００６４】ファージをフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ
＋、アマーシャム社）に吸着させ、製造者の推奨する方
法で処理した後、このフィルターをハイブリダイゼーシ
ョンバッファー（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５
０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、
７％ＳＤＳ、２％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ
（ベーリンガー社）、０．１％ラウロイルサルコシン、
８０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で４２℃で１時間保
持した。ＤＩＧ標識した前述のＤＮＡ断片をハイブリダ
イゼーション液中に加え、さらに１６時間のインキュベ
ーションを行った。
【００６５】洗浄液（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ）でフィルターを洗浄し、アルカリホスファターゼで
標識されたＤＩＧ特異的な抗体による酵素免疫測定法
（ベーリンガー・マンハイム株式会社）により５−ブロ
モ４−クロロ３−インドリルリン酸とニトロブルーテト
ラゾリウム塩の発色反応によって検出した。検出方法は
製造者による使用説明書に従った。
【００６６】この結果、数十個の陽性クローンが得ら
れ、うち２０クローンをストラタジーン社の推奨する方
法で、ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ上に回収した。アガロースゲル電気泳動でｃＤＮＡ
の挿入を調べたところ、全てのクローンにおいて各種サ
イズのｃＤＮＡの挿入が認められ、そのうち最長のもの
は１．７ｋｂであった。それらのうちから適当に９クロ
ーン選び制限酵素による解析を行ったところ、サイズは
異なるが全てのクローンで同様の制限酵素パターンを示
した。
【００６７】（５）塩基配列の決定 得られたクローンからプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３７
３Ａ・ＤＮＡ シークエンサー（パーキンエルマー社）
を用い、同社の推奨する蛍光試薬によるダイデオキシ
シークエンス法で、前述の９クローンのうち全長を含む
と考えられる６つのクローン（ｐＧＡＴ２、ｐＧＡＴ
３、ｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ７、ｐＧＡＴ８及びｐＧＡＴ
１１）についてｃＤＮＡの５’側の塩基配列を決定し
た。
【００６８】その結果、これらのクローンは互いに同じ
塩基配列を持っており、ｃＤＮＡの長さが異なるものと
考えられた。これらのクローンのうちｐＧＡＴ４の全塩
基配列を決定した。塩基配列の決定は、Ｋｉｌｏ−Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ用 Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ （宝酒造
（株））を用いて、一連の欠失クローンを得た後、各々
のクローン用いて上述の方法により行った。
【００６９】（６）塩基配列とアミノ酸配列の比較 ｐＧＡＴ４に挿入されたｃＤＮＡは１７０３塩基であり
その中に１４１０塩基（終止コドンを含む）からなるオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出され
た。この配列を配列表・配列番号１に示す。実施例２で
明らかになったアシル基転移酵素の部分アミノ酸配列の
全てがＯＲＦ中のアミノ配列として存在することから、
クローニングされたｃＤＮＡは、リンドウ由来のアシル
基転移酵素遺伝子であると結論した。開始コドンについ
ては、アミノ末端の解析からグルタミン酸がアミノ末端
の残基であると推測されたので、ｃＤＮＡの塩基配列の
上で、５’側から最初のＡＴＧが開始コドンであると推
察した。
【００７０】一方、ｐＧＡＴ８に係るｃＤＮＡは、５’
側がｐＧＡＴ４よりも７塩基短いため、完全長のｃＤＮ
Ａではないと考えられた。
【００７１】実施例４ 大膓菌における遺伝子の発現 （１）発現プラスミドの構築 大腸菌でのアシル基転移酵素遺伝子の発現には、大腸菌
の発現べクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア
社）を用いた。このｐＴｒｃ９９Ａはイソプロピルーβ
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能
な大腸菌のｔｒｃプロモーターを含み、その下流に目的
遺伝子を挿入することにより、大腸菌での遺伝子発現が
可能になる。
【００７２】また、制限酵素ＮｃｏＩ部位が開始コドン
であるＡＴＧ配列を利用して導入されており、ＮｃｏＩ
部位で組換えることにより、目的遺伝子の開始コドンか
らの直接発現が可能である。
【００７３】ｐＧＡＴ４を当該べクター内に存在する制
限酵素部位ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られる約
１．８ｋｂ（７）ＤＮＡ断片（配列表・配列番号１記載
の塩基配列を全て含む）を前述のｐＴｒｃ９９Ａ（７）
ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位に組換えることにより、ｐＧ
ＡＴ１０１を構築した。
【００７４】アシル基転移酵素の開始コドン近傍にＮｃ
ｏＩ部位の導入を行うために、開始コドン近傍、及びア
シル基転移酵素遺伝子内部（開始コドンから３００塩基
目付近）に対応する以下の２種類のオリゴヌクレオチド
を合成した。
【００７５】オリゴヌクレオチド（ＧＡＴ−Ｎｃｏ
Ｉ）；
【化１２】
【００７６】オリゴヌクレオチド（ＧＡＴ−Ｓｃａ
Ｉ）；
【化１３】
【００７７】１０ｎｇのｐＧＡＴ４を鋳型とし、上記の
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行
った。反応はポリメラーゼチェイン反応キットＧｅｎｅ
Ａｍｐ（宝酒造（株））を用いて、９５℃１分、５６
℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、１５サイクル行
い、得られた反応物を１％アガロース電気泳動したとこ
ろ、約３００ｂｐの特異的なＤＮＡ断片が観察された。
このＤＮＡ断片を回収し、制限酵素ＮｃｏＩとＡａｔＩ
で切断後、ｐＧＡＴ１０１をＮｃｏＩとＡａｔＩで切断
して得られる約６ｋｂの断片と連結することにより、ｐ
ＧＡＴ１０２を構築した。ＰＣＲ法により増幅した部分
の塩基配列はｐＧＡＴ１０２構築後にｐＧＡＴ４と同じ
であることを確認した。
【００７８】（２）アシル基転移酵素遺伝子の大腸菌で
の発現 ｐＧＡＴ１０２で大腸菌ＭＭ２９４ （ｓｕｐＥ４４
ｈｓｄＲ ｅｎｄＡｌｐｒｏ ｔｈｉ）（Ｍｅｓｅｌｓ
ｏｎ ａｎｄ Ｙｕａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２１７，１１
１０−，１９６８）を形質転換した。なお、ここで形質
転換される宿主は、形質転換用の宿主として利用可能な
大腸菌であれば特に特定されるものではなく、遺伝子組
換えに一般に用いられ、当業者が容易に入手できるその
他の株（例えば、ＪＭ１０９やＤＨ５等）を利用するこ
とができる。また、大腸菌の形質転換方法はＨａｎａｈ
ａｎの方法．に従った（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１６６，５５７−，１９８３）。形質転換された大腸菌
をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌ（７）
ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩
化ナトリウム １０ｇを１リッターの蒸留水に溶かし、
水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整する）に植菌
し、３７℃で一晩培養した。
【００７９】この培養液１ｍｌを１０ｍｌ（７）Ｍ９培
地（リン酸一水素ナトリウム ０．６％、リン酸二水素
カリウム ０．３％、塩化ナトリウム ０．５％、塩化
アンモニウム ０．１％、グルコース ０．５％、硫酸
マグネシウム １ｍＭ、ビタミンＢ１４μｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈ７．２）にカザミノ酸０．５％とアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを加えた培地に接種し、３７℃で３時間培養
後、０．５Ｍ（７）ＩＰＴＧを４ｏμ１添加（終濃度２
ｍＭ）し、更に５時間培養を続けた。集菌後、３０ｍＭ
塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄菌体を同じバッファー１
ｍｌに懸濁した。１ｍｇリゾチーム、０．２５Ｍ ＥＤ
ＴＡを２５ｍｌ加えて３０分間０℃に放置した後、凍結
・融解を３回繰り返して菌体を破壊した。
【００８０】これを１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心を
して得た上清を粗酵素液とし、実施例１ （３）で示し
た酵素活性測定法により酵素活性を測定した。マイクロ
タイタープレート法により、ｐＧＡＴ１０２を導入した
大腸菌ではアシル基転移反応が確認されたので、ＨＰＬ
Ｃによる分析を行った。
【００８１】その結果、ｐＧＡＴ１０２を導入した大腸
菌では２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，５−ジグルコ
シドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−ＣｏＡから１
８．３ｎｍｏｌのデルフイニジン３−グルコシル５−カ
フェオイルグルコシドの生成が認められた。この結果
と、リンドウのアントシアニンにおいては５位と３’位
のグルコースにアシル基が結合しているという既知の事
実と併せて考えると、ｐＧＡＴ４がコードするアシル基
転移酵素はアントシアニジン３，５−ジグルコシドの５
位のグルコースにアシル基を転移する反応を触媒するこ
とが判った。また、大腸菌で生産されたアシル基転移酵
素によりアシル化されたデルフィニジン３，５−ジグル
コシドも、リンドウから精製して得られたアシル基転移
酵素によりアシル化されたものと同様に室温で長期間放
置しても安定な発色を示した。
【００８２】実施例５ 酵母における遺伝子の発現 （１）酵母の発現べクター 酵母の発現べクターｐＹＧＡ２２６９（Ａｓｈｉｋａｒ
ｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，５１５−５２０，１９８
９、特開昭６２−１５８４８１参照）をＥｃｏＲＩとＢ
ｇｌＩＩで消化して得られる約８ｋｂ（７）ＤＮＡ断片
と、Ｍ１３ｍｐ１８（例えば、宝酒造（株））をＥｃｏ
ＲＩとＢｇｌＩＩで消化して得られる約０．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を連結して得られるプラスミドをｐＹＧＡ２２
ｍとした。ｐＹＧＡ２２ｍをＳａｌＩで消化したのちに
得られる約８ｋｂ（７）ＤＮＡ断片を自己連結（セルフ
ライゲーション）してプラスミドｐＹＥ２２ｍを構築し
た。
【００８３】（２）アシル基転移酵素遺伝子の酵母での
発現 ｐＧＡＴ４又はｐＧＡＴ８を当該各べクター内に存在す
る制限酵素部位ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られ
る約１． ８ｋｂ（７）ＤＮＡ断片とｐＹＥ２２ｍを同
じくＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られる約８ｋｂ
（７）ＤＮＡ断片を連結して酵母発現プラスミドｐＹＧ
ＡＴ４とｐＹＧＡＴ８を各々構築した。ｐＹＧＡＴ４は
第１番目のメチオニンからの翻訳を行うが、ｐＹＧＡＴ
８では分離したｃＤＮＡの５’側の一部が欠けているた
め、アシル基転移酵素の翻訳開始メチオニン（配列表・
配列番号１におけるアミノ酸配列番号；−１）ではな
く、次のメチオニン（配列表・配列番号１におけるアミ
ノ酸配列番号；５）からの翻訳が行われる。
【００８４】これらの酵母発現プラスミドでは、アシル
基転移酵素をコードしているｃＤＮＡは酵母の構成的な
プロモーターのひとつであるグリセロアルデヒド−３リ
ン酸脱水素酵素のプロモーターの下流に連結されてお
り、同プロモーターにより転写が制御されている。
【００８５】伊藤らの方法（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８，１９
８３）を用いｐＹＧＡＴ４及びｐＹＧＡＴ８で、酵母Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｇ
１３１５（Ａｓｈｉｋａｒｉｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，５１
５−５２０，１９８９）を形質転換した。形質転換され
た酵母はトリプトファンの合成能の回復により選択し
た。なお、ここで形質転換に用いる酵母の宿主は特に限
定されるものではなく、ＴＲＰＩ遺伝子が不完全なため
にトリプトファンの要求性を示す株であれば何れのもの
でも用いることができる（例えば、イースト・ジェネテ
ィク・ストック・センターより購入可能（Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ第７版（１９９１
年）第３６頁）。
【００８６】得られた形質転換株を１０ｍｌ（７）１％
カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）を含むバークホルダー培地
（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．３
０，２０６−２１０）にて、３０℃で４０時間振盪培養
した。併せて、対照実験のために、トリプトファンの合
成能を自然に回復した酵母も同様に培養した。
【００８７】これらを集菌後、同量の菌体破砕用バッフ
ァー（３０ｍＭ トリス塩酸ｐＨ７．５、３０ｍＭ 塩
化ナトリウム）で洗浄し、さらに１ｍｌの同じバッファ
ーにサスペンドし、１．５ｍｌのエッペンドルフチュー
ブに移した。遠心分離後、上清を除き０．４ｍｌの同じ
バッファーで沈殿菌体を再度サスペンドし、４００ｍｇ
のグラスビーズ（Ｇｌａｓｓ Ｂｅａｄｓ ４２５−６
００ｍｉｃｒｏｎｓＡｃｉｄ−Ｗａｓｈ、シグマ社）を
加えて激しく振盪することにより、酵母菌体を破砕し
た。
【００８８】遠心分離後の上清を粗酵素液とし実施例１
（３）で示した酵素活性測定法により酵素活性を測定し
た。マイクロタイタープレート法により、ｐＹＧＡＴ４
及びｐＹＧＡＴ８を導入した酵母は何れもアシル基転移
反応が確認されたので、ＨＰＬＣによる分析を行った。
なお、対照に用いた酵母ではアシル基転移活性は認めら
れなかった。
【００８９】その結果、ｐＹＧＡＴ４及びｐＹＧＡＴ８
を導入した酵母では２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，
５−ジグルコシドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−
ＣｏＡから各々１６．６ｎｍｏｌと２０．９ｎｍｏｌの
デルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコ
シドの生成が認められた。ｐＹＧＡＴ４とｐＹＧＡＴ８
から生産される蛋白質はそのアミノ末端が異なるが、と
もにアシル基転移酵素活性を保持していた。また酵母で
生産されたアシル基転移酵素によりアシル化されたデル
フィニジン３，５−ジグルコシドも、リンドウから精製
して得られたアシル基転移酵素によりアシル化されたも
のと同様に室温で長期間放置しても安定な発色を示し
た。
【００９０】実施例６ リンドウ由来のアシル基転移酵
素のｃＤＮＡクローニング （２） 実施例３（６）に記載のｐＧＡＴ４、即ち配列表・配列
番号１記載のＤＮＡを有するｐＧＡＴ４を、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＮｄｅＩで消化して得られるＤＮＡ断片のう
ち、アシル基転移酵素の翻訳領域を含むＤＮＡ断片２つ
をまとめて回収し、前述の方法でＤＩＧ標識した。これ
をプローブとして実施例３（４）に記載したリンドウの
花弁のｃＤＮＡライブラリーのファージを吸着させたフ
イルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマーシャム社）を、
製造者（アマーシャム社）が推奨する方法でフィルター
に結合した色素及びＤＩＧ標識を除去して再生した後、
低濃度ホルムアミドハイブリダイゼーションバッファー
（５×ＳＳＣ、３０％ホルムアミド、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ＳＤＳ）中で４２度で１
６時間ハイブリダイズした。
【００９１】洗浄液（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中
で５０度で洗浄し、実施例３（４）に記載したように発
色させた。数十のクローンが発色したが、発色したクロ
ーンのうちで、実施例３（４）では発色しなかったクロ
ーンを１２個得た。これらのクローンのｃＤＮＡの塩基
配列を先に述べたような方法で、５’側から決定したと
ころ、１１クローンはｐＧＡＴ４の塩基配列と一致した
が、１クローンは一致しなかった。これをｐＧＡＴ１０
６とした。
【００９２】ｐＧＡＴ１０６の全塩基配列を先に述べた
ようにして決定した。ｐＧＡＴｌ０６に挿入されたｃＤ
ＮＡは１６２２塩基でありその中に１４４０塩基（終止
コドンを含む）からなるＯＲＦが見い出された。これを
配列表・配列番号２に示す。配列番号２が含むＯＲＦに
ついて、ｐＧＡＴ４がコードするアミノ酸配列と全領域
にわたって、相同性を調べた。そのホモロジーは、３８
％であった。
【００９３】ｐＧＡＴｌ０６のコードするアミノ酸配列
は、アシル基転移酵素であるｐＧＡＴ４のコードしてい
る酵素と相同であるため、同様な酵素活性、つまりアン
トシアニンにアシル基転移を触媒する活性を持っている
と推測される。リンドウのアントシアニンは、５位と
３’位のグルコースにアシル基が結合しているので、ｐ
ＧＡＴ１０６がアントシアニンの３’位のグルコースに
アシル基を転移する酵素反応を触媒することを示唆す
る。また、この結果はアシル基転移酵素は、アシル基を
転移するアントシアニンの糖の位置は異なっていても、
アミノ酸配列及びそれをコードしている塩基配列は相同
であることを示している。先に述べたようにアシル基を
有するアントシアニンは多数存在し、これら化合物のア
シル基の数や位置は多様性に富み、アシル基の転移反応
を触媒する酵素も多数あることが推測されるが、それら
の酵素のアミノ酸配列は、ここで得られたｐＧＡＴ４及
びｐＧＡＴ１０６のアミノ酸配列と相同性がみられるこ
とは容易に類推でき、これに基づき、他のアシル基転移
酵素遺伝子を得ることができる。
【００９４】実施例７ ぺチュニアのアントシアニン ぺチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｖｂｒｉｄａ）品種サ
フィニアパープル（サントリー（株））の花色が通常の
赤紫から紫に変異した変異株（ＶＭ）のアントシアニン
をその花弁を液体窒素中で粉砕し、５０％アセトニトリ
ル、０．１％ＴＦＡ水溶液で抽出した。濾過後、濾液を
ＯＤＳ、ＯＤＰの逆相カラムクロマトグラフィーで分
離、精製した。そのうちの一つの化合物の構造をＦＡＢ
ＭＳ、１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲを用いて、詳細に解析
したところ、新規なアントシアニンを見いだした。その
構造を以下に示す。
【００９５】
【化１４】
【００９６】即ち、この構造は３−０−（６−０−（４
−０−（４−０−（６−０−カフェオイルーβ−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−クマロイル）−α−Ｌ−ラムノシ
ル）−β−Ｄ−グルコピラノシル）−５−０−β−Ｄ−
グルコピラノシル−マルビジンであり、アシル基が２つ
結合したアントシアニンであった。
【００９７】また、３−０−（６−０−（４−０−（４
−０−（６−０−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−クマロイル）−α−Ｌ−ラムノシル）−β−Ｄ−
グルコピラノシル）−５−０−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル−マルビジン、３−０−（６−０−（４−０−（４−
０−（６−０−カフエオイル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−カフェオイル）−α−Ｌ−ラムノシル）−β−Ｄ
−グルコピラノシル）−５−０−β−Ｄ−グルコピラノ
シル−マルビジン、３−０−（６−０−（４−０−（４
−０−（６−０−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−カフェオイル）−α−Ｌ−ラムノシル）−β−Ｄ
−グルコピラノシル）−５−０−β−Ｄ−グルコピラノ
シル−マルビジンも検出された。このアントシアニン
は、ＶＭの花弁のみならず、フルコンブルー（サカタの
タネ（株））、Ｏｌｄ ＧｌｏｒｙＢｌｕｅ（Ｂａｌｌ
Ｓｅｅｄｓ）などの濃い紫色の花弁にも存在している
ことがわかった。即ち、アシル基を２つ持つアントシア
ニンはぺチュニアの濃い紫色に寄与していると思われ
る。
【００９８】従って、ぺチュニア由来のアントシアニン
に関するアシル基転移酵素には、アントシアニンの３位
のルチノシドにクマル酸又はカフェ酸を転移する反応を
触媒する酵素と、モノアシルマルビジンにグルコースを
介してクマル酸又はカフェ酸を転移する反応を触媒する
酵素の２種類があることを示唆する。
【００９９】実施例８ ぺチュニア由来のアシル基転移
酵素のｃＤＮＡクロ−ニング 実施例３（６）に記載のｐＧＡＴ４、即ち配列表・配列
番号１記載のＤＮＡを有するｐＧＡＴ４のｃＤＮＡ部分
を、前述の方法でＤＩＧ標識し、ぺチュニア（Ｐｅｔｕ
ｎｉａ ｈｖｂｒｉｄａ）品種オールドグローリーブル
ーの花弁のｃＤＮＡライブラリー（Ｎａｔｕｒｅ， ３
６６，２７６−２７９，１９９３）をプラークハイブリ
ダイゼーシヨンの手法により、スクリーニングした。ハ
イブリダイゼーシヨンと洗浄は、実施例６と同様の条件
で行った。
【０１００】約２０万クローンをスクリーニングし、弱
くハイブリダイズするクローンを１つ得た。このクロー
ンをｐＰＡＴ５とした。塩基配列を決定したところ、ｐ
ＰＡＴ５には複数のＤＮＡが挿入されていた。すなわ
ち、プラスミドのリバースプライマー側に、ｐＧＡＴ４
およびｐＧＡＴ１０６のコードする蛋白質のＣ末端の配
列に似た配列が存在した。そこで、この配列をもとに、
【０１０１】ヌクレオチド配列；
【化１５】 を合成し、このオリゴヌクレオチドをＲＰプライマーと
した。
【０１０２】ｐＰＡＴ５のｃＤＮＡの完全長を取得する
ために、ＲＰプライマー、オリゴ２プライマー各１００
ｎｇ、ＸｈｏＩで消化したｐＰＡＴ５・１０ｎｇを最終
体積５０μｌで、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃
１分、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、２０
サイクル行った。得られた約６００ｂｐ（７）ＤＮＡ断
片をアガロース電気泳動後、ジーンクリーンで精製し
た。この断片をＳｍａＩで酵素消化した後、約４００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を同様に精製した。このＤＮＡ断片を前
述のＤＩＧで標識した。
【０１０３】この標識したＤＮＡ断片を用いて、前述の
ぺチュニアの花弁ｃＤＮＡライブラリーをプラークハイ
ブリダイゼーシヨンの手法を用いて、スクリーニングし
た。ハイブリダイゼーシヨン後の洗浄は、０．２ＸＳＳ
Ｃ、６５℃、１時間とした。得られたクローンから回収
したプラスミドの塩基配列を決定したところ、ｐＰＡＴ
４８が、ｐＰＡＴ５と同じ配列を含むことがわかった。
これを配列表・配列番号３に示す。この配列は、ｐＧＡ
Ｔ４とｐＧＡＴｌ０６に対して、アミノ酸配列レベル
で、それぞれ２０％、１６％のホモロジーがあった。
【０１０４】実施例９ シソ由来の粗酵素液の抽出 シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｏｃｉｍｏｉｄｅｓ）・品種赤
チリメンの植物体から、赤い若い葉を採集し、実施例１
（２）に記載の方法に従って、粗酵素液の抽出を行っ
た。最終濃度５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、
０．４８ｍＭデルフィニジン３，５−ジグルコシド、
０．４３ｍＭカフェオイル−ＣｏＡと２０μｌの酵素液
を含む５０μｌの混合物を３０℃で１０分間反応させ
た。反応液に１３．８％の酢酸を含む５０μｌのアセト
ニトリルを加えて反応を停止した。１５０００回転で５
分間遠心した後、上清のうちの１０μｌを以下の条件で
ＨＰＬＣにて解析した。
【０１０５】カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ
（６．０Ｘ１５ｃｍ）を用い、０．１％トリフルオロ酢
酸、２１．６％アセトニトリルの溶媒で、流速１ｍｌ／
分の条件でサンプルを分離した。検出は、５２０ｎｍで
行った。この条件で未反応のデルフイニジン３，５−ジ
グルコシドは、３分で、デルフィニジン３，５−ジグル
コシドの３位にカフェ酸が転移したものは、４．７分に
溶出され、この化合物の吸収極大値は、５３１ｎｍであ
った。
【０１０６】基質として、デルフィニジン３−グルコシ
ドを用いた場合も、カフェ酸による修飾が見られた。ま
た、アシル基の供与体として、クマロイル−ＣｏＡを用
いても、クマール基の転移が見られた。シソは天然には
アントシアニンとしてデルフィニジングルコシドは含ま
ないが、シソのアシル基転移酵素はデルフィニジン３−
グルコシドとデルフィニジン３，５−ジグルコシドをア
シル基受容体として、クマロイル−ＣｏＡをアシル基供
与体として利用できることがわかった。
【０１０７】実施例１０ シソ由来のアシル基転移酵素
の精製 シソアシル基転移酵素の精製は、実施例２（１）に準じ
て行った。３ｋｇのシソの葉を、液体窒素で凍結させ、
凍結したままホモジナイザーで、粉砕した。粉末状にな
ったものに１０１の抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ６．８、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウ
ム、５ｍＭジチオスレオトール、１０μＭ ｐ−ＡＰＭ
ＳＦ、５％（ｗ／ｖ）ポリクラールＳＢ−１００）中
で、再び、ホモジナイザーで磨砕した。これを４層に重
ねたガーゼで濾過後、遠心分離（８０００回転、４度、
３０分）を行った。上静に４０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを加えて、溶解後、同じ条件で遠心分離を
行う。上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え、溶解後、同じ条件で遠心分離を行う。沈殿を最
小量の脱塩緩衝液（ビストリス塩酸、ｐＨ６．３、１ｍ
Ｍジチオスレイトール、１０μＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１
０％グリセロール）に溶解した後、同じ緩衝液で平衡化
したセファデックスＧ−２５メデイウム（ファルマシア
社、９．５Ｘ４５ｃｍ）で脱塩した。
【０１０８】脱塩したサンプルをＱ−セファロースファ
ーストフロー２６／１０を用いたイオン交換クロマトグ
ラフィーを行った。脱塩緩衝液をもとにした塩化ナトリ
ウムの０から０．５Ｍの直線濃度勾配を８ｍｌ／分の流
速で１時間かけて行った。活性画分は、食塩濃度０．１
５から０．３Ｍ付近で溶出された。この活性画分を、脱
塩緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐＢｌｕｅ（５ｍｌ）
を４本直列に接続したカラムに吸着させた。同じ緩衝液
でカラムを良く洗浄した後、脱塩緩衝液をもとにした０
から１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配（２時間、流
速５ｍｌ／分）で溶出した。活性画分は塩化ナトリウム
濃度０．８から０．９Ｍで溶出した。この画分を次にヒ
ドロキシアパタイトカラム（セラミックタイプ１１ ４
０ｍｍ；バイオラド社）でクロマトグラフィーを行っ
た。緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．
８、１ｍＭジチオスレイトール、１０μＭ ｐ−ＡＰＭ
ＳＦ）１０％グリセロール）で、サンプルをかけたカラ
ムをよく洗浄し、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（４００ｍＭリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ｍＭジチオスレイトー
ル、１０μＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール）
への直線濃度勾配（１時間、流速２．５ｍｌ／分）で酵
素を溶出したところ、約０．２Ｍリン酸ナトリウムで溶
出した。この活性画分を用いて酵素の生化学的性質を調
べた。
【０１０９】粗酵素標品を用いた場合と同様に、アシル
基の受容体としては、シアニジン３−グルコシド、シア
ニジン３，５−ジグルコシド、デルフィニジン３−グル
コシド、デルフィニジン３，５−ジグルコシドのいずれ
を用いることができた。アシル基の供与体としては、ク
マロイル−ＣｏＡでも、カフェオイル−ＣｏＡでも用い
ることができた。また、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動から、分子量は約５００００であった。等電点は、
Ｍｏｎｏ−Ｐカラム（ファルマシア社）を用いて、５．
３と決定した。
【０１１０】実施例１１ シソ由来のアシル基転移酵素
のｃＤＮＡクロ−ニング 実施例３、実施例６及び実施例８でクローニングしたｐ
ＧＡＴ４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８の構造を比較
すると、
【０１１１】アミノ酸配列；
【化１６】 が保存されていることがわかった。従って、この構造
は、アシル基転移酵素において保存されていることが予
想される。そこで、この配列をもとに、
【０１１２】ヌクレオチド配列；
【化１７】 を合成し、このオリゴヌクレオチドをＡＴＣプライマー
とした。
【０１１３】シソの若い葉からＲＮＡを実施例３に記載
の方法で抽出し、同じく、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット
（ストラタジーン杜製）を用い、ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。この際にできた２本鎖のｃＤＮＡ約５０ｎ
ｇを鋳型にして、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマ
ーを各１００ｎｇ用い、最終体積５０μｌにて、ＰＣＲ
キット（宝酒造（株）製）を用いて、ＰＣＲ反応を行っ
た。反応は、９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１
サイクルとし、２５サイクル行った。得られた約４００
ｂｐ（７）ＤＮＡ断片を回収し、ＴＡクローニングキッ
ト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、べクターにク
ローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し
たところ、ｐＳＡＴ１０４としたクローンがｐＧＡＴ４
に対して高いホモロジーを示した。
【０１１４】１０ｎｇのｐＳＡＴ１０４を鋳型にして、
ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ
用いて、最終体積５０μｌにて、ＰＣＲキット（宝酒造
社（株）製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。反応は、
９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルと
し、１５サイクル行った。この反応物の１μｌを用い、
ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ
用いて、最終体積５０μｌにて、同様にＰＣＲキットを
用いて、ＰＣＲ反応を行った。ただし、この際デオキシ
ヌクレオチド溶液として、ＤＩＧ標識ヌクレオチド溶液
（ベーリンガー社製）を４μｌ用いた。反応終了後、５
μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと１００μｌのエタノールを
加え、エタノール沈殿を行い、以後の実験に用いた。
【０１１５】このｐＳＡＴ１０４由来の標識ＤＮＡを用
いて、シソの葉のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイ
ブリダイゼーシヨンの手法でスクリーニングした。洗浄
は、１ＸＳＳＣ、６５℃で１時間行った。ハイブリダイ
ズしたクローンの塩基配列を決定したところ、ｐＳＡＴ
２０６、ｐＳＡＴ２０７、ｐＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２
０９、ｐＳＡＴ２１０などのクローンがｐＳＡＴ１０４
の塩基配列を含んでいることがわかった。これらのクロ
ーンの５’側の塩基配列をｐＧＡＴ４と比較したとこ
ろ、どのクローンもｐＧＡＴ４よりアミノ末端が短く開
始コドンも見られなかった。また、ｐＳＡＴ２０６とｐ
ＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２０９とｐＳＡＴ２１０は、
５’側の塩基配列は同一であった。ｐＳＡＴ２０７は、
ｐＳＡＴ２０６より６残基、ｐＳＡＴ２０９はｐＳＡＴ
２０６より５残基短かった。
【０１１６】べクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−
上で、これらのｃＤＮＡは、べクターのＬａｃＺ遺伝子
と融合できる形となっている。上のクローンの内、ｐＳ
ＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２０７は、Ｌａ
ｃＺのコードしている大腸菌のβガラクトシダーゼと融
合蛋白として発現できる形になっているが、ｐＳＡＴ２
０９とｐＳＡＴ２１０は、フレームがずれているので融
合蛋白質とはならない。ｐＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０
７、ｐＳＡＴ２０９、ｐＳＡＴ２１０を大腸菌で発現さ
せ、デルフィニジン３，５−ジグルコシドとカフェオイ
ル−ＣｏＡを用いて、３位のグルコースへのアシル基転
移酵素活性を測定した。発現の誘導などの方法は、実施
例４に記載の方法に従った。
【０１１７】ｐＳＡＴ２０９、ｐＳＡＴ２１０を含む大
腸菌は、アシル基転移酵素活性を全く示さなかったが、
ｐＳＡＴ２０６を含む大腸菌は、デルフィニジン３，５
−ジグルコシドの４８％をアシル化する酵素活性を示
し、ｐＳＡＴ２０７を含む大腸菌は同じく２４％をアシ
ル化する酵素活性を示した。このことから、得られたｐ
ＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０７などは、シソのアントシ
アニンの３位のグルコースにアシル基を転移する酵素活
性を持つ遺伝子をクローニングできたことが証明でき
た。
【０１１８】これらのクローンの内、ｐＳＡＴ２０８の
ｃＤＮＡ由来の塩基配列を決定した。これを配列表・配
列番号４に示す。その塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は、ｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８に
対して、３７％、２９％、１５％のホモロジーを示し
た。先に述べたようにこの配列は、完全長のｃＤＮＡで
はないが、ＬａｃＺとの融合遺伝子などとして、適当な
開始コドンを与えることで、活性のある酵素を発現でき
る。また、このように本発明で明らかになったアシル基
転移酵素のアミノ酸配列を比較することにより、保存さ
れている領域が明らかになった。この領域のアミノ酸配
列をもとにすれば、アントシアニンの他の位置の糖を修
飾するアシル基転移酵素をクローニングすることができ
る。
【０１１９】実施例１２ サイネリア由来のアシル基転
移酵素のｃＤＮＡクローニング サイネリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）品種
ジュピターブルー（サカタノタネ）の花弁から実施例３
に記載の方法でＲＮＡを抽出し、さらにＰｏｌｙＡ＋Ｒ
ＮＡを精製した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラ
タジーン社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製
した。
【０１２０】この際にできた２本鎖のｃＤＮＡ約５０ｎ
ｇを鋳型にして、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマ
ーを各１００ｎｇ用い、最終体積５０μｌにて、宝のＰ
ＣＲキットを用いて、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９
５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、
２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐ（７）ＤＮ
Ａ断片を回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社）を用いて、ベクターにクローニングし
た。得られたクローンの塩基配列を決定したところ、ｐ
ＪＡＴ４としたクローンがｐＧＡＴ４に対して高いホモ
ロジーを示した。
【０１２１】次にサイネリアの花弁ｃＤＮＡライブラリ
ーをｐＪＡＴ４でスクリーニングした。いくつかのクロ
ーンが得られたが、それらのｃＤＮＡの５’端側の塩基
配列から類推したアミノ酸配列は、ｐＧＡＴ４のコード
している蛋白質の配列と比較してみると、サイネリアの
クローンのｃＤＮＡはいずれも完全長ではなかった。そ
のうち、ｐＣＡＴ８としたクローンのｃＤＮＡの前塩基
配列を決定した。これを配列表・配列番号５に示す。そ
の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、ｐＧＡＴ
４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８、ｐＳＡＴ２０８に
対してそれぞれ２８％、３５％、１６％、３７％のホモ
ロジーを示した。
【０１２２】
【発明の効果】以上のように、本発明においてはリンド
ウ由来の芳香族アシル基転移酵素の精製、当該酵素のｃ
ＤＮＡのクローニング及び当該ｃＤＮＡの塩基配列の決
定を行った。また、大腸菌と酵母での活性発現を行うこ
とにより、分離したｃＤＮＡが芳香族アシル基転移酵素
をコードするものであることを確認した。従って、本発
明に係るｃＤＮＡを適当な植物発現べクターに接続し、
植物に導入することにより、アシル化反応を植物の花色
調節に利用することが可能となった。また、本酵素活性
を利用することにより、植物の中であるいは試験管内で
アントシアンの構造を改変し、より安定なアントシアン
を提供することができる。
【０１２３】
【配列表】
配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１ 配列の長さ （ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：１７
０３ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ） ：核酸（ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（ｄｏｕ
ｂｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（Ｉｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：ｃＤＮＡ
ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：リンドウ（Ｇｅｎｔｉａ
ｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）
組織の種類（ＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥ）：花弁（ｐｅ
ｔａｌ） 直接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣＥ） ライブラリー名（ＬＩＢＲＡＲＹ）：ｃＤＮＡ ｌｉｂ
ｒａｒｙ クローン名（ＣＬＯＮＥ）：ｐＧＡＴ４ 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
【０１２４】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２ 配列の長さ （ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：１
６２２ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（ｄｏｕ
ｂｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（Ｉｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：ｃＤＮＡ
ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：リンドウ（Ｇｅｎｔｉａ
ｎａｔｒｉｆｌｏｒａｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ） 組
織の種類（ＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥ）：花弁（ｐｅｔａ
ｌ） 直接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣＥ） ライブラリー名（ＬＩＢＲＡＲＹ）：ｃＤＮＡ ｌｉｂ
ｒａｒｙ クローン名（ＣＬＯＮＥ）：ｐＧＡＴ１０６ 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
【０１２５】配列番号（ＳＥＱＩＤ ＮＯ）：３ 配列の長さ （ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：１
６０５ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（ｄｏｕ
ｂｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：ｃＤＮＡ
ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセテイカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：ぺチユニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａ ｈｙｂｒｉｄａ） 組織の種類（ＴＩＳＳＵＥ
ＴＹＰＥ）：花弁（ｐｅｔａｌ） 直接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣＥ） ライブラリー名（ＬＩＢＲＡＲＹ）：ｃＤＮＡ ｌｉｂ
ｒａｒｙ クローン名（ＣＬＯＮＥ）：ｐＰＡＴ４８ 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
【０１２６】配列番号（ＳＥＱＩＤ ＮＯ）：４ 配列の長さ （ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：１
４７９ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（ｄｏｕ
ｂｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：ｃＤＮＡ
ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ
ｏｃｉｍｏｉｄｅｓ） 組織の種類（ＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥ） ：葉（ｌｅａ
ｆ） 直接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥＳＯＵＲＣＥ） ライブラリー名（ＬＩＢＲＡＲＹ）：ｃＤＮＡ ｌｉｂ
ｒａｒｙ クローン名（ＣＬＯＮＥ）：ｐＳＡＴ２０８ 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
【０１２７】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：１５
０８ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ） ：二本鎖（ｄｏ
ｕｂｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：ｃＤＮＡ
ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセテイカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：サイネリア（Ｓｅｎｅｃ
ｉｏ ｃｒｕｅｎｔｕｓ） 組織の種類（ＴＩＳＳＵＥ
ＴＹＰＥ）：花弁（ｐｅｔａｌ） 直接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣＥ） ライブラリー名（ＬＩＢＲＡＲＹ）：ｃＤＮＡ ｌｉｂ
ｒａｒｙ クローン名（ＣＬＯＮＥ）：ｐＣＡＴ８ 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中尾 正宏 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 福井 祐子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 米倉 圭子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 水谷 正子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 久住 高章 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質
    をコードする遺伝子。
  2. 【請求項２】 配列番号１において塩基配列番号２１〜
    １４１２の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
  3. 【請求項３】 配列番号２において塩基配列番号３５〜
    １４７１の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
  4. 【請求項４】 配列番号３において塩基配列番号６７〜
    １４１０の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
  5. 【請求項５】 配列番号４において塩基配列番号３〜１
    ３４０の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
  6. 【請求項６】 配列番号５において塩基配列番号３〜１
    ３６４の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか１項に記載
    の遺伝子よってコードされるアミノ酸配列を有し、芳香
    族アシル基転移酵素活性を有する蛋白質。
  8. 【請求項８】 植物体の粗酵素抽出液をシバクロンブル
    ー３ＧＡを固定した樹脂を用いたアフィニティークロマ
    トグラフィー処理により得られる芳香族アシル基転移活
    性を有する蛋白質。
  9. 【請求項９】 植物体の粗酵素抽出液をシバクロンブル
    ー３ＧＡを固定した樹脂を用いたアフィニティークロマ
    トグラフィー処理による芳香族アシル基転移活性を有す
    る蛋白質の単離方法。
  10. 【請求項１０】 芳香族アシル基転移活性を有する蛋白
    質の製造方法において、請求項１ないし６のいずれか１
    項に記載の遺伝子を含んでなる発現べクターにより形質
    転換された宿主を培養し、該培養物から前記蛋白質を採
    取することを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 植物体内における色素のアシル化方法
    において、芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコ
    ードする遺伝子を、導入する植物において適当な発現べ
    クターに組み込み、当該植物に導入後、当該植物体内に
    おいて目的色素のアシル化を行うことを特徴とする方
    法。
  12. 【請求項１２】 色素がアントシアニンである請求項１
    １記載の植物体内における色素のアシル化方法。
  13. 【請求項１３】 植物体内における色素の安定化方法に
    おいて、芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコー
    ドする遺伝子を、導入する植物において適当な発現べク
    ターに組み込み、当該植物に導入後、当該植物体内にお
    いて目的色素のアシル化反応が行われることにより当該
    色素が安定化されることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 色素がアントシアニンである請求項１
    ３記載の植物体内における色素の安定化方法。
  15. 【請求項１５】 植物の花色調節方法において、芳香族
    アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
    を、導入する植物において適当な発現べクターに組み込
    み、当該植物に導入後、当該植物体内において目的色素
    のアシル化反応によって当該色素が安定化されることに
    より植物の花色を目的の花色に調節することを特徴とす
    る方法。
  16. 【請求項１６】 色素がアントシアニンである請求項１
    ５記載の植物の花色調節方法。
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