CN110832080A

CN110832080A - 丙二酰基转移酶基因的应用

Info

Publication number: CN110832080A
Application number: CN201880044274.7A
Authority: CN
Inventors: 兴津奈央子; 中村典子
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2020-02-21
Also published as: US20200123555A1; CO2020000318A2; WO2019009257A1; CA3068398A1; JP7146754B2; JPWO2019009257A1

Abstract

本发明所要解决的课题在于：提供一种制造方法，其使用编码具有将丙二酰基转移到黄酮7‑葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸来制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮；以及制作一种植物品种，其含有作为辅色素的在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮，并藉由此而具有经改变的花色、优选具有比现有品种更蓝的花色。使用选自以下(a)～(d)等的多聚核苷酸：(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；(b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将丙二酰基转移到黄酮7‑葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的多聚核苷酸；(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；(d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将丙二酰基转移到黄酮7‑葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的多聚核苷酸。

Description

丙二酰基转移酶基因的应用

技术领域

本发明涉及一种制作方法及一种制造方法，即使用编码具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸，来制作含有作为辅色素的在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮并藉由此而具有经改变的花色、优选具有比现有品种更蓝的花色的植物品种，以及来制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮。

背景技术

花的颜色起因于四种类型的色素：类黄酮、类胡萝卜素、叶绿素、甜菜素(betalain)。其中，类黄酮呈现黄、红、紫、蓝等多种颜色。类黄酮中呈现红、紫、蓝色的一组统称为花色苷，根据糖苷配基的结构可将其分类为花葵素、花青素、花翠素这三组。

为使花色变蓝，认为除了积累花翠素外，还需具备以下任一者：(i)花色苷被1个或多个芳香族酰基修饰，(ii)使花色苷与黄酮或黄酮醇等辅色素共存，(iii)使铁离子或铝离子与花色苷共存，(iv)使花色苷所处的液胞的pH由中性上升为弱碱性或(v)使花色苷、辅色素、金属离子形成复合物(这种花色苷被称为金属花色苷)(非专利文献1)。

类黄酮和花色苷的生物合成途径已被充分研究，相关的生物合成酶和编码它们的基因已被鉴定(非专利文献2)。另外，作为类黄酮之一的黄酮与花色苷共存时，具有使花色蓝色加深的作用，并已从多种植物中鉴定出编码黄酮的生物合成酶的基因。

可从多种植物中得到修饰花色苷和黄酮的酶基因，例如糖转移酶基因、酰基转移酶基因、甲基转移酶基因等。花色苷和黄酮通过这些酶得到多样的物种及品种特异性修饰，这种多样性成为花色多样性的原因之一。例如，从菊花、天竺牡丹、瓜叶菊中分离出了编码具有将丙二酰基转移到花色苷3-葡萄糖苷的3位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因(非专利文献3、专利文献1)。从一串红、拟南芥中分离出了编码具有将丙二酰基转移到花色苷5-葡萄糖苷的5位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因(非专利文献4、专利文献1)。从大豆、紫花苜蓿等中分离出了编码具有将丙二酰基转移到异黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因(非专利文献5、6)。从烟草中分离出了编码具有将丙二酰基转移到黄酮醇7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因(非专利文献7)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1国际公开第2001/092536号

专利文献2国际公开第2017/002945号

非专利文献

非专利文献1Natural Product Reports(2009),26,884-915

非专利文献2Biosci.Biotechnol.Biochem(2010),74(9),1760-1769

非专利文献3Plant Biotechnology,20(3),229-234(2003)

非专利文献4The Plant Journal(2007)50,678-695

非专利文献5Phytochemistry 68(2007),2035-2042

非专利文献6The Plant Journal(2008)55,382-396

非专利文献7The Plant Journal(2005)42,481-491

非专利文献8THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY

VOL.282,NO.21,15812-15822

通过基因重组，制作了生成蓝色色素花翠素的衍生物的蓝色菊花(专利文献2)。导致这种花瓣蓝色化的主要原因，被认为除了花翠素的生成外还有共存的一种黄酮即木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷的辅色素作用。但是，编码具有将丙二酰基转移到木犀草素7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的来自菊花的基因尚未鉴定。

在这种情况下，本发明所要解决的课题在于：鉴定菊花中编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸，并提供一种使用该多聚核苷酸制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮的方法。进而，使用这种多聚核苷酸制作生成在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮并藉由该黄酮的辅色素作用而具有经改变的花色、优选具有比现有品种更蓝的花色的植物品种。

本申请发明者为解决上述课题进行了深入研究并反复进行实验，结果鉴定了作为具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的来自菊花的花色苷丙二酰基转移酶同源物(Dm3MaT3)，从而完成了本发明。

即本发明如下。

[1]一种方法，为生产生成在7位葡萄糖上赋予了丙二酰基的黄酮的基因重组植物或其后代的方法，其特征在于，包含将选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸导入宿主植物内：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

(d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及

(e)编码具有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的多聚核苷酸。

[2]根据[1]所述的方法，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其特征在于，所述基因重组植物具有经改变的花色。

[4]一种基因重组植物或其后代或它们的部分或组织，其生成在7位葡萄糖上赋予了丙二酰基的黄酮，其特征在于，含有选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

[5]根据[4]所述的基因重组植物或其后代或它们的部分或组织，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。

[6]根据[4]或[5]所述的基因重组植物或其后代或它们的部分或组织，其特征在于，所述基因重组植物具有经改变的花色。

[7]根据[4]～[6]中任一项所述的植物的部分，其特征在于，其为切花。

[8]一种切花加工品，其特征在于，使用[7]中所述的切花。

[9]一种方法，为制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮的方法，其特征在于，包含将选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸导入非人宿主内，并培养或培育该非人宿主：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

[10]根据[9]所述的方法，其特征在于，所述非人宿主为植物细胞。

[11]根据[9]或[10]所述的方法，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。

根据本发明，可制作含有作为辅色素的在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮并藉由此而具有经改变的花色、优选具有比现有品种更蓝的花色的植物品种。并且，根据本发明可提供一种在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮的制造方法。

附图说明

图1为使以下溶液分别与木犀草素7-葡萄糖苷进行酶反应的反应液的高效液相色谱：从表达Dm3MaT3的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液，从表达Dm3MaT1的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液，从表达Dm3MaT2的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液。

图2为使以下溶液分别与花青素3-葡萄糖苷进行酶反应的反应液的高效液相色谱：从表达Dm3MaT3的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液，从表达Dm3MaT1的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液，从表达Dm3MaT2的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液。

图3为使Dm3MaT3蛋白质溶液与木犀草素7-葡萄糖苷进行酶反应的反应液的高效液相色谱。

图4为使Dm3MaT3蛋白质溶液与木犀草素4’-葡萄糖苷进行酶反应的反应液的高效液相色谱。

图5为Dm3MaT3蛋白质对各种类黄酮底物的反应性的汇总图。

图6为比较Dm3MaT3与Dm3MaT1及Dm3MaT2的氨基酸序列的比对图。

图7为标明本发明的Dm3MaT3与各种酶之间的关系的系统树。

图8为pSPB7136的质粒图谱。

具体实施方式

本发明中所使用的多聚核苷酸(序列号1)编码Dm3MaT3。在本说明书中，用语“多聚核苷酸”意味着DNA或RNA。本发明中所使用的多聚核苷酸并不限于由序列号1的碱基序列构成，或由编码由与该碱基序列相应的氨基酸序列(序列号2)构成的蛋白质的多聚核苷酸构成，还包含由该碱基序列或其互补序列构成的多聚核苷酸或编码与该氨基酸序列具有特定的序列同源性、优选具有序列同一性且具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸。

在本说明书中，描述了有关来自菊花的编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因，但本发明中所使用的多聚核苷酸并不限于来自菊花的基因，作为编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因的来源，可为植物、动物、微生物，只要具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性，则无论来源如何都可用来改变植物中的花色。

本发明中所使用的多肽，是由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，也包含编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸。在本说明书中，用语“严谨条件”是指多聚核苷酸或寡聚核苷酸与基因组DNA能够选择性且可检测的特异性结合的条件。严谨条件可通过盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)、温度及其他公知的条件的适当组合来定义。即通过减少盐浓度或增加有机溶剂浓度或提高杂交温度可增加严谨性(stringency)。进而，杂交后的清洗条件也会影响严谨性。该清洗条件还可通过盐浓度和温度来定义，通过盐浓度的减少和温度的上升可增加清洗的严谨性。因此，用语“严谨条件”是指各碱基序列间“同一性”或“同源性”的程度，例如是指仅在以全体的平均计具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选97％以上、最优选98％以上这样高同源性的碱基序列间进行特异性杂交的条件。作为“严谨条件”，例如可列举在温度60℃～68℃下钠浓度为150～900mM、优选600～900mM、pH6～8这样的条件，作为具体例，可列举在5×SSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠)、1％SDS、5×Denhardt溶液50％甲醛及42℃的条件下进行杂交，并且在0.1×SSC(15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠)、0.1％SDS及55℃的条件下进行清洗。

杂交例如可按照最新分子生物学实验方法汇编(Current protocols inmolecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.,1987))记载的方法等本领域公知的方法或以其为参考的方法进行。而且，使用市售的文库时可按照所附的使用说明书记载的方法进行。作为通过这种杂交所选择的基因，可为来自天然的基因，例如来自植物的基因、来自除植物以外的基因。而且，通过杂交所选择的基因可为cDNA，也可为基因组DNA，还可为化学合成的DNA。

本发明涉及的DNA，可通过本领域技术人员公知的方法得到，例如通过亚磷酰胺法等进行合成的化学方法、以植物的核酸试剂为模板并使用基于目标基因的核苷酸序列设计的引物的核酸扩增法等。

本发明中所使用的多肽，包含编码由在序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸。上述“1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列”是指例如1～20个、优选1～5个、更优选1～3个的任意数量的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列。由于作为基因工程的方法之一的定点诱变法为可在特定的位置导入特定突变的方法，故而有用，可按照Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989等记载的方法进行。通过使用适当的表达系统使该突变的DNA表达，可得到由1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成的蛋白质。

本发明中所使用的多肽，包含具有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列且编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸。这种多肽，编码具有相对于序列号2的氨基酸序列有优选约95％以上、进一步优选97％以上、最优选98％以上同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本说明书中，用语“同一性”是指在多肽序列(或氨基酸序列)或者多聚核苷酸序列(或碱基序列)的2条链之间构成该链的各氨基酸残基彼此或各碱基彼此的相互配合关系中可确定为相同的量(个数)，是指两个多肽序列或两个多聚核苷酸序列之间的序列相关性的程度，“同一性”可容易地算出。已知有很多测定两个多聚核苷酸序列或多肽序列间的同源性的方法，用语“同一性”为本领域技术人员所周知(例如参考Lesk,A.M.(Ed.),ComputationalMolecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith,D.W.(Ed.),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Academic Press,New York,(1993)；Grifin,A.M.&Grifin,H.G.(Ed.),Computer Analysis of Sequence Data:Part I,HumanPress,New Jersey,(1994)；von Heinje,G.,Sequence Analysis in Molecular Biology,Academic Press,New York,(1987)；Gribskov,M.&Devereux,J.(Ed.),Sequence AnalysisPrimer,M-STockton Press,New York,(1991)等)。

此外，本说明书中记载的“同一性”的数值，除特别明示的情况外，还可为本领域技术人员使用公知的同源性检索程序算出的数值，优选使用Macvector应用程序(14.5.2(24)版、Oxford Molecular Ltd.,Oxford,England)的Clustal W程序算出的数值。

本发明中所使用的多聚核苷酸(核酸、基因)“编码”目标蛋白质。在此，“编码”意味着使目标蛋白质在具备其活性的状态下表达。而且，“编码”包含将目标蛋白质作为连续结构序列(外显子)进行编码或介由间隔序列(内含子)进行编码这两种含义。

具有天然的碱基序列的基因如以下实施例所记载，例如可通过DNA测序仪进行分析来得到。此外，编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的DNA，能够以具有天然的碱基序列的DNA为基础，使用常用的定点诱变法、PCR法来合成。例如，可通过天然的cDNA或基因组DNA的限制酶处理来得到欲修饰的DNA片段，进而将其做为模板使用导入了期望的突变的引物来实施定点诱变法、PCR法，从而得到所期望的经修饰的DNA片段。其后，只要将该导入了突变的DNA片段与编码成为目标的酶的其他部分的DNA片段进行连接即可。

或者，就得到编码由缩短的氨基酸序列构成的酶的DNA而言，例如可将编码比目标氨基酸序列长的氨基酸序例如全长氨基酸序列的DNA由所期望的限制酶切断，其结果所得到的DNA片段不编码目标氨基酸序列的全体时，只要合成由不足部分的序列构成的DNA片段并进行连接即可。

而且，通过用大肠杆菌及酵母的基因表达系统使所得到的多聚核苷酸表达并测定酶活性，可确认所得到的多聚核苷酸编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质。进而，通过使该多聚核苷酸表达，可得到作为多聚核苷酸产物的具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质。或者，即使使用与由序列号2记载的氨基酸序列构成的多肽相对的抗体，也可得到具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质，还可使用相关抗体将来自其他生物的编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸克隆化。

通过将以这种方式获得的编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的外源性多聚核苷酸，例如用(重组)载体尤其是表达载体导入植物中并使其包含于该植物细胞内，从而可生产含有作为辅色素的在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮并藉由此而具有经改变的花色、优选具有比现有品种更蓝的花色的基因重组植物或其后代或它们的部分或组织(包括细胞)。作为该部分或组织的形式可为切花。

作为可转化的植物的例子，可列举玫瑰、康乃馨、菊花、金鱼草、仙克兰、兰花、洋桔梗、洋水仙、非洲菊、剑兰、满天星(Gypsophila)、长寿花、百合、天竺葵、洋葵、矮牵牛、蓝猪耳、郁金香、红掌、蝴蝶兰、水稻、大麦、小麦、油菜籽、马铃薯、番茄、毛果杨、香蕉、蓝桉、甘薯、大豆、苜蓿、羽扇豆(lupine)、玉米、花椰菜、天竺牡丹等，但并不限定于此。

此外，由本发明可提供使用了由上述方法所得的基因重组植物或其后代的切花的加工品(切花加工品)。在此，作为切花加工品包含使用该切花的压花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但并不限定于此。

进而，通过将编码具有将丙二酰基特异性地转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的多聚核苷酸导入含有黄酮7-葡萄糖苷及/或丙二酰CoA等丙二酰基供体的非人宿主内，并培养或培育该非人宿主，进而从该非人宿主中收集在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮，可容易地制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮。

从通过培养、栽培或培育经转化的非人宿主所得的培养物或培养基中，按照常规方法例如通过过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等可回收、纯化进而得到目标蛋白质。此外，由本发明的制造方法制造的7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮，可用于食品、医药品、化妆品的制造等用途。

作为非人宿主，可使用原核生物或真核生物。作为原核生物可使用细菌例如属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌(Bacillus)属微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等常用宿主。作为真核生物可使用低等真核生物例如真核微生物如作为真菌的酵母或丝状菌。作为酵母可列举例如酵母(Saccharomyces)属微生物如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，并且作为丝状菌可列举曲霉(Aspergillus)属微生物如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，青霉(Penicillium)属微生物。作为宿主，进一步可使用动物细胞或植物细胞，作为动物细胞可使用小鼠、仓鼠、猴子、人类等的细胞系，进而昆虫细胞例如蚕细胞、蚕的成虫本身也可作为宿主。本发明的方法中优选使用植物细胞。

在现有技术水平下，可利用将多聚核苷酸通过包含上述多聚核苷酸的(重组)载体尤其是表达载体导入非人宿主从而使该多聚核苷酸构成性或组织特异性表达的技术。向非人宿主导入多聚核苷酸，可通过本领域技术人员公知的方法例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、PEG法、粒子枪法等来进行。

本发明中所使用的表达载体，含有依存于将其导入的非人宿主种类的表达控制区，例如启动子、终止子、复制起始位点等。作为细菌用表达载体的启动子，可使用常用的启动子例如trc启动子、tac启动子、lac启动子等；作为酵母用启动子，可使用例如3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等；并且作为丝状菌用启动子，可使用例如淀粉酶启动子、trpC启动子等。此外，作为动物细胞宿主用的启动子，可使用病毒性启动子例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子等。

作为使多聚核苷酸在植物细胞内构成性表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、mac-1启动子等。此外，为了组织特异性的基因表达，可使用在该组织内特异性表达的基因的启动子。

表达载体的制备可使用限制酶、连接酶等按照常规方法来进行。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明。

[实施例1：具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的候选蛋白的酶活性测定实验(使用从大肠杆菌粗提的蛋白质溶液时)]＜大肠杆菌表达用载体的制备＞

将非专利文献8记载的功能未鉴定的Dm3MaT3作为具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的候选蛋白，按照制造商推荐的实验方法用pET32a(Novagen公司)制备包含Dm3MaT3全长的大肠杆菌表达用载体(pET32a-Dm3MaT3)。

＜丙二酰转移酶的大肠杆菌表达＞

按照制造商推荐的实验方法用One Shot BL21(DE3)(invitorgen)将pET32a-Dm3MaT3导入大肠杆菌株BL21中，得到转化大肠杆菌。按照制造商推荐的实验方法用OvernightExpress Autoinduction System1(Novagen公司)培养该大肠杆菌。用制备的2ml培养液将转化大肠杆菌在37℃下培养至OD600值为0.5(约4小时)。将该大肠杆菌液作为预培养液，添加至50ml培养液中，在25℃下主培养一晚。

离心分离(3000rpm、4℃、15分钟)主培养一晚的大肠杆菌液，将集菌后的菌体悬浮于5ml超声缓冲液(组成：TrisHCl(pH7.0)：2.5mM，二硫苏糖醇(DTT)：1mM，对脒苯基甲磺酰氯盐酸(APMSF)：10μM)中，通过超声波处理将大肠杆菌粉碎，之后进行离心分离(15000rpm、4℃、10分钟)并回收上清。将该上清作为从表达Dm3MaT3的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液。离心分离使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMAN COULTER公司)。

＜酶活性测定＞

将50μl从表达Dm3MaT3的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液、5μl 1mg/ml丙二酰-CoA、5μl1M KPB(pH7.0)、5μl 500μg/ml木犀草素7-葡萄糖苷(溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中)进行混合，在冰上用水将其调整为100μl的反应液，并在30℃下保持20分钟。其后，加入100μl终止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应终止，并用高效液体色谱法(Prominence(岛津制作所))分析反应液。使用岛津PDA SPD-M20A检测器在330nm处检出了黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS 150mm＊4.6mm(岛津制作所)。溶出时使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％甲醇水溶液)。由两者的8:2混合液至0:10混合液进行16分钟的线性浓度梯度溶出和随后由0:10混合液进行6分钟溶出。流速设为0.6ml/分钟。作为对照，使用从导入了未插入嵌入片段的pET32a载体的大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液进行相同的实验。

菊花除了具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性以外还具有将丙二酰基转移到花色苷的3位葡萄糖的6位上的活性(参考非专利文献8)。作为编码具有将丙二酰基转移到花色苷的3位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因以及编码具有将丙二酰基转移到3位葡萄糖的6位被丙二酰化的花色苷的3位葡萄糖的3位上的活性的蛋白质的基因已被报道，其分别为来自菊花的花色素3-O-葡萄糖苷-6”-O-丙二酰基转移酶(Dm3MaT1)以及来自菊花的花色素3-O-葡萄糖苷-3”,6”-O-二丙二酰基转移酶(Dm3MaT2)，为了将Dm3MaT3与Dm3MaT1及Dm3MaT2差别化，针对Dm3MaT1、2也同样制备了大肠杆菌表达用载体，并使用从大肠杆菌中粗提的蛋白质溶液进行了酶活性测定实验。进而，进行以花青素3-葡萄糖苷为底物的酶反应，并与Dm3MaT3的结果进行比较。这种情况下用高效液体色谱法(Prominence(岛津制作所))分析反应液时，使用岛津PDA SPD-M20A检测器在520nm处检出了花色苷。色谱柱使用Shodex RSpak DE-413L(Shodex)。溶出时使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)。由两者的8:2混合液至0:10混合液进行15分钟的线性浓度梯度溶出和随后由0:10混合液进行5分钟溶出。流速设为0.6ml/分钟。

其结果，使Dm3MaT3与木犀草素7-葡萄糖苷进行酶反应时，除了作为底物添加的木犀草素7-葡萄糖苷外，还检测到了木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷的峰。使Dm3MaT1、2与木犀草素7-葡萄糖苷进行酶反应时，未检测到木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷的峰(参考图1)。

此外，使Dm3MaT3与花青素3-葡萄糖苷进行酶反应时，除了作为底物添加的花青素3-葡萄糖苷以外，还检测到了花青素3-丙二酰葡萄糖苷的峰。但是，与使Dm3MaT1和花青素3-葡萄糖苷进行反应时比较，在Dm3MaT3的情况下，花青素3-葡萄糖苷的消耗量明显减少(参考图2)。

此结果显示如下可能性：Dm3MaT3与Dm3MaT1、2不同，不是编码具有将丙二酰基转移到花色苷3-葡萄糖苷的3位葡萄糖的6位的活性的蛋白质的基因，也不是编码具有将丙二酰基转移到3位葡萄糖的6位被丙二酰化的花色苷的3位葡萄糖的3位的活性的蛋白质的基因，而是编码具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的基因。

[实施例2：具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质的酶活性测定实验(使用从大肠杆菌中纯化附加了His-Tag的蛋白质的蛋白质溶液时)]

＜丙二酰基转移酶的大肠杆菌表达和蛋白质纯化＞

按照制造商推荐的实验方法用Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司)培养实施例1中记载的导入了pET32a-Dm3MaT3的大肠杆菌株BL21。用制备的8ml培养液将转化大肠杆菌在37℃下培养至OD600值为0.5(约4小时)。将该大肠杆菌液作为预培养液，添加至200ml培养液中，在25℃下主培养一晚。

离心分离(1000×g、4℃、10分钟)主培养一晚的大肠杆菌液，将集菌后的菌体悬浮于20ml提取液(组成：缓冲液(KCl：300mM、KH₂PO₄：50mM、咪唑：5mM)(pH8.0)、对脒苯基甲磺酰氯盐酸(APMSF)：10μM)中，通过超声波处理将大肠杆菌粉碎，之后进行离心分离(1400×g、4℃、20分)并回收上清。将该上清通过0.45μm的过滤器，按照制造商推荐的实验方法用Profinia(Bio-Rad)纯化His-Tag。将所得的纯化蛋白质溶液用centrifugal Filters(Ultracel-10K)(Amicon Ultra公司)进行离心分离(7500×g、4℃、15分钟)，将该浓缩的蛋白质溶液作为“Dm3MaT3蛋白质溶液”。离心分离使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMANCOULTER公司)。

＜酶活性测定＞

将30μl Dm3MaT3蛋白质溶液(10μg)、5μl 1mg/ml丙二酰-CoA、5μl 1M KPB(pH7.0)、5μl500μg/ml木犀草素7-葡萄糖苷(溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中)进行混合，在冰上用水将其调整为100μl的反应液，并在30℃下保持20分钟。其后，加入100μl终止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应终止，用高效液体色谱法(Prominence(岛津制作所))分析反应液。使用岛津PDA SPD-M20A检测器在330nm处检出了黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS 150mm＊4.6mm(岛津制作所)。溶出时使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％甲醇水溶液)。由两者的8:2混合液至0:10混合液进行16分钟的线性浓度梯度溶出和随后由0:10混合液进行6分钟溶出。流速设为0.6ml/分钟。

其结果，在酶反应液中合成了木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷。反应率(底物转化比例)为81.13％(参考图3、图5)。相同反应条件下将500μg/ml芹菜素7-葡萄糖苷(溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中)作为底物进行酶反应时，合成了芹菜素7-丙二酰葡萄糖苷。反应率为85.80％(图5)。另一方面，相同反应条件下将500μg/ml木犀草素4’-葡萄糖苷(溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中)作为底物进行酶反应时，合成了被预测为木犀草素4’-丙二酰葡萄糖苷的物质，其反应率仅为34.81％(参考图4、图5)。进而针对图5中记载的各种类黄酮化合物(芹菜素、木犀草素、五羟黄酮、山奈酚、山奈酚3-葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素3-葡萄糖苷、杨梅素、花葵素、花葵素3-葡萄糖苷、花葵素3,5-二葡萄糖苷、花青素、花青素3-葡萄糖苷、花青素3,5-二葡萄葡萄糖苷、花翠素、花翠素3-葡萄糖苷、花翠素3,5-二葡萄葡萄糖苷)进行反应性研究时，明确了Dm3MaT3蛋白质将芹菜素7-葡萄糖苷、木犀草素7-葡萄糖苷这样的黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖选择性地丙二酰化，为底物特异性高的丙二酰基转移酶(参考图5)。

此外，分析Dm3MaT3与已知的糖转移酶中的碱基序列及氨基酸序列的同一性。将Dm3MaT3与同样来自菊花的丙二酰基转移酶进行比较时，Dm3MaT3与Dm3MaT1之间以及Dm3MaT3与Dm3MaT2之间的氨基酸序列同一性分别为55％及53％(参考图6)。在已鉴定的丙二酰基转移酶中，与Dm3MaT3同一性最高的氨基酸序列为Dm3MaT1(参考图7)。该分析使用MacVector应用程序(14.5.2(24)版、Oxford Molecular Ltd.,Oxford,England)的ClustalW程序。然而，Dm3MaT1和Dm3MaT2不具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性，本申请的Dm3MaT3是与Dm3MaT1和Dm3MaT2功能不同的丙二酰基转移酶。

[实施例3：Dm3MaT3基因在玫瑰中的表达]

为了确认本发明的Dm3MaT3基因在植物内编码具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性的蛋白质，构建了使Dm3MaT3在植物内表达的双元载体pSPB7136(参考图8)，并将其导入玫瑰(海洋之歌，Ocean Song)中。就pSPB7136而言，用pBINPLUS(Van Engel et al.,Transgenic Research 4,288)作为基本骨架，用EL235S启动子(Mitsuhara et al.,(1996)Plant Cell Physiol.37,p49)作为使Dm3MaT3基因表达的启动子，用HSP终止子(Plant Cell Physiol(2010)51,328-332)作为终止子。

用导入了pSPB7136的基因重组玫瑰的幼叶进行Dm3MaT3基因的表达分析。总RNA的分离按照制造商推荐的实验方法用Plant RNAeasy Kit(QIAGEN公司)获得，cDNA的合成按照制造商推荐的实验方法用GeneRacer Kit(Invitrogen公司)进行。逆转录PCR反应按照制造商推荐的实验方法以cDNA为模板用AmpliTaq Gold DNA Polymerase(Thermo FisherScientific公司)以20μl进行(将94℃下保持5分钟，94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分30秒保持的循环重复30个循环，之后72℃下7分钟，在4℃下保持)。此时，设计、使用使Dm3MaT3的全长cDNA特异性扩增的引物(正向引物：ATGGCTTCTCTTCCCATCTTG，反向引物：TTAAAGGTATGCTTTTAGTCC)。用琼脂糖凝胶电泳分析反应物时，由于检测到对应于全长cDNA的1365bp的扩增带，因此可确认在玫瑰中Dm3MaT3基因被转录。

[实施例4：玫瑰中的Dm3MaT3的功能分析]

由合成了全长cDNA Dm3MaT3的转录产物的玫瑰株系的花瓣制备粗酶溶液，并评价是否具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖的6位上的活性。将2.5g花瓣样本在液氮中一边冷却一边用研钵研磨，然后溶于30ml提取缓冲液(组成：TrisHCl(pH7.5)：100mM、聚乙烯吡咯烷酮K-30：10mg/ml、1-硫代甘油：1mg/ml、对脒苯基甲磺酰氯盐酸(APMSF)：10μM)中。离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)所得的蛋白质溶液并回收上清，在其中加入硫酸铵使饱和浓度为35％。在4℃下搅拌1小时后，离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)并回收上清。在所得的上清中加入硫酸铵使饱和浓度为70％，在4℃下搅拌3小时后，离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)得到沉淀。将该沉淀溶于1ml溶出缓冲液(组成：TrisHCl(pH7.5：20mM、DTT：1mM、对脒苯基甲磺酰氯盐酸(APMSF)：10μM)中，用NAP-5Colums Sephadex G-25DNA Grade(GE Healthcare公司)进行色谱柱纯化以去除硫酸铵。将该溶液作为“花瓣粗酶溶液”。离心分离使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMAN COULTER公司)。

将20μl花瓣粗酶溶液、5μl 1mg/ml丙二酰-CoA、5μl 1M KPB(pH7.0)、2.5μl 1mM芹菜素(溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中)进行混合，在冰上用水将其调整为100μl的反应液，在30℃下保持20分钟。其后，加入100μl终止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应终止，并用高效液体色谱法(Prominence(岛津制作所))分析反应液。使用岛津PDA SPD-M20A的检测器在330nm处检出了黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS 150mm＊4.6mm(岛津制作所)。溶出时使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)。由两者的9:1混合液至8:2混合液进行20分钟的线性浓度梯度溶出、由8:2混合液至2:8混合液进行15分钟的线性浓度梯度溶出、由2:8混合液至0:10混合液进行5分钟的线性浓度梯度溶出和随后由0:10混合液进行1分钟溶出。流速设为0.6ml/分钟。作为对照，对于非基因重组玫瑰也同样，由花瓣制备粗酶溶液并进行酶活性测定实验。

在使用非基因重组玫瑰的花瓣粗酶溶液的酶反应液中，芹菜素化合物中芹菜素占71.24％，芹菜素7-葡萄糖苷占28.76％，但未检测到芹菜素7-丙二酰葡萄糖苷。在使用导入了Dm3MaT3基因的基因重组玫瑰的花瓣粗酶溶液的酶反应液中，芹菜素7-丙二酰葡萄糖苷的峰占2.04％，其余的97.96％为对照的使用非基因重组玫瑰的花瓣粗酶溶液的酶反应液中也含有的芹菜素、芹菜素7-葡萄糖苷。由此可确认在基因重组玫瑰的花瓣中表达了具有将丙二酰基转移到黄酮7-葡萄糖苷的7位葡萄糖上的活性的Dm3MaT3。

序列表

<110> 三得利控股株式会社

<120> 丙二酰基转移酶基因的应用

<130> 1173605

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> 菊花

<400> 1

atggcttctc ttcccatctt gactgttctt gagcagtccc aagtatcgcc accaccagac 60

actctaggcg acaagtcact gcaactcact tttttcgatt tcttttggct gcgttctcct 120

ccgattaaca atcttttctt ttacgagctt cccatcacta gaagccaatt tactgaaacc 180

gttgttccca atattaaaca ttcgttatcg attacactta aacattttta cccttttgta 240

ggtaagttgg tagtatatcc tgctcctact aaaaagcctg aaatttgtta tgttgaaggt 300

gattctgtgg ctgttacttt cgcagaatgt aaccttgact taaacgaatt aacaggaaac 360

catcctagaa actgtgacaa gttttacgat cttgtaccaa tactaggtga gagtactaga 420

ttatcagact gcataaagat tccacttttc tccgttcaag tgacgctttt tcccaaccaa 480

ggaatagcta ttggaattac aaatcaccat tgcctaggtg atgctagcac tcggttttgt 540

ttcttgaagg cgtggacatc aattgcgcga tctggtaata atgatgagtc atttttagct 600

aacggcacta ggccattata tgatagaatc atcaaatatc caatgctaga tgaagcgtat 660

ctaaagcgtg caaaagttga aagttttaat gaagattatg taactcaaag cctagctgga 720

ccgagtgata aacttcgtgc cacgtttatc ttgacacgag ctgttatcaa tcagttaaaa 780

gatagagtat tagcccaact gccaacatta gaatatgtat catcttttac agtagcatgt 840

gcttacattt ggagttgcat tgcgaaatca cgcaatgata agttgcaact atttggtttc 900

ccaattgatc gtagagcacg tatgaagcca cctataccca cggcctactt tggcaactgc 960

gtcgggggtt gtgcggcgat tgcaaaaacc aatcttttaa tcggaaaaga aggattcata 1020

actgctgcaa aattgatagg agagaatcta cacaagacct tgactgatta taaggatgga 1080

gtcctaaaag acgacatgga atctttcaat gatttggtct ctgaaggaat gccaacaaca 1140

atgacatggg tatccggaac accaaagctt agattctatg acatggattt cgggtggggg 1200

aagccaaaaa agctcgaaac agtttcaatt gatcataatg gagcaatatc tatcaattct 1260

tgcaaagaat caaatgaaga tctggagatt ggtgtttgca tttcagctac tcagatggag 1320

gattttgttc atatctttga tgatggacta aaagcatacc tttaa 1365

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> 菊花

<400> 2

Met Ala Ser Leu Pro Ile Leu Thr Val Leu Glu Gln Ser Gln Val Ser

1 5 10 15

Pro Pro Pro Asp Thr Leu Gly Asp Lys Ser Leu Gln Leu Thr Phe Phe

20 25 30

Asp Phe Phe Trp Leu Arg Ser Pro Pro Ile Asn Asn Leu Phe Phe Tyr

35 40 45

Glu Leu Pro Ile Thr Arg Ser Gln Phe Thr Glu Thr Val Val Pro Asn

50 55 60

Ile Lys His Ser Leu Ser Ile Thr Leu Lys His Phe Tyr Pro Phe Val

65 70 75 80

Gly Lys Leu Val Val Tyr Pro Ala Pro Thr Lys Lys Pro Glu Ile Cys

85 90 95

Tyr Val Glu Gly Asp Ser Val Ala Val Thr Phe Ala Glu Cys Asn Leu

100 105 110

Asp Leu Asn Glu Leu Thr Gly Asn His Pro Arg Asn Cys Asp Lys Phe

115 120 125

Tyr Asp Leu Val Pro Ile Leu Gly Glu Ser Thr Arg Leu Ser Asp Cys

130 135 140

Ile Lys Ile Pro Leu Phe Ser Val Gln Val Thr Leu Phe Pro Asn Gln

145 150 155 160

Gly Ile Ala Ile Gly Ile Thr Asn His His Cys Leu Gly Asp Ala Ser

165 170 175

Thr Arg Phe Cys Phe Leu Lys Ala Trp Thr Ser Ile Ala Arg Ser Gly

180 185 190

Asn Asn Asp Glu Ser Phe Leu Ala Asn Gly Thr Arg Pro Leu Tyr Asp

195 200 205

Arg Ile Ile Lys Tyr Pro Met Leu Asp Glu Ala Tyr Leu Lys Arg Ala

210 215 220

Lys Val Glu Ser Phe Asn Glu Asp Tyr Val Thr Gln Ser Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Ser Asp Lys Leu Arg Ala Thr Phe Ile Leu Thr Arg Ala Val Ile

245 250 255

Asn Gln Leu Lys Asp Arg Val Leu Ala Gln Leu Pro Thr Leu Glu Tyr

260 265 270

Val Ser Ser Phe Thr Val Ala Cys Ala Tyr Ile Trp Ser Cys Ile Ala

275 280 285

Lys Ser Arg Asn Asp Lys Leu Gln Leu Phe Gly Phe Pro Ile Asp Arg

290 295 300

Arg Ala Arg Met Lys Pro Pro Ile Pro Thr Ala Tyr Phe Gly Asn Cys

305 310 315 320

Val Gly Gly Cys Ala Ala Ile Ala Lys Thr Asn Leu Leu Ile Gly Lys

325 330 335

Glu Gly Phe Ile Thr Ala Ala Lys Leu Ile Gly Glu Asn Leu His Lys

340 345 350

Thr Leu Thr Asp Tyr Lys Asp Gly Val Leu Lys Asp Asp Met Glu Ser

355 360 365

Phe Asn Asp Leu Val Ser Glu Gly Met Pro Thr Thr Met Thr Trp Val

370 375 380

Ser Gly Thr Pro Lys Leu Arg Phe Tyr Asp Met Asp Phe Gly Trp Gly

385 390 395 400

Lys Pro Lys Lys Leu Glu Thr Val Ser Ile Asp His Asn Gly Ala Ile

405 410 415

Ser Ile Asn Ser Cys Lys Glu Ser Asn Glu Asp Leu Glu Ile Gly Val

420 425 430

Cys Ile Ser Ala Thr Gln Met Glu Asp Phe Val His Ile Phe Asp Asp

435 440 445

Gly Leu Lys Ala Tyr Leu

450

<210> 3

<211> 1380

<212> DNA

<213> 菊花

<400> 3

atggcttcca attccattgt tacaattctt gaacaatctc gaatatcctc accaccaggc 60

accattggtg aacgttcatt gccacttact tttttcgaca ttggatgggt acctttccct 120

ccagtccacc atgttttctt ctaccgcttc ccgcactcta aatcacattt cttagaaacc 180

gttgtcccaa atcttaaaca ctctttatca ctcgcactac aacatttttt cccattcgct 240

agcaatttgt atgtatctcc taatgctgat gattttggcg tcattagaaa accggaaatt 300

agacacgtgg aaggtgatta tgttgcactt acttttgcag aatgttctct tgattttaat 360

gatttgacag gaaatcatcc tcgaaaatgt gaaaactttt atccacttgt gcctccatta 420

ggtaatgttg ttaaaatggc tgattgtgtc acaatcccac ttttttcagt ccaagtgacg 480

tactttaggg actcgggtat ctctattgga atgacaaatc atcatagcct aggtgacgct 540

agcacacgcc ttggtttttt gaaggtgtgg acttcaattg ctaaatcggg gggtgatcaa 600

tcacttttaa tgaatggatc actcccggtt ttagatagat tgattgacgt tccaaaacta 660

gatgaataca gattgaggca cacaagcctt gaaacttttt atcagcctcc gagccttgtt 720

gggcctacaa agaaagttcg ggcaacattt atattgagtc gaaccaatat caatcagtta 780

aagaaaaggg tccttaccca aatcccaaca ttggaataca tatcatcttt tacggtaact 840

tgtggttata tatggagttg cattgcaaaa tcactagtga aaatgggaga aaaaaagggc 900

gaggatgagt tagaacaatt catttgcacg gctgattgtc gctctcgtat ggatccaccg 960

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aaaatggtaa agaataagga aggaatcttg aaagatgccg agagatggca tgatgctttc 1140

aagattccag caaggaagat tggtgttgcg ggtacaccaa agctcaactt ctatgatatt 1200

gattttgggt gggggaagcc gcaaaagaat gaaactattt cgattgatta taacggttcg 1260

gttgctataa atgcaagcaa agaatcaaca caagattttg aaattggatt gtgtttttca 1320

aatatgcaaa tggaggcgtt tgctgatatc tttaatcacg gattagagag tgagatataa 1380

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> 菊花

<400> 4

Met Ala Ser Asn Ser Ile Val Thr Ile Leu Glu Gln Ser Arg Ile Ser

1 5 10 15

Ser Pro Pro Gly Thr Ile Gly Glu Arg Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe

20 25 30

Asp Ile Gly Trp Val Pro Phe Pro Pro Val His His Val Phe Phe Tyr

35 40 45

Arg Phe Pro His Ser Lys Ser His Phe Leu Glu Thr Val Val Pro Asn

50 55 60

Leu Lys His Ser Leu Ser Leu Ala Leu Gln His Phe Phe Pro Phe Ala

65 70 75 80

Ser Asn Leu Tyr Val Ser Pro Asn Ala Asp Asp Phe Gly Val Ile Arg

85 90 95

Lys Pro Glu Ile Arg His Val Glu Gly Asp Tyr Val Ala Leu Thr Phe

100 105 110

Ala Glu Cys Ser Leu Asp Phe Asn Asp Leu Thr Gly Asn His Pro Arg

115 120 125

Lys Cys Glu Asn Phe Tyr Pro Leu Val Pro Pro Leu Gly Asn Val Val

130 135 140

Lys Met Ala Asp Cys Val Thr Ile Pro Leu Phe Ser Val Gln Val Thr

145 150 155 160

Tyr Phe Arg Asp Ser Gly Ile Ser Ile Gly Met Thr Asn His His Ser

165 170 175

Leu Gly Asp Ala Ser Thr Arg Leu Gly Phe Leu Lys Val Trp Thr Ser

180 185 190

Ile Ala Lys Ser Gly Gly Asp Gln Ser Leu Leu Met Asn Gly Ser Leu

195 200 205

Pro Val Leu Asp Arg Leu Ile Asp Val Pro Lys Leu Asp Glu Tyr Arg

210 215 220

Leu Arg His Thr Ser Leu Glu Thr Phe Tyr Gln Pro Pro Ser Leu Val

225 230 235 240

Gly Pro Thr Lys Lys Val Arg Ala Thr Phe Ile Leu Ser Arg Thr Asn

245 250 255

Ile Asn Gln Leu Lys Lys Arg Val Leu Thr Gln Ile Pro Thr Leu Glu

260 265 270

Tyr Ile Ser Ser Phe Thr Val Thr Cys Gly Tyr Ile Trp Ser Cys Ile

275 280 285

Ala Lys Ser Leu Val Lys Met Gly Glu Lys Lys Gly Glu Asp Glu Leu

290 295 300

Glu Gln Phe Ile Cys Thr Ala Asp Cys Arg Ser Arg Met Asp Pro Pro

305 310 315 320

Ile Pro Ser Thr Tyr Phe Gly Asn Cys Gly Ala Pro Cys Val Thr Thr

325 330 335

Ile Lys Asn Val Val Leu Ser Ser Glu Asn Gly Phe Val Phe Ala Ala

340 345 350

Lys Leu Ile Gly Glu Ala Ile Asn Lys Met Val Lys Asn Lys Glu Gly

355 360 365

Ile Leu Lys Asp Ala Glu Arg Trp His Asp Ala Phe Lys Ile Pro Ala

370 375 380

Arg Lys Ile Gly Val Ala Gly Thr Pro Lys Leu Asn Phe Tyr Asp Ile

385 390 395 400

Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Gln Lys Asn Glu Thr Ile Ser Ile Asp

405 410 415

Tyr Asn Gly Ser Val Ala Ile Asn Ala Ser Lys Glu Ser Thr Gln Asp

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435 440 445

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450 455

<210> 5

<211> 1383

<212> DNA

<213> 菊花

<400> 5

atggcttcca atcccattgt tacaattctt gaacactctc gaatatcctc accaccaggc 60

accattggtg aacgatcatt gccgcttact tttttcgaca ttacatggct agctttccct 120

cctgtccatc atgttttctt ctacgccttc cagcactcta aatcacattt cctagaaacc 180

gttgttccaa atcttaagca ctctttatca ctcacactac aacatttttt cccattcgca 240

ggcaatttgt ttgtatttcc taatgctgat gattatggtg tcattagaaa accggaaatt 300

cgacacgtgg aaggtgatta tgttgcactt acttttgcag aatgtcctac tcttgatttt 360

aatgatttga caggaaacca tcctcgagaa tgtgaaaatt ttcatccact tgtacctcca 420

ttgggtgatc ttgttaaaat gtatgattat gtcacgatcc cacttttgtc ggtccaagtt 480

acgtacttta aggactcggg tatctctatt ggtatgacaa atcatcatac cgtagctgat 540

gctagcacac gccttggttt tttgaaggcg tggacttcaa ttgctaaatc ggggagagat 600

caatcatttg taatgaatgg atcacccccg gttttagata ggttgattga cattccaaaa 660

ctagatgaat tcagattgag gcacacaagc cttgaaactc tttatcagcc tcggagcctt 720

gttgggccta ctaagaaagt tcgggcaaca tttatattga gtcgaaccaa tatcaatcag 780

ttgaagaaaa gggttctcac ccaaatccca acattggaat acatatcatc ttttacggta 840

acttgtggtt atatatggag ttgcattgcg aaatcactag tgaaaatggg agaaaaaaag 900

ggtgaggacg agttagaaca attcattatc tcggttgatt gtcgctctcg tatgaatcca 960

ccgattccat caacctactt gggtaattgt ggtgcaccat gtatcacaac cataaaaaat 1020

gttgttttgt cgagtgaaaa tggatttgta ttcactgcta aactaattag tgaggctata 1080

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ttcaagattc cagcaaggaa gattggtgtt gcgggtacac caaagctcaa cttctatgat 1200

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tcggttgcta taaatgcaag caaagaatca acacaagatt ttgaaattgg attgtgtttt 1320

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taa 1383

<210> 6

<211> 460

<212> PRT

<213> 菊花

<400> 6

Met Ala Ser Asn Pro Ile Val Thr Ile Leu Glu His Ser Arg Ile Ser

1 5 10 15

Ser Pro Pro Gly Thr Ile Gly Glu Arg Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe

20 25 30

Asp Ile Thr Trp Leu Ala Phe Pro Pro Val His His Val Phe Phe Tyr

35 40 45

Ala Phe Gln His Ser Lys Ser His Phe Leu Glu Thr Val Val Pro Asn

50 55 60

Leu Lys His Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln His Phe Phe Pro Phe Ala

65 70 75 80

Gly Asn Leu Phe Val Phe Pro Asn Ala Asp Asp Tyr Gly Val Ile Arg

85 90 95

Lys Pro Glu Ile Arg His Val Glu Gly Asp Tyr Val Ala Leu Thr Phe

100 105 110

Ala Glu Cys Pro Thr Leu Asp Phe Asn Asp Leu Thr Gly Asn His Pro

115 120 125

Arg Glu Cys Glu Asn Phe His Pro Leu Val Pro Pro Leu Gly Asp Leu

130 135 140

Val Lys Met Tyr Asp Tyr Val Thr Ile Pro Leu Leu Ser Val Gln Val

145 150 155 160

Thr Tyr Phe Lys Asp Ser Gly Ile Ser Ile Gly Met Thr Asn His His

165 170 175

Thr Val Ala Asp Ala Ser Thr Arg Leu Gly Phe Leu Lys Ala Trp Thr

180 185 190

Ser Ile Ala Lys Ser Gly Arg Asp Gln Ser Phe Val Met Asn Gly Ser

195 200 205

Pro Pro Val Leu Asp Arg Leu Ile Asp Ile Pro Lys Leu Asp Glu Phe

210 215 220

Arg Leu Arg His Thr Ser Leu Glu Thr Leu Tyr Gln Pro Arg Ser Leu

225 230 235 240

Val Gly Pro Thr Lys Lys Val Arg Ala Thr Phe Ile Leu Ser Arg Thr

245 250 255

Asn Ile Asn Gln Leu Lys Lys Arg Val Leu Thr Gln Ile Pro Thr Leu

260 265 270

Glu Tyr Ile Ser Ser Phe Thr Val Thr Cys Gly Tyr Ile Trp Ser Cys

275 280 285

Ile Ala Lys Ser Leu Val Lys Met Gly Glu Lys Lys Gly Glu Asp Glu

290 295 300

Leu Glu Gln Phe Ile Ile Ser Val Asp Cys Arg Ser Arg Met Asn Pro

305 310 315 320

Pro Ile Pro Ser Thr Tyr Leu Gly Asn Cys Gly Ala Pro Cys Ile Thr

325 330 335

Thr Ile Lys Asn Val Val Leu Ser Ser Glu Asn Gly Phe Val Phe Thr

340 345 350

Ala Lys Leu Ile Ser Glu Ala Ile Asn Lys Met Val Lys Asn Lys Glu

355 360 365

Gly Ile Leu Lys Asp Ala Glu Arg Trp His Glu Gly Phe Lys Ile Pro

370 375 380

Ala Arg Lys Ile Gly Val Ala Gly Thr Pro Lys Leu Asn Phe Tyr Asp

385 390 395 400

Ile Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Gln Lys Tyr Glu Ala Ile Ser Ile

405 410 415

Asp Tyr Lys Gly Ser Val Ala Ile Asn Ala Ser Lys Glu Ser Thr Gln

420 425 430

Asp Phe Glu Ile Gly Leu Cys Phe Pro Asn Met Gln Met Lys Ala Phe

435 440 445

Ala Asp Ile Phe Asn His Gly Phe Glu Ser Glu Val

450 455 460

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dm3MaT3的正向引物

<400> 7

atggcttctc ttcccatctt g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dm3MaT3的反向引物

<400> 8

ttaaaggtat gcttttagtc c 21

Claims

1.一种方法，为生产生成在7位葡萄糖上赋予了丙二酰基的黄酮的基因重组植物或其后代的方法，其特征在于，包含将选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸导入宿主植物内：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因重组植物具有经改变的花色。

4.一种基因重组植物或其后代或它们的部分或组织，其生成在7位葡萄糖上赋予了丙二酰基的黄酮，其特征在于，含有选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

5.根据权利要求4所述的基因重组植物或其后代或它们的部分或组织，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。

6.根据权利要求4或5所述的植物或其后代或它们的部分或组织，其特征在于，所述基因重组植物具有经改变的花色。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的植物的部分，其特征在于，其为切花。

8.一种切花加工品，其特征在于，使用权利要求7中所述的切花。

9.一种方法，为制造在7位葡萄糖上附加了丙二酰基的黄酮的方法，其特征在于，包含将选自以下(a)～(e)的多聚核苷酸导入非人宿主内，并培养或培育该非人宿主：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；

(c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述非人宿主为植物细胞。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述黄酮为木犀草素或芹菜素。