JP4691720B2 - 新規アントシアニジングルコシル基転移酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において一個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質、
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して20%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
〔3〕本発明の第三は、配列番号1に記載の塩基配列で表される核酸、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードする核酸の一部又は全部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、グルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性及び/又はグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、グルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性及び/又はグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性を有するタンパク質をコードするものである。
ここで「配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する」とは、配列番号2に記載のアミノ酸配列のみからなるタンパク質だけでなく、このようなタンパク質のN末端又はC末端側に複数のアミノ酸が付加したタンパク質をも含む趣旨である。付加するアミノ酸の個数は、上記グルコシル基転移活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は400個以内であり、好ましくは50個以内である。
このような付加、欠失、置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質は、天然のものでもよく、また、人工的なものであってもよい。付加、欠失、置換するアミノ酸の個数は上記グルコシル基転移活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は20個以内であり、好ましくは5個以内である。
ここで「一定以上の相同性」とは、通常は20%以上の相同性、好ましくは50%以上の相同性、より好ましくは60%以上の相同性、最も好ましくは70%以上の相同性を意味する。
ここで「核酸の一部」とは、例えば、コンセンサス配列領域の6個以上のアミノ酸配列をコードする部分などを意味する。
本発明のベクターは、既知の発現ベクターに(1)の遺伝子を挿入することにより作製できる。
本発明における形質転換された宿主細胞とは、(2)のベクターにより形質転換された宿主細胞である。
上記(1)の遺伝子によってコードされるタンパク質も本発明に含まれる。このタンパク質は、例えば、後述する(5)の方法によって製造することができる。
本発明のタンパク質の製造方法は、(3)の宿主細胞を培養し、又は生育させ、その後、該宿主細胞からグルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性及び/又はグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性を有するタンパク質を採取すること、もしくは無細胞タンパク質合成系などによるタンパク質の製造を特徴とするものである。
本発明の植物は、上記(1)の遺伝子又は(2)のベクターが導入され形質転換されたものである。
上記(6)の植物の子孫も本発明に含まれる。
上記(6)の植物又は(7)の植物の子孫の組織も本発明に含まれる。
上記(6)の植物又は(7)の植物の子孫の切り花も本発明に含まれる。
本発明のグルコシル基の転移方法は、上記(1)の遺伝子のうちグルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性とグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性の両者を有するタンパク質をコードするもの、又は上記(2)のベクターのうちグルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性とグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性の両者を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいるものを、植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることによる、アントシアニジンの5位の水酸基へグルコシル基を転移させた後、3位の水酸基へグルコシル基を転移させるものである。
本発明の花色の調節方法は、上記(1)の遺伝子又は(2)のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることにより、あるいは、上記(1)の遺伝子を持つ植物において、該遺伝子の発現を抑制することにより、植物体の花や果実の色を調節するものである。遺伝子導入の対象とする植物は特に限定されず、例えば、上記(6)で例示した植物を使用できる。また、(1)の遺伝子の抑制対象とする植物は(1)の遺伝子を持つ植物であれば特に限定されない。
(1)植物材料の調製
バラ‘クリムソングローリー’(Rosa hybrida cv. Crimson Glory)(広島バラ園)の苗を、10号ポリポットに移植してガラス温室にて育苗した。その後、アントシアニン抽出に用いた‘クリムソングローリー’の開花花弁は35℃で通風乾燥した後、アントシアニン抽出に用いるまで真空デシケーター内で保存した。
酵素反応基質および反応産物の同定は、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析による標準物質とのコクロマトグラフィーおよび分光学的手法により行った。シアニジン、シアニジン3-グルコシド、シアニジン3,5-グルコシドは市販品(フナコシ(株)製)を用いた。
バラ乾燥花弁(後述のHPLC(520nm)分析の結果、粗抽出液でシアニジン3,5-ジグルコシドを95%以上含む:生重量100g)を1Lの0.05%塩酸水溶液にて一晩常温で放置し粗抽出液を得た後、石油エーテル、クロロホルム及び酢酸エチルにより分画操作を行った。アンバーライトXAD-7(オルガノ(株)製)を充填したガラスカラム(30 mm i.d.×600 mm)を0.01%塩酸水溶液にて平衡化したのち2倍に希釈した水層画分をカラムに通し、色素を吸着させた。未吸着物質を洗浄した後、0.01%塩酸を含む80%メタノール水溶液にて色素を溶出した。溶出液は乾燥固化させた。
0.1Mトリス-塩酸緩衝液(pH8.0)、0.5mMシアニジンまたはシアニジン5-グルコシドまたはシアニジン3-グルコシド、1mM UDP-グルコース及び粗酵素液30μlを含む反応液 50μlを30℃で反応させた。1M塩酸水溶液10μlを加えて反応を停止させ、クロロホルム:メタノール=2:1を等量加え攪拌後遠心し、上清を凍結乾燥機にて乾燥させHPLC溶媒 A/B=95:5を10μl加え再溶解後遠心し上清を分析サンプルとした。
バラ‘クリムソングローリー’(Rosa hybrida cv. Crimson Glory)‘ローテローゼ(cv. Rote Roze)‘カールレッド’(cv. Carl Red)の花弁をそれぞれ用い、シアニジン、シアニジン5-グルコシドおよびシアニジン 3-グルコシドを基質に用いて活性測定を行った。以下の実験は0〜4℃で行った。
バラの凍結花弁10gをポリビニルポリピロリドン(PVPP)5gと共に液体窒素存在下で乳鉢及び乳棒で磨砕した。100mlの緩衝液A(100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、14mM 2-メルカプトエタノール、1%ポリビニルピロリドンK-30(PVP)、100mM 塩化ナトリウム、5mM EDTA、5mM アスコルビン酸ナトリウム、10%グリセロール、0.1% Triton X-100)を加え、攪拌溶出した。抽出懸濁液を四重のガーゼにて濾過後12,000 rpmで20分間遠心した。
濾液(約100ml)を10%飽和硫安で40分間塩析を行った後、不溶物を12,000 rpmで20分間遠心することにより除去した。70%飽和硫安で再び塩析を行い、12,000 rpmで20分間遠心することにより沈殿を得た。沈殿を最少量の緩衝液B(50mMトリス塩酸(pH 8.0)、14mM 2-メルカプトエタノール)に再溶解した後、緩衝液Bで平衡化したSephadex G-25 Fine(30 mm i.d.×500 mm;Amersham Bioscience)カラムを用いて脱塩した。タンパク質画分(約20ml)を回収して以下のクロマトグラフィーに供した。
陰イオン交換樹脂であるDE52(ワットマン製)をカラム(30 mm i.d.×50 mm)に充填して、緩衝液Bで平衡化した。カラムへ2倍希釈した酵素溶液を添加し、緩衝液Bで洗浄後、塩化ナトリウム0.3Mを含む緩衝液Bにより溶出し、粗酵素液とした。
上述の粗酵素液を用い酵素活性測定を行った。HPLC分析は、実施例1および2に記載の方法に従って行った。その結果、シアニジンを基質とした場合、その反応産物はシアニジン5-グルコシド、シアニジン3,5-ジグルコシドおよび極微量のシアニジン3-グルコシドであり、シアニジン3-グルコシドを基質とした場合、シアニジン3,5-ジグルコシドは得られなかった。さらに、シアニジン5-グルコシドを基質とした時シアニジン3,5-ジグルコシドが得られた。基質別の反応結果を図1に示す。つまり、これまで考えられていたアントシアニジンの3位への配糖体化、その後の5位への配糖体化という生合成(Tanaka et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39: 1119-1126、Forkmann, (2003) in: Encyclopedia of rose science Vol.1. 256-262, Elsevier academic press, Oxford).とは逆の、最初に5位の配糖体化、そして3位の配糖体化がバラ粗酵素液で検出された。さらにバラ花弁に含まれるペラルゴニジン3,5-ジグルコシドのアグリコンであるペラルゴニジンを基質とした場合もシアニジンと同様の配糖体化反応が起こり、ペラルゴニジン3-グルコシドを基質とした場合はシアニジン3-グルコシド同様、反応産物は得られなかった。
(1)RNAの調製
バラ品種、クリムソングローリーの花弁から改変CTAB法(Chang et al., 1993, 向井・山本 植物細胞工学シリーズ7 pp.57-62)により全RNAを調製した。poly(A)+RNAはこの全RNA(250μg)からOligotex-dT30 super(Takara)を用い、製造者の推奨する方法にて調製した。
調製した全RNAを99℃で2分間処理し、氷冷後、First strand cDNA synthesis kit (Pharmacia)を用い、製造者の示した方法によりcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、植物二次代謝産物配糖化酵素(Plant Secondary Product Glycosyltransferase)に高度に保存されている領域PSPG-box(Huges and Huges (1994) DNA Seq., 5: 41-49)のアミノ酸配列を基に設計した縮重プライマーGTSPFd[WCICAYTGYGGITGGAAYTC:配列番号3]及びcDNA合成に用いたNot Id(T)18に存在する配列を基に設計したNotIR1[AACTGGAAGAATTCGCGGC:配列番号4]をプライマーとし、PCR反応を行った。PCR反応液は、2μl cDNA,1x Expand HF バッファー(BOEHRINGER MANNHEIM), 0.2mM dNTPs、プライマー各1.6pmol/μl、Expand High Fidelity PCR system 酵素ミックス1.75 unitからなる総体積50μlに調製した。反応は、94℃で2分反応させた後、94℃・30秒、48℃・30秒、72℃・30秒の反応を40サイクル行い、最後に72℃で1分間処理した。得られた反応産物を0.8%アガロースゲル電気泳動し、予想されるサイズのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を鋳型に、GTSPFd及びNot Id(T)18に存在する配列を基にNotIR1の3’側に設計したNotR2(GAACGCGGCCGCAGGAAT:配列番号5)をプライマーとしPCR反応を行った。PCR反応液は、2μl cDNA,1x Expand HF バッファー(BOEHRINGER MANNHEIM), 0.2mM dNTPs、プライマー各1.6pmol/μl、Expand High Fidelity PCR system 酵素ミックス1.75 unitからなる総体積50μlに調製した。反応は、94℃で2分反応させた後、94℃・30秒、48℃・30秒、72℃・30秒の反応を40サイクル行い、最後に72℃で1分間処理した。得られた反応産物を0.8%アガロースゲル電気泳動し、予想されるサイズのDNA断片を回収した。回収したDNA産物をpGEM Easy Tベクター(Promega)にクローニングした。このようにして得られたプラスミドのいくつかのクローンをABITM BigDyeTMTerminator cycle sequencing reaction ver.3.1(Applied Biosystem)を用いて反応し、DNA Sequencer model 3100を用いて、全塩基配列を決定した後、BLASTX 検索を行い、糖転移酵素遺伝子に相同性の認められるクローン RhGT fra.42を見出した。
5’RACEに用いた5’末端を有するmRNAに対するcDNAはGeneRacer kit (Invitrogen) を用い、製造者の示した方法に従って合成した。合成したcDNAを鋳型にGeneRacer kitのGeneRacer 5’primer (CGACTGGAGCACGAGGACACTGA:配列番号6)及び RhGT Fra.42の内部配列に設定したプライマー42R1(TTATGCGGGCCCAACATGCC:配列番号7)を用い1st-PCRを行った。PCR反応液は、1μl cDNA、1x LA PCR Buffer II(Takara),0.2mM dNTPs、 3μl GeneRacer 5’primer (10μM)、2μl 42R1(5μM)、2mM MgCl2、Takara LA Taq 2.5 unitからなる総体積50μlに調製した。反応は、94℃で2分反応させた後、94℃・30秒、58℃・30秒、72℃・2分の反応を40サイクル行い、最後に72℃で2分間処理した。この反応液を0.8%アガロース電気泳動にかけ、増幅産物のバンドを切り出し、Qiagen Gel Extraction kit(Qiagen)により増幅産物を回収した。回収した増幅産物を鋳型にGeneRacer kitのGeneRacer 5’Nested primer 及びRhGT Fra.42の内部配列に設定したプライマー42R2(CCACAGCTGAGCCAACTTGG:配列番号8)を用いNeated-PCRを行った。PCR反応液は、1μl cDNA,1x LA PCR Buffer II(Takara),0.2mM dNTPs、1μl GeneRacer 5’primer (10μM)、2μl 42R1(5μM)、2mM MgCl2、Takara LA Taq 2.5 unitからなる総体積50μlに調製した。反応は、94℃で2分反応させた後、94℃・30秒、58℃・30秒、72℃・2分の反応を40サイクル行い、最後に72℃で2分間処理した。この反応液を0.8%アガロース電気泳動にかけ、増幅産物のバンドを切り出し、Qiagen Gel Extraction kit(Qiagen)により増幅産物を回収した。得られたPCR産物をpGEM Easy Tベクター(Promega)にクローニングした。このようにして得られたプラスミドのいくつかのクローンをABITM BigDyeTMTerminator cycle sequencing reaction ver.3.1(Applied Biosystem)を用いて反応し、DNA Sequencer model 3100を用いて、全塩基配列を決定した後、DNASISを用い、コードされるアミノ酸配列を推定した。
(1)RhGT Fra.42の全タンパク質コード領域のクローニング
実施例5によって得られたクローンの塩基配列から予想されるタンパク質コード領域をPCRにより増幅後、大腸菌発現用pETベクターにクローニングした。全RNAに対するcDNAをFirst strand cDNA synthesis kit(Pharmacia)を用い、製造者の推奨する方法にてNot I dTプライマーを用い逆転写反応を行い合成した。大腸菌発現用pET30Ek/LIC(Novagen)にクローニングするための配列と実施例5で得られた塩基配列から予想されるタンパク質の開始コドンを含むプライマーRhGTFd(GACGACGACAAGATGGGTGGTGATGCTATAGTTTG:配列番号9)及び終始コドンを含むプライマーRhGTRv(GAGGAGAGCCCGGTTCATTTTTGCTTCCACAGCTGAGCC:配列番号10)を製造者の推奨する方法に従って合成した。PCR反応液は2μl cDNA,1x Expand HF バッファー(BOEHRINGER MANNHEIM), 0.2mM dNTPs、プライマー各1.6pmol/μl、Expand High Fidelity PCR system 酵素ミックス1.75 unitからなる総体積50μlに調製した。反応は、94℃で2分反応させた後、94℃・30秒、55℃・30秒、72℃・2分の反応を40サイクル行い、最後に72℃で2分間処理した。得られた反応産物を0.8%アガロースゲル電気泳動し、増幅産物をQIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いてゲルからDNAを精製した。得られたDNAをpET30Ek/LIC(Novagen)に製造者の推奨する方法に従って連結した後、大腸菌JM109に形質転換して幾つかのクローンをT7 プロモーター、T7ターミネータープライマーを用い、BigDye Terminator Ver. 3.1を用いたCycle Sequencing Reactionを行った後、ABI3100 Genetic Analyserを用いて塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定を行ったpETクローンのうちpETRhGT1は1,422塩基対(この塩基配列を配列番号1に示す。)からなり、473アミノ酸残基(このアミノ酸配列を配列番号2に示す。)からなるタンパク質をコードしていた。このpETRhGT1を用いて機能解析を行った。
pETRhGT1を大腸菌BL21(DE3)(Novagen)に形質転換した。形質転換株はカナマイシン30μg/mlを含むLB培地3mlで37℃で一晩振盪培養した。この培養液500μlをカナマイシン30μg/mlを含むLB培地に加え、600nmにおける吸光度が0.4に達するまで振盪培養した後、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度0.4mMになるように添加し、22℃で12時間振盪培養した後、冷却遠心(8000rpm, 4℃, 20分間)して菌体を回収した。
(1)組換えタンパク質の抽出
組換えタンパク質の抽出には、菌体のペレットを、1mlの溶解緩衝液(pH8.0)(100mMトリス塩酸、300mM塩化ナトリウム、14mM 2-メルカプトエタノール0.1% Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails (SIGMA社製))に再懸濁し、超音波破砕機により破壊し、冷却遠心機で分離した。上清を組換えタンパク質液とし、酵素活性測定に用いた。
組換えpETRhGT1タンパク質を用い酵素反応を行った。組換えタンパク質液30μlを用い〔実施例2〕と同様の方法で行った。HPLCによる分析には逆層カラム Wakosil-II5C18ARカラム(4.6 mm i.d.×250 mm)を用い、カラム温度35℃で行った。流速1ml/minにて0.5%TFA、5%アセトニトリルを含む水溶液に対して5%から20%の0.5%TFAを含むアセトニトリル溶液による直線的濃度勾配で20分間の溶出時間でPDAを用いて検出した。基質別の反応結果を図2に示す。標準物質とのコクロマトグラフィー分析により、反応産物をそれぞれシアニジン3,5-ジグルコシド及びシアニジン5-グルコシドと同定した。さらにシアニジン3-グルコシドを基質とした場合、その反応産物は得られなかった。本条件による各化合物の溶出時間は以下のとおりである。シアニジン 3,5-ジグルコシド:6.31 分、シアニジン3-グルコシド:9.85 分、シアニジン5-グルコシド:10.68 分、シアニジン:16.34 分。以上の結果より、pETRhGT1クローンの組換え酵素はUDP-glucose: cyanidin 5-O-glucosyltransferase及びUDP-glucose: cyanidin 5-O-glucoside 3-O-glucosyltransferase活性の両方を持つことがあきらかになった。従って、RhGT1遺伝子はアントシアニジンの5位及び3位の水酸基に逐次グリコシル基を転移する活性がある、UDP-glucose:anthocyanidin 5,3-O-glucosyltransferaseをコードしていることが確認された。
Claims (15)
- グルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性及び/又はグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、以下の(a)〜(b)のタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質。 - グルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性とグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性の両者を有するタンパク質をコードする請求項1に記載の遺伝子。
- 請求項1に記載の遺伝子を含んでいるベクター。
- 請求項2に記載の遺伝子を含んでいるベクター。
- 請求項3又は4に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質。
- 請求項5に記載の宿主細胞を培養し、又は生育させ、その後、該宿主細胞からグルコシル基をアントシアニジンの5位の水酸基へ転移させる活性及び/又はグルコシル基をアントシアニジン5-グルコシドの3位の水酸基へ転移させる活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子を用いた無細胞タンパク質合成系による該タンパク質の製造方法。
- 請求項1若しくは2に記載の遺伝子、又は請求項3若しくは4に記載のベクターが導入され、形質転換された植物であって、花又は果実の発色が変換された植物。
- 請求項9に記載の植物の子孫であって、花又は果実の発色が変換されているという性質を有する該植物の子孫。
- 請求項9に記載の植物又は請求項10に記載の該植物の子孫の組織。
- 請求項9に記載の植物又は請求項10に記載の該植物の子孫の切り花。
- 請求項2に記載の遺伝子、又は請求項4に記載のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることによる、アントシアニジンの5位の水酸基へグルコシル基を転移させた後、3位の水酸基へグルコシル基を転移させる方法。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子、又は請求項3又は4に記載のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることにより、植物体の花色を調節する方法。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子を持つ植物において、該遺伝子の発現を抑制することにより、植物体の花色を調節する方法。
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