WO2013108794A1 - 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents

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protein
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田中　良和
奈央子 興津
啓祐 松井
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サントリーホールディングス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4'-position hydroxyl group of flavone, and use thereof.
  • the flower color is attributed to four types of pigments: flavonoids, carotenoids, chlorophyll, and betalain.
  • flavonoids exhibit various colors such as yellow, red, purple, and blue.
  • Anthocyanin One group exhibiting red, purple, and blue is collectively called anthocyanin, and the variety of anthocyanin structure is one of the causes of the variety of flower colors.
  • Anthocyanins can be roughly classified into three groups depending on the structure of aglycone, considering their biosynthetic pathway. Vivid red flowers such as carnation and geranium often contain pelargonidin-type anthocyanins, and blue and purple flowers often contain delphinidin-type anthocyanins. The lack of blue and purple varieties in roses, carnations, chrysanthemums and lilies is due to the inability of these plants to synthesize delphinidin-type anthocyanins.
  • anthocyanins are modified with one or more aromatic acyl groups, (ii) anthocyanins coexist with pigments such as flavones and flavonols (Iii) iron ions and aluminum ions coexist with anthocyanins, (iv) the pH of vacuoles where anthocyanins are localized increases from neutral to weakly alkaline, or (v) anthocyanins, pigments, metals It is considered that one of ions forming a complex (such anthocyanins are called metalloanthocyanins) is necessary (hereinafter, Non-Patent Document 1).
  • Flavonoid and anthocyanin biosynthesis has been well studied, and related biosynthetic enzymes and genes encoding them have been identified (see Non-Patent Document 2 and FIG. 1 below).
  • the gene of flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (F3'5'H) that hydroxylates the flavonoid B ring necessary for delphinidin biosynthesis has been obtained from many plants.
  • these F3′5′H genes are introduced into carnations (hereinafter, see Patent Document 1), roses (hereinafter, Non-Patent Document 3, Patent Documents 2, 3), and chrysanthemums (hereinafter, Patent Document 4).
  • a genetically modified plant in which delphinidin is accumulated in the petals and the color of the flower changes to blue has been created (see Non-Patent Document 4 below).
  • Such carnations and roses are commercially available.
  • Flavon is a kind of organic compound and is a cyclic ketone of a flavan derivative. In a narrow sense, a compound having the chemical formula C 15 H 10 O 2 and a molecular weight of 222.24, 2,3-didehydroflavan-4-one ( 2,3-didehydroflavan-4-one). In a broad sense, derivatives belonging to flavones are referred to as “flavones”. Flavonoids (flavones) in a broad sense are one of the flavonoid categories. Among flavonoids, those having a flavone structure as a basic skeleton and having no hydroxyl group at the 3-position are classified as “flavones”.
  • flavones include apigenin (apigenin; 4 ′, 5,7-trihydroxyflavone) and luteolin (luteolin; 3 ′, 4 ′, 5,7-tetrahydroxyflavone).
  • flavone means a flavone in a broad sense, that is, a derivative belonging to flavones.
  • the gene of flavone synthase (FNS) necessary for flavone biosynthesis is also obtained from many plants. It has been known that flavones have an effect of darkening the color of anthocyanins in blue when they coexist with anthocyanins, and these FNS genes have attracted attention in flower color modification. By introducing the FNS gene together with F3′5′H into a rose that does not have the ability to synthesize flavones, delphinidin is accumulated in petals, and at the same time, flavones are accumulated, and the color of the flower is further changed to blue (hereinafter, patents). Reference 5).
  • flavones In addition to flower-blue coloration, flavones absorb ultraviolet rays, so that they protect plants from ultraviolet rays and function as a signal to insect vision in insect flowers. Flavones are also involved in the interaction between plants and soil microorganisms. Furthermore, flavones are also used as a material for food and cosmetics as a healthy component. For example, flavone is said to have an anti-cancer effect, and it has been demonstrated that ingestion of foods containing a large amount of flavone can help treat or prevent cancer.
  • genes that modify anthocyanins and flavones have been obtained from many plants.
  • glycosyltransferases acyltransferases, methyltransferases, and the like.
  • glycosyltransferase (GT) that catalyzes glycosylation is described.
  • GT glycosyltransferase
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 3-position of anthocyanin has been isolated from gentian, perilla, petunia, rose, snapdragon (hereinafter, non-patent documents 4 to 6, patents). Reference 6).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 5-position of anthocyanin has been isolated from perilla, petunia, gentian, verbena, torenia and the like (hereinafter, non-patent documents 5 to 7, patent document 7). reference).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of flavone has been isolated from Arabidopsis thaliana (refer to Non-Patent Document 8 below).
  • a gene encoding a protein having the activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of baicalen has been isolated from Scutella niger, and the protein expressing this gene in Escherichia coli has the activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of flavonoids. It has also been reported to catalyze a reaction showing the following (see Non-Patent Document 9).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 3'-position of anthocyanin has been isolated from gentian, sturgeon, and cineraria (see Patent Document 8 below).
  • glycosyltransferase uses UDP-glucose as a sugar donor, but recently a glycosyltransferase using acylglucose as a sugar donor has also been identified.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 5-position of anthocyanin-3 glucoside was isolated from carnation, and a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 7-position was isolated from delphinium. (Refer to Non-Patent Document 10 below).
  • glycosyltransferases have proteins having an activity of transferring glucose to various hydroxyl groups.
  • many glycosyltransferases whose functions have not been identified still remain.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4 ′ position of a flavonoid, or a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar sequentially to two hydroxyl groups of the A ring and B ring of the flavonoid Has not yet been identified. It has been reported that a protein in which a glycosyltransferase gene derived from Livingstone Daisy is expressed in E.
  • metalloanthocyanins typified by the pigments of camellia, cornflower, salvia, and nemophila are composed of 6 anthocyanins, 6 flavones, and 2 atoms of metal ions, and each component aggregates to form a stable blue pigment.
  • nemophila metalloanthocyanin is formed from nemophilin (see FIG. 3), malonyl apigenin 4 ′, 7-diglucoside (see FIG. 4), Mg 2+ , and Fe 3+ .
  • Salvia metalloanthocyanins are formed from cyanosalvianin (see FIG.
  • the blue Dutch Iris petal contains a flavone with sugar added at the 4 'position.
  • the addition of two sugars to the flavone increases the solubility and changes the physical properties, so that it can be expected to expand its use as a health food, pharmaceutical and cosmetic material.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone and use thereof.
  • the present applicants have intensively studied and repeated experiments.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone was isolated and used. It was confirmed that this can be done, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a polynucleotide encoding a protein having the activity of: A polynucleotide selected from the group consisting of:
  • [11] A method for adding a sugar to the 4′-position hydroxyl group of a flavone using the polynucleotide according to any one of [1] to [7].
  • a protein having an activity of specifically transferring a sugar to the 4'-position hydroxyl group of flavone can be used for modification of flower color by expressing it constitutively or tissue-specifically in a plant.
  • a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone for example, into a plant having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, such as rose, And a flavone in which sugar is added to both hydroxyl groups at the 7-position.
  • a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone is expressed in a plant together with a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, whereby the 4′-position and the 7-position are expressed.
  • a flavone in which sugar is added to both hydroxyl groups is formed.
  • the present invention also provides a method for producing a flavone in which a sugar is added to the 4′-position hydroxyl group, and foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like obtained by the method.
  • NmGT8 It is an alignment figure which compares the amino acid sequence of NmGT8 and NmGT4. It is an alignment figure which compares the amino acid sequence of NmGT8, NmGT3, and NmGT4. It is an alignment figure which compares the amino acid sequence of the enzyme which adds sugar at 4'-position of NmGT8 and the snapdragon chalcone. It is an alignment figure which compares the amino acid sequence of the enzyme which adds sugar to 3rd-position and 5th-position of NmGT8 and rose anthocyanidin. It is a phylogenetic tree indicating the relationship between the NmGT8 of the present invention and the various enzymes described above. A construct containing NmGT8 introduced into Torenia (pSPB4583).
  • a construct containing NmGT8 introduced into Petunia (pSPB 5424, 5428). It is a high-performance liquid chromatogram of a petal extract of recombinant petunia introduced with NmGT8. It is an extraction positive ion mass chromatogram of a petal extract of recombinant petunia (250-1250 m / z) into which NmGT8 has been introduced.
  • a construct containing NmGT8 introduced into carnation (pSPB5433). Constructs containing NmGT8 introduced into roses (pSPB4577, 4578, 5437, 5440). It is a high-speed liquid chromatogram of the petal extract of a recombinant rose into which NmGT8 has been introduced.
  • FIG. 5 is an extracted positive ion mass chromatogram of a recombinant rose petal extract (250-1250 m / z) into which NmGT8 has been introduced.
  • the present invention provides the following (a) to (e): (A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and has an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone A polynucleotide encoding (C) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (D) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and transfers sugar to the hydroxyl group at the 4 ′ position of flavone.
  • the term “polynucleotide” means DNA or RNA.
  • stringent conditions refers to conditions that enable selective and detectable specific binding between a polynucleotide or an oligonucleotide and genomic DNA. Stringent conditions are defined by a suitable combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is decreased, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased. In addition, washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • the term “stringent conditions” means that the degree of “identity” or “homology” between the base sequences is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably, on the average on the whole. It means a condition that specifically hybridizes only between nucleotide sequences having high homology, such as about 95% or more, more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more.
  • Examples of the “stringent conditions” include conditions in which the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, pH 6 to 8 at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C.
  • Hybridization was performed under the conditions of 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 1% SDS, 5 x Denhardt's solution 50% formaldehyde, and 42 ° C.
  • 5 x SSC 750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate
  • 1% SDS 1% SDS
  • 5 x Denhardt's solution 50% formaldehyde and 42 ° C.
  • 0.1 x SSC 15 mM NaCl, 1.5 mM Acid trisodium
  • 0.1% SDS washed at 55 ° C.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • the gene selected by such hybridization may be naturally derived, for example, a plant-derived gene or a non-plant-derived gene.
  • the gene selected by hybridization may be cDNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 Means an amino acid sequence wherein a certain number of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • Site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory It can be performed according to the method described in Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, etc.
  • the DNA according to the present invention is a primer designed based on the nucleotide sequence of the target gene using a method known to those skilled in the art, for example, a method of chemically synthesizing by the phosphoramidide method, a plant nucleic acid sample as a template It can be obtained by a nucleic acid amplification method using
  • the terms “identity” and “homology” constitute a chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). Means the amount (number) of each amino acid residue or base that can be determined to be identical in each other's fitness, and the sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences It means a degree, and “identity” and “homology” can be easily calculated. Many methods for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences are known, and the terms “identity” and “homology” are well known to those skilled in the art (see, for example, Lesk, A. M.
  • the numerical values of “identity” and “homology” described in the present specification may be numerical values calculated using a homology search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified. Preferably, the value is calculated using the ClustalW program of the MacVector application (version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England).
  • the polynucleotide (nucleic acid, gene) of the present invention “encodes” a protein of interest.
  • encode means that the protein of interest is expressed in a state having the activity.
  • encode includes both the meaning of encoding the protein of interest as a continuous structural sequence (exon) or encoding via an intervening sequence (intron).
  • a gene having a native base sequence can be obtained, for example, by analysis using a DNA sequencer as described in the following examples.
  • DNA encoding an enzyme having a modified amino acid sequence can be synthesized using conventional site-directed mutagenesis or PCR based on DNA having a native base sequence.
  • a DNA fragment to be modified is obtained by restriction enzyme treatment of native cDNA or genomic DNA, using this as a template, site-directed mutagenesis or PCR method is performed using a primer into which a desired mutation is introduced, A modified DNA fragment is obtained. Thereafter, the DNA fragment into which this mutation has been introduced may be ligated with a DNA fragment encoding another part of the target enzyme.
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the target amino acid sequence
  • a DNA encoding a full-length amino acid sequence is cleaved with a desired restriction enzyme, and the result When the obtained DNA fragment does not encode the entire target amino acid sequence, a DNA fragment consisting of the missing portion sequence may be synthesized and ligated.
  • the obtained polynucleotide is expressed using a gene expression system in Escherichia coli and yeast, and the activity of the resulting polynucleotide is transferred to the 4′-position hydroxyl group of the flavone by measuring enzyme activity. It can be confirmed that it encodes a protein having it. Furthermore, by expressing the polynucleotide, a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of a flavone, which is a polynucleotide product, can be obtained.
  • a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone can be obtained using an antibody against the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and other organisms can be obtained using such an antibody. It is also possible to clone a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of the derived flavone.
  • the present invention also relates to (recombinant) vectors, in particular expression vectors, comprising a polynucleotide as described above, and also to a host transformed with the vector.
  • Prokaryotes or eukaryotes can be used as the host.
  • a common host such as a bacterium, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an Escherichia coli, a microorganism belonging to the genus Bacillus, for example, Bacillus subtilis can be used.
  • eukaryotes lower eukaryotes such as eukaryotic microorganisms such as yeast or filamentous fungi that are fungi can be used.
  • yeast examples include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae.
  • filamentous fungi examples include microorganisms belonging to the genus Aspergillus, such as Aspergillus oryzae. Examples include microorganisms belonging to the genus Aspergillus niger and Penicillium.
  • animal cells or plant cells can be used.
  • animal cells cell systems such as mice, hamsters, monkeys, and humans are used.
  • insect cells such as silkworm cells and silkworm adults themselves are used. Used as a host.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region, for example, a promoter, a terminator, an origin of replication, etc., depending on the type of host into which they are introduced.
  • an expression control region for example, a promoter, a terminator, an origin of replication, etc., depending on the type of host into which they are introduced.
  • promoters for bacterial expression vectors conventional promoters such as trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc. are used, and as yeast promoters, for example, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc. are used.
  • yeast promoters for example, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc.
  • the promoter for filamentous fungi for example, amylase promoter, trpC promoter and the like are used.
  • viral promoters such as SV40 early promoter and SV40 rate promoter are used.
  • promoters that constitutively express polynucleotides in plant cells include cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, rd29A gene promoter, rbcS promoter, mac-1 promoter, and the like.
  • tissue-specific gene expression a promoter of a gene that is specifically expressed in the tissue can be used.
  • An expression vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme, ligase or the like.
  • transformation of a host with an expression vector can be performed according to a conventional method.
  • the host transformed with the expression vector is cultured, cultivated or grown, and recovered from the culture or medium according to a conventional method, for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, etc.
  • the target protein can be obtained by purification.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of nemophila-derived flavone is described.
  • the polynucleotide according to the present invention is limited to a gene derived from nemophila.
  • the origin of a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone may be a plant, animal or microorganism, and the sugar is transferred to the 4′-position hydroxyl group of flavone. As long as it has the activity to do so, it can be used to change the flower color in plants regardless of origin.
  • the present invention relates to a plant or a progeny thereof obtained by introducing an exogenous polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of a flavone into a plant and incorporating the same into the plant. Or these parts or organizations.
  • the form of the part or tissue can be a cut flower.
  • the 4 ′ position of the flavone is glycosylated or the 4 ′ position of the flavone is glycosylated. Can be suppressed, and as a result, the flower color in the plant can be changed.
  • a technique for introducing a polynucleotide into a plant and expressing the polynucleotide constitutively or tissue-specifically can be used.
  • Introduction of DNA into a plant can be performed by methods known to those skilled in the art, such as the Agrobacterium method, binary vector method, electroporation method, PEG method, particle gun method, and the like.
  • transformable plants include roses, carnations, chrysanthemum, snapdragons, cyclamen, orchids, turkeys, freesia, gerbera, gladiolus, gypsophila, kalanchoe, lily, pelargonium, geranium, petunia, torenia, tulip, anthurium, moth orchid , Rice, barley, wheat, rapeseed, potato, tomato, poplar, banana, eucalyptus, sweet potato, soybean, alfalsa, rubin, corn, cauliflower, dahlia and the like.
  • the present invention also relates to a processed product (cut flower processed product) using the cut flower.
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • the flavone produced by the production method of the present invention and having a sugar added to the 4′-position hydroxyl group can be used for applications such as food, pharmaceutical and cosmetic production methods.
  • RNAi method it is also possible to suppress the expression of a target gene in a plant by an antisense method, a cosuppression method, an RNAi method, or the like.
  • Methods for suppressing the expression of the target gene can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • antisense RNA / DNA technology Bioscience and Industry, 50, 322 (1992), Chemistry, 46, 681] (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell Engineering, 16,1463 (1997)]
  • Triple helix technology Triple helix technology [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)].
  • suppression of gene expression is performed using a single-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the antisense strand of the gene according to the present invention.
  • a method is known as an antisense method.
  • expression of a target gene is suppressed by expressing RNA having a sequence complementary to the gene whose expression is to be suppressed at a high level.
  • single-stranded RNA comprising the entire nucleotide sequence identical to the antisense strand of the polynucleotide (gene) according to the present invention can be used.
  • a single-stranded RNA comprising a part of the same nucleotide sequence as the antisense strand of the gene according to the present invention can also be used.
  • Such partial single-stranded RNA is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the gene according to the present invention and can be appropriately designed by those skilled in the art, but is preferably specific for the gene according to the present invention.
  • the chain length is preferably 5 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 10 to 20 nucleotides.
  • Suppression of gene expression is performed using a single-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the sense strand of the gene according to the present invention. That is, this sense single-stranded nucleic acid can be used for the suppression of gene expression according to the present invention, similarly to the above-described antisense single-stranded nucleic acid.
  • single-stranded RNA comprising the entire nucleotide sequence identical to the sense strand of the gene according to the present invention can be used.
  • a single-stranded RNA comprising a part of the same nucleotide sequence as the gene sense strand can also be used.
  • Such partial single-stranded RNA is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the gene according to the present invention and can be appropriately designed by those skilled in the art, but is preferably specific for the gene according to the present invention.
  • the chain length is preferably 5 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 10 to 20 nucleotides.
  • suppression of gene expression is performed using a double-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the gene according to the present invention.
  • a double-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the gene according to the present invention.
  • an antisense or sense single-stranded nucleic acid of the gene according to the present invention can be expressed in angiosperms.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention is preferably DNA, and its chain length and specific nucleotide sequence correspond to the chain length and nucleotide sequence of the intended single-stranded nucleic acid molecule.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention when the antisense single-stranded nucleic acid is expressed, includes the antisense strand of the gene according to the present invention as a coding strand.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention when the sense single-stranded nucleic acid is expressed, includes the sense strand of the gene according to the present invention as a coding strand.
  • Double-stranded nucleic acid molecules can be expressed in plants using methods known to those skilled in the art.
  • an expression vector containing a promoter, a double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention, a transcription terminator, etc. is introduced into a target plant, and the resulting plant is cultivated to express the double-stranded nucleic acid molecule.
  • An expression vector can be introduced into a plant by methods known to those skilled in the art, for example, the Agrobacterium method, binary vector method, electroporation method, PEG method, particle gun method and the like.
  • RNA As another example of the method for suppressing gene expression using the nucleic acid molecule according to the present invention, there is a cosuppression method.
  • a sense double-stranded DNA having the entire nucleotide sequence of the gene according to the invention is introduced into the target plant.
  • the sense single-stranded RNA according to the present invention is expressed, and the expression of the gene is extremely suppressed by this RNA (Plant Cell 9: 1357-1368, 1997).
  • the obtained protein solution was centrifuged (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and ammonium sulfate was added to the collected supernatant to a saturation concentration of 30%. After stirring at 4 ° C. for 1 hour, the supernatant was collected by centrifugation (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes). Ammonium sulfate was added to the resulting supernatant to a saturation concentration of 70%, stirred at 4 ° C. for 1 hour, and then centrifuged (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a precipitate.
  • flavone showing the same retention time and absorption maximum as those of purified apigenin 4 ′, 7-diglucoside and apigenin 7-glucoside flavone showing a retention time close to that of apigenin 7-glucoside was biosynthesized (FIG. 7).
  • the enzyme reaction was carried out without adding UDP-glucose, nothing was biosynthesized.
  • Example 2 Determination of retention time / absorption maximum of apigenin 4′-glucoside
  • apigenin 4'-glucoside and apigenin 7-glucoside are biosynthesized as intermediate adults during the process of apigenin 4', 7-diglucoside biosynthesis. Should be done (see FIG. 8). From this, it was determined that the flavone showing the retention time close to that of apigenin 7-glucoside detected in Example 1 was apigenin 4′-glucoside (see FIG. 7). The retention time and absorption maximum of apigenin 4′-glucoside could be determined.
  • Nemophila petals have a protein having an activity of transferring sugars to the 4′-position and 7-position hydroxyl groups of flavones depending on UDP-glucose.
  • one enzyme may carry out glycosylation of both, and different enzymes each carry out the glycosylation of the hydroxyl groups at the 4′-position and the 7-position. The possibility was considered.
  • Example 3 Acquisition of a candidate gene for a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone] ⁇ Isolation of total RNA> Total RNA was isolated from petals of Nemophila stage 1 and 2 using Plant RNAeasy Kit (QIAGEN) according to the protocol recommended by the manufacturer. ⁇ Expression analysis of cDNA derived from petals of Nemophila> After reverse transcription reaction of 30 ⁇ g of Nemophila petal-derived total RNA, a homogenized cDNA library was prepared.
  • the prepared library was amplified for each clone by emulsion PCR, and then the nucleotide sequence was determined by genome sequencer FLX (Roche Diagnostics Japan Co., Ltd.).
  • the obtained sequence data was translated into an amino acid sequence, and a sequence showing homology with the amino acid sequence of gentian anthocyanin 3′-glycosyltransferase was extracted. These sequences were assembled to obtain candidate genes encoding glycosyltransferases.
  • Example 4 Obtaining a full-length cDNA sequence of a candidate gene of a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4'-position hydroxyl group of flavone]
  • 25 types of glycosyltransferase gene sequences were obtained.
  • Experiments were conducted to obtain full-length cDNA sequences for 10 genes (NmGT0-9).
  • the full-length cDNA sequence was obtained using GeneRacer Kit (Invitrogen) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • a region specific to the clone was selected from the cDNA partial sequence obtained in Example 3, a primer for RACE was designed based on the sequence of this region, and the 5 ′ and 3 ′ terminal sequences were determined by RACE PCR. Obtained. Based on this sequence, a primer for amplifying a full-length cDNA sequence is designed, and nemophila cDNA is used as a template, using KOD-plus polymerase (TOYOBO) according to the protocol recommended by the manufacturer. PCR reaction was carried out at 50 ⁇ l (held at 94 ° C. for 2 minutes, repeated for 30 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2 minutes, and then held at 4 ° C.).
  • TOYOBO KOD-plus polymerase
  • Nemophila cDNA was synthesized according to the protocol recommended by the manufacturer using SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen), using the total RNA isolated in Example 2 as a template.
  • the primers were designed so that restriction enzyme sites were included at both ends of the full-length cDNA so that the NmGT0-9 gene could be inserted into the E. coli expression vector pET15b (Novagen).
  • pTOPO-NmGT09 plasmid containing the full length of the NmGT gene (pTOPO-NmGT0-9) is obtained according to the protocol recommended by the manufacturer using Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit for sequencing (invitrogen). did.
  • NmGT8 SEQ ID NO: 1
  • candidate genes NmGT0 to 9
  • Example 5 Experiment for measuring enzyme activity of candidate protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at 4 ′ position of flavone (when using crude enzyme)] ⁇ Preparation of E. coli expression construct>
  • pTOPO-NmGT0-9 Each 3 ⁇ g of pTOPO-NmGT0-9 was treated with the corresponding restriction enzyme, and the obtained DNA fragment of about 1.5 kb was recovered.
  • 2 ⁇ g of vector pET15b was also treated with a restriction enzyme and ligated with the obtained DNA fragment to prepare an E. coli expression construct (pET-NmGT0-9).
  • pET-NmGT0-9 was introduced into E. coli strain BL2 using One Shot BL21 (DE3) (invitrogen) according to the protocol recommended by the manufacturer to obtain transformed E. coli.
  • This Escherichia coli was cultured using an Overnight Express Autoinduction System 1 (Novagen) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • transformed E. coli was cultured at 37 ° C. until the OD600 value reached 0.5 (about 4 hours).
  • This Escherichia coli solution was added as a preculture solution to 50 ml of the culture solution, followed by main culture at 27 ° C. overnight.
  • the Escherichia coli solution cultured overnight was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 15 minutes), and the collected cells were mixed with 5 ml of sonic buffer (composition: TrisHCl (pH 7.0): 2.5 mM, dithiothreitol (DTT). ): 1 mM, amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF): 10 ⁇ M), pulverized E. coli by sonication, and then centrifuged (15000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to collect the supernatant. . The supernatant was used as a crude enzyme solution. For the centrifugation, Avanti HP-26XP (rotor: JA-2) was used (BECKMAN COULTER).
  • Example 6 Experiment for measuring enzyme activity of protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at 4'-position of flavone (when protein with added His-Tag is purified)] ⁇ Expression of glycosyltransferase in E. coli and protein purification>
  • the Escherichia coli strain BL2 introduced with pET-NmGT8 described in Example 5 was cultured using the Overnight Express Automation System 1 (Novagen) according to the protocol recommended by the manufacturer. In 8 ml of the prepared culture solution, the transformed Escherichia coli was cultured at 37 ° C. until the OD600 value reached 0.5 (about 4 hours).
  • This Escherichia coli solution was added as a preculture solution to 200 ml of the culture solution, and main culture was performed overnight at 25 ° C.
  • the Escherichia coli solution that was cultured overnight was centrifuged (1000 ⁇ g, 4 ° C., 10 minutes), and the collected cells were extracted into 20 ml of an extract (composition: buffer (KCl: 300 mM, KH 2 PO 4 : 50 mM), Suspension in imidazole: 5 mM) (pH 8.0), amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF): 10 ⁇ M) and pulverization of E.
  • composition composition: buffer (KCl: 300 mM, KH 2 PO 4 : 50 mM
  • Suspension in imidazole 5 mM
  • APIMSF amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride
  • NmGT8 protein performs glycosylation at the 4 'position prior to glycosylation at the 7 position of apigenin or luteolin (see Fig. 8).
  • NmGT8 protein has high substrate specificity and selectively glycosides the 4′-position of flavones such as apigenin and luteolin. Became clear (see FIG. 11).
  • Dbs5GT Livingstone daisy-derived glycosyltransferase gene
  • NmGT8 and NmGT3 and between NmGT8 and NmGT4 were 32% and 32%, respectively (see FIGS. 12-1 to 12-3).
  • ClustalW program of the MacVector application version 11.02, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England
  • the amino acid sequence having the highest identity with NmGT8 is an enzyme (GenBank accession No. Q4R1I9) that adds a sugar to positions 3 and 5 of rose anthocyanidins. was 52% (see FIG. 14).
  • amino acid sequence having high identity with NmGT8 is an enzyme (described in PCT / JP2004 / 019461) that adds a sugar to the 4′-position of the snapdragon chalcone, and the identity was 51% (see FIG. 13). .
  • FIG. 15 shows a phylogenetic tree indicating the relationship between the NmGT8 of the present invention and the various enzymes described above.
  • Example 7 Expression in Torenia of a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone
  • a binary vector pSPB4583 for expressing NmGT8 was constructed, and Torenia ( (Summer Wave). Details of the introduced construct are shown below (see FIG. 16).
  • pSPB4583 is based on a binary vector pBINPLUS (vanEngel et al., Transgenic Research 4, p288) for plant introduction, and has an El235S promoter (Mittsuhara et al., () with an enhancer sequence repeated twice upstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. 1996) Plant Cell Physiol.37, p49), full length cDNA NmGT8 and mas terminator.
  • the reverse transcription PCR reaction was performed in 30 ⁇ l using ExTaq polymerase (Takara) using cDNA as a template according to the protocol recommended by the manufacturer (holding at 94 ° C. for 2 minutes, holding at 94 ° C. for 1 minute, The cycle of holding at 55 ° C. for 1 minute and holding at 72 ° C. for 2 minutes was repeated 25 cycles and then held at 4 ° C.).
  • Primers were designed to specifically amplify each full-length cDNA. As a result, transcription of NmGT8 in Torenia was confirmed.
  • Example 8 Expression in petunia of a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone
  • Binary vectors pSPB5424 and 5428 for expressing NmGT8 were constructed and introduced into Petunia (Saffinia Bouquet Red). Since petunia originally does not biosynthesize flavones, Torenia flavone synthase (described in PCT / JP2008 / 061600, SEQ ID NO: 5) was introduced together, and in petunia NmGT8 transferred sugar to the 4'-position hydroxyl group of flavone Was evaluated. Details of the introduced construct are shown below (see FIG. 17). ⁇ Production of construct>
  • pSPB5424 has pBINPLUS as a basic backbone, three expression cassettes (1. El235S promoter and full-length cDNA pansy F3′5′H (described in PCT / JP2004 / 011958, SEQ ID NO: 3)) and HSP terminator (Plant Cell Physiology (2010 51, 328-332), 2. El235S promoter, full-length cDNA torenia flavone synthase, HSP terminator, 3. El235S promoter, full-length cDNA NmGT8, and HSP terminator).
  • pSPB5428 is based on pBINPLUS and includes two expression cassettes (1. El235S promoter, full-length cDNA torenia flavone synthase, HSP terminator, 2. El235S promoter, full-length cDNA NmGT8 and HSP terminator).
  • Petal pigment analysis was performed on lines in which transcripts were confirmed for full-length cDNA Torenia flavone synthase and full-length cDNA NmGT8. Freeze dried petals of 0.2 g of fully bloomed flowers for more than 24 hours, pulverize with a spatula, add 4 ml of extraction buffer (composition: 50% acetonitrile in water containing 0.1% TFA), and over 20 minutes Processed under sonic. The petal extract was analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)). Analysis was performed under the same conditions as described in Example 5.
  • Inertsil ODS-4 250 * 4.6 mm, 5 ⁇ m (Shimadzu Corporation) was used.
  • liquid A (0.1% formic acid aqueous solution
  • liquid B 90% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% formic acid
  • 35 minutes linear concentration gradient from both 9: 1 mixture to 11: 9 mixture and 10 minutes linear concentration gradient from 11: 9 mixture to 0:10 mixture followed by 5 Elution was performed with a 0:10 mixture for a minute.
  • the flow rate was 0.6 ml / min (FIG. 19).
  • apigenin 4′-glucoside and luteolin 4′-glucoside were detected in recombinant petunia introduced with flavone synthase and NmGT8 (FIG. 18), and 95.6% of the flavone biosynthesized flavone 4′-glucoside. It was found that occupied. The remaining 4.4% was also found to be flavone 7-glucoside biosynthesized by petunia endogenous activity that transfers sugar to position 7 of flavone (FIG. 19).
  • NmGT8 is a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position of a flavone that functions preferentially over a protein having an activity of transferring a sugar to the 7-position of a petunia endogenous flavone. It became clear. By using NmGT8, flavone 4'-glucoside can be efficiently biosynthesized in petunia.
  • Example 9 Expression in carnation of gene encoding protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at 4'-position of flavone
  • a binary vector pSPB5433 for expressing NmGT8 was constructed and introduced into carnation (Cream Cinderella). Since carnation originally does not biosynthesize flavones, torenia flavone synthase was introduced together to evaluate whether NmGT8 has an activity of transferring sugars to the 4′-position hydroxyl group of flavones. Details of the introduced construct are shown below (see FIG. 20).
  • Example 10 Expression in rose of gene encoding protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at 4 ′ position of flavone
  • Binary vectors pSPB4577, 4578, 5437, and 5440 for expressing NmGT8 were constructed and introduced into roses (Knobless, Ritapahumera). Since rose originally does not biosynthesize flavones, torenia flavone synthase was introduced together, and it was evaluated whether NmGT8 has the activity of transferring sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavones. Details of the introduced construct are shown below (see FIG. 21).
  • pSPB4577 has pBINPLUS as a basic backbone, three expression cassettes (1.
  • El235S promoter promoter full-length cDNA pansy F3′5′H and mas terminator, 2. El235S promoter, full-length cDNA torenia flavone synthase, mas terminator, 3 El235S promoter and full length cDNA NmGT8 and mas terminator).
  • pSPB4578 has pBINPLUS as a basic skeleton, three expression cassettes (1. Sisoanthocyanin 3-acyl transferase promoter (described in PCT / JP2010 / 053909), full-length cDNA pansy F3′5′H and mas terminator; El235S promoter, full-length cDNA torenia flavone synthase and mas terminator, 3. El235S promoter, full-length cDNA NmGT8 and mas terminator).
  • pSPB5437 has pBINPLUS as a basic skeleton, five expression cassettes (1. El235S promoter, full-length cDNA pansy F3′5′H and HSP terminator, 2. lysoanthocyanin 3-acyl transferase chromosomal gene (PCT / JP2010 / 053886 3) El235S promoter, full-length cDNA torenia flavone synthase and HSP terminator, 4. El235S promoter and full-length cDNA NmGT8 and HSP terminator, 5. El235S promoter and full-length cDNA NmGT3 and HSP terminator) include.
  • pSPB5440 is based on pBINPLUS, and is composed of five expression cassettes (1. El235S promoter and full-length cDNA pansy F3′5′H and HSP terminator, 2. El235S promoter and cDNA lavender anthocyanin 3-acyltransferase (PCT / 3) El235S promoter, full-length cDNA Torenia flavone synthase and HSP terminator, 4. El235S promoter, full-length cDNA NmGT8, HSP terminator, 5. El235S promoter, full-length cDNA NmGT3, and HSP terminator )It is included.
  • Petal pigment analysis was performed on lines in which transcripts were confirmed for full-length cDNA Torenia flavone synthase and full-length cDNA NmGT8. Freeze dried petals of 0.2 g of fully bloomed flowers for more than 24 hours, pulverize with a spatula, add 4 ml of extraction buffer (composition: 50% acetonitrile in water containing 0.1% TFA), and over 20 minutes Processed under sonic. The petal extract was analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)). Analysis was performed under the same conditions as described in Example 5. As a control, non-recombinant roses into which no gene was introduced were similarly analyzed (FIG. 22).
  • the petal extract diluted 50 times was analyzed with a liquid chromatograph mass spectrometer (Shimadzu Corporation). Shimadzu LCMS-IF-TOF was used as a detector, and detection was performed at 433.1057 ([Api-Glc + H] +) and 449.184 ([Lut-Glc + H] +).
  • As the column Inertsil ODS-4 (250 * 4.6 mm, 5 ⁇ m) (Shimadzu Corporation) was used.
  • liquid A (0.1% formic acid aqueous solution
  • liquid B 90% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% formic acid
  • apigenin 4′-glucoside and luteolin 4′-glucoside were detected in the recombinant rose introduced with flavone synthase and NmGT8 (FIG. 22), and 97.0% of the flavone biosynthesized flavone 4′-glucoside. It was found that occupied. The remaining 3.0% was also found to be flavone 7-glucoside biosynthesized by rose intrinsic activity that transfers sugar to position 7 of flavone (FIG. 23). On the other hand, no flavone was detected in the non-recombinant rose.
  • NmGT8 is a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position of a flavone that functions preferentially over a protein having an activity of transferring a sugar to the 7-position of a rose endogenous flavone. It became clear. By using NmGT8, flavone 4'-glucoside can be efficiently biosynthesized in roses.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4'-position of flavone was identified for the first time.
  • the polynucleotide of the present invention in an appropriate host cell, it is possible to produce a protein having an activity of specifically transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4'-position of flavone.
  • a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 4'-position of a flavone can be used for modification of flower color by expressing it constitutively or tissue-specifically in a plant.
  • the present invention also provides a method for producing a flavone in which sugar is added to the hydroxyl group at the 4 'position, and foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like obtained by the method.

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Abstract

　フラボンの４'位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの提供。（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４'位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４'位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；等からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。

Description

新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
　本発明は、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。
　花産業において、新しい形質を持つ花は常に珍重される。特に、花の最も重要な形質である「色」を変化させた植物の開発は産業上重要視され、これまで、古典的な方法である交配による品種改良によってさまざまな色の花が開発されてきた。交配は有効な品種改良方法であるものの、植物に固有の遺伝的制限があるため、交配可能な近縁種が持つ遺伝子資源しか利用することができないという欠点がある。例えば、長年の交配育種にも拘わらず、バラ、カーネーション、キク、ユリには紫色～青色、リンドウ、アイリスには鮮やかな赤色、ゼラニウム、アサガオには黄色の品種は、これまで作出されていない。
　花の色は、フラボノイド、カロテノイド、クロロフィル、ベタレインの４種類の色素に起因する。この中で、フラボノイドは黄、赤、紫、青といった多様な色を呈する。赤、紫、青色を呈する１グループはアントシアニンと総称され、アントシアニンの構造の多彩さが花の色が多彩である原因の１つである。アントシアニンはその生合成経路を考慮するとアグリコンの構造に依り、大きく３つのグループに分類することができる。カーネーションやゼラニウムのような鮮やかな赤色の花にはペラルゴニジン型アントシアニンが、青色や紫色の花にはデルフィニジン型アントシアニンが含まれることが多い。バラ、カーネーション、キク、ユリに青や紫色の品種が存在しないのは、これらの植物がデルフィニジン型アントシアニンを合成する能力がないことが原因である。
　花色が青くなるためにはデルフィニジンが蓄積することに加え、（ｉ）アントシアニンが１つ又は複数の芳香族アシル基により修飾されること、（ｉｉ）アントシアニンがフラボンやフラボノールなどのコピグメントと共存すること、（ｉｉｉ）鉄イオンやアルミニウムイオンがアントシアニンと共存すること、（ｉｖ）アントシアニンが局在する液胞のｐＨが中性から弱アルカリ性に上昇すること、又は（ｖ）アントシアニン、コピグメント、金属イオンが錯体を形成すること（このようなアントシアニンはメタロアントシアニンと呼ばれる）のいずれかが必要であると考えられている（以下、非特許文献１）。
　フラボノイドやアントシアニン生合成はよく研究され、関連する生合成酵素やそれをコードする遺伝子が同定されている（以下、非特許文献２参照、図１参照）。例えば、デルフィニジンの生合成に必要なフラボノイドのＢ環を水酸化するフラボノイド３’，５’－水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）の遺伝子は多くの植物から得られている。また、これらのＦ３’５’Ｈ遺伝子をカーネーション（以下、特許文献１参照）、バラ（以下、非特許文献３、特許文献２、３参照）、キク（以下、特許文献４参照）に導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積し、花の色が青く変化した遺伝子組換え植物も作出されている（以下、非特許文献４参照）。このようなカーネーションとバラは市販されている。
　フラボン（flavone）は、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量２２２．２４の化合物、２，３－ジデヒドロフラバン－４－オン（2,3-didehydroflavan-4-one）を指す。広義にはフラボン類に属する誘導体を「フラボン」と称する。広義のフラボン（フラボン類）はフラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。代表的な「フラボン」としてはアピゲニン（apigenin; 4',5,7-trihydroxyflavone）やルテオリン（luteolin; 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone）が挙げられる。本願明細書中、用語「フラボン」とは、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体を意味する。
　フラボンの生合成に必要なフラボン合成酵素（ＦＮＳ）の遺伝子も多くの植物から得られている。フラボンは、アントシアニンと共存するとアントシアニンの色を青く濃くする効果があることが知られており、これらのＦＮＳ遺伝子は花色改変において注目されていた。Ｆ３’５’Ｈと共にＦＮＳ遺伝子を、フラボンを合成する能力がないバラへ導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積すると同時に、フラボンも蓄積し、花の色がより一層青く変化した（以下、特許文献５参照）。また、フラボンは、花色青色化以外に、紫外線を吸収することから、植物を紫外線から護ったり、虫媒花では昆虫の視覚へのシグナルとして機能する。また、フラボンは植物と土壌微生物との相互作用にも関係している。さらに、フラボンは健康によい成分として食品や化粧品の素材としても用いられている。例えば、フラボンは抗癌作用を有するといわれており、フラボンを多く含む食材を摂取することによって、ガンの治療や予防になることも実証されている。
　また、アントシアニンやフラボンを修飾する遺伝子も多くの植物から得られている。糖転移酵素、アシル基転移酵素、メチル基転移酵素などがあるが、ここでは配糖化反応を触媒する糖転移酵素（ＧＴ）について記載する。例えば、アントシアニンの３位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、シソ、ペチュニア、バラ、キンギョソウなどから単離されている（以下、非特許文献４～６、特許文献６参照）。アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シソ、ペチュニア、リンドウ、バーベナ、トレニアなどから単離されている（以下、非特許文献５～７、特許文献７参照）。フラボンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シロイヌナズナから単離されている（以下、非特許文献８参照）。バイカレンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がコガネバナから単離されており、この遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質がフラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を示す反応を触媒することも報告されている（以下、非特許文献９参照）。アントシアニンの３’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、チョウマメ、サイネリアから単離されている（以下、特許文献８参照）。また、アントシアニンのＡ環とＣ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がバラで単離されている（以下、特許文献９参照）。アントシアニンのＢ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がチョウマメで単離されている（以下、特許文献１０参照）。
　前記した糖転移酵素は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としているが、最近、アシルグルコースを糖供与体とする糖転移酵素も同定されている。アントシアニン－３グルコシドの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がカーネーションから、７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がデルフィニウムから単離されている（以下、非特許文献１０参照）。
　このように糖転移酵素としては様々な水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が多数存在している。
　しかしながら、その機能が同定されていない糖転移酵素も未だ多数残っていると考えられている。例えば、フラボノイドの４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子や、フラボノイドのＡ環とＢ環の２箇所の水酸基に逐次的に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は未だ同定されていない。リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質が、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されているが、この糖転移酵素の植物体における本来の活性は、ベタニジンの５位の水酸基にグルコースを転移するものである（以下、非特許文献１１参照）。
　ところで、ツユクサ、ヤグルマギク、サルビア、ネモフィラの色素に代表されるメタロアントシアニンは、アントシアニン６分子、フラボン６分子、及び金属イオン２原子からなり、各成分が集合して安定な青色色素を形成している（図２、非特許文献１参照）。例えば、ネモフィラのメタロアントシアニンは、ネモフィリン（図３参照）、マロニルアピゲニン４’，７－ジグルコシド（図４参照）、Ｍｇ2+、及びＦｅ3+から形成されている。サルビアのメタロアントシアニンは、シアノサルビアニン（図５参照）、アピゲニン４’，７－ジグルコシド（図６参照）、及びＭｇ2+から形成されている。これまでの研究によって、メタロアントシアニンを形成する青い花はすべて、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを生合成しており、そのフラボンに付加されている糖が、メタロアントシアニン形成における分子認識において、重要な役割を担っていることが分かっている。フラボンの４’位に配位されている糖が形成時の分子認識に重要であり、７位の糖はその安定性に寄与することが示されている（以下、非特許文献１参照）。これら２つの糖がフラボンに付加されてはじめて、メタロアントシアニンが形成され、美しい青色が発現する。また、青いダッチアイリス花弁には４’位に糖が付加したフラボンが含まれている。また、フラボンに糖が２個付加されることによって溶解度が上がり、物性も変わるため、健康食品、医薬品や化粧品素材としての用途が拡がることが期待される。
国際公開第ＷＯ２００６／１０５５９８号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１０／１２２８４９号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００５／０１７１４７号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００９／０６２２５３号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００８／１５６２１１号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００７／０９４５２１号パンフレット 国際公開第ＷＯ９９／０５２８７号パンフレット 国際公開第ＷＯ０１／０９２５０９号パンフレット 特開２００６－１４９２９３号公報 特開２００５－９５００５号公報
Natural Product Reports (2009), 26, 884-915 Biosci. Biotechnol. Biochem (2010), 74(9), 1760-1769 Plant Cell Physiol (2007), 48(11), 1589-1600 Plant Cell Physiol (1996), 37(5), 711-716 J. Biol. Chem (1999), 274(11), 7405-7411 Plant Molecular Biology (2002), 48, 401-411 Journal of Experimental Botany (2008), 59(6), 1241-1252 Biosci. Biotechnol. Biochem (2006), 70(6), 1471-1477 Planta (2000), 210, 1006-1013 Plant Cell (2010), 22(10), 3374-89 The Plant Journal (1999), 19(5), 509-519
　フラボンの物性を変えることは、花の色を変えることや、食品、医薬品、化粧品の素材の開発に必要である。例えば、デルフィニジンを蓄積しているカーネーション、バラ、キクの色は青紫色であるが、この色をさらに青くする研究が行われている。
　かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとその使用を提供することである。
　上記課題を解決すべく、本願出願人らは鋭意検討し、実験を重ねた結果、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、これを使用することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］以下の（ａ）～（ｅ）：
　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
　［２］（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［３］（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［４］（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［５］（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［４］に記載のポリヌクレオチド。
　［６］（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［５］に記載のポリヌクレオチド。
　［７］ＤＮＡである、前記［１］～［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
　［８］前記［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
　［９］前記［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
　［１０］前記［９］に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
　［１１］前記［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの４’位の水酸基に糖を付加する方法。
　［１２］前記［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入され、かつ、該ポリヌクレオチドを含有する、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
　［１３］切花である、前記［１２］に記載の植物の部分。
　［１４］前記［１３］に記載の切花を用いた切花加工品。
　［１５］以下の工程：
　前記［１０］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
　該非ヒト宿主からフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
　［１６］以下の工程：
　前記［１０］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
　該非ヒト宿主から、４’位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、４’位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。
　［１７］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する食品。
　［１８］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する医薬品。
　［１９］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する化粧品。
　本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボンの４’位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。
　フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、例えば、バラのように元来フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有する植物へ導入することにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンが生成する。あるいは、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質と共に植物体内で発現させることにより、４’位と7位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンが生成する。
　また、本発明により、４’位の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られた食品、医薬品、化粧品なども提供される。
アントシアニンの生合成経路を説明する図である。 メタロアントシアニンの構造の概要図である。 ネモフィラ由来のアントシアニン（ネモフィリン）の構造式である。 ネモフィラ由来のフラボン（マロニルアピゲニン４’，７－ジグルコシド）の構造式である。 サルビア由来のアントシアニン（シアノサルビアニン）の構造式である。 サルビア由来のフラボン（アピゲニン４’，７－ジグルコシド）の構造式である。 花弁抽出液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 アピゲニン４’，７－ジグルコシドの生合成経路を説明する図である。 ＮｍＧＴ８タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ８タンパク質溶液とアピゲニン７－グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ８タンパク質と、バイカレインの５位に糖を付加する酵素の、各種フラボノイド基質に対する反応性をまとめた図である。 ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ３とのアミノ酸配列を比較するアラインメント図である。 ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ４とのアミノ酸配列を比較するアラインメント図である。 ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ３及びＮｍＧＴ４とのアミノ酸配列を比較するアラインメント図である。 ＮｍＧＴ８とキンギョソウのカルコンの４’位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である。 ＮｍＧＴ８とバラのアントシアニジンの３位と５位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である。 本発明のＮｍＧＴ８と前記した諸酵素との関係を指標する系統樹である。 トレニアへ導入したＮｍＧＴ８を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ４５８３）。 ペチュニアへ導入したＮｍＧＴ８を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ５４２４、５４２８）。 ＮｍＧＴ８を導入した組換えペチュニアの花弁抽出液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ８を導入した組換えペチュニアの花弁抽出液（２５０－１２５０ｍ/ｚ）の抽出正イオンマスクロマトグラムである。 カーネーションへ導入したＮｍＧＴ８を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ５４３３）。 バラへ導入したＮｍＧＴ８を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ４５７７、４５７８、５４３７、５４４０）。 ＮｍＧＴ８を導入した組換えバラの花弁抽出液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ８を導入した組換えバラの花弁抽出液（２５０－１２５０ｍ/ｚ）の抽出正イオンマスクロマトグラムである。
　本発明は、以下の（ａ）～（ｅ）：
　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。
　本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」又は「相同性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度150～900mM、好ましくは600～900mM、pH 6～8であるような条件を挙げることができ、具体例としては、5 x SSC（750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム）、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC（15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム）、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
　上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
　また、本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
　本明細書中、用語「同一性」及び「相同性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」及び「相同性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」及び「相同性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
　また、本明細書に記載される「同一性」及び「相同性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。
　本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
　生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
　あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
　また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物であるフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いてもフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。
　本発明は、前記したポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された宿主にも関する。
　宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。
　酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
　本発明の発現ベクターは、それらを導入する宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。
　植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
　発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
　前記発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培又は生育させ、培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。
　本明細書では、ネモフィラ由来のフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明に係るポリヌクレオチドは、ネモフィラ由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。
　本発明は、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物に導入し、これを該植物内に含有させることにより得られる、植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織にも関する。該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。本発明に係るフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、フラボンの４’位を配糖化したり、又はフラボンの４’位の配糖化を抑制したりすることができ、その結果として植物における花色を変更することができる。
　現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　本発明は、上記切花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　また、本発明の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されたフラボンは、食品、医薬品、化粧品の製造方法などの用途に使用することができる。
　本発明においては、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって、植物内で目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。目的の遺伝子の発現を抑制する方法は、当業者に公知の方法に従って行なうことができるが、例えば、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等が挙げられる。例えば、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。このような方法はアンチセンス法として知られている。アンチセンス法では、発現を抑制したい遺伝子に相補的な配列をもつＲＮＡを高レベルで発現させることにより、標的遺伝子の発現が抑制される。この方法では、本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５～１００ヌクレオチド、より好ましくは５～５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０～２０ヌクレオチドとされる。
　遺伝子の発現の抑制は、本発明に係る遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。すなわち、このセンス一本鎖核酸は、上記のアンチセンス一本鎖核酸と同様に、本発明による遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。この方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５～１００ヌクレオチド、より好ましくは５～５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０～２０ヌクレオチドとされる。
　さらに、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる二本鎖核酸分子を用いて行なわれる。例えば、この二本鎖核酸分子を用いることにより、被子植物において本発明による遺伝子のアンチセンス又はセンス一本鎖核酸を発現させることができる。本発明による二本鎖核酸分子は、好ましくはＤＮＡとされ、その鎖長及び具体的なヌクレオチド配列は、目的とする一本鎖核酸分子の鎖長およびヌクレオチド配列に対応するものとされる。例えば、上記アンチセンス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。また、上記センス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。
　二本鎖核酸分子は、当業者に公知の方法を用いて植物中で発現させることができる。例えば、プロモーター、本発明による二本鎖核酸分子、及び転写ターミネーター等を含む発現ベクター、目的とする植物中に導入し、得られた植物体を栽培することにより、二本鎖核酸分子を発現させることができる。植物への発現ベクターの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法の他の例としては、コサプレッション法が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明によるセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、このＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される（Plant Cell 9: 1357-1368, 1997）。
　以下、実施例に従って発明を具体的に説明する。
［実施例１：ネモフィラ花弁におけるフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性の検出］
　ネモフィラ（Nemophila menziesii）の花弁を、以下のように定義した発達段階に分けて採取し、液体窒素で凍らせ、－８０℃冷凍庫で保存した：
　ステージ１：色が付いていない堅く閉じたつぼみ（約２－５ｍｍ）；
　ステージ２：有色の堅く閉じたつぼみ（約２－５ｍｍ）；
　ステージ３：有色の閉じたつぼみ、がく片がちょうど開こうとしているつぼみ（約５－１０ｍｍ）；
　ステージ４：花弁が開こうとしているつぼみ（約１０－１５ｍｍ）
　ステージ５：完全にひらいた花
＜ネモフィラ花弁抽出液の調製＞
　アントシアニンが生合成される前の花弁のステージ１と２で、フラボン糖転移酵素活性が検出されることが期待される。そこで、ステージ１と２の花弁を用いて、花弁抽出液を調製した。５００ｍｇの花弁サンプル（－８０℃で保存していたステージ１と２のサンプル２５０ｍｇずつ）を液体窒素で冷やしながら乳鉢ですりつぶし、１．５ｍｌの抽出バッファー（組成；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、ポリビニルピロリドン４０：５０ｍｇ／ｍｌ、スクロース：１００ｍｇ／ｍｌ）に溶かした。得られたタンパク質溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３０％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を５００μｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２．５ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ－５Ｃｏｌｕｍｓ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５　ＤＮＡ　Ｇｒａｄｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてカラム精製を行って、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁抽出液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
　４０μｌの花弁抽出液、２０μｌの５ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、２０μｌの１Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｌ アピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を、３０℃で１時間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、花弁抽出液を１００℃２０分で熱処理した花弁抽出液を用いて同じ条件下で酵素反応させた反応液を用いた。
　その結果、アピゲニン４’，７－ジグルコシド精製品やアピゲニン７－グルコシド標品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンに加え、アピゲニン７－グルコシドと近い保持時間を示すフラボンが生合成された（図７参照）。ＵＤＰ－グルコースを加えずに酵素反応したときには、何も生合成されなかった。
［実施例２：アピゲニン４’ －グルコシドの保持時間・吸収極大の決定］
　ネモフィラ花弁におけるアピゲニン４’，７－ジグルコシドの生合成経路を考慮すると、アピゲニン４’，７－ジグルコシドが生合成される過程で、アピゲニン４’ －グルコシドとアピゲニン７－グルコシドが中間成生物として生合成されるはずである（図８参照）。このことから、実施例１において検出されたアピゲニン７－グルコシドと近い保持時間を示すフラボンは、アピゲニン４’ －グルコシドであると判断された（図７参照）。アピゲニン４’ －グルコシドの保持時間・吸収極大を決定することができた。
　これらの結果より、ネモフィラ花弁には、ＵＤＰ－グルコースに依存したフラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質が存在することが明らかとなった。４’位と７位の水酸基の配糖化については、１つの酵素が両方の配糖化を行っている可能性と、４’位と７位の水酸基の配糖化をそれぞれ別の酵素が行っている可能性が考えられた。
［実施例３：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの単離＞
　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡｅａｓｙ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者に推奨されているプロトコールに従い、ネモフィラのステージ１と２の花弁からｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。
＜ネモフィラの花弁由来のｃＤＮＡの発現解析＞
　３０μｇのネモフィラの花弁由来ｔｏｔａｌＲＮＡの逆転写反応を行った後、均一化ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーをエマルジョンＰＣＲによって、クローンごと増幅した後、ゲノムシークエンサーＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｊａｐａｎ株式会社）により塩基配列の決定を行った。また、得られた配列データをアミノ酸配列に翻訳し、リンドウのアントシアニン３’－糖転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示す配列を抽出した。これらの配列をアセンブルし、糖転移酵素をコードする候補遺伝子を得た。
［実施例４：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列の取得］
　実施例３では糖転移酵素遺伝子の配列が２５種得られた。その内１０個の遺伝子（ＮｍＧＴ０～９）について完全長ｃＤＮＡ配列を取得するための実験を行った。
　完全長ｃＤＮＡ配列の取得は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ部分配列の中からそのクローンに特異的な領域を選び、この領域の配列をもとにしてＲＡＣＥ用プライマーを設計し、ＲＡＣＥ　ＰＣＲによって５’，３’末端配列を得た。この配列をもとに、完全長ｃＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーを設計し、ネモフィラｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社） を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、５０μｌでＰＣＲ反応を行った（９４℃で２分間保持し、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ネモフィラのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、実施例２で単離したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型にして、製造者に推奨されているプロトコールに従って合成した。プライマーは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＮｍＧＴ０～９遺伝子を挿入できるよう、完全長ｃＤＮＡの両端に制限酵素サイトが含まれるように設計した。このＰＣＲ生成物を用いて、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、ＮｍＧＴ遺伝子の完全長を含むプラスミド（ｐＴＯＰＯ－ＮｍＧＴ０～９）を取得した。プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、フラボンの４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子（ＮｍＧＴ０～９）の中から完全長ｃＤＮＡ配列（ＮｍＧＴ８：配列番号１）を取得した。
［実施例５：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（粗酵素を用いた場合）］
＜大腸菌発現コンストラクトの作製＞
　それぞれ３μｇのｐＴＯＰＯ－ＮｍＧＴ０～９を該当する制限酵素で処理し、得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。２μｇのベクターｐＥＴ１５ｂも制限酵素で処理し、得られたＤＮＡ断片とライゲーションさせて、大腸菌発現コンストラクト（ｐＥＴ－ＮｍＧＴ０～９）を作製した。
＜糖転移酵素の大腸菌での発現＞
　ｐＥＴ－ＮｍＧＴ０～９を、Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２７℃で一晩本培養した。
　一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を粗酵素液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
　８０μｌの粗酵素液、２０μｌの５ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、２０μｌの１Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｌ のアピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で３０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴベクターを導入した大腸菌の粗酵素液を用いて同じ条件化で酵素反応させた反応液を用いた。
　その結果、ＮｍＧＴ８について、基質以外のピークがみられた。
　実施例６以降は、ＮｍＧＴ８（配列番号１）について記載する。
［実施例６：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の酵素活性測定実験（Ｈｉｓ－Ｔａｇを付加したタンパク質を精製した場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
　実施例５で記載したｐＥＴ－ＮｍＧＴ８を導入した大腸菌株ＢＬ２をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
　一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの抽出液（組成；緩衝液（ＫＣl：３００ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４：５０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ）（ｐＨ８．０）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ－Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「ＮｍＧＴ８タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
　１０μｌのタンパク質溶液、２μｌの５０ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、１０μｌの１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５μｌの１ｍMアピゲニンを混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
　その結果、アピゲニン４’－グルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成されていた（図９参照）。基質を他のフラボンであるルテオリンに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行った場合、ルテオリン４’－グルコシドが生合成された（図１１参照）。一方、基質を１ｍMのアピゲニン７－グルコシドに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行った場合は、アピゲニン４’，７－ジグルコシドは生合成されなかった（図１０参照）。同様に、基質を１ｍMのルテオリン７－グルコシドに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行った場合も、ルテオリン４’，７－ジグルコシドは生合成されなかった（図１１参照）。このことから、ＮｍＧＴ８タンパク質は、アピゲニンやルテオリンの７位の配糖化よりも先に、４’位の配糖化を行うことが明らかとなった（図８参照）。さらに、図１１に記載の各種フラボノイド化合物、及びベタニジンに対する反応性を調べたところ、ＮｍＧＴ８タンパク質は、基質特異性が高く、アピゲニンやルテオリンのようなフラボンの4’位を選択的に配糖化することが明らかとなった（図１１参照）。
　尚、リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子（Ｄｂｓ５ＧＴ）は、本来、ベタニジンの５位の水酸基にグルコースを転移するものであるが、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されている。このリビングストーンデージー由来の糖転移酵素は、本発明のＮｍＧＴ８タンパク質と、フラボノイド化合物やベタニジンに対する反応性が大きく異なることを明らかとした（図１１参照）。
　ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ３の間の、及びＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ４の間のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ、３２％、及び３２％であった（図１２－１～１２－３参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン１１．０２、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。既に同定されている糖転移酵素の中で、ＮｍＧＴ８と最も同一性が高いアミノ酸配列は、バラのアントシアニジンの３位と５位に糖を付加する酵素（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ４Ｒ１Ｉ９）であり、アミノ酸配列の同一性は５２％であった（図１４参照）。次にＮｍＧＴ８と同一性が高いアミノ酸配列は、キンギョソウのカルコンの４’位に糖を付加する酵素（ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９４６１に記載）であり、同一性は５１％であった（図１３参照）。
　また、図１５に、本発明のＮｍＧＴ８と前記した諸酵素との関係を指標する系統樹を示す。
［実施例７：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のトレニアにおける発現］
　本発明のＮｍＧＴ８遺伝子が、植物内でフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を翻訳するかどうかを確かめるため、ＮｍＧＴ８を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４５８３を構築し、トレニア（サマーウェーブ）へ導入した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図１６参照）。
＜コンストラクトの作製＞
　ｐＳＰＢ４５８３は、植物導入用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　４，ｐ２８８）を基本骨格とし、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター上流にエンハンサー配列を２回繰り返してもつＥｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーターが含まれている。
＜遺伝子発現解析＞
　カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、それぞれの組換えトレニアのガク割れしていないつぼみの花弁を用いて、遺伝子発現解析を行った。ｔｏｔａｌＲＮＡ単離は実施例３に記載した方法と同様にして、ｃＤＮＡ合成は実施例４に記載した方法と同様にして行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、３０μｌで行った（９４℃で２分間保持し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間保持のサイクルを２５サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。それぞれの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマーを設計した。その結果、トレニアにおけるＮｍＧＴ８の転写が確認された。
［実施例８：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のペチュニアにおける発現］
　ＮｍＧＴ８を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５４２４、５４２８を構築し、ペチュニア（サフィニアブーケレッド）へ導入した。ペチュニアは元来フラボンを生合成しないため、トレニアフラボン合成酵素（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６１６００に記載、配列番号５）を共に導入し、ペチュニアでＮｍＧＴ８がフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するかどうかを評価した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図１７参照）。
＜コンストラクトの作製＞
　ｐＳＰＢ５４２４は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、３つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈ（ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９５８に記載、配列番号３）とＨＳＰターミネーター（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０１０）５１，３２８－３３２）、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
　ｐＳＰＢ５４２８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、２つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
＜遺伝子発現解析＞
　カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、それぞれの組換えペチュニアの完全にひらいた花の花弁を用いて、実施例７に記載した方法と同様にして、遺伝子発現解析を行った。その結果、ペチュニアにおけるＮｍＧＴ８の転写が確認された。
＜花弁色素分析＞
　完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８について転写産物が確認された系統について、花弁の色素分析を行った。０．２ｇの完全にひらいた花の花弁を２４時間以上凍結乾燥させ、スパチュラで細かく砕き、４ｍｌの抽出バッファー（組成；０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液）を加えて、２０分間超音波下で処理した。その花弁抽出液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。分析は実施例５に記載した条件と同様にして行った。コントロールとして、遺伝子を導入していない非組換えペチュニアとトレニアフラボン合成酵素のみを導入しフラボンを生合成させた組換えペチュニアについても同様にして分析を行った（図１８）。さらに、５０倍希釈した花弁抽出液を液体クロマトグラフ質量分析計（島津製作所）にて分析した。検出器は島津LCMS-IF-TOFを用い、４３３．１０５７（〔Api－Glc+H〕＋）と４４９．１０８４（〔Lut－Glc＋H〕＋）で検出した。カラムはInertsil ODS－４（２５０＊４．６ｍｍ、５μｍ）（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ギ酸水溶液）とＢ液（０．１％ギ酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の９：１の混合液から１１：９の混合液までの３５分間の直線濃度勾配及び、１１：９の混合液から０：１０の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした（図１９）。
　その結果、フラボン合成酵素とＮｍＧＴ８を導入した組換えペチュニアでアピゲニン４’－グルコシドとルテオリン４’－グルコシドが検出され（図１８）、フラボン４’－グルコシドが生合成されたフラボンの９５．６％を占めていることが分かった。残りの４．４％は、フラボンの７位に糖を転移するペチュニア内在活性によって生合成されたフラボン７―グルコシドであることも分かった（図１９）。一方、非組換えペチュニアではフラボンは検出されず、トレニアフラボン合成酵素のみを導入した組換えペチュニアでは、フラボン７－グルコシドが生合成されたフラボンの８２．８％を占めていることが分かった。このことから、ＮｍＧＴ８は、ペチュニア内在性のフラボンの７位に糖を転移する活性を有するタンパク質よりも、優先的に機能するフラボンの４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが明らかとなった。ＮｍＧＴ８を利用することによって、ペチュニア内にフラボン４’－グルコシドを効率よく生合成させることが可能となる。
［実施例９：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のカーネーションにおける発現］
　ＮｍＧＴ８を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５４３３を構築し、カーネーション（クリームシンデレラ）へ導入した。カーネーションは元来フラボンを生合成しないため、トレニアフラボン合成酵素を共に導入し、カーネーションでＮｍＧＴ８がフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するかどうかを評価した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図２０参照）。
　ｐＳＰＢ５４３３は、植物導入用バイナリーベクターｐWTT２１３２（DNA　Plant　Technologies, USA=DNAP）を基本骨格とし、４つの発現カセット（１．キンギョソウカルコン合成酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２６５に記載）と完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．キンギョソウカルコン合成酵素プロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、３．カーネーションアントシアニン合成酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＡＵ／２００９／００１６５９に記載）と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、４．カーネーションアントシアニン合成酵素プロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３（特願２０１１－００６３１７）とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
［実施例１０：フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のバラにおける発現］
　ＮｍＧＴ８を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４５７７、４５７８、５４３７、５４４０を構築し、バラ（ノブレス、リタパヒューメラ）へ導入した。バラは元来フラボンを生合成しないため、トレニアフラボン合成酵素を共に導入し、バラでＮｍＧＴ８がフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するかどうかを評価した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図２１参照）。
　ｐＳＰＢ４５７７は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、３つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモータープロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈとｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とｍａｓターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター）が含まれている。
　ｐＳＰＢ４５７８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、３つの発現カセット（１．シソアントシアニン３－アシル基転位酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３９０９に記載）と完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈとｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とｍａｓターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター）が含まれている。
　ｐＳＰＢ５４３７は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、５つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．シソアントシアニン３－アシル基転位酵素染色体遺伝子（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３８８６に記載、配列番号７参照）、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、５．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
　ｐＳＰＢ５４４０は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、５つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．Ｅｌ２３５ＳプロモータープロモーターとｃＤＮＡラベンダーアントシアニン３－アシル基転位酵素（ＰＣＴ／ＪＰ１９９６／０００３４８に記載、配列８参照）、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、５．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
＜遺伝子発現解析＞
　カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、それぞれの組換えバラの完全にひらいた花の花弁を用いて、実施例７に記載した方法と同様にして、遺伝子発現解析を行った。その結果、バラにおけるＮｍＧＴ８の転写が確認された。
＜花弁色素分析＞
　完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８について転写産物が確認された系統について、花弁の色素分析を行った。０．２ｇの完全にひらいた花の花弁を２４時間以上凍結乾燥させ、スパチュラで細かく砕き、４ｍｌの抽出バッファー（組成；０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液）を加えて、２０分間超音波下で処理した。その花弁抽出液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。分析は実施例５に記載した条件と同様にして行った。コントロールとして、遺伝子を導入していない非組換えバラについても同様にして分析を行った（図２２）。５０倍希釈した花弁抽出液を液体クロマトグラフ質量分析計（島津製作所）にて分析した。検出器は島津LCMS-IF-TOFを用い、４３３．１０５７（〔Api－Glc+H〕＋）と４４９．１０８４（〔Lut－Glc＋H〕＋）で検出した。カラムはInertsil ODS－４（２５０＊４．６ｍｍ、５μｍ）（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ギ酸水溶液）とＢ液（０．１％ギ酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の９：１の混合液から１１：９の混合液までの３５分間の直線濃度勾配及び、１１：９の混合液から０：１０の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした（図２３）。
　その結果、フラボン合成酵素とＮｍＧＴ８を導入した組換えバラでアピゲニン４’－グルコシドとルテオリン４’－グルコシドが検出され（図２２）、フラボン４’－グルコシドが生合成されたフラボンの９７．０％を占めていることが分かった。残りの３．０％は、フラボンの７位に糖を転移するバラ内在活性によって生合成されたフラボン７―グルコシドであることも分かった（図２３）。一方、非組換えバラではフラボンは検出されなかった。このことから、ＮｍＧＴ８は、バラ内在性のフラボンの７位に糖を転移する活性を有するタンパク質よりも、優先的に機能するフラボンの４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが明らかとなった。ＮｍＧＴ８を利用することによって、バラ内にフラボン４’－グルコシドを効率よく生合成させることが可能となる。
　本発明において、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが初めて同定された。本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボンの４’位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。また、本発明により、４’位の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られた食品、医薬品、化粧品なども提供される。

Claims (19)

  1. 　以下の（ａ）～（ｅ）：
    　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
  2. 　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 　（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 　ＤＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  10. 　請求項９に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの４’位の水酸基に糖を付加する方法。
  12. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入され、かつ、該ポリヌクレオチドを含有する、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
  13. 　切花である、請求項１２に記載の植物の部分。
  14. 　請求項１３に記載の切花を用いた切花加工品。
  15. 　以下の工程：
    　請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
    　該非ヒト宿主からフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
    を含む、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
  16. 　以下の工程：
    　請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
    　該非ヒト宿主から、４’位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
    を含む、４’位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。
  17. 　請求項１６に記載の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する食品。
  18. 　請求項１６に記載の製造方法により製造された４’位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する医薬品。
  19. 　請求項１６に記載の製造方法により製造された４’位の両方の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する化粧品。
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