CN114807075A

CN114807075A - 糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用

Info

Publication number: CN114807075A
Application number: CN202110109409.7A
Authority: CN
Inventors: 薛哲勇; 宋伟; 华欣; 袁强
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN114807075B

Abstract

本发明涉及皂苷代谢途径，具体涉及糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用。所述糖基转移酶是如下a1或a2所述的蛋白质：a1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；a2.将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有糖基转移酶活性的蛋白质。所述糖基转移酶能够催化甾体皂苷元糖基化，为后续获得多种重楼皂苷提供了基因资源。

Description

糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用

技术领域

本发明涉及皂苷代谢途径，具体涉及糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用。

背景技术

重楼是百合科重楼属植物的泛称，可作为云南白药、宫血宁和热毒清等中成药的主要原料，具有极高的药用和经济价值。甾体皂苷是重楼植物的主要化学成分，目前已分离鉴定出 160余种，主要包括重楼皂苷(polyphyllin)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ(薯蓣皂苷类)和Ⅵ、Ⅶ(偏诺皂苷类)，药理活性广泛。抗肿瘤是重楼皂苷的主要作用，重楼皂苷Ⅰ通过抑制人胃癌HGC-27 细胞中PDK1/Akt/mTOR信号通路并下调细胞周期蛋白B1，诱导自噬和细胞周期停滞(Heet al.2019)。重楼皂苷Ⅵ在非小细胞肺癌中通过ROS触发的mTOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬(Teng et al.2019)。重楼皂苷Ⅶ能够促进线粒体产生ROS并激活MAPK和PTEN/p53 途径，共同诱导HepG2人肝癌细胞凋亡(Zhang et al.2016)。重楼皂苷Ⅶ在抗菌消炎方面也颇有成效，能显著抑制枝状枝孢菌、念珠菌和痤疮丙酸杆菌的生长，可作为合成药物的有效替代品(Deng et al.2008；Qin et al.2012)。薯蓣皂苷元(diosgenin)能增强高脂血症小鼠的脂蛋白脂肪酶、肝脂酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶与一氧化氮合酶的活性，改善脂质分布，起到降血脂的效果(Gong et al.2010)。重楼皂苷Ⅲ具有优异的驱虫活性，可以杀死寄生在金鱼鳃部的指环虫(EC₅₀＝18.06mg l^-1)，且对金鱼低毒(Wang et al.2010)。在新冠肺炎研究中发现，皂苷类分子具有潜在的抗新冠病毒活性。通过对接筛选，推测重楼皂苷Ⅰ可与2019-nCoV主要蛋白酶(M protease)结合，阻止病毒复制(Yan et al.2020)。

现阶段对于重楼皂苷的研究主要集中在医药和临床，导致对其代谢途径，尤其是下游生物合成过程的了解还十分欠缺。2,3-氧化鲨烯(2,3-oxidosqualene)是甾醇和三萜合成的共同前体，在2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-Oxidosqualene cyclases，OSCs)的催化下生成甾醇类或三萜类骨架。多数五环三萜合酶能够催化2,3-氧化鲨烯形成“chair-chair-chair”构象的达玛烷型阳离子，随后经过进一步重排产生α-amyrin、β-amyrin和羽扇豆醇(lupeol)等五环三萜(Xue et al.2018)。环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase)催化2,3-氧化鲨烯形成“chair-boat-chair”构象的前固醇阳离子，继而转化成环阿屯醇，并经一系列反应合成胆固醇。植物中胆固醇的含量虽然普遍较低，但却是植物甾醇(phytosterol)的重要组成部分，亦是甾体皂苷的直接前体(Cárdenas et al.2015)。甾体皂苷元合成需要胆固醇侧链的羟化，主要由细胞色素P450酶 (cytochrome P450 monooxygenase,CYP)参与修饰。例如，在七叶一枝花(Paris polyphylla) 中发现CYP90Bs通过基因复制进化出固醇多羟化酶活性，PpCYP90G4能催化胆固醇C16和 C22位羟化伴随E环闭合。16,22(S)-二羟基胆固醇在PpCYP94D108等酶作用下C26位进一步羟化形成薯蓣皂苷元(Christ etal.2019)，而偏诺皂苷元(pennogenin)C17位P450酶仍待解析。最后，薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元在糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)的作用下发生糖基化，形成具有多种生物活性的重楼皂苷。目前，有关甾体皂苷元糖基化修饰的研究鲜有报道。

重楼皂苷基本来源于植物提取，然而由于过度开发导致了重楼资源的枯竭。利用合成生物学构建异源生物合成途径，逐渐成为获取天然活性成分的有效方式。《中国药典》中收录的重楼仅有滇重楼(Paris polyphylla SMITH var.yunnanensis(FRANCH.)Hand.-Mazz.)和七叶一枝花。而滇重楼因皂苷含量丰富，药用价值高，品质优良，固多以其入药。重楼属植物基因组庞大，皂苷种类众多，通过基因共表达网络对重楼皂苷代谢途径进行解析存在很大的困难。

发明内容

我们以滇重楼作为研究材料，利用加权基因共表达网络分析(Weightedcorrelation network analysis,WGCNA)挖掘可能参与重楼皂苷合成的基因模块，发现了一种新的糖基转移酶基因，命名为PpUGT73E5。为验证该基因的功能，我们设计了PpUGT73E5基因编码区的引物，以反转录得到的滇重楼叶片cDNA为模板进行PCR，获得了PpUGT73E5基因。该基因的开放阅读框含有1398个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。接下来我们进行了蛋白表达和纯化，并对PpUGT73E5进行了功能验证。结果表明PpUGT73E5蛋白能够催化甾体皂苷元糖基化。具体地，PpUGT73E5蛋白可与薯蓣皂苷元、 UDP-葡萄糖反应生成延龄草苷，也可与偏诺皂苷元、UDP-葡萄糖反应生成偏诺皂苷元-3-O- 葡糖苷。糖基转移酶PpUGT73E5将有助于我们探究植物甾体皂苷的合成途径，为后续获得多种重楼皂苷提供基因资源。

基于上述研究，本发明提供一种糖基转移酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：

a1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2.将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加而形成的具有糖基转移酶活性的蛋白质。

编码所述糖基转移酶的基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。在一些实施例中，所述载体是克隆载体，包含所述糖基转移酶的编码基因以及质粒复制所需的元件，例如，插入了所述编码基因的pClone007 Blunt Simple Vector。在另一些实施例中，所述载体是表达载体，包含所述糖基转移酶的编码基因和能够使蛋白成功表达的元件，例如，插入了所述编码基因的pGEX-6p-1载体。在一些实施例中，所述重组菌是含有克隆载体的重组菌，例如E.coli DH5α，通过培养重组菌使所述糖基转移酶的编码基因得到复制。在另一些实施例中，所述重组菌是含有表达载体的重组菌，在适当的条件下培养该重组菌，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导所述糖基转移酶的表达。

本发明还提供所述糖基转移酶的制备方法，包括如下步骤：构建所述糖基转移酶基因的表达载体，将表达载体导入表达宿主菌中，获得重组菌，培养重组菌并诱导蛋白表达。

所述糖基转移酶在糖基转移反应中的用途也属于本发明的保护范围。

所述糖基转移酶在甾体皂苷合成中的用途也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施例中，所述甾体皂苷包括延龄草苷、偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷、重楼皂苷V和重楼皂苷Ⅵ。在一些实施例中，所述甾体皂苷合成中以薯蓣皂苷元为底物，在所述糖基转移酶的作用下引入葡萄糖基，从而产生延龄草苷。在另一些实施例中，所述甾体皂苷合成中以偏诺皂苷元为底物，在所述糖基转移酶的作用下引入葡萄糖基，从而产生偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷。

本发明还提供一种合成重楼皂苷V的方法，包括如下步骤：利用本发明所述的糖基转移酶与薯蓣皂苷元、UDP-葡萄糖反应生成延龄草苷；然后以延龄草苷为底物，加入氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的酶蛋白和UDP-鼠李糖继续反应，生成重楼皂苷V。

本发明还提供一种合成重楼皂苷Ⅵ的方法，包括如下步骤：利用本发明所述的糖基转移酶与偏诺皂苷元、UDP-葡萄糖反应生成偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷；然后以偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷为底物，加入氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的酶蛋白和UDP-鼠李糖继续反应，生成重楼皂苷Ⅵ。

附图说明

图1.PpUGT73E5基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；M为DL 2000DNA Marker。

图2.PpUGT73E5基因表达产物的SDS-PAGE电泳图；M为Page-ruler预染蛋白Ladder， 1为pGEX-6p-1空载体重组菌诱导后的全细胞蛋白，2为未经诱导的PpUGT73E5重组菌全细胞蛋白；3为IPTG诱导后的PpUGT73E5重组菌上清蛋白；4为纯化后的PpUGT73E5蛋白。

图3.PpUGT73E5蛋白与薯蓣皂苷元的反应产物的液相色谱图和质谱分析图；A为液相色谱图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)，空载对照是指含有pGEX-6P-1空载体的Rosetta(DE3)细胞经蛋白诱导表达后提取和纯化的蛋白；B为质谱分析图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。

图4.PpUGT73E5蛋白与偏诺皂苷元的反应产物的液相色谱图和质谱分析图；A为液相色谱图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)，空载对照是指含有pGEX-6P-1空载体的Rosetta(DE3)细胞经蛋白诱导表达后提取和纯化的蛋白；B为质谱分析图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。

图5.AsUGT73E1蛋白与延龄草苷的反应产物的液相色谱图和质谱分析图。A为液相色谱图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)，空载对照是指含有pGEX-6P-1 空载体的Rosetta(DE3)细胞经蛋白诱导表达后提取和纯化的蛋白；B为质谱分析图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。

图6.AsUGT73E1蛋白与偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷的反应产物的液相色谱图和质谱分析图。A为液相色谱图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)，空载对照是指含有pGEX-6P-1空载体的Rosetta(DE3)细胞经蛋白诱导表达后提取和纯化的蛋白；B为质谱分析图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。

图7.PpUGT73E5蛋白催化甾体皂苷元糖基化的过程。

图8.AsUGT73E1蛋白催化延龄草苷和偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷糖基化的过程。

图9.AsUGT73E1基因表达产物的SDS-PAGE检测结果；1为未经诱导的全细胞蛋白；2为IPTG诱导后的全细胞蛋白；3为IPTG诱导后的细胞上清；4为IPTG诱导后的细胞沉淀； 5为细胞上清GST柱纯化的蛋白；6为超滤浓缩后的纯化蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

实验材料：

滇重楼(Paris polyphylla SMITH var.yunnanensis(FRANCH.)Hand.-Mazz.)，收录在《中华人民共和国药典》(2015版)中。《中华人民共和国药典》，简称《中国药典》，作者：国家药典委员会，出版社：国医药科技出版社，出版时间：2015年6月5日。以下实验中使用的滇重楼材料采自云南大理，将滇重楼的不同组织用液氮速冻后带回实验室。上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(CAT#:DL1001)和Rosetta(DE3)感受态细胞(CAT#:EC1010)购于上海唯地生物技术有限公司。克隆载体pClone007 BluntSimple Vector购于北京擎科新业生物技术有限公司，货号：TSV-007BS。原核表达载体pGEX-6P-1 为实验室保存，该载体可商购获得(优宝生物，产品编号VT1258)。

PCR引物：

主要试剂与溶液：

薯蓣皂苷元：CAS号：512-04-9，分子式：C₂₇H₄₂O₃，英文名称diosgenin，购买自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP0504。

偏诺皂苷元：CAS号：507-89-1，分子式：C₂₇H₄₂O₄，英文名称pennogenin，可从上海源叶生物科技有限公司购买，货号B50146。以下实验中使用的偏诺皂苷元通过重楼皂苷VI酶解分离纯化获得，酶解分离纯化方法参考Li,W.,Wang,Z.,Gu,J.,Chen,L.,Hou,W.,Jin,Y.P., &Wang,Y.P.(2015).Bioconversion of ginsenoside Rd to ginsenoside M1 bysnailase hydrolysis and its enhancement effect on insulin secretion invitro.Die Pharmazie,70:340–346.中记载的方法。

UDP-葡萄糖：CAS号：28053-08-9，分子式：C₁₅H₂₂N₂Na₂O₁₇P₂，购买自北京酷来博科技有限公司，货号CU11611-500mg。

UDP-鼠李糖：CAS号：1526988-33-9，分子式：C₁₅H₂₂N₂Na₂O₁₆P₂，英文名称UDP 5'-diphospho-a-L-rhamnose，购买自苏州汉酶生物技术有限公司。

延龄草苷：CAS号：14144-06-0，分子式：C₃₃H₅₂O₈，购买自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP1124。

重楼皂苷V：CAS号：19057-67-1，分子式：C₃₉H₆₂O₁₂，购买自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP1151。

重楼皂苷Ⅵ：CAS号：55916-51-3，分子式：C₃₉H₆₂O₁₃，购买自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP1131。

色谱甲醇：Sigma-Aldrich，货号：34885。

色谱乙腈：Sigma-Aldrich，货号：34851。

PBS磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24 g，调节pH 7.4，加蒸馏水定容至1L。

PBS磷酸缓冲液(0.01M，pH 8.0)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24 g，调节pH 8.0，加蒸馏水定容至1L。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1.糖基转移酶基因PpUGT73E5的发现、克隆与表达

1.基因发现

我们以滇重楼作为研究材料，通过加权基因共表达网络分析计算重楼转录组中所有基因间的相关系数，将表达模式类似的基因归于同一模块，找出与重楼皂苷分布积累变化高度协同的模块，在模块中发现了一个糖基转移酶基因，将其命名为PpUGT73E5。PpUGT73E5基因的开放阅读框(ORF)含有1398个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。为了验证PpUGT73E5基因在甾体皂苷合成中的功能，我们进行了基因克隆与表达。

2.基因克隆

2.1重楼叶片总RNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure Plant Kit(货号：DP441)，提取重楼新鲜叶片的总RNA，具体操作步骤如下：

(1)将50-100mg重楼叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL RL(使用前加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀；

(2)将溶液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2-5min，吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中；

(3)加入0.5倍上清体积的无水乙醇混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中， 12,000rpm离心30-60sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(4)吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(5)DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD缓冲液，轻柔混匀；

(6)向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min；

(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec，倒掉废液，吸附柱CR3放回收集管中；

(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复一次；

(9)12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，彻底晾干残余的漂洗液；

(10)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 30-100μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。

2.2 cDNA的合成

采用SuperScriptⅢReverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen，货号：18080085)，按照试剂盒说明书对重楼叶片总RNA进行cDNA合成，操作步骤如下：

(1)RNA模板变性

将混合物在65℃温度下加热5min，然后迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

(2)向上述(1)所得的反应物中加入下列组分，进行第一链cDNA合成：

短暂离心混匀。置于55℃反应60min，然后70℃加热15min终止反应，将cDNA产物置于-20℃保存。

2.3目的基因扩增

设计糖基转移酶基因PpUGT73E5编码区引物PpUGT73E5-ORF-F(SEQ ID NO:3)和PpUGT73E5-ORF-R(SEQ ID NO:4)。以5倍稀释后的重楼叶片cDNA作为模板，使用引物PpUGT73E5-ORF-F/R和2×Phanta Max Master Mix高保真酶(vazyme，货号：P515-02)对目的基因进行PCR扩增，反应体系如下：

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共33个循环；72℃彻底延伸7min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，琼脂糖凝胶电泳检测条带大小为1400bp左右。

2.4 DNA凝胶回收

使用Gel Extraction Kit(Omega，货号：D2500-02)试剂盒，按照试剂盒说明书回收 PpUGT73E5目的基因片段，操作步骤如下：

(1)在紫外切胶仪中切下含有目的条带的琼脂糖凝胶，取等体积的结合缓冲液/Binding Buffer，将混合物在55℃孵育7min至凝胶完全融化；

(2)吸取700μL混合液，转移到套有2mL收集管的DNA吸附柱内，静置1min，10,000 g离心1min，弃滤液；

(3)吸附柱置回收集管内，加入700μL无水乙醇稀释的SPW Wash Buffer，10,000g离心1min，弃滤液。重复一次；

(4)弃去滤液，空吸附柱置回离心管内，12,000g离心2min；

(5)空吸附柱置于灭菌的1.5mL离心管中，打开管盖静置1min，在吸附膜中央加入30μL无菌水(60℃预热)，室温静置1min。12,000g离心1min，洗脱DNA。

2.5克隆载体连接

将PpUGT73E5基因克隆至pClone007 Blunt Simple Vector(北京擎科生物，货号：TSV-007BS)，反应体系如下表：

反应条件：室温反应5min即可。

2.6大肠杆菌转化

采用热激法将2.5中的载体连接产物转入大肠杆菌DH5α中，步骤如下：

(1)取100μL冰浴融化的感受态细胞DH5α(上海唯地生物，CAT#:DL1001)，加入载体连接产物，轻轻混匀后冰浴放置30min；

(2)42℃水浴热激60s，然后将离心管迅速转移到冰浴中静置2min；

(3)向离心管中加入200μL无抗性的无菌LB培养液，混匀后37℃摇床中180rpm培养1h，使细菌复苏；

(4)吸取上一步的菌液100μL，加到含有氨苄青霉素(Amp，筛选浓度100mg/L)的 LB琼脂培养基上，将菌液均匀涂开，吹干培养基表面液体，将培养基平板倒置于37℃恒温箱中过夜培养；

(5)挑取若干单菌落，加入含有Amp抗性(100mg/L)的500μL LB液体培养基中， 37℃ 180rpm培养4h，菌液PCR鉴定，鉴定引物为M13-F/R(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8)，将鉴定结果为阳性的单克隆送睿博兴科生物技术有限公司测序，得到测序正确的阳性克隆。

2.7质粒提取

测序正确的阳性克隆保菌后，使用E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅠ试剂盒(omega，货号： D6942-02)，按照试剂盒说明书提取质粒pClone007-PpUGT73E5，操作步骤如下：

(1)取5mL 37℃过夜培养(12-16h)的菌液，10,000g离心1min，弃去上清；

(2)向离心管中加入250μL SolutionⅠ(已加入RNase A)，吹打混匀；

(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4-6次混匀，静置2min使菌体充分裂解(总时间少于5min)；

(4)加入350μL SolutionⅢ，立即上下颠倒6-8次，让溶液彻底混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。13,000g离心10min；

(5)将吸附柱置于收集管内，吸取离心后的上清加入吸附柱中，10,000g离心1min，弃滤液；

(6)向吸附柱中加入700μL的DNA Wash Buffer，10,000g离心1min，弃滤液。重复一次；

(7)将空吸附柱放回收集管中，13,000g离心2min，将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，打开管盖干燥吸附柱1min，挥干吸附柱中残留的漂洗液；

(8)向吸附柱的膜中央加入50μL预热至55℃的无菌水，静置2min，13,000g离心1min。弃去吸附柱，得到质粒pClone007-PpUGT73E5，保存于-20℃待用。

3.蛋白表达

3.1原核表达载体构建

以包含目的基因PpUGT73E5开放阅读框的pClone007载体(pClone007-PpUGT73E5)为模板，采用重组引物PpUGT73E5-pGEX-F(SEQ ID NO:5)和PpUGT73E5-pGEX-R(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增，除模板和引物不同以外，反应体系和反应条件同上述2.3，获得用于构建表达载体的基因片段。以pGEX-6p-1作为原核表达载体。pGEX-6p-1载体用EcoRⅠ (Thermo，货号：FD0274)和SalⅠ(Thermo，货号：FD0644)快速内切酶线性化，酶切体系如下：

酶切条件：37℃反应1h后终止。

将PCR扩增产物和线性化的pGEX-6p-1载体通过琼脂糖凝胶电泳检测后回收。使用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit试剂盒(vazyme，货号：C112-02)按照试剂盒说明书对回收的基因片段和线性化pGEX-6p-1载体进行同源重组，将基因的ORF克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中，反应体系如下：

反应条件：37℃反应30min，然后降至4℃或置于冰上冷却。采用热激法将得到的反应产物转化大肠杆菌DH5α，转化方法同上述2.6。过夜培养后，挑取单菌落，加入含有Amp 抗性(100mg/L)的500μL LB液体培养基中，37℃ 180rpm培养4h，菌液PCR鉴定，鉴定引物为pGEX-F/R(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)，将鉴定结果为阳性的单克隆送睿博兴科生物技术有限公司进行测序。对测序结果正确的阳性克隆保菌后提取质粒 pGEX-PpUGT73E5，质粒提取方法同上述2.7。用提取的质粒pGEX-PpUGT73E5转化大肠杆菌Rosetta(DE3)表达感受态细胞(上海唯地生物，CAT#:EC1010)。同时设置空载对照：使用pGEX-6p-1空载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)表达感受态细胞。转化方法同上述2.6。

3.2蛋白诱导表达

按1:100的体积比将含有pGEX-PpUGT73E5表达载体的Rossetta(DE3)菌液和含有pGEX-6p-1空载体的Rossetta(DE3)菌液分别接种于1L含有Amp抗性(100mg/L)的LB 液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，然后16℃，160rpm摇床培养过夜，诱导蛋白表达。4℃，4,000rpm离心收集培养好的菌体，加入10mL 4℃预冷的PBS溶液(0.01M，pH 7.4)重悬菌体，冰上超声破碎至溶液呈半透明状。将超声破碎产物于4℃，12,000rpm离心15min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE电泳检测。

3.3蛋白纯化

配制平衡液/洗杂液(平衡液和洗杂液的配方一样)和洗脱液，并在使用前加入DTT至终浓度为1mmol/L。平衡液/洗杂液(1L)：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄， 1.8mMKH₂PO₄，pH 7.4。洗脱液(1L)：50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0。

(1)将Glutathione Beads(常州天地人和生物科技有限公司，货号：SA008010)装入合适的层析柱，用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用；

(2)将样品加到平衡好的Glutathione Beads中，保证目的蛋白与GlutathioneBeads充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液；

(3)用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液；

(4)使用5倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分；

(5)依次使用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水平衡填料；

(6)将纯化后的蛋白液加入millipore 15mL超滤管(10KD)中，于4℃，4,000rpm离心浓缩样品至500μL，加入15mL PBS磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)，继续浓缩至500μL。

重复一次；

(7)吸取纯化的蛋白，稀释后加入甘油至终浓度10％(v/v)，-80℃保存。

SDS-PAGE检测结果如图2所示，1为pGEX-6p-1空载体重组菌诱导后的全细胞蛋白，2 为未经诱导的PpUGT73E5重组菌全细胞蛋白；3为IPTG诱导后的PpUGT73E5重组菌上清蛋白；4为纯化后的PpUGT73E5蛋白。与空载体对照和未经诱导的对照样品相比，重组蛋白在70-80KDa附近均出现了明显条带。PpUGT73E5蛋白包含465个氨基酸，与GST标签融合后的分子量为78.64KDa。

实施例2.糖基转移酶PpUGT73E5的功能鉴定

步骤一：酶活性检测

PpUGT73E5蛋白的酶活实验：准确称取400μg甾体皂苷元(薯蓣皂苷元/偏诺皂苷元)， 570μg UDP-葡萄糖，50μL纯化后的PpUGT73E5蛋白溶液(1mg/mL)，溶于PBS磷酸缓冲液(0.01M，pH 8.0)中，使终体积达到300μL。置于37℃反应2h后，加入与反应体系等体积的甲醇终止酶活，将产物减压旋干后，溶于500μL色谱甲醇中待测。

设置空载体对照：用pGEX-6p-1空载体的原核表达产物(即：含有pGEX-6p-1空载体的 Rosetta(DE3)细胞经蛋白诱导表达和蛋白纯化后得到的蛋白)代替PpUGT73E5蛋白进行酶活实验，方法和步骤同上述PpUGT73E5蛋白的酶活实验。

标准品溶液配制：称取薯蓣皂苷元，加入色谱甲醇中，配制成1mmol/L的薯蓣皂苷元标准品溶液。称取延龄草苷，加入色谱甲醇中，配制成1mmol/L的延龄草苷标准品溶液。称取偏诺皂苷元，加入色谱甲醇中，配制成1mmol/L的偏诺皂苷元标准品溶液。

步骤二：HPLC及LC-Q-TOF鉴定PpUGT73E5酶产物

(1)液相色谱

本实验使用Thermo UltiMate 3000液相色谱仪，Thermo Hypersil GOLD C₁₈液相色谱柱 (250mm×4.6mm，5μm)进行HPLC检测。流动相为水(A)和乙腈(B)。洗脱梯度：0～6min，20％～30％B；6～15min，30％～60％B；15～21min，60％～100％B；21～30min，100％B，30～35min，100％～20％B。流速1mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长：210nm。

(2)质谱检测

本实验使用AB SCIEX TripleTOF 6600超高分辨质谱仪进行检测。正离子数据采集模式，条件为：毛细管电压3.6kV，锥孔电压35kV，离子源温度105℃，脱溶剂气温度340℃，反向锥孔气流55L/h，脱溶剂气650L/h，萃取锥孔4V。质荷比数据扫描范围：50-1500m/z。

结果与分析：

将PpUGT73E5蛋白与薯蓣皂苷元、UDP-葡萄糖反应的产物用真空浓缩仪干燥，加入500 μL色谱甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测，结果如图3A所示，与空载体对照的反应产物相比，PpUGT73E5的产物在22.3min出现了新峰(product 1)，与延龄草苷(trillin) 标准品出峰时间相同。TOF正离子扫描模式检测结果见图3B，product 1的分子量大小为577.37 [M+H]⁺，与延龄草苷分子量(576.3)一致，表明薯蓣皂苷元经过PpUGT73E5催化后生成了延龄草苷。

将PpUGT73E5蛋白与偏诺皂苷元、UDP-葡萄糖反应的产物用真空浓缩仪干燥，加入500 μL色谱甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测，结果如图4A所示，与空载体对照的反应产物相比，PpUGT73E5的产物在18.9min出现了新峰(product 2)。TOF正离子扫描模式检测结果见图4B，product 2的分子量大小为593.37[M+H]⁺，与偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷分子量(592.3)一致，表明偏诺皂苷元经过PpUGT73E5催化后生成了偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷。

步骤三：PpUGT73E5酶产物的进一步糖基化反应

利用我们前期发现的一种糖基转移酶AsUGT73E1对上述步骤一所得到的PpUGT73E5酶产物进行如下糖基化反应。

第二步糖基化反应：重复上述步骤一中的糖基化反应，将产物浓缩干燥后全部用作底物，加入550μg UDP-鼠李糖，50μL纯化的糖基转移酶AsUGT73E1(1mg/mL)，溶于PBS磷酸缓冲液(0.01M，pH 8.0)中，使终体积达到300μL。置于37℃反应2h后，加入与反应体系等体积的甲醇终止酶活，产物减压旋干后，溶于500μL色谱甲醇中待测。

标准品溶液配制：称取重楼皂苷V，加入色谱甲醇中，配制成1mmol/L的重楼皂苷V标准品溶液。称取重楼皂苷Ⅵ，加入色谱甲醇中，配制成1mmol/L的重楼皂苷Ⅵ标准品溶液。

液相色谱和质谱检测：方法和步骤同上述步骤二。

结果与分析：

将PpUGT73E5蛋白与薯蓣皂苷元、UDP-葡萄糖反应的产物用真空浓缩仪干燥回收后，加入AsUGT73E1蛋白和UDP-鼠李糖继续反应。如图5A所示，AsUGT73E1蛋白的产物在20.7min出现了新产物峰(product 3)，时间与重楼皂苷V标准品相符。TOF正离子扫描模式检测见图5B，product 3的分子量大小为723.43[M+H]⁺，与重楼皂苷V(722.4)的分子量一致，表明薯蓣皂苷元经过PpUGT73E5和AsUGT73E1的连续催化后生成了重楼皂苷V。

将PpUGT73E5蛋白与偏诺皂苷元、UDP-葡萄糖反应的产物用真空浓缩仪干燥回收后，加入AsUGT73E1蛋白和UDP-鼠李糖继续反应。如图6A所示，AsUGT73E1蛋白的产物在17.1min出现了新产物峰(product 4)，时间与重楼皂苷Ⅵ标准品相符。TOF正离子扫描模式检测见图6B，product 4的分子量大小为739.43[M+H]⁺，与重楼皂苷Ⅵ(738.4)的分子量一致，表明偏诺皂苷元经过PpUGT73E5和AsUGT73E1的连续催化后生成了重楼皂苷Ⅵ。

PpUGT73E5蛋白催化甾体皂苷元糖基化的过程见图7。AsUGT73E1蛋白催化延龄草苷和偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷糖基化的过程见图8。

糖基转移酶AsUGT73E1的基因克隆与蛋白表达

我们以燕麦为模式材料，发现了糖基转移酶基因AsUGT73E1。AsUGT73E1基因的开放阅读框含有1473个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码的氨基酸序列如SEQID NO:12所示。

糖基转移酶AsUGT73E1的基因克隆与蛋白表达的过程记载在申请号为2020112516647，发明名称为“燕麦糖基转移酶AsUGT73E1及其在甾体皂苷合成中的应用”的中国发明专利申请中，在此通过引用将该专利申请的全部内容包含于本文中。AsUGT73E1的基因克隆与蛋白表达方法如下。

1.AsUGT73E1基因克隆

RNA提取：采用天根生物公司的RNAprep Pure Plant Kit试剂盒(货号：DP441)，按照试剂盒使用说明书提取燕麦幼苗叶片的总RNA。操作步骤同实施例1中的2.1。实验中使用的燕麦材料为二倍体燕麦(Avena strigosa，S75)，已知品种，记载在非专利文献“Papadopoulou, K.,Melton,R.E.,Leggett,M.,Daniels,M.J.,&Osbourn,A.E.(1999).Compromised disease resistance in saponin-deficient plants.Proceedings ofthe National Academy of Sciences,96(22), 12923-12928”中。该生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

cDNA合成：采用SuperScriptⅢRreverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen，货号： 18080085)按照试剂盒说明书对提取的燕麦幼苗叶片总RNA进行cDNA合成。操作步骤同实施例1中的2.2。

基因扩增：设计AsUGT73E1基因编码区引物AsUGT73E1-ORF-F/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。以5倍稀释后的燕麦幼苗cDNA作为模板，使用引物AsUGT73E1-ORF-F/R和2×Phanta Max Master Mix高保真酶(vazyme，货号：P515-02)对目的基因AsUGT73E1进行PCR扩增。除模板和引物不同以外，反应体系和反应条件同实施例1中的2.3。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示AsUGT73E1 基因条带大小为1500bp左右。

基因回收：使用Gel Extraction Kit(Omega，货号：D2500-02)试剂盒，按照试剂盒说明书回收AsUGT73E1目的基因。操作步骤同实施例1中的2.4。

克隆载体构建：将目的基因AsUGT73E1克隆至pClone007 Blunt Simple Vector(北京擎科生物，货号：TSV-007BS)中。除目的基因不同以外，克隆载体连接的反应体系和反应条件同实施例1中的2.5。

大肠杆菌转化：将基因AsUGT73E1与载体pClone007 Blunt Simple Vector的连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α，转化方法同实施例1中的2.6。菌液PCR鉴定，鉴定引物为 M13-F/R(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)，将鉴定结果为阳性的单克隆送睿博兴科生物技术有限公司测序，得到测序正确的阳性克隆。

质粒提取：培养测序正确的阳性克隆，然后使用E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅠ试剂盒(omega，货号：D6942-02)，按照试剂盒说明书提取得到质粒pClone007-AsUGT73E1。操作步骤同实施例1中的2.7。

2.蛋白表达与纯化

原核表达载体构建：以质粒pClone007-AsUGT73E1为模板，采用重组引物AsUGT73E1-pGEX-F/R(核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示)进行PCR扩增。除模板和引物不同以外，反应体系和反应条件同实施例1中的2.3，获得用于构建表达载体的基因片段。以pGEX-6p-1作为原核表达载体。pGEX-6p-1载体用EcoRⅠ(Thermo，货号：FD0274)和SalⅠ(Thermo，货号：FD0644)快速内切酶线性化，酶切体系和酶切条件同实施例1中的3.1。将PCR扩增产物和线性化的pGEX-6p-1载体通过琼脂糖凝胶电泳检测后回收。使用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit试剂盒(vazyme，货号：C112-02)按照试剂盒说明书对回收的基因片段和线性化pGEX-6p-1进行同源重组，将AsUGT73E1基因的ORF克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中。除基因片段不同以外，同源重组的反应体系和反应条件同实施例1中的3.1。将得到的反应产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，将鉴定结果为阳性的单克隆进行测序，测序结果正确的样品保菌后提取质粒pGEX-AsUGT73E1，用提取的质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)表达感受态细胞(上海唯地生物，CAT#:EC1010)。大肠杆菌转化、阳性克隆鉴定以及质粒提取的方法和步骤同实施例1中的3.1。

蛋白诱导表达：按1:100的体积比将含有pGEX-AsUGT73E1的Rossetta(DE3)菌液接种于1L含有Amp抗性(100mg/L)的LB液体培养基中进行蛋白诱导表达，方法和步骤同实施例1中的3.2。

蛋白纯化：对诱导表达的AsUGT73E1蛋白进行纯化，方法和步骤同实施例1中的3.3。 AsUGT73E1基因表达产物的SDS-PAGE检测结果如图9所示，1为未经诱导的全细胞蛋白； 2为IPTG诱导后的全细胞蛋白；3为IPTG诱导后的细胞上清；4为IPTG诱导后的细胞沉淀； 5为细胞上清GST柱纯化的蛋白；6为超滤浓缩后的纯化蛋白。与未经诱导的对照样品相比，重组蛋白在80KDa附近出现了明显条带。AsUGT73E1蛋白包含490个氨基酸，与GST标签融合后的分子量为79.79KDa。

参考文献：

Cárdenas,P.D.,Sonawane,P.D.,Heinig,U.,Bocobza,S.E.,Burdman,S.,&Aharoni,A.(2015). The bitter side of the nightshades:Genomics drivesdiscovery in Solanaceae steroidal alkaloid metabolism.Phytochemistry,113,24-32.

Christ,B.,Xu,C.C.,Xu,M.L.,Li,F.S.,Wada,N.,Mitchell,A.J.,…&Weng,J.K.(2019). Repeated evolution of cytochrome P450-mediated spiroketal steroidbiosynthesis in plants. Nature Communications,10,3206.

Deng,D.,Lauren,D.R.,Cooney,J.M.,Jensen,D.J.,Wurms,K.V.,Upritchard,J.E.,…&Li,M.Z. (2008).Antifungal saponins from Paris polyphylla Smith.PlantaMedica,74(11),1397-1402.

Gong,G.H.,Qin,Y.,Huang,W.,Zhou,S.,Wu,X.H.,Yang,X.H,…&Li.D.(2010).Protective effects of diosgenin in the hyperlipidemic rat model and in humanvascular endothelial cells against hydrogen peroxide-inducedapoptosis.Chemico-Biological Interactions,184(3), 366-375.Journal ofagricultural and food chemistry,64(7),1549-1556.

He,J.L.,Yu,S.,Guo,C.J.,Tan,L.,Song,X.M.,Wang,M.,…&Peng,C.(2019).Polyphyllin I induces autophagy and cell cycle arrest via inhibiting PDK1/Akt/mTOR signal and downregulating cyclin B1 in human gastric carcinoma HGC-27cells.Biomedicine& Pharmacotherapy,117,109189.

Qin,X.J.,Sun,D.J.,Ni,W.,Chen,C.X.,Hua,Y.,He,L.,&Liu,H.Y.(2012).Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves ofParis polyphylla var.yunnanensis. Steroids,77(12),1242-1248.

Teng,J.F.,Qin,D.L.,Mei,Q.B.,Qiu,W.Q.,Pan,R.,Xiong,R.,…&Wu.,A.G.(2019). Polyphyllin VI,a saponin from Trillium tschonoskii Maxim.inducesapoptotic and autophagic cell death via the ROS triggered mTOR signalingpathway in non-small cell lung cancer. Pharmacological Research,147,104396.

Wang,G.X.,Han,J.,Zhao,L.W.,Jiang,D.X.,Liu,Y.T.,&Liu,X.L.(2010).Anthelmintic activity of steroidal saponins from ParisPolyphylla.Phytomedicine,17(14),1102-1105.

Xue,Z.Y.,Tan,Z.W.,Huang,A.C.,Zhou,Y.,Sun,J.C.,Wang,X.N.,…&Qi,X.Q.(2018). Identification of key amino acid residues determining productspecificity of 2,3-oxidosqualene cyclase in Oryza species.New Phytologist,218(3):1076-1088.

Yan,Y.M.,Shen,X.,Cao,Y.K.,Zhang,J.J.,Wang,Y.,&Cheng,Y.X.(2020).Discovery of Anti-2019-nCoV Agents from 38Chinese Patent Drugs towardRespiratory Diseases via Docking Screening.Preprints,2020020254(doi:10.20944/preprints202002.0254.v2).

Zhang,C.,Jia,X.J.,Bao,J.L.,Chen,S.H.,Wang,K.,Zhang,Y.L.,…&He,C.W.(2016). Polyphyllin VII induces apoptosis in HepG2 cells through ROS-mediatedmitochondrial dysfunction and MAPK pathways.BMC Complementary and AlternativeMedicine,16(58)。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用

<130> P210032-DBL

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> 滇重楼(Paris polyphylla SMITH var. yunnanensis (FRANCH.) Hand.-Mazz)

<400> 1

Met Ala Arg Leu Leu Ala Glu Arg Asp Gly Ile His Val Thr Val Ala

1 5 10 15

Ile Ser Pro Val Gly Ala Glu Arg Ile Arg Ser Cys Phe Ile Glu Pro

20 25 30

Val Ala Ala Ala Lys Leu Pro Ile Ser Phe Leu Glu Leu Pro Phe Pro

35 40 45

Cys Ala Glu Ala Gly Leu Pro Asp Gly Val Glu Thr Ile Glu Gln Ile

50 55 60

Gln Asp Pro Ser Leu Phe Pro Lys Met His Val Ala Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

Arg Lys Pro Leu Glu Ser Lys Leu Arg Glu Leu Pro Arg Lys Pro Ser

85 90 95

Val Ile Leu Ala Asp Leu Tyr His Pro Trp Ala Arg Glu Val Ala Ala

100 105 110

Asp Phe Cys Val Pro Leu Leu Leu Tyr Tyr Val Phe Pro Cys Phe Thr

115 120 125

Ile Leu Val Tyr Arg Ser Leu Arg Gln His Gly Ile Tyr Asp Asp Gly

130 135 140

Ala Ala Asp Ala Ser Arg Met Phe Pro Val Pro Asp Ala Pro Glu Tyr

145 150 155 160

Met Val Ser Arg Ala Gln Ala Pro Gly Thr Phe Asp Arg Pro Gly Trp

165 170 175

Glu Trp Leu Arg Glu Glu Ala Ile Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Gly

180 185 190

Val Ile Phe His Ser Phe Asp Gln Leu Glu Pro Asn Phe Leu Pro Lys

195 200 205

Phe Gln Glu Ile Met Gly Gly Leu Lys Thr Trp Ala Ile Gly Pro Leu

210 215 220

Ser Leu Ser His Lys Asn Val Leu Ala Glu Arg Gly Ser Ala Asn Ala

225 230 235 240

Val Ala Ala Asp Arg Cys Leu Thr Trp Leu Asp Ala Asn Pro Pro Ala

245 250 255

Ser Val Ile Tyr Val Cys Phe Gly Thr Asn Thr Tyr Trp Thr Pro Gln

260 265 270

Gln Ile Ile Glu Val Gly Ser Gly Ile Glu Ser Ser Gly His Pro Phe

275 280 285

Ile Trp Val Leu Lys Lys Arg Glu Leu Thr Pro Glu Val Glu Glu Phe

290 295 300

Leu Ser Gly Gly Phe Glu Glu Arg Val Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile

305 310 315 320

Arg Gly Trp Ala Pro Gln Ala Ala Ile Leu Thr His Lys Ser Ile Gly

325 330 335

Gly Phe Met Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Ser Ile Glu Gly Val Ala

340 345 350

Ala Gly Val Pro Met Leu Thr Trp Pro His Phe Glu Asp Gln Phe Leu

355 360 365

His Gln Met Ile Ile Val Gln Val Leu Gly Met Gly Ile Gly Val Gly

370 375 380

Val Arg Ala Gln Glu Asp Tyr Ile Ala Gln Val Met Asp Thr Ile Lys

385 390 395 400

Arg Glu Gln Val Glu Lys Ala Val Arg Glu Leu Met Gly Gly Gly Glu

405 410 415

Glu Ala Asp Ala Arg Arg Arg Lys Ala Lys Glu Tyr Gly Glu Lys Ala

420 425 430

Arg Lys Ala Met Glu Val Gly Gly Ser Ser Tyr Val Asn Leu Thr Glu

435 440 445

Val Ile Asp Ser Val Pro Phe Val Ala Ala Ile Glu Asn Gly Gly Gly

450 455 460

Asp

465

<210> 2

<211> 1398

<212> DNA

<213> 滇重楼(Paris polyphylla SMITH var. yunnanensis (FRANCH.) Hand.-Mazz)

<400> 2

atggcccgcc tcctcgctga gcgggacggc atccacgtaa ccgtggccat ctcccccgtg 60

ggcgcggaac gcatccggag ctgcttcata gagcccgtgg ccgccgcgaa gctccccatc 120

tccttcctcg agcttccctt cccctgcgcc gaagccggcc tccctgacgg cgtggagacc 180

atcgagcaaa tccaggaccc ctcactcttc cccaagatgc acgtggccgc cggcctcctc 240

cgcaaaccac tcgagtccaa actccgagag ctcccccgca agccctccgt catcctcgct 300

gacctctacc acccatgggc gcgggaagtc gccgccgact tctgcgtccc actgctgctc 360

tactacgtgt tcccctgctt caccatcctc gtctaccgca gtctgagaca acatggtatc 420

tacgatgacg gcgcggcgga cgcgagtcgg atgttcccgg tgcccgatgc cccggagtac 480

atggtcagcc gggcacaggc gccggggacc ttcgacaggc ccgggtggga gtggcttcgc 540

gaggaggcta ttgcagccga gtccgccgcc gccggggtta tttttcacag cttcgaccag 600

ctcgagccca atttcctccc caagttccag gagatcatgg gtggcctgaa gacgtgggcc 660

atcggcccgc tgtccctcag ccacaagaac gtgctggctg agcgcgggag cgcaaatgca 720

gtggccgccg accgctgcct cacctggctc gacgccaacc cccccgcctc tgtcatctac 780

gtctgcttcg gcaccaacac atactggacc cctcagcaga ttattgaggt cgggtccggg 840

atagagagct cgggccaccc cttcatctgg gtgctgaaga agcgggagct gacgcccgag 900

gtggaggagt tcctgtcggg agggttcgag gagcgggtgc aggaccgagg cctgctcatc 960

aggggatggg cccctcaggc ggccatactg acccataagt caatcggggg attcatgacg 1020

catggcgggt ggaactcgtc gatcgagggg gtggcggccg gggtgccaat gctgacgtgg 1080

ccgcacttcg aggaccagtt cctgcaccag atgatcatcg ttcaggtgct agggatgggg 1140

atcggagtag gggtgcgggc gcaggaggac tacatcgcgc aggtgatgga caccatcaag 1200

cgggagcagg tcgagaaggc ggtcagagag ctgatgggag gaggggagga agctgacgcg 1260

aggaggagga aggcgaagga gtacggggag aaggcgagga aggccatgga ggtcgggggg 1320

tcgtcttacg tgaacctgac cgaagtgatc gactccgttc cgttcgtcgc cgccatcgag 1380

aatggtggcg gtgactaa 1398

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcccgcc tcctcgct 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagtcaccg ccaccattct 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcccctggga tccccggaat tcatggcccg cctcctcgct 40

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgatgcggcc gctcgagtcg acttagtcac cgccaccatt ct 42

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagcaagtat atagcatggc c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggagctgcat gtgtcagagg 20

<210> 11

<211> 1473

<212> DNA

<213> 燕麦(Avena strigosa)

<400> 11

atggttgcca gccgtgtgaa gaagctgcgt gtcctgctca ttcccttctt cgcgacaagc 60

cacatcgagc cctacaccga gctcgccatc cgcctcgccg gcgccaagcc ggactacgcc 120

gtggagccaa caattgcggt gacgccggcg aacgtcccaa tcgtccagtc cttgctggag 180

cgacgcggac agcaggggcg catcaagatc gcgacgtacc cgttcccggc cgtggagggc 240

ctcccggcgg gcgtggagaa cctgggcaag gtcgcggcgg ccgacgcctg gcgcatcgac 300

gcggccgcca tcagcgacac cctgatgcgg cccgcgcagg aggcgctggt gagggcgcag 360

tcccccgacg ccatggtcgc cgacccgcac ttctcctggc aggccggcat cgccgccgat 420

ctgggcgtgc cgctggtgtc gttcagcgtg gtgggcgcct tctcggggct cgtcatgggc 480

aaactcatgg cctacggcgc cgtcgaggac ggcgaagacg ccgttacgat ccctcagttt 540

ccccttccgg agatacggat accggtgacc gagctgccgg agttcctgag gacccacctg 600

ctcgagcgtg acgggaagga cgtcgatagc atcggcaaag tttcggtggg acagaatttc 660

ggcctcgcca tcaacacggc gtcgcacctg gagcagcagt actgcgagat gcacaccagc 720

ggcggccaaa tcaagcgagc ctacttcgtg gggcccctct cgctgggagc cgaagcagtt 780

gcccccggcg gcggcggcgg cgagacacag gcgccgccgt gcatccgttg gctggactcg 840

aagccggacc ggtcggtggt gtacctgtgc ttcgggagcc tgacccacgt ctcggacgcg 900

cagctggacg agctggctct cgggctggag gcgtccggga aggcgttcct gtgggtggtg 960

agggcggcgg aggcgtggcg gccgccggcg gggtgggcgg agcgcgtgca ggacaggggg 1020

atgctcctga ccgcctgggc cccgcagacc gccatcctgg gccaccgcgc cgtgggcgcc 1080

ttcgtgacgc actgcgggtg gaactcggtg ctggaggcgg tggcggcggg gctgccggtg 1140

ctgacgtggc cgatggtgtt cgagcagttc atcacggaga ggctggtgac ggaggtgatg 1200

gggatcgggg agcggttctg gccggagggc gccggacggc ggagcaccag gtacgaagag 1260

cacgggctgg tcccggcgga ggacgtggcg cgggcggtga caacgttcat gtgccccgga 1320

ggagcagggg acgccaagag gcagagggcg atggagctcg ccgccgagtc tcgtgcggcc 1380

atggcggaag gaggctcgtc gcaccgtgat ctgtgccgcc tcgttgacga tctcgtcgca 1440

gctaagctag agagagagca ggtgcctagc tag 1473

<210> 12

<211> 490

<212> PRT

<213> 燕麦(Avena strigosa)

<400> 12

Met Val Ala Ser Arg Val Lys Lys Leu Arg Val Leu Leu Ile Pro Phe

1 5 10 15

Phe Ala Thr Ser His Ile Glu Pro Tyr Thr Glu Leu Ala Ile Arg Leu

20 25 30

Ala Gly Ala Lys Pro Asp Tyr Ala Val Glu Pro Thr Ile Ala Val Thr

35 40 45

Pro Ala Asn Val Pro Ile Val Gln Ser Leu Leu Glu Arg Arg Gly Gln

50 55 60

Gln Gly Arg Ile Lys Ile Ala Thr Tyr Pro Phe Pro Ala Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Ala Gly Val Glu Asn Leu Gly Lys Val Ala Ala Ala Asp Ala

85 90 95

Trp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Ile Ser Asp Thr Leu Met Arg Pro Ala

100 105 110

Gln Glu Ala Leu Val Arg Ala Gln Ser Pro Asp Ala Met Val Ala Asp

115 120 125

Pro His Phe Ser Trp Gln Ala Gly Ile Ala Ala Asp Leu Gly Val Pro

130 135 140

Leu Val Ser Phe Ser Val Val Gly Ala Phe Ser Gly Leu Val Met Gly

145 150 155 160

Lys Leu Met Ala Tyr Gly Ala Val Glu Asp Gly Glu Asp Ala Val Thr

165 170 175

Ile Pro Gln Phe Pro Leu Pro Glu Ile Arg Ile Pro Val Thr Glu Leu

180 185 190

Pro Glu Phe Leu Arg Thr His Leu Leu Glu Arg Asp Gly Lys Asp Val

195 200 205

Asp Ser Ile Gly Lys Val Ser Val Gly Gln Asn Phe Gly Leu Ala Ile

210 215 220

Asn Thr Ala Ser His Leu Glu Gln Gln Tyr Cys Glu Met His Thr Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gln Ile Lys Arg Ala Tyr Phe Val Gly Pro Leu Ser Leu Gly

245 250 255

Ala Glu Ala Val Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Thr Gln Ala Pro

260 265 270

Pro Cys Ile Arg Trp Leu Asp Ser Lys Pro Asp Arg Ser Val Val Tyr

275 280 285

Leu Cys Phe Gly Ser Leu Thr His Val Ser Asp Ala Gln Leu Asp Glu

290 295 300

Leu Ala Leu Gly Leu Glu Ala Ser Gly Lys Ala Phe Leu Trp Val Val

305 310 315 320

Arg Ala Ala Glu Ala Trp Arg Pro Pro Ala Gly Trp Ala Glu Arg Val

325 330 335

Gln Asp Arg Gly Met Leu Leu Thr Ala Trp Ala Pro Gln Thr Ala Ile

340 345 350

Leu Gly His Arg Ala Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn

355 360 365

Ser Val Leu Glu Ala Val Ala Ala Gly Leu Pro Val Leu Thr Trp Pro

370 375 380

Met Val Phe Glu Gln Phe Ile Thr Glu Arg Leu Val Thr Glu Val Met

385 390 395 400

Gly Ile Gly Glu Arg Phe Trp Pro Glu Gly Ala Gly Arg Arg Ser Thr

405 410 415

Arg Tyr Glu Glu His Gly Leu Val Pro Ala Glu Asp Val Ala Arg Ala

420 425 430

Val Thr Thr Phe Met Cys Pro Gly Gly Ala Gly Asp Ala Lys Arg Gln

435 440 445

Arg Ala Met Glu Leu Ala Ala Glu Ser Arg Ala Ala Met Ala Glu Gly

450 455 460

Gly Ser Ser His Arg Asp Leu Cys Arg Leu Val Asp Asp Leu Val Ala

465 470 475 480

Ala Lys Leu Glu Arg Glu Gln Val Pro Ser

485 490

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggttgcca gccgtgtga 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctagctaggc acctgctct 19

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcccctggga tccccggaat tcatggttgc cagccgtgtg a 41

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgatgcggcc gctcgagtcg acctagctag gcacctgctc t 41

Claims

1.一种糖基转移酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：

a1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2.将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有糖基转移酶活性的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的糖基转移酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、载体或重组菌。

5.权利要求1所述的糖基转移酶的制备方法，包括如下步骤：构建权利要求2或3所述基因的表达载体，将表达载体导入表达宿主菌中，获得重组菌，培养重组菌并诱导蛋白表达。

6.权利要求1所述的糖基转移酶在糖基转移反应中的用途。

7.权利要求1所述的糖基转移酶在甾体皂苷合成中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述甾体皂苷包括延龄草苷、偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷、重楼皂苷V和重楼皂苷Ⅵ。

9.一种合成重楼皂苷V的方法，包括如下步骤：利用权利要求1所述的糖基转移酶与薯蓣皂苷元、UDP-葡萄糖反应生成延龄草苷；然后以延龄草苷为底物，加入氨基酸序列如SEQID NO:12所示的酶蛋白和UDP-鼠李糖继续反应，生成重楼皂苷V。

10.一种合成重楼皂苷Ⅵ的方法，包括如下步骤：利用权利要求1所述的糖基转移酶与偏诺皂苷元、UDP-葡萄糖反应生成偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷；然后以偏诺皂苷元-3-O-葡糖苷为底物，加入氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的酶蛋白和UDP-鼠李糖继续反应，生成重楼皂苷Ⅵ。