CN105177100A - 一组糖基转移酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组糖基转移酶及其应用。具体地，提供了糖基转移酶gGT29-7及其衍生多肽在萜类化合物糖基化催化及新皂苷合成中的应用，其中，糖基转移酶能特异和高效地将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链。本发明糖基转移酶还可应用于构建人工合成稀有人参皂苷及多种新人参皂苷及其衍生物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本发明涉及一组新的糖基转移酶及其应用。
背景技术
人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心、护肝等功能。
人参皂苷Rg3、Rf和Rg2均为稀有人参皂苷，分别具有非常强大的上述生理活性。例如，人参皂苷Rg3具有很好的抗肿瘤活性，可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果；人参皂苷Rf具有抗肿瘤,抗疲劳的功效,能够减少子宫收缩,且起到与脑神经细胞有关联的镇痛作用，同时具有调节磷脂蛋白代谢的生理功能；人参皂苷Rg2对阿尔茨海默病大鼠大脑具有保护作用，可以增强大鼠学习记忆能力，同时对心肌损伤具有修复作用，此外人参皂苷Rg2还具有保护细胞受到紫外线伤害的作用。
然而，由于这些低度糖基化的稀有人参皂苷在天然人参中非常容易被糖基转移酶修饰并产生含复杂糖链的人参皂苷，因此，这些具有高生物活性的人参皂苷在人参中含量极低。
目前，生产这类稀有人参皂苷的方法是从人参中的大量人参皂苷出发，通过选择性水解糖基的方法进行转化后再进行提取和纯化。以人参属植物的总皂苷或原人参二醇类皂苷为原料，通过化学，酶法转化、分离和提取。由于化学制备方法原料损失较大，操作繁琐，副产物多，从而导致成本增加，而且难以提高产率。此外，由于人参总皂苷的获得依赖于人参的种植，所以导致用传统方法生产的稀有人参皂苷单体市场价格高昂。
目前本领域尚缺乏一种有效的生产稀有人参皂苷Rg3、Rf和Rg2的方法，因此迫切需要开发多种特异高效的糖基转移酶。
发明内容
本发明的目的就是提供一组糖基转移酶及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种体外糖基化方法，包括步骤：
在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：
C-3和/或C-6位的第一个糖基上；
从而形成糖基化的四环三萜类化合物；
其中，所述的糖基转移酶为如SEQIDNO.:61所示的糖基转移酶或其衍生多肽。
在另一优选例中，所述的延伸糖链包括直接延伸或置换延伸。
在另一优选例中，所述的直接延伸为在C-3和/或C-6位的第一个糖基上添加一个糖基以延伸糖链。
在另一优选例中，所述的置换延伸为将C-3和/或C-6位糖链的末端糖基置换成不同的糖基，从在C-3和/或C-6位的第一个糖基上延伸糖链。
在另一优选例中，所述的衍生多肽选自：
将SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；或
氨基酸序列与SEQIDNO.:61氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
在另一优选例中，所述的衍生多肽包括选自SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95的任一所示序列。
本发明第二方面，提供了一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：
(a)具有SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；
(d)氨基酸序列与SEQIDNO.:61氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
在另一优选例中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的衍生多肽包括选自SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：
(A)编码权利要求3所述多肽的核苷酸序列；
(B)编码如SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；
(C)如SEQIDNO.:60所示的核苷酸序列；
(D)与SEQIDNO.:60所示序列的同源性≥90％(较佳地≥91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列；
(E)在SEQIDNO.:60所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；
(F)与(A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
在另一优选例中，序列如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示的多核苷酸编码氨基酸序列分别如SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示的多肽。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有第三方面所述的多核苷酸。较佳地，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在本发明的第五方面，提供了本发明第一或第二方面所述分离的多肽的用途，它被用于催化以下一种或多种反应，或被用于制备催化以下一种或多种反应的催化制剂：将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位或C6位的第一个糖基上以延伸糖链；优选地，
它被用于催化以下一种或多种体外反应，或被用于制备催化以下一种或多种反应的催化制剂：
(i)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位的第一个糖基上，延伸糖链；
(ii)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的第一个糖基上，延伸糖链；
(iii)将来之糖基供体的糖基与四环三萜类化合物的C-6位糖链的末端糖基进行置换，从在C-3和/或C-6位的第一个糖基上延伸糖链。
在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的核苷二磷酸糖：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-乙酰基葡萄糖，ADP-乙酰基葡萄糖，TDP-乙酰基葡萄糖，CDP-乙酰基葡萄糖，GDP-乙酰基葡萄糖，UDP-木糖，ADP-木糖，TDP-木糖，CDP-木糖，GDP-木糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。
在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的尿苷二磷酸(UDP)糖：UDP-葡萄糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。
在另一优选例中，所述分离的多肽用于催化下述一种或多种反应或被用于制备催化下述一种或多种反应的催化制剂：
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，R5-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:61所示的多肽或其衍生多肽；优选地，选自26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95或其衍生多肽。
R1-R4经取代后的化合物如下表所示：
| 底物 | R1 | R2 | R3 | R4 |
| Rh2 | 糖基 | H | OH | H |
| F2 | 糖基 | H | OH | 糖基 |
即当R1为葡萄糖基；R2为H，R3为OH，R4为H，式(I)化合物为Rh2。
R1为葡萄糖基；R2为H，R3为OH，R4为葡萄糖基，式(I)化合物为F2。
当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物(I)化合物为Rh2，则产物式(II)化合物为Rg3；底物(I)化合物为F2，则产物式(II)化合物为Rd；
当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物(I)化合物为Rh2，则产物式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；底物(I)化合物为F2，则产物式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
其中，R1和R2为H或者糖基，R3和R4为糖基。R3-R4-O为C6第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选地，为SEQIDNO.:55，57，59，78，82，92，94或者95或其衍生多肽。
当R1和R2为H，R3为葡萄糖基时，式(III)化合物为Rh1。
当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物(III)化合物为Rh1，则产物式(IV)化合物为Rf；
当以UDP-鼠李糖作为糖基供体时，底物(III)化合物为Rh1，则产物式(IV)化合物为Rg2。
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，R5-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基；R6为糖基，R6-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、59、76、84、86或88所示的多肽。
R1为两个葡萄糖基，R2为H，R3为OH，R4为H，式(V)化合物为Rg3。
R1为两个葡萄糖基，R2为H，R3为OH，R4为葡萄糖基，式(V)化合物为Rd
当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物(V)化合物为Rg3，则产物式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；底物(V)化合物为Rd，则产物式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
在另一优选例中，所述的糖基选自：葡萄糖基、半乳糖醛酸基、木糖糖基，半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基，以及其他己糖基或戊糖基。
在另一优选例中，所述反应式(I)、或(III)化合物包括(但不限于)：S构型或R构型的达玛烷型四环三萜类化合物、羊毛脂烷型四环三萜类化合物、apotirucallane型四环三萜、甘遂烷型四环三萜类化合物、环阿屯烷(环阿尔廷烷)型四环三萜类化合物、葫芦烷四环三萜类化合物、或楝烷型四环三萜类化合物。
在另一优选例中，所述的多肽选自下组：
(a)具有SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95中任一条所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95中任一条所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；
(d)氨基酸序列与SEQIDNO：26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95中任一条中所示氨基酸序列的同源性≥85％或≥90％(较佳地≥95％)，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。
在另一优选例中，编码所述多肽的核苷酸所述的多核苷酸为选自下组的序列：
(A)编码本发明第二方面所述多肽的核苷酸序列；
(B)编码如SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示多肽的核苷酸序列；
(C)如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示的核苷酸序列；
(D)与SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示序列的同源性≥85％(较佳地较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列；
(E)在SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；
(F)与(A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
在另一优选例中，序列如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示的多核苷酸编码氨基酸序列分别如SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示的多肽。
在本发明的第六方面，提供了一种进行糖基转移催化反应的方法，包括步骤：在本发明第二方面所述的多肽或其衍生多肽存在的条件下，进行糖基转移催化反应。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
在糖基供体以及如本发明第二方面所述多肽及其衍生多肽的存在下，或式(I)化合物转化为所述的式(II)化合物，或式(III)化合物转化为所述的式(IV)化合物，或式(V)化合物转化为所述的式(VI)化合物；
在另一优选例中，所述的方法还包括将所述的多肽及其衍生多肽分别加入催化反应；和/或
将所述的多肽及其衍生多肽同时加入催化反应。
在另一优选例中，所述的方法还包括将编码糖基转移酶的核苷酸序列与达玛稀二醇和/或原人参二醇和/或原人参三醇合成代谢途径中的关键基因和/或其他糖基转移酶基因在宿主细胞中共表达，从而获得所述的式(II)、(IV)、或(VI)化合物。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为酵母菌或大肠杆菌。
在另一优选例中，所述的多肽为具有SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示氨基酸序列的多肽及其衍生多肽。
在另一优选例中，编码所述多肽的核苷酸序列如SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示。
在另一优选例中，所述方法还包括：向反应体系中提供用于调节酶活性的添加物。
在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物是：提高酶活性或抑制酶活性的添加物。
在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物选自下组：Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+。
在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物是：可以生成Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+的物质。
在另一优选例中，所述的糖基供体是核苷二磷酸糖，选自下组：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-乙酰基葡萄糖，ADP-乙酰基葡萄糖，TDP-乙酰基葡萄糖，CDP-乙酰基葡萄糖，GDP-乙酰基葡萄糖，UDP-木糖，ADP-木糖，TDP-木糖，CDP-木糖，GDP-木糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。
在另一优选例中，所述的糖基供体是尿苷二磷酸糖，选自下组：UDP-葡萄糖，UDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。
在另一优选例中，反应体系的pH为：pH4.0-10.0，优选pH为5.5-9.0。
在另一优选例中，反应体系的温度为：10℃-105℃，优选20℃-50℃。
在另一优选例中，所述的达玛稀二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因。
在另一优选例中，所述的原人参二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因和其的还原酶基因，或其组合。。
在另一优选例中，所述的原人参三醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、及细胞色素P450CYP716A53V2基因及其还原酶基因，或其组合。
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh2合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、四环三萜C-3位糖基转移酶基因UGTPg45，或其组合。
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh1合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、及细胞色素P450CYP716A53V2基因及其还原酶基因、四环三萜C-6位的糖基转移酶基因UGTPg100，或其组合。
在另一优选例中，所述糖基催化反应的底物分别为式(I)、或(III)化合物，且所述的产物分别为(II)、或(IV)化合物；
在另一优选例中，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rh2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rg3；
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rh2，并且式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷F2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rd；
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷F2，并且式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK；
或，所述的式(III)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(IV)化合物为人参皂苷Rf；
或，所述的式(III)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(IV)化合物为人参皂苷Rg2；
或，所述的式(V)化合物为人参皂苷Rg3，并且式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；
或，所述的式(V)化合物为人参皂苷Rd，并且式(IV)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。在本发明的第七方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶为如本发明第二方面中所述的多肽或其衍生多肽。
在另一优选例中，编码所述糖基转移酶的核苷酸序列如本发明第三方面所述。
在另一优选例中，所述的细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞原核细胞，如大肠杆菌。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为人参细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞不是天然产生式(II)，(IV)，(VI)，(VIII)，(II)，(IIII)化合物的细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞不是天然产生稀有人参皂苷Rg3和/或稀有人参皂苷Rf和/或稀有人参皂苷Rg2，和/或新的人参皂苷3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD和3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK等的细胞。
在另一优选例中，所述的达玛稀二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因。
在另一优选例中，所述的宿主细胞含有原人参二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因，或其组合。
在另一优选例中，所述的宿主细胞含有原人参三醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶、P450CYP716A47的还原酶基因及其基因，或其组合。。
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh2合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、四环三萜C-3位糖基转移酶基因UGTPg45，或其组合。
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh1合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、及细胞色素P450CYP716A53V2基因及其还原酶基因、四环三萜C-6位的糖基转移酶基因UGTPg100，或其组合。
在本发明的第八方面，提供了第八方面所述的宿主细胞的用途，用于制备酶催化试剂，或生产糖基转移酶、或作为催化细胞、或产生式(II)、(IV)或(VI)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞用于通过对人参皂苷Rh2、F2、Rg3、Rd和/或人参皂苷Rh1、Rg1的糖基化反应，生产新皂苷3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD和3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CKII和/或稀有人参皂苷Rg3和/或稀有人参皂苷Rf和/或稀有人参皂苷Rg2。
在本发明的第九方面，提供了一种产生转基因植物的方法，包括步骤：将第八方面所述的遗传工程化的宿主细胞再生为植物，并且所述的遗传工程化的宿主细胞为植物细胞。
在另一优选例中，所述的遗传工程化的宿主细胞为人参细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示(a)gGT29/gGT29-3基因和(b)gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6和gGT29-7基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。(b)泳道1，核酸Marker；泳道2，gGT29/gGT29-3基因PCR产物；(b)泳道1，gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6基因PCR产物；泳道2，gGT29-7基因PCR产物；泳道3，核酸Marker。
图2显示SDS-PAGE检测gGT29和gGT29-3在酿酒酵母中的表达；泳道1，空载体pYES2重组子的裂解液上清；泳道2，gGT29-pYES2酵母重组子的裂解液上清；泳道3，gGT29-3-pYES2酵母重组子的裂解液上清。
图3显示WesternBlot检测gGT29和gGT29-3在酿酒酵母中的表达；泳道1，空载体pYES2重组子的裂解液上清；泳道2，gGT29-pYES2酵母重组子的裂解液上清；泳道3，gGT29-3-pYES2酵母重组子的裂解液上清。
图4显示糖基转移酶gGT29和gGT29-3催化人参皂苷Rh2和F2的产物的TLC检测图谱；泳道1，PPD及PPD类型皂苷混合标样，泳道2，gGT29粗酶液(gGT29-pYES2酵母重组子的裂解液上清)催化Rh2生成Rg3，泳道3，gGT29粗酶液催化Rh2对照，加入pYES2空质粒酵母重组子裂解液替代酶液；泳道4，gGT29催化F2生成Rd，泳道5，gGT29催化F2对照，加入pYES2空质粒酵母重组子裂解液替代酶液；泳道6，gGT29-3粗酶液(gGT29-3-pYES2酵母重组子的裂解液上清)催化Rh2生成Rg3；泳道7，gGT29-3粗酶液催化F2生成Rd。
图5显示糖基转移酶gGT29和BvUGT73C10或gGT29和UGTPg45联合催化PPD产物的TLC检测；(a)gGT29和BvUGT73C10联合催化PPD,泳道1，PPD及PPD类型皂苷混合标样；泳道2，BvUGT73C10催化PPD生成Rh2；泳道3，gGT29催化Rh2生成Rg3；泳道4，BvUGT73C10和gGT29联合催化PPD生成Rg3；(b)gGT29和UGTPg45联合催化PPD,泳道1，PPD及PPD类型皂苷混合标样；泳道2，UGTPg45催化PPD生成Rh2；泳道3，PPD；泳道4，UGTPg45和gGT29联合催化PPD生成Rg3。
图6显示糖基转移酶BvUGT73C10和gGT29分别催化20(R)-PPD和20(R)-PPD以及联合催化20(R)-PPD的产物TLC检测图谱；泳道1，BvUGT73C10催化20(R)-PPD生成20(R)-Rh2；泳道2，gGT29催化20(R)-Rh2生成20(R)-Rg3；泳道3，BvUGT73C10和gGT29联合催化20(R)-PPD生成20(R)-Rg3。
图7显示糖基转移酶gGT29和BvUGT73C10或gGT29和UGTPg45联合催化PPD产物的的HPLC检测结果。第一行，Rg3，Rh2和PPD混合标准样品；第二行，gGT29和BvUGT73C10联合催化PPD,第三行，gGT29和UGTPg45联合催化PPD。
图8显示糖基转移酶gGT29和BvUGT73C10或gGT29和UGTPg45联合催化PPD的产物LC/MS检测结果。显示了标准样品Rg3的质谱图和图7中P1峰(gGT29和BvUGT73C10联合催化PPD的产物)和P2峰(gGT29和UGTPg45联合催化PPD的产物产物峰)的质谱图。
图9显示产Rg3酵母工程菌A2细胞裂解液抽提物的HPLC检测结果，第一行样品：原人参二醇(PPD)、达玛烯二醇(DM)，人参皂苷Rh2和Rg3的混合标准样品；第二行样品：产Rg3酵母工程菌A2细胞裂解液抽提物。
图10显示SDS-PAGE检测gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6，gGT29-7在重组大肠杆菌中的表达。泳道1，gGT29-4-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道2，gGT29-4-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道3，gGT29-5-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道4，gGT29-5-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道5，gGT29-6-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道6，gGT29-6-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道7，gGT29-7-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道8，gGT29-7-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道9，蛋白分子量Marker。
图11显示WesternBlot检测gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6，gGT29-7在重组大肠杆菌中的表达。泳道1，gGT29-4-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道2，gGT29-4-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道3，gGT29-5-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道4，gGT29-5-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道5，gGT29-6-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道6，gGT29-6-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清；泳道7，gGT29-7-pET28a重组大肠杆菌体裂解总蛋白；泳道8，gGT29-7-pET28a重组大肠杆菌体裂解上清。
图12显示糖基转移酶gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6，gGT29-7分别催化Rh2和F2的产物TLC检测图谱。泳道Rh2表示用皂苷Rh2为底物；泳道F2表示用皂苷F2为底物。gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6，gGT29-7表示用不同的酶液进行催化反应。
图13显示糖基转移酶gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6，gGT29-7分别催化Rh1的产物TLC检测图谱。(a)泳道1，2和3分别代表糖基转移酶gGT29-4，gGT29-5和gGT29-6分别催化Rh1的产物，泳道4代表原人参三醇型皂苷混合标样；(b)泳道1代表糖基转移酶gGT29-7催化Rh1的产物，泳道2代表原人参三醇型皂苷混合标样。
图14显示了显示糖基转移酶gGT29-7与其突变蛋白gGT29-7-N343G,gGT29-7-A359P和gGT29-7-N343G/A359P催化Rh1的检测结果(同时使用UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖作为糖基供体)。第一行，Rg1，Rf，Rg2和Rh1混合标准样品；第二行，gGT29-7催化Rh1；第三行，gGT29-7-N343G催化Rh1；第四行，gGT29-7-A359P催化Rh1；第五行，gGT29-7-N343G/A359P催化Rh1。
图15显示糖基转移酶gGT29-3和gGT29-14以UDP-xylose为糖基供体，催化人参皂苷Rh2，Rg3和Rd产物的TLC检测图谱；(A)以表达空载体pET28a的肠杆菌裂解液上清作为酶液进行催化；(B)以表达pET28a-gGT29-3的肠杆菌裂解液上清作为酶液进行催化；(C)以表达pET28a-gGT29-14的肠杆菌裂解液上清作为酶液进行催化。泳道Rh2，Rg3和Rd分别表示用皂苷Rh2，Rg3和Rd作为底物，泳道M代表原人参二醇型皂苷混合标准。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供糖基转移酶gGT29-7(SEQIDNO.:61)及其衍生多肽，如gGT29(SEQIDNO.:26)，gGT29-3(SEQIDNO.:28)，gGT29-4(SEQIDNO.:55)，gGT29-5(SEQIDNO.:57)，gGT29-6(SEQIDNO.:59)，gGT29-8(SEQIDNO.:72)，gGT29-9(SEQIDNO.:74)，gGT29-10(SEQIDNO.:76)，gGT29-11(SEQIDNO.:78)，gGT29-12(SEQIDNO.:80)，gGT29-13(SEQIDNO.:82)gGT29-14(SEQIDNO.:84)、gGT29-15(SEQIDNO.:86)、gGT29-16(SEQIDNO.:88)、gGT29-17(SEQIDNO.:90)、gGT29-18(SEQIDNO.:92)、gGT29-7-N343G(SEQIDNO.:93)、gGT29-7-A359P(SEQIDNO.:94)、gGT29-7-N343G/A359P(SEQIDNO.:95)在萜类化合物糖基化催化及新皂苷合成中的应用。具体地，本发明的糖基转移酶能特异和高效地催化四环三萜化合物底物的和/或将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位或C-6的第一个糖基上以延伸糖链。特别是能够将人参Rh2转化为具有抗癌活性的稀有人参皂苷Rg3，将人参皂苷F2转化为人参皂苷Rd，将人参皂苷Rh1转化为抗肿瘤,抗疲劳功效的稀有人参皂苷Rf，将人参皂苷Rh1转化具有神经保护作用和紫外线保护作用的稀有人参皂苷Rg2。本发明还提供了转化和催化方法。本发明的糖基转移酶还可与达玛烯二醇和/或原人参二醇或原人参三醇合成代谢途径中的关键酶以及四环三萜C-3或者C-6位的糖基转移酶在宿主细胞中共表达，或者应用于制备人参皂苷Rh2和人参皂苷Rh1的遗传工程细胞中，应用于构建人工合成稀有人参皂苷Rg3和Rf。此外，本发明的糖基转移酶还可与达玛烯二醇和/或原人参二醇或原人参三醇合成代谢途径中的关键酶以及C-6位的糖基转移酶以及合成UDP-鼠李糖的关键酶在宿主细胞中共表达，应用于构建人工合成稀有人参皂苷Rg2的菌株。在此基础上完成了本发明。
定义
如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明的多肽及其衍生多肽”、“本发明的酶”、“糖基转移酶”、“本发明的gGT29或其衍生多肽”或“本发明的糖基转移酶”，均指糖基转移酶gGT29-7(SEQIDNO.:61)或其衍生多肽。其中优选的衍生多肽包括gGT29(SEQIDNO.:26)、gGT29-3(SEQIDNO.:28)、gGT29-4(SEQIDNO.:55)、gGT29-5(SEQIDNO.:57)、gGT29-6(SEQIDNO.:59)、gGT29-8(SEQIDNO.:72)、gGT29-9(SEQIDNO.:74)，gGT29-10(SEQIDNO.:76)，gGT29-11(SEQIDNO.:78)，gGT29-12(SEQIDNO.:80)，gGT29-13(SEQIDNO.:82)gGT29-14(SEQIDNO.:84)、gGT29-15(SEQIDNO.:86)、gGT29-16(SEQIDNO.:88)、gGT29-17(SEQIDNO.:90)、gGT29-18(SEQIDNO.:92)、gGT29-7-N343G(SEQIDNO.:93)、gGT29-7-A359P(SEQIDNO.:94)、gGT29-7-N343G/A359P(SEQIDNO.:95)。
如非特别说明，本文所说的人参皂苷和皂苷元，是的C20位S和/或R构型的人参皂苷和皂苷元。
如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明的活性多肽具有糖基转移酶活性，并且能够催化以下一种或多种反应：
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95或其衍生多肽。
R1-R4经取代后的化合物如下表所示：
| 底物 | R1 | R2 | R3 | R4 |
| Rh2 | 糖基 | H | OH | H |
| F2 | 糖基 | H | OH | 糖基 |
即当R1为葡萄糖基；R2为H，R3为OH，R4为H，式(I)化合物为Rh2。
R1为葡萄糖基；R2为H，R3为OH，R4为葡萄糖基，式(I)化合物为F2。
当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物(I)化合物为Rh2，则产物式(II)化合物为Rg3；底物(I)化合物为F2，则产物式(II)化合物为Rd；
当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物(I)化合物为Rh2，则产物式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；底物(I)化合物为F2，则产物式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
其中，R1和R2为H或者糖基，R3和R4为糖基。R3-R4-O为C6第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:55，57，59，61，78，82，92，94或者95或其衍生多肽。
当R1和R2为H，R3为葡萄糖基时，式(III)化合物为Rh1。
当以UDP-葡糖糖作为糖基供体时，底物(IIII)化合物为Rh1，则产物式(IV)化合物为Rf；
当以UDP-鼠李糖作为糖基供体时，底物(IIII)化合物为Rh1，则产物式(IV)化合物为Rg2；
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，R5-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基；R6为糖基，R6-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:26、28、59、76、84、86或88或其衍生多肽。R1为两个葡萄糖基，R2为H，R3为OH，R4为H，式(V)化合物为Rg3。R1为两个葡萄糖基，R2为H，R3为OH，R4为葡萄糖基，式(V)化合物为Rd当以UDP-木糖作为糖基供体时，底物(V)化合物为Rg3，则产物式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；底物(V)化合物为Rd，则产物式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
所述的多肽序列为SEQIDNO.:61或其衍生多肽，其优选的衍生多肽26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或者95序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的gGT29-7多肽或其衍生多肽，例如优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表1列出了其中的一些标签及其序列。
表1
为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO.:60所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO.:61或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或者95的蛋白质，但与SEQIDNO.:60或其衍生蛋白的编码序列，优选为SEQIDNO.:25、27、54、56、58、60、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91所示的序列有差别的核酸序列。
编码SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93,94或95的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO.:26、28、55、57、59、61、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或者95所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P、或gGT29-7-N343G/A359P蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
应用
本发明涉及的活性多肽或肽基转移酶gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P的用途包括(但不限于)：特异和高效地将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位和C-6位的第一个糖基上以延伸糖链。特别是能够将人参皂苷Rh2转化为抗癌活性更优良的稀有人参皂苷Rg3；将人参皂苷F2转化为人参皂苷Rd；将人参皂苷Rh1转化为具有抗肿瘤和抗疲劳活性的稀有人参皂苷Rf；将人参皂苷Rh1转化具有神经保护作用和紫外线保护作用的稀有人参皂苷Rg2；本发明的糖基转移酶还能将人参皂苷Rh2，Rg3和Rd合成之前未见报道的新皂苷3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD和(3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
所述的四环三萜化合物包括(但不限于)：S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷(环阿尔廷烷)型、apotirucallane型、葫芦烷、楝烷型等四环三萜类化合物。
本发明提供了一种工业催化方法，包括：在提供糖基供体的条件下，用本发明的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P活性多肽或肽基转移酶获得式(II)、(IV)或式(VI)化合物。具体是，所述的(A)反应中所用的多肽选自SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示氨基酸序列的活性多肽；所述(B)反应中所用的多肽选自SEQIDNO.:55，57，59，61，78，82，92，94或者95；所述(C)反应中所用的多肽选自SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、59、76、84、86或88。
所述的糖基供体是核苷二磷酸糖，选自下组：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-乙酰基葡萄糖，ADP-乙酰基葡萄糖，TDP-乙酰基葡萄糖，CDP-乙酰基葡萄糖，GDP-乙酰基葡萄糖，UDP-木糖，ADP-木糖，TDP-木糖，CDP-木糖，UDP-木糖，GDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。
所述的糖基供体优选是尿苷二磷酸糖，选自下组：UDP-葡萄糖，UDP-木糖，UDP-鼠李糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。
在所述方法中，还可以添加酶活性添加物(提高酶活性或抑制酶活性的添加物)。所述酶活性的添加物可以选自下组：Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+；或为可以生成Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+的物质。
所述方法的pH条件为：pH4.0-10.0，优选pH6.0-pH8.5，更优选8.5。
所述方法的温度条件为：10℃-105℃，优选25℃-35℃，更优选35℃。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的活性多肽或肽基转移酶gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或者gGT29-7-N343G/A359P，以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
所述的组合物中还可添加调节本发明糖基转移酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的糖基转移酶活性的物质选自巯基乙醇。此外，很多物质可以降低酶活性，包括但不限于：Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+和Fe2+；或在添加至底物后可水解形成Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+和Fe2+的物质。
在获得了本发明的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P后，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥转糖基的作用，特别是对达玛稀二醇、原人参二醇和原人参三醇的转糖基作用。作为本发明的优选方式，还提供了二种形成稀有人参皂苷的方法，该方法之一包含：用本发明所述的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P处理待转糖基的底物，所述的底物包括达玛稀二醇、原人参二醇和原人参三醇及其衍生物等四环三萜类化合物。较佳地，在pH3.5-10条件下，用所述的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G或gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P酶处理待转糖基的底物。较佳地，在温度30-105℃条件下，用所述的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P、gGT29-7-N343G/A359P、gGT29-3酶处理待转糖基的底物。
该方法之二包含：将本发明所述的gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P或gGT29-7-N343G/A359P基因转入可以合成人参皂苷Rh2或者Rh1的工程菌(例如，酵母或大肠杆菌工程菌)中，或者，将gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、gGT29-7-A359P、或gGT29-7-N343G/A359P基因与达玛稀二醇、原人参二醇和原人参三醇合成代谢途径中的关键基因以及四环三萜C-3和/或C-6位的糖基转移酶于宿主细胞(例如酵母细胞或大肠杆菌)中共表达，获得直接生产稀有人参皂苷Rg3或Rf的重组菌。或者，将gGT29-7多肽或其衍生多肽，优选为gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18、gGT29-7-N343G、或gGT29-7-A359P、或gGT29-7-N343G/A359P基因与达玛烯二醇和/或原人参二醇或原人参三醇合成代谢途径中的关键酶以及四环三萜C-6位的糖基转移酶以及合成UDP-鼠李糖的关键酶在宿主细胞中共表达，应用于构建人工合成稀有人参皂苷Rg2的重组菌株。
所述的达玛稀二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因。
在另一优选例中，所述的原人参二醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因，或其组合。或者以上各种酶的同功酶及其组合。其中，达玛烯二醇合成酶将环氧角鲨烯(酿酒酵母自身合成)转化为达玛烯二醇，细胞色素P450CYP716A47及其还原酶再将达玛烯二醇转化为原人参二醇。(Hanet.al，plant&cellphysiology，2011，52.2062-73)
在另一优选例中，所述的原人参三醇合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、及细胞色素P450CYP716A53V2基因及其还原酶基因，或其组合。或者以上各种酶的同功酶及其组合。其中，达玛烯二醇合成酶将环氧角鲨烯(酿酒酵母自身合成)转化为达玛烯二醇，细胞色素P450CYP716A47及其还原酶再将达玛烯二醇转化为原人参二醇，细胞色素P450CYP716A53v2(JII036031)及其还原酶再进一步将原人参二醇转化为原人参三醇。(Hanet.al，plant&cellphysiology，2012，53.1535-45)
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh2合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、四环三萜C-3位糖基转移酶UGTPg45或其组合。或者以上各种酶的同功酶及其组合。其中，达玛烯二醇合成酶将环氧角鲨烯(酿酒酵母自身合成)转化为达玛烯二醇，细胞色素P450CYP716A47及其还原酶再将达玛烯二醇转化为原人参二醇，糖基转移酶UGTPg45可以进一步把原人参二醇转化为Rh2(Wanget.al,MetabolicEngineering,2015,29.97-105)。
在另一优选例中，所述的人参皂苷Rh1合成代谢途径中的关键基因包括(但不限于)：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450CYP716A47基因及其还原酶基因、及细胞色素P450CYP716A53V2基因及其还原酶基因，及C-6糖基转移酶UGTPg100或其组合。或者以上各种酶的同功酶及其组合。其中，达玛烯二醇合成酶将环氧角鲨烯(酿酒酵母自身合成)转化为达玛烯二醇，细胞色素P450CYP716A47及其还原酶再将达玛烯二醇转化为原人参二醇，细胞色素P450CYP716A53v2(JII036031)及其还原酶再进一步将原人参二醇转化为原人参三醇，糖基转移酶UGTPg100可以进一步把原人参三醇转化为Rh1(Weiet.al,MolecularPlant,2015,15.doi:10.1016/j.molp.2015.05.010)。
本发明的主要优点：
(1)本发明的糖基转移酶可以特异性和高效地将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链
(2)本发明的糖基转移酶特别能够分别将人参皂苷Rh2和Rh1转化为具有更好抗癌活性的稀有人参皂苷Rg3和具有抗肿瘤,抗疲劳的功效的稀有人参皂苷Rf以及具有神经保护中的作用和紫外线保护作用的稀有人参皂苷Rg2
(3)在酵母中构建了人参皂苷元(达玛稀二醇、原人参二醇和原人参三醇)的合成途径或稀有人参皂苷Rh2或Rh1的合成途径，从而实现以葡萄糖等单糖为底物，用酵母来发酵生产稀有人参皂苷Rg3和Rf。在酵母中构建了稀有人参皂苷Rh1的合成途径以及合成UDP-鼠李糖的途径，用酵母来发酵生产稀有人参皂苷Rg2。这不但可以解决皂苷生产的原料来源问题，而且可以大幅降低稀有皂苷Rg3、Rg2和Rf的生产成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1糖基转移酶及其编码基因的分离
从发表的人参属植物表达谱数据提取了100多条预测为糖基转移酶的cDNA序列，从中克隆了60条cDNA全长序列并对它们进行了表达及转糖基反应分析，其中有17种表达产物对人参皂苷元及皂苷具有转糖基活性。
提取人参RNA并进行反转录，获得人参的cDNA。以该cDNA为模板进行PCR扩增，使用其中引物对1(SEQIDNO.:7、8)；引物对2(SEQIDNO.:9、10)；引物对3(SEQIDNO.:11，12)；引物对5(SEQIDNO.:34、35)；引物对7(SEQIDNO.:46、47)；引物对8(SEQIDNO.:62、63)；引物对9(SEQIDNO.:64、65)全部获得扩增产物。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用AIIygenGelEIItractionKit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的DNA片段。将此DNA片段用宝生物工程有限公司的rTaqDNA聚合酶在末端加A后与市售的克隆载体pMD18-TVector连接，连接产物转化市售的大肠杆菌EPI300感受态细胞，将转化后的大肠杆菌菌液涂布在添加氨苄青霉素50ug/mL、IPTG0.5mM、II-Gal25μg/mL的LB平板上，并进一步通过PCR和酶切验证重组克隆。分别选取其中一个克隆提取重组质粒后进行测序。用BESTORF软件寻找开放阅读框(ORF)。通过序列比对，ORF编码了糖基转移酶第1家族保守功能域PSPG盒，表明是糖基转移酶基因。
用引物对5(SEQIDNO.:34，35)获得基因具有SEQIDNO.:25，27所示的核苷酸序列，分别命名为gGT29和gGT29-3。其中，相应的基因信息见表2。
表2
| SEQ ID NO.: | 自5'的起始位点 | 基因名称 | 作用 | 序列 |
| 25 | 1-1329 | gGT29 | 开放阅读框 | |
| 25 | 1-3 | gGT29 | 起始密码子 | ATG |
| 25 | 1327-1329 | gGT29 | 终止密码子 | TAG |
| 27 | 1-1329 | gGT29-3 | 开放阅读框 | |
| 27 | 1-3 | gGT29-3 | 起始密码子 | ATG |
| 27 | 1327-1329 | gGT29-3 | 终止密码子 | TAG |
用引物对7(SEQIDNO.:62、63)获得基因具有表3所示的gGT29-7衍生多肽的核苷酸序列，命名为gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-17和gGT29-18。其中相应的基因信息见表3。
表3
| SEQ ID NO.: | 自5'的起始位点 | 基因名称 | 作用 | 序列 |
| 54 | 1-1341 | gGT29-4 | 开放阅读框 | |
| 54 | 1-3 | gGT29-4 | 起始密码子 | ATG |
| 54 | 1339-1341 | gGT29-4 | 终止密码子 | TAG |
| 56 | 1-1341 | gGT29-5 | 开放阅读框 | |
| 56 | 1-3 | gGT29-5 | 起始密码子 | ATG |
| 56 | 1339-1341 | gGT29-5 | 终止密码子 | TAG |
| 58 | 1-1341 | gGT29-6 | 开放阅读框 | |
| 58 | 1-3 | gGT29-6 | 起始密码子 | ATG |
| 58 | 1339-1341 | gGT29-6 | 终止密码子 | TAG |
| 71 | 1-1329 | gGT29-8 | 开放阅读框 | |
| 71 | 1-3 | gGT29-8 | 起始密码子 | ATG |
| 71 | 1327-1329 | gGT29-8 | 终止密码子 | TAG |
| 73 | 1-1341 | gGT29-9 | 开放阅读框 | |
| 73 | 1-3 | gGT29-9 | 起始密码子 | ATG |
| 73 | 1339-1341 | gGT29-9 | 终止密码子 | TAG |
| 75 | 1-1341 | gGT29-10 | 开放阅读框 | |
| 75 | 1-3 | gGT29-10 | 起始密码子 | ATG |
| 75 | 1339-1341 | gGT29-10 | 终止密码子 | TAG |
| 77 | 1-1341 | gGT29-11 | 开放阅读框 | |
| 77 | 1-3 | gGT29-11 | 起始密码子 | ATG |
| 77 | 1339-1341 | gGT29-11 | 终止密码子 | TAG |
| 79 | 1-1329 | gGT29-12 | 开放阅读框 | |
| 79 | 1-3 | gGT29-12 | 起始密码子 | ATG |
| 79 | 1327-1329 | gGT29-12 | 终止密码子 | TAG |
| 81 | 1-1341 | gGT29-13 | 开放阅读框 | |
| 81 | 1-3 | gGT29-13 | 起始密码子 | ATG |
| 81 | 1339-1341 | gGT29-13 | 终止密码子 | TAG |
| 83 | 1-1341 | gGT29-14 | 开放阅读框 | |
| 83 | 1-3 | gGT29-14 | 起始密码子 | ATG |
| 83 | 1339-1341 | gGT29-14 | 终止密码子 | TAG |
| 89 | 1-1329 | gGT29-17 | 开放阅读框 |
| 89 | 1-3 | gGT29-17 | 起始密码子 | ATG |
| 89 | 1327-1329 | gGT29-17 | 终止密码子 | TAG |
| 91 | 1-1341 | gGT29-18 | 开放阅读框 | |
| 91 | 1-3 | gGT29-18 | 起始密码子 | ATG |
| 91 | 1339-1341 | gGT29-18 | 终止密码子 | TAG |
用引物对8(SEQIDNO.:64、65)获得基因具有表4所示的核苷酸序列，命名为gGT29-7、gGT29-15和gGT29-16。其中，相应的基因信息见表4。
表4
| SEQ ID NO.: | 自5'的起始位点 | 基因名称 | 作用 | 序列 |
| 60 | 1-1341 | gGT29-7 | 开放阅读框 | |
| 60 | 1-3 | gGT29-7 | 起始密码子 | ATG |
| 60 | 1339-1341 | gGT29-7 | 终止密码子 | TAG |
| 86 | 1-1329 | gGT29-15 | 开放阅读框 | |
| 86 | 1-3 | gGT29-15 | 起始密码子 | ATG |
| 86 | 1327-1329 | gGT29-15 | 终止密码子 | TAG |
| 88 | 1-1329 | gGT29-16 | 开放阅读框 | |
| 88 | 1-3 | gGT29-16 | 起始密码子 | ATG |
| 88 | 1327-1329 | gGT29-16 | 终止密码子 | TAG |
所涉及的蛋白及其特性如5表所示：
表5
实施例2糖基转移酶基因gGT29和gGT29-3的酵母重组表达载体的构建
分别以实施例1构建的含有gGT29和gGT29-3基因的质粒gGT29-pMD18T和gGT29-3-pMD18T为模板扩增目标基因。
gGT29所用正向引物均为(SEQIDNO.:36)，其5’端添加KpnI识别位点：GGATCC；所用反向引物均为(SEQIDNO.:37)，其5’端添加IIhoI识别位点：CTCGAG，反向引物引入6-HisTag以便进行WesternBlot检测表达和纯化。
gGT29-3所用正向引物均为(SEQIDNO.:38)，其5’端添加KpnI识别位点：GGATCC；所用反向引物均为(SEQIDNO.:39)，其5’端添加IIhoI识别位点：CTCGAG，反向引物引入6-HisTag以便进行WesternBlot检测表达和纯化。
以质粒gGT29-pMD18T和gGT29-3-pMD18T为模板，利用上述引物通过PCR方法扩增gGT29和gGT29-3的基因。DNA聚合酶选用Toyobo公司的高保真DNA聚合酶kod，参考其说明书设定PCR程序：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃1.5min，共30个循环；68℃10min；10℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下，切下与目标DNA大小一致的条带。然后采用AIIYGEN公司的AIIyPrepDNAGelEIItractionKit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。用Takara公司的的QuickCut限制性内切酶KpnI和IIbaI双酶切回收的DNA片段30min，用AIIYGEN公司的AIIyPrepPCRCleanupKit对酶切产物进行清洁回收。利用NEB公司的T4DNA连接酶将酶切产物与酿酒酵母表达质粒pYES2(同样以KpnI和IIbaI酶切并割胶回收)25℃连接2h。连接产物转化E.coliTOP10感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒gGT29-pYES2和gGT29-3-pYES2构建成功。
实施例3糖基转移酶基因gGT29和gGT29-3在酿酒酵母中的表达
通过电转化方法将构建好的表达质粒gGT29-pYES2和gGT29-3-pYES2转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，涂布于筛选平板SC-Ura(0.67％酵母无氨基酸基本氮源，2％葡萄糖)。通过菌落PCR验证酵母重组子。挑酵母重组子菌落于10mLSC-Ura(2％葡萄糖)培养基中，30℃200rpm培养20h。4℃3500g离心收集菌体，用无菌去离子水清洗菌体两次，用诱导培养基SC-Ura(2％半乳糖)重悬菌体，并接种到50mL诱导培养基中，使OD600在0.4左右，30℃200rpm开始诱导表达。4℃3500g离心收集诱导表达12h的菌体，用无菌去离子水清洗菌体两次，重悬于酵母裂解缓冲液中，使OD600在50-100之间。用Fastprep细胞破碎仪震荡破碎酵母细胞，4℃12000g离心10min去除细胞碎片，收集细胞裂解液上清。取适量裂解液上清进行SDS-PAGE电泳检测，与pYES2空载体的重组子相比，gGT29-pYES2和gGT29-3-pYES2重组子没有明显的条带表征(图2)。采用anti-6-HisTagWesternBlot检测表达情况，表达gGT29和gGT29-3的酿酒酵母显示很强的WesternBlot信号，表明gGT29和gGT29-3在酵母中均可溶表达，而转pYES2空载体的重组子则没有anti-6-HisTagWesternBlot信号(图3)。
实施例4酵母表达产物gGT29和gGT29-3转糖基反应和产物鉴定
以表达gGT29和gGT29-3的重组酵母裂解上清做为酶液来催化人参皂苷Rh2和F2的转糖基反应，表达空载体的重组酵母裂解上清为对照。100μL反应体系如表3所示。反应在35℃下进行12h，然后加入100μL丁醇终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用甲醇溶解。
反应产物先用薄层层析(TLC)进行检测，表达gGT29和gGT29-3的酵母宿主裂解上清酶液可以在人参皂苷Rh2和F2的3位糖基再延伸一个糖基，转化为人参皂苷Rg3和Rd(图4)。gGT29和gGT29-3的催化活性不受人参皂苷20位糖基或者羟基构型的影响，可以将20(R)-Rh2转化为20(R)-Rg3(图6)。
实施例5糖基转移酶BvUGT73C10/UGTPg45和gGT29的联合转糖基反应和产物鉴定
以表达BvUGT73C10(JQ291613)或UGTPg45(KM401918)的大肠杆菌宿主裂解上清和以表达gGT29的酵母宿主裂解上清做为酶液来共同催化原人参二醇(PPD)。100μL反应体系如表3所示。73.4μL的酶液中40μL为BvUGT73C10的大肠宿主裂解上清，剩余33.4μL为表达gGT29的酵母宿主裂解上清。反应在35℃下进行12h，然后加入100μL丁醇终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用甲醇溶解。反应产物先用薄层层析(TLC)进行检测(图5)，可以看到糖基转移酶BvUGT73C10和gGT29或者UGTPg45和gGT29联合使用都可将PPD转化为Rg3。
糖基转移酶BvUGT73C10和gGT29或者3GT2和gGT29联合使用都可以催化20(R)-PPD，生成20(R)-Rg3(图6)。
实施例6产Rg3酵母工程菌的构建与产物鉴定
6.1在pESC-HIS质粒((Stratagene，Agilent)上，同时组装达玛烯二醇合成酶(Dammarenediolsynthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10GAL10侧启动子，ADH1终止子)、细胞色素P450CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1启动子，CYC1终止子)以及糖基转移酶UGTPg45和gGT29(GAL1/GAL10GAL1侧启动子，TDH2终止子)，构成游离型质粒，转化酿酒酵母BY4742，并将拟南芥来源的细胞色素P450还原酶ATR2-1(NP_849472.2)整合于酿酒酵母BY4742染色体中染色体trp1基因位点(GAL1启动子，利用trp1原有终止子)，构建了重组酵母A2。重组酵母菌需补加的相应氨基酸(0.01％色氨酸，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸)。
将重组酵母A2裂解液转移到2mLEP管中，每个管装1mL，加入等体积(1mL)的正丁醇抽提约30min后12000g离心10min。吸取上清至一新的EP管中。45℃并真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后用于HPLC检测。
通过HPLC和LC-MS分析，重组酵母A2的细胞裂解液中含有达玛烯二醇、原人参二醇(PPD)和人参皂苷活性代谢物Rg3(图8和图9)。
6.2方法同6.1，区别在于用糖基转移酶BvUGT73C10代替UGTPg45，得到重组酵母A6。通过HPLC分析，重组酵母A6的细胞裂解液中也含有达玛烯二醇、原人参二醇(PPD)及人参皂苷活性代谢物Rg3。
实施例7糖基转移酶基因gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7的大肠杆菌重组表达载体的构建
以实施例1构建的含有gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7基因的质粒gGT29-4-pMD18T，gGT29-5-pMD18T，gGT29-6-pMD18T和gGT29-7-pMD18T为模板扩增目标基因。
gGT29-5和gGT29-6基因所用的正向引物如SEQIDNO.:66所示，其5’端添加了与载体pET28a同源的序列：CTGGTGCCGCGCGGCAGC；所用反向引物为如SEQIDNO.:68所示，其5’端添加了与载体pET28a同源的序列：TGCGGCCGCAAGCTTGTC。
gGT29-4和gGT29-7基因所用正向引物为SEQIDNO.:67，其5’端添加了与载体pET28a同源的序列：CTGGTGCCGCGCGGCAGC；所用反向引物为SEQIDNO.:68，其5’端添加了与载体pET28a同源的18个碱基片段：TGCGGCCGCAAGCTTGTC。
利用上述引物通过PCR方法扩增gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7基因。扩增基因选用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，参考其说明书设定PCR程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃2min；10℃保温。
同时，使用SEQIDNO.:69和SEQIDNO.:70分别作为正向和反向引物扩增载体pET28a，获得线性化的载体pET28a。扩增pET28a线性化载体也选用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，参考其说明书设定PCR程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃3min，共35个循环；72℃2min；10℃保温。
上述gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7基因PCR产物以及线性化的载体pET28a，经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外光下切下与目标DNA大小一致的条带。然后采用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。参考诺晶生物科技有限公司的BGclonart无缝克隆试剂盒说明书，将回收的线性化的pET28a载体片段，回收的gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7基因片段及诺晶生物科技有限公司的BGclonart无缝克隆反应液以适当比例进行混合，共20μl。混匀后在50℃孵育30分种，然后将混合反应液转移到冰上。使用5μl反应液转化E.coliEPI300感受态细胞，并涂布于添加50μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒gGT29-4-pET28a，gGT29-5-pET28a，gGT29-6-pET28a和gGT29-7-pET28a构建成功。
实施例8糖基转移酶基因gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7在大肠杆菌中的表达
以实施例19构建的大肠杆菌表达载体gGT29-4-pET28a，gGT29-5-pET28a，gGT29-6-pET28a和gGT29-7-pET28a转化到市售的E.coliBL21中。接种一个重组子到LB培养基中，30℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳(图10)。gGT29-4-pET28a，gGT29-5-pET28a，gGT29-6-pET28a和gGT29-7-pET28a重组子裂解液和总蛋白和上清中都有明显的目的蛋白条带(大约50KD)，分别表征糖基转移酶gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7。从WesternBlot的结果看(图11)，也证明目标蛋白gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7在宿主中实现了可溶表达。
实施例9大肠杆菌表达产物gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7转糖基反应和产物的鉴定
以表达gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和gGT29-7的重组酵母裂解上清做为酶液来催化人参皂苷Rh2和F2的转糖基反应。100μL反应体系如表6所示。反应在35℃下进行12h，然后加入100μL丁醇终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用甲醇溶解。
表6
| 9％吐温20 | 11.1μL |
| 50mM UDP-葡萄糖 | 10μL |
| 1M Tris-HCl pH8.5 | 5μL |
| 100mM底物(乙醇溶解) | 0.5μL |
| 酶液 | 73.4μL |
反应产物用薄层层析(TLC)进行检测，gGT29-6的粗酶液可以在人参皂苷Rh2和F2的3位糖基上再延伸一个糖基，分别生成为人参皂苷Rg3和Rd(图12)；gGT29-4,gGT29-5和gGT29-7的粗酶液可以在人参皂苷F2的3位糖基再延伸一个糖基生成皂苷Rd,但是它们不能催化皂苷Rh2(图12)。gGT29-4，gGT29-5，gGT29-6和gGT29-7的粗酶液还可以在原人参三醇型皂苷Rh1的C-6位糖基上再延伸一个糖基，形成人参皂苷Rf(图13)，其中，gGT29-4，gGT29-5和gGT29-6的活性比较弱，而gGT29-7则具有比较强的活性(表7)。
实施例10糖基转移酶基因gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18大肠杆菌重组表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达以及产物鉴定
方法同实施例7-8，构建了gGT29-8、gGT29-9、gGT29-10、gGT29-11、gGT29-12、gGT29-13、gGT29-14、gGT29-15、gGT29-16、gGT29-17、gGT29-18的大肠杆菌表达载体(gGT29-8-pET28a，gGT29-9-pET28a，gGT29-10-pET28a，gGT29-11-pET28a，gGT29-12-pET28a，gGT29-13-pET28a，gGT29-14-pET28a，gGT29-15-pET28a，gGT29-16-pET28a，gGT29-17-pET28a，gGT29-18-pET28a)，并在大肠杆菌中实现可溶性表达。根据实施例9所示方法的鉴定，其产物与其他gGT29系列糖基转移酶对底物不同位置(C3或C6)第一个糖基的延伸活性见表7，其中，“+"表示在该位置有活性，“++"表示在该位置有比较强的活性。
表7
实施例11通过氨基酸定点突变改变gGT29-7对糖基供体专一性
糖基转移酶gGT29-7可以以UDP-葡萄糖为糖基供体，催化人参皂苷Rh1的C6-O-Glc延伸一个葡萄糖生成人参皂苷Rf。通过对对糖基转移酶gGT29-7的糖基供体结合区域(PSPG)进行了定点突变来改变它对糖基供体的专一性。对已有研究报道的能够催化其他糖基受体的鼠李糖基转移酶与gGT29-7进行氨基酸序列比对，筛选并最后选取了gGT29-7PSPG盒上两个位点进行定点突变(N343G和A359P)。
根据常规设计并合成两条引物，以质粒pET28a-gGT29-7为模板，利用Yeasen公司的HieffMutTMsite-directedmutagenesiskit进行gGT29-7的N343位点分别进行定点突变。
PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，56℃10s，72℃1.5min，共30个循环；降至10℃。PCR产物用DpnI酶切，37℃水浴反应2h。再取3μL用试剂盒中的重组酶EIInase进行重组37℃30min，转化大肠杆菌TOP10感受态。挑取单克隆并抽提质粒，测序验证突变位点，所获得的质粒命名为pET28a-gGT29-7-N343G。
将质粒pET28a-gGT29-7-N343G转化到大肠杆菌BL21(DE3),构建重组菌株pET28a-gGT29-7-N343G-BL21，诱导表达的步骤同实施例8。
根据常规设计并合成两条引物对gGT29-7的A359位点进行点突变并构建突变质粒pET28a-gGT29-7-A359P和重组菌株gGT29-7-N343G-BL21，步骤同上。诱导表达的步骤同实施例8。以质粒pET28a-gGT29-7-N343G为模板，29-7-A359P-F和29-7-A359P-R为引物对A359进行点突变构建双突变质粒pET28a-gGT29-7-N343G/A359P和重组菌株gGT29-7-N343G/A359P-BL21，步骤同上。诱导表达的步骤同实施例8，转糖基反应和产物的鉴定同实施例9，反应体系如表6所示，但是使用按照1/1的比例混合的UDP-葡萄糖/UDP-鼠李糖代替UDP-葡萄糖作为糖基供体。
结果如图14所示，单突变蛋白gGT29-7-N343G催化Rh1的C6-O-Glc延伸一个葡萄糖生成Rf的酶活力已经基本检测不到，而gGT29-7-A359P仍然保留了催化Rh1的C6-O-Glc延伸一个葡萄糖的酶活力。双突变蛋白gGT29-7-N343G/A359P不仅保留了野生型蛋白的催化Rh1的C6-O-Glc延伸一个葡萄糖生成Rf的酶活力，还获得了催化Rh1的C6-O-Glc延伸一个鼠李糖生成Rg2的酶活力。
实施例12以UDP-xylose为糖基供体，糖基转移酶大肠杆菌表达产物的转糖基反应和产物的鉴定
以表达gGT29-10和gGT29-14的重组大肠杆菌上清做为酶液来催化人参皂苷Rh2和F2的转糖基反应。100μL反应体系如表6所示，但是用UDP-木糖代替UDP-葡萄糖作为糖基供体。反应在35℃下进行12h，然后加入100μL丁醇终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用甲醇溶解。
反应产物用薄层层析(TLC)进行检测，gGT29-10和gGT29-14能够在人参皂苷Rh2的C-3糖基延伸一个木糖生成一种新的三萜皂苷，(3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；gGT29-10和gGT29-14能够将人参皂苷Rg3C-3位的第二个葡萄糖置换为木糖生成一种新的三萜皂苷(3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD)；gGT29-10和gGT29-14还能够将人参皂苷RdC-3位的第二个葡萄糖置换为木糖生成一种新的三萜皂苷(3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK)(图15)。
其它糖基转移酶gGT29，gGT29-4,gGT29-5,gGT29-6和，gGT29-7gGT29-8，gGT29-9，gGT29-10,gGT29-11，gGT29-12，gGT29-13，gGT29-15，gGT29-16，gGT29-17和gGT29-18，以UDP-木糖为糖基供体，催化Rh2，Rg3和Rd的活性如表8所示。
表8
实施例13产Rf酵母工程菌的构建与产物鉴定
在pESC-HIS质粒((Stratagene，Agilent)上，同时组装达玛烯二醇合成酶(Dammarenediolsynthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10GAL10侧启动子，ADH1终止子)、细胞色素P450CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1启动子，CYC1终止子)、细胞色素P450CYP716A53V2基因(ENO2启动子，CYC1终止子)以及糖基转移酶基因UGTPg100(KP795113)(GAL1/GAL10GAL1侧启动子，TDH2终止子)和糖基转移酶gGT29-7(TEF1启动子，FBA1终止子)，构成游离型质粒，转化酿酒酵母BY4742，并将拟南芥来源的细胞色素P450还原酶ATR2-1(NP_849472.2)整合于酿酒酵母BY4742染色体中染色体trp1基因位点(GAL1启动子，利用trp1原有终止子)，构建了重组酵母A5。重组酵母菌需补加的相应氨基酸(0.01％色氨酸，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸)。
将重组酵母A7裂解液转移到2mLEP管中，每个管装1mL，加入等体积(1mL)的正丁醇抽提约30min后12000g离心10min。吸取上清至一新的EP管中。45℃并真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后用于HPLC检测。
通过HPLC分析，重组酵母A7的细胞裂解液中含有原人参三醇(PPT)及人参皂苷活性代谢物Rh1和Rf。
实施例14产Rg2酵母工程菌的构建与产物鉴定
在pESC-HIS质粒((Stratagene，Agilent)上，同时组装达玛烯二醇合成酶(Dammarenediolsynthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10GAL10侧启动子，ADH1终止子)、细胞色素P450CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1启动子，CYC1终止子)、细胞色素P450CYP716A53V2基因(ENO2启动子，CYC1终止子)以及两个糖基转移酶基因UGTPg100(KP795113)(GAL1/GAL10GAL1侧启动子，TDH2终止子)和gGT29-7-N343G/A359P(TEF1启动子，FBA1终止子)，构成游离型质粒，转化酿酒酵母BY4742，并将拟南芥来源的细胞色素P450还原酶ATR2-1(NP_849472.2)(GAL1启动子，利用trp1原有终止子)和UDP-L-鼠李糖合成酶RHM2(GQ292791.1)(GAL10启动子，FBA1终止子)整合于酿酒酵母BY4742染色体中染色体trp1基因位点，构建了重组酵母A8。重组酵母菌需补加的相应氨基酸(0.01％色氨酸，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸)。
将重组酵母A8裂解液转移到2mLEP管中，每个管装1mL，加入等体积(1mL)的正丁醇抽提约30min后12000g离心10min。吸取上清至一新的EP管中。45℃并真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后用于HPLC检测。通过HPLC分析，重组酵母A8的细胞裂解液中含有原人参三醇(PPT)及人参皂苷活性代谢物Rh1和Rg2。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种体外糖基化方法，其特征在于，包括步骤：
在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：
C-3和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链；
从而形成糖基化的四环三萜类化合物；
其中，所述的糖基转移酶为如SEQIDNO.:61所示的糖基转移酶或其衍生多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生多肽选自：
将SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；或
氨基酸序列与SEQIDNO.:61氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
3.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽选自下组：
(a)具有SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQIDNO.:61所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；
(d)氨基酸序列与SEQIDNO.:61氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；
其中，所述糖基转移酶活性指能将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3和/或C-6位的第一个糖基上以延伸糖链的活性。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸为选自下组的序列：
(A)编码权利要求3所述多肽的核苷酸序列；
(B)编码如SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；
(C)如SEQIDNO.:60所示的核苷酸序列；
(D)与SEQIDNO.:60所示序列的同源性≥90％(较佳地≥91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列；
(E)在SEQIDNO.:60所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；
(F)与(A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.权利要求3所述分离的多肽的用途，其特征在于，它被用于催化以下一种或多种体外反应，或被用于制备催化以下一种或多种反应的催化制剂：
(i)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位的第一个糖基上，延伸糖链；
(ii)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的第一个糖基上，延伸糖链；
(iii)将来之糖基供体的糖基与四环三萜类化合物的C-6位糖链的末端糖基进行置换，从在C-3和/或C-6位的第一个糖基上延伸糖链。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述分离的多肽用于催化下述一种或多种反应或被用于制备催化下述一种或多种反应的催化制剂：
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，R5-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:61所示的多肽或其衍生多肽，优选地，选自SEQIDNO.:26、28、55、57、59、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、94或95所示的多肽；
其中，R1和R2为H或者糖基，R3和R4为糖基。所述的多肽选自SEQIDNO.:61或其衍生多肽，优选地，选自55，57，59，78，82，92，94或者95或其衍生多肽；
其中，R1为糖基；R2和R3为OH或者H；R4为糖基或者H；R5为糖基，R5-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基；R6为糖基，R6-R1-O为C3第一个糖基衍生的糖基，所述的多肽选自SEQIDNO.:61所示多肽或其衍生多肽，优选为SEQIDNO.:26、28、59、76、84、86或88所示的多肽。
8.一种进行糖基催化反应的方法，其特征在于，包括步骤：在权利要求3所述的多肽或其衍生多肽存在的条件下，进行糖基催化反应。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖基催化反应的底物为式(I)、(III)、或(V)化合物，且所述的产物为(II)、(IV)、或(VI)化合物；较佳地，
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rh2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rg3；
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rh2，并且式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；或，所述的式(I)化合物为人参皂苷F2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rd；
或，所述的式(I)化合物为人参皂苷F2，并且式(II)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK；
或，所述的式(III)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(IV)化合物为人参皂苷Rf；
或，所述的式(III)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(IV)化合物为人参皂苷Rg2；
或，所述的式(V)化合物为人参皂苷Rg3，并且式(VI)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD；
或，所述的式(V)化合物为人参皂苷Rd，并且式(IV)化合物为3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK。
10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
11.权利要求10所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备酶催化试剂，或生产糖基转移酶、或作为催化细胞、或产生糖基化的四环三萜类化合物。
12.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求10所述的遗传工程化的宿主细胞再生为植物，并且所述的遗传工程化的宿主细胞为植物细胞。
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