CN108728423A - 枯草芽孢杆菌糖基转移酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自枯草芽孢杆菌的新型糖基转移酶及其应用。具体而言，本发明提供了一种来自枯草芽孢杆菌的新型糖基转移酶BsUGT1，编码该酶的多核苷酸，含有所述多核苷酸的载体，以及含有所述载体或其中整合有所述多核苷酸的重组细胞，BsUGT1催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化反应。本发明还提供了使用该酶进行糖基化的方法，以及使用该酶生产稀有人参皂苷的方法。该酶能够催化生成多种稀有人参皂苷，以及新的稀有人参皂苷(3β,12β‑Di‑O‑Glc‑PPT)，尤其是C12位糖基化的稀有人参皂苷。

Description

枯草芽孢杆菌糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及新型的糖基转移酶及其应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是传统名贵药材，始载于我国第一部本草专著《神农本草经》，列为上品，有补脾益肺、生津止渴、安神益智、延年益寿之功效。因具有神奇而广泛的作用，人参享有“百草之王”的美誉。现代医学研究证明，人参除了能滋补强身之外，在抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、调节免疫及增强记忆功能等方面均有显著作用。

药理学研究证明，人参的主要活性成分是人参皂苷(ginsenoside)。人参皂苷属于三萜类化合物，是人参属植物(如人参、三七或西洋参等)的一类重要次级代谢产物。根据苷元基本骨架不同，人参皂苷可分为两种类型：一类是达玛烷型四环三萜类皂苷；另一类是齐墩果烷型五环三萜类皂苷。达玛烷型皂苷在人参皂苷中占大多数，是其中的主要活性成分。达玛烷型皂苷包括人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷。迄今为止，从人参属植物中分离得到的达玛烷型皂苷已达110多种。

以有限的几种苷元骨架为母核结构，产生种类多样的人参皂苷，糖基化的作用极其重要。数据显示，人参中分离得到的天然人参皂苷均含1～5个不等的糖基。达玛烷型皂苷中，原人参二醇型皂苷主要在C3位和C20位羟基发生糖基化，糖基种类多为葡萄糖、阿拉伯糖和木糖；原人参三醇型皂苷主要在C6位和C20位羟基发生糖基化，糖基种类多为葡萄糖、鼠李糖和木糖。

根据人参皂苷在人参属植物中的含量，人参皂苷分为主要人参皂苷(majorginsenosides，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1等)和稀有人参皂苷(rare ginsenosides，如Compound K(20S-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇)、F1(20S-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,6α,12β,20S-四醇)、Rh1(6α-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,6α,12β,20S-四醇)、Rh2(3β-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇)、Rg3(3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇)等)。其中稀有人参皂苷是指在人参中含量极低或者不存在的皂苷。

另一方面，糖基修饰不仅使人参皂苷产生了丰富的种类，单糖种类、连接数目和连接位置等均会对人参皂苷发挥生物活性产生重要影响。许多人参皂苷仅仅是糖基修饰存在微小差异，就产生了截然不同的药理作用。以人参皂苷Rh2、Rb1为例，Rh2主要表现为抗肿瘤作用，Rb1主要对神经细胞的增长起到促进作用，而从结构上来看，Rh2只在C3位羟基上连有一个葡萄糖基，而Rb1在C3和C20位羟基上均连有由两个葡萄糖组成的二糖链。同样作用于中枢神经系统，Rb1和Rg1由于具有不同的糖基修饰，在药理活性及作用机制上也略有不同。Rb1可以通过激活cAMP依赖的蛋白激酶通路刺激神经递质释放；Rg1则通过蛋白激酶-II依赖的信号通路来产生相同作用效果。此外，与Rg1相比，Rb1的作用要弱很多，甚至在某些情况下会对中枢神经系统起到抑制作用。

因此，本领域技术人员还致力于寻找各种具有不同糖基化的新型稀有人参皂苷，来丰富人参皂苷的多样性，以期寻找到活性更强的新型稀有人参皂苷。

从可糖基化的位点来看，人参皂苷的基本骨架除了C3、C6和C20位羟基，还有C12位羟基。但迄今为止，在人参中未发现C12位羟基糖基化的人参皂苷，仅在竹节参中分离得到了具有C12位羟基糖基化结构的Chikusetsusaponin FK1、FK7、L10、LM4(结构式请参见下式(1))。它们主要存在于竹节参的果实和叶片中且含量甚微，而对此类人参皂苷的研究还停留在分离提取阶段，其合成途径以及药理活性的研究少有涉及。

采用化学合成方法对人参皂苷苷元C12位羟基进行糖基化修饰已有报道。Atopkina等首次报道了以乙酰溴代葡萄糖为糖基供体，在氧化银和二氯甲烷的催化下，对原人参二醇C12位羟基糖基化的化学合成方法，半合成了稀有人参皂苷12β-O-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇(简称12β-O-Glc-PPD)，并进行了药理活性研究，结果发现，12β-O-Glc-PPD对肺癌细胞的细胞毒活性明显高于Rg3、Rh2等人参皂苷(AtopkinaLN，Denisenko VA，Uvarova NI等，Glycosides from ginseng，Carbohydrate Research，1988，177(88)：101-109，在此以引用的方式将其整体并入本文)。牛一鸣等以C3和C6位羟基乙酰化保护而C12位羟基裸露的PPT为前体，以特定的邻炔基苯甲酸酯为糖基供体，在PPh3AuNTf2为催化剂条件下，合成了Chikusetsusaponin L₁₀(也称为12β-O-Glc-PPT)(牛一鸣，人参皂苷的高效合成，郑州：郑州大学，2012，以引用的方式将其整体并入本文)。但化学合成方法存在副产物多、收率低、成本高的问题，且合成过程中会产生大量污染物，对环境造成危害。

有鉴于此，亟待挖掘新的C12位羟基糖基化的稀有人参皂苷生产途径。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种糖基转移酶BsUGT1及其氨基酸序列，编码该酶的多核苷酸，以及含有所述多核苷酸的载体和重组细胞，并提供一种稀有人参皂苷的生产方法。

为了解决上述技术问题，本发明从枯草芽孢杆菌中克隆到糖基转移酶BsUGT1基因，通过表达获得的重组酶具有催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化的活性，因此能够催化产生多种稀有人参皂苷，包括多种C12位糖基化的稀有人参皂苷。

因此，在第一个方面，本发明提供了糖基转移酶BsUGT1，BsUGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的序列。

所述的糖基转移酶BsUGT1来源于枯草芽孢杆菌，具有催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化的活性。

本发明的BsUGT1可以是天然蛋白、合成蛋白或重组蛋白。进一步的，本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核宿主或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。其中，所述的使用重组技术获得的本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明第一方面所述的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列可操作地连接有标签序列、信号序列或分泌信号序列。

例如，本发明的氨基酸序列的氨基端或羧基端可含有一个或多个寡肽片段和/或多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，标签包括但不限于FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、GST、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。优选的标签选自Poly-His，更优选的标签为6×His。

根据本发明的一些实施方式，蛋白标签可与BsUGT1的氨基酸序列直接连接，还可利用间隔寡肽或多肽将蛋白标签连接至本发明的BsUGT1。

在本发明中，为了使本发明的BsUGT1在表达过程中更好地分泌至胞外，可用宿主细胞特异的分泌信号肽序列替换枯草芽孢杆菌的天然信号肽序列。本发明可使用的宿主细胞特异的分泌信号肽包括但不限于α因子信号肽、酸性磷酸酶(PHO5)信号肽和蔗糖酶(SUC2)信号肽。本发明的分泌信号肽可为酿酒酵母的α因子信号肽。

在第二个方面，本发明提供了多核苷酸，该多核苷酸为编码本发明所述BsUGT1的多核苷酸。

所述的多核苷酸可为从枯草芽孢杆菌中获得的DNA。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码本发明蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：1的蛋白质，但与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。即，本发明的多核苷酸可为任何能够编码具有SEQID NO：1的氨基酸序列的多核苷酸序列。优选的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明中，优选密码子经过优化的多核苷酸序列。

本发明中，可通过化学合成的方式获得本发明的编码糖基转移酶BsUGT1的多核苷酸(例如，带有或不带有编码纯化标签的DNA序列及任选的编码间隔序列的DNA序列)。

根据本发明的优选实施方式，多核苷酸可为编码在氨基末端或羧基末端带有标签的BsUGT1。例如，标签可为Poly-His标签。

在第三个方面，本发明提供了含有本发明第二方面所述的多核苷酸的载体。

根据本发明的实施方式，载体可包括表达载体、穿梭载体或整合载体。例如，载体可为可商购的载体，或任何具有相同功能的载体。在一个优选实施方式中，载体为表达载体。

利用本领域技术人员熟知的方法构建含本发明的BsUGT1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体、穿梭载体或整合载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

例如，可使用本领域技术人员熟知的多种大肠杆菌细胞表达载体，包括但不限于pET-32(a)和pET-28(a)。优选地，大肠杆菌表达载体为pET-32(a)。例如，可使用本领域技术人员熟知的多种酵母细胞表达载体，包括但不限于pESC-HIS、pESC-LEU、pESC-URA、pESC-TRP、pYES2或pAUR123。优选地，酵母表达载体为pESC-HIS、pESC-LEU、pESC-URA和pESC-TRP。

在第四个方面，本发明提供了重组细胞，该重组细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

根据本发明的一些实施方式，重组细胞为原核细胞或真核细胞。优选地，所述重组细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

在一个优选实施方式中，重组细胞为酵母细胞或植物细胞，优选为酿酒酵母细胞。在又一优选实施方式中，重组细胞为大肠杆菌。在优选实施方式中，重组细胞为人参细胞。

在另一优选实施方式中，所述细胞不是天然产生下述式(3)、式(5)、式(7)、式(9)、式(11)或式(13)的化合物的细胞。

在另一优选实施方式中，所述细胞不是天然产生3β-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,20S-二醇(简称3β-O-Glc-DM)、20S-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,20S-二醇(简称20S-O-Glc-DM)、3β,20S-Di-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,20S-二醇(简称3β,20S-Di-O-Glc-DM)、12β-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇(简称12β-O-Glc-PPD)、3β,12β-Di-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,12β,20S-三醇(3β,12β-Di-O-Glc-PPD)、12β-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,6α,12β,20S-四醇(简称12β-O-Glc-PPT)和3β-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,6α,12β,20S-四醇(简称3β-O-Glc-PPT)，和/或新的人参皂苷3β,12β-Di-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-3β,6α,12β,20S-四醇(简称3β,12β-Di-O-Glc-PPT)等的细胞。

根据本发明的优选实施方式，所述细胞优选含有DM、PPD或PPT合成代谢途径关键基因的细胞。

在一个优选实施方式中，所述细胞含有DM合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因。在另一优选实施方式中，所述细胞含有PPD合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因、和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因，或其组合。在另一优选实施方式中，所述细胞含有PPT合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因、及原人参三醇合酶基因，或其组合。

可根据重组细胞的类型选择将载体或多核苷酸导入细胞的合适方法。这些方法都是本领域技术人员熟知的。例如，可采用本领域已知的方法将载体转化到酿酒酵母细胞中，或将多核苷酸片段通过同源重组整合进酿酒酵母的基因组中。其中，转化酿酒酵母的方法可使用本领域技术人员熟知的各种转化方法，例如电转化法、醋酸锂化学转化法等。

在第五个方面，本发明提供了糖基化方法，该方法包括：在糖基转移酶BsUGT1的存在下，进行糖基化反应。

根据本发明的一些实施方式，该方法使达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化。进一步的，本发明的糖基化方法可催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12或C20中的一个位点上的羟基糖基化。或者，本发明的方法可催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3和C12位上的羟基糖基化；或者，本发明的方法可催化达玛烷型四环三萜类化合物的C3和C20位上的羟基糖基化。

其中，达玛烷型四环三萜类化合物优选自达玛烷型人参皂苷前体或达玛烷型人参皂苷。

除非另有说明，本文中的术语“达玛烷型人参皂苷前体”是指在人参皂苷生物合成途径中具有达玛烷型四环三萜母核的所有化合物。例如，达玛烷型人参皂苷前体包括但不限于DM、PPD或PPT。

除非另有说明，本文中的术语“人参皂苷”是指从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的达玛烷型皂苷，以及非天然的人参皂苷。例如，所述人参皂苷包括但不限于：Compound K、Rh2、Rg3、12β-O-Glc-PPD、12β-O-Glc-PPT和3β-O-Glc-PPT等。

其中，糖基可来自糖基供体。优选地，糖基供体选自由以下物质的一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、UDP-乙酰基葡萄糖、ADP-乙酰基葡萄糖、TDP-乙酰基葡萄糖、CDP-乙酰基葡萄糖、GDP-乙酰基葡萄糖、UDP-木糖、ADP-木糖、TDP-木糖、CDP-木糖、GDP-木糖、UDP-半乳糖醛酸、ADP-半乳糖醛酸、TDP-半乳糖醛酸、CDP-半乳糖醛酸、GDP-半乳糖醛酸、UDP-半乳糖、ADP-半乳糖、TDP-半乳糖、CDP-半乳糖、GDP-半乳糖、UDP-阿拉伯糖、ADP-阿拉伯糖、TDP-阿拉伯糖、CDP-阿拉伯糖、GDP-阿拉伯糖、UDP-鼠李糖、ADP-鼠李糖、TDP-鼠李糖、CDP-鼠李糖、GDP-鼠李糖、或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。在优选的实施方式中，糖基供体选自：UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，或其组合。

在该方法中，糖基转移酶BsUGT1可以分离的形式提供，优选被纯化至均质。该酶也可以与重组细胞的其它成分一起提供，例如含有BsUGT1的细胞裂解液等。

本发明所述的糖基化方法的pH可为pH 6.0～12.0、优选pH8.0～11.0、更优选pH9.0～10.0。本发明所述的糖基化方法的温度可为10℃～60℃、优选20℃～50℃、更优选30℃～45℃、最优选35℃～40℃。

在第六个方面，本发明提供了人参皂苷的生产方法，该方法包括：在糖基供体的存在下，使用BsUGT1催化下述一种或多种反应，以生产人参皂苷。

其中，R¹和R²为H或羟基基团，R³为H或糖基，R⁴为糖基；

其中，R¹为H或羟基基团，R²和R³相同或不同，各自独立地为糖基；

其中，R¹和R³相同或不同，各自独立地为糖基，R²为H或羟基基团；

其中，R¹为H或羟基，R²和R³相同或不同，各自独立地为糖基；

其中，R¹和R²相同或不同，各自独立地为糖基；或者

其中，R¹和R²相同或不同，各自独立地为糖基。

根据本发明的优选实施方式，取代基上的糖基包括葡萄糖(Glc)糖基、鼠李糖(Rha)糖基、半乳糖(Gal)糖基、乙酰基葡萄糖(Glc(6)Ac)糖基、阿拉伯呋喃糖(Araf)糖基、阿拉伯吡喃糖(Arap)糖基、或木糖(Xyl)糖基等。

根据本发明的优选实施方式，式(2)、式(4)、式(6)、式(8)、式(10)或式(12)的化合物为底物；式(3)、式(5)、式(7)、式(9)、式(11)或式(13)的化合物为产物人参皂苷。

在一个优选实施方式中，当式(2)的化合物为DM，式(3)的化合物为3β-O-Glc-DM。在一个优选实施方式中，当式(2)的化合物为PPD，式(3)的化合物为3β-O-Glc-PPD。在一个优选实施方式中，当式(2)的化合物为PPT，式(3)的化合物为3β-O-Glc-PPT。在一个优选实施方式中，当式(2)的化合物为Compound K，式(3)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-PPD。

在一个优选实施方式中，当式(4)的化合物为12β-O-Glc-PPD，式(5)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD。在一个优选实施方式中，当式(4)的化合物为12β-O-Glc-PPT，式(5)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

在一个优选实施方式中，当式(6)的化合物为Rh2，式(7)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD。在一个优选实施方式中，当式(6)的化合物为3β-O-Glc-PPT，式(7)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

在一个优选实施方式中，当式(8)的化合物为PPD，式(9)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD。在一个优选实施方式中，当式(8)的化合物为PPT，式(9)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

在一个优选实施方式中，当式(10)的化合物为DM，式(11)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-DM。

在一个优选实施方式中，当式(12)的化合物为20S-O-Glc-DM，式(13)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-DM。

在本发明中，糖基供体选自由以下物质所组成的组：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、UDP-乙酰基葡萄糖、ADP-乙酰基葡萄糖、TDP-乙酰基葡萄糖、CDP-乙酰基葡萄糖、GDP-乙酰基葡萄糖、UDP-木糖、ADP-木糖、TDP-木糖、CDP-木糖、GDP-木糖、UDP-半乳糖醛酸、ADP-半乳糖醛酸、TDP-半乳糖醛酸、CDP-半乳糖醛酸、GDP-半乳糖醛酸、UDP-半乳糖、ADP-半乳糖、TDP-半乳糖、CDP-半乳糖、GDP-半乳糖、UDP-阿拉伯糖、ADP-阿拉伯糖、TDP-阿拉伯糖、CDP-阿拉伯糖、GDP-阿拉伯糖、UDP-鼠李糖、ADP-鼠李糖、TDP-鼠李糖、CDP-鼠李糖、GDP-鼠李糖、或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。在一个优选实施方式中，糖基供体选自：UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖醛酸、UDP-半乳糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-鼠李糖，或其组合。

在一些优选实施方式中，该方法包括，分别制备本发明所述的糖基转移酶BsUGT1，以及底物式(2)、式(4)、式(6)、式(8)、式(10)或式(12)的化合物，然后在糖基供体的存在下进行反应。

在一个优选实施方式中，将BsUGT1与一种底物进行反应。在另一优选实施方式中，将BsUGT1与多种底物(例如，式(2)、式(4)、式(6)、式(8)、式(10)或式(12)所示的化合物中的两种以上的化合物)同时进行反应。

在另一些优选实施方式中，该方法包括将编码糖基转移酶BsUGT1的核苷酸序列与DM和/或PPD和/或PPT合成代谢途径中的关键基因在宿主细胞中共表达，从而获得所述式(3)、式(5)、式(7)、式(9)、式(11)或式(13)的化合物。

在一个优选实施方式中，所述宿主细胞为酵母菌或大肠杆菌。

在一个优选实施方式中，所述宿主细胞含有DM合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因。

在另一优选实施方式中，所述宿主细胞含有PPD合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因，或其组合。

在另一优选实施方式中，所述宿主细胞含有PPT合成代谢途径中的关键基因，所述关键基因包括但不限于：达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因及原人参三醇合酶基因，或其组合。

在第七个方面，本发明提供了BsUGT1用于生产稀有人参皂苷的用途。

有益技术效果

本发明的糖基转移酶BsUGT1能够催化人参皂苷前体的C3、C12和/或C20位羟基的糖基化，从而生成人参皂苷。该酶是首次发现的能够催化达玛烷型四环三萜类化合物的C12位羟基糖基化的酶。因此，该酶可以用来生产多种稀有人参皂苷，尤其是C12位糖基化的人参皂苷，其中包括新的稀有人参皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

此外，BsUGT1还可以作为基本元件参与构建稀有人参皂苷代谢途径，通过合成生物学技术开发产生稀有人参皂苷的新资源，为抗肿瘤创新药物研究提供原料，具有重要的理论意义和良好的应用前景。

附图说明

图1示出了枯草芽孢杆菌基因组DNA及BsUGT1克隆的琼脂糖凝胶电泳结果。图1A：枯草芽孢杆菌基因组DNA；图1B：BsUGT1。

图2示出了大肠杆菌表达BsUGT1的SDS-PAGE结果。其中，泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：阴性对照Transetta-32a破碎上清；泳道2：阴性对照Transetta-32a破碎沉淀；泳道3：Transetta-BsUGT1破碎上清；泳道4：Transetta-BsUGT1破碎沉淀。

图3示出了用HPLC和LC-MS检测重组BsUGT1催化DM糖基化的反应产物的图谱。图3A示出了阴性对照Transetta-32a粗酶液催化DM的HPLC图谱。图3B示出了Transetta-BsUGT1粗酶液催化DM的HPLC图谱。图3C示出了3β-O-Glc-DM的MS图谱。图3D示出了3β,20S-Di-O-Glc-DM的MS图谱。

图4示出了用HPLC和LC-MS检测重组BsUGT1催化PPD糖基化生成3β,12β-Di-O-Glc-PPD的图谱。图4A示出了阴性对照Transetta-32a粗酶液催化PPD的HPLC图谱。图4B示出了Transetta-BsUGT1粗酶液催化PPD生成3β,12β-Di-O-Glc-PPD的HPLC图谱。图4C示出了3β,12β-Di-O-Glc-PPD的MS图谱。

图5示出了用HPLC和LC-MS检测重组BsUGT1催化PPT糖基化生成3β,12β-Di-O-Glc-PPT的图谱。图5A示出了阴性对照Transetta-32a粗酶液催化PPT的HPLC图谱。图5B示出了Transetta-BsUGT1粗酶液催化PPT生成3β,12β-Di-O-Glc-PPT的HPLC图谱。图5C示出了3β,12β-Di-O-Glc-PPT的MS图谱。

图6示出了大肠杆菌表达糖基转移酶UGTPg1的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道M：蛋白质分子量标准；泳道1：阴性对照Transetta-32a破碎上清；泳道2：Transetta-UGTPg1破碎上清。

图7示出了用HPLC和LC-MS检测重组UGTPg1催化DM糖基化生成20S-O-Glc-DM的图谱。图7A示出了阴性对照Transetta-32a粗酶液催化DM的HPLC图谱。图7B示出了Transetta-UGTPg1粗酶液催化DM生成20S-O-Glc-DM的HPLC图谱。图7C示出了20S-O-Glc-DM的MS图谱。

图8示出了重组BsUGT1经镍亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳结果。

具体实施方式

下文描述了本发明的示例性实施方式，本领域技术人员应该明了的是，以下实施方式并不限制本发明的特定实施方式，应理解为包括本发明的精神和范围内的所有变体、等同物或替代物。多种调整和其它实施方式在本领域普通技术人员的能力范围内，并预期落入本发明的范围内。

除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如，可利用下列著作中描述的标准程序来实施：Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，ElsevierScience Publishing，Inc.，New York，USA(1995)；以及Current Protocols in CellBiology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等著，John Wiley and Sons，Inc.)。

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

在以下实施例中，克隆载体pEASY-Blunt simple vector购自全式金公司，表达载体pET-32a(+)载体购自Novagen公司。大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞和Transetta感受态细胞均购自Transgene公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶和Q5DNA polymerase均购自NewEngland Biolabs(NEB)公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和细菌质粒DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

化合物PPD、PPT、DM、Rh2、Rg3和Compound K等购自南京春秋生物工程有限公司。所用引物及测序均由睿博兴科生物技术有限公司完成。

实施例1.糖基转移酶基因BsUGT1的克隆

使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CTCC63501)基因组DNA(图1A)。以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，使用引物BsUGT1-F(SEQ IDNO：3)和BsUGT1-R(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增，得到糖基转移酶基因BsUGT1(SEQ ID NO：2)。其中，所使用的引物BsUGT1-F(SEQ ID NO：3)和BsUGT1-R(SEQ ID NO：4)的序列在表1中列出。将PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳中进行检测(图1B)。

表1引物序列

PCR反应体系和反应条件：

PCR反应体系(50μL)

PCR反应条件

98℃，2min

98℃，15s；55-60℃，30s；72℃，1kb/15-30s；30循环

72℃，10min

4℃，∞

PCR反应结束后，取4μL PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt simple vector连接，PCR产物和克隆载体连接的反应条件如下：室温(20℃-37℃)反应20min。将连接产物直接转化Trans1-T1感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，选取PCR结果正确的转化子进行测序确证，质粒命名为pEASY-Blunt-BsUGT1。

测序结果表明，糖基转移酶基因BsUGT1的长度为1179bp，与琼脂糖凝胶电泳结果吻合，并具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

实施例2.糖基转移酶BsUGT1的原核表达

根据质粒pEASY-Blunt-BsUGT1测序获得的序列信息，设计引物BsUGT1-F1(SEQ IDNO：5)和BsUGT1-R1(SEQ ID NO：6)，扩增与原核表达质粒pET-32a(+)具有同源臂的PCR片段BsUGT1，同时引入限制性酶切位点BamH I和Sal I，引物序列见表2。

表2引物序列

PCR反应体系和反应条件：

PCR反应体系(50μL)

PCR反应条件

98℃，2min

98℃，15s；55-60℃，30s；72℃，1kb/15-30s；30循环

72℃，10min

4℃，∞

利用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切表达载体pET-32a(+)。将PCR片段和双酶切处理的载体切胶回收。建立如下eFusion反应体系，将BsUGT1与pET-32a(+)连接：

室温反应30min后，立即转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。挑取转化子，进行菌落PCR验证，选取PCR结果正确的转化子测序，验证目的基因正确插入以及表达盒正确无误，将重组质粒命名为pET-32a(+)-BsUGT1。

挑取测序正确的转化子，过夜培养，提取质粒pET-32a(+)-BsUGT1。将对照质粒pET-32a(+)和重组质粒pET-32a(+)-BsUGT1分别转化Transetta感受态细胞，得到阴性对照转化菌株Transetta-32a，以及Transetta-BsUGT1。挑取转化子，接种于30mL LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～1；以1％接种量转接于100mL LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，共接种30瓶。37℃，220rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～1，加入IPTG至终浓度1mM，16℃，180rpm培养16h，诱导重组蛋白表达。使用SDS-PAGE电泳进行检测。

结果表明，BsUGT1在大肠杆菌中以可溶性形式表达，从而建立了BsUGT1的原核表达系统(见图2)。

实施例3.重组BsUGT1催化DM糖基化活性检测

以Transetta-32a细胞为阴性对照组，将Transetta-32a细胞和Transetta-BsUGT1细胞进行超声破碎。以破碎上清作为粗酶液，以UDP-葡萄糖为糖基供体，DM为底物，进行体外酶促反应。

糖基转移酶催化活性鉴定体系：100μL，20mM Tris-HCl(pH 8.0)

粗酶液： 88μL

50mM底物： 2μL

50mM UDPG： 10μL

反应体系混匀，37℃，静置反应24h，加入200μL冰甲醇终止反应，混匀，12000rpm离心10min，取上清过0.45μm滤膜，利用HPLC检测BsUGT1催化DM的糖基化产物。

HPLC检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150mm，流速为1mL/min，紫外检测波长为203nm，进样30μL。流动相：0min，20％乙腈-水；20min，95％乙腈-水；30min，100％乙腈；40min，100％乙腈；41min，20％乙腈-水；50min，20％乙腈-水。

结果显示，对照组中仅检测到保留时间(Rt)为25.37min的DM底物峰，没有产物生成(图3A)；以BsUGT1粗酶液进行催化实验中，分别在Rt为10.99min和17.93min有明显的产物峰，即峰1和峰2，其紫外吸收与底物一致(图3B)。利用LC-MS分别对两种产物进行检测，结果显示，产物1的分子量为606.5，相较于DM分子量444.5，增加了162；¹H-NMR和¹³C-NMR确证产物1是在BsUGT1催化作用下，由DM发生一次糖基化生成的产物3β-O-Glc-DM(图3C)；产物2的分子量为768.5，相较于DM分子量444.5，增加了324；¹H-NMR和¹³C-NMR确证产物2是在BsUGT1催化作用下，由DM发生两次糖基化生成的产物3β,20S-Di-O-Glc-DM(图3D)。

3β,20S-Di-O-Glc-DM：ESI-MS m/z 791.49[M+Na]⁺；¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d₄)δ131.71,(C-25),126.31,(C-24),90.80,(C-3),83.76,(C-20),57.68,(C-5),52.17,(C-14),51.50,(C-17),49.63,(C-9),43.49,(C-13),41.66,(C-21),40.83,(C-4),40.39,(C-1),40.32,(C-10),38.01,(C-8),36.49,(C-7),32.28,(C-11),28.86,(C-15),28.40,(C-28),27.23,(C-2),25.97,(C-16),25.92,(C-12),23.74,(C-26),22.76,(C-21),21.70,(C-23),19.27,(C-6),17.94,(C-27),17.05,(C-19),16.89,(C-29),16.80,(C-18),16.08(C-30),106.74,(C-1′),75.67,(C-2′),78.55,(C-3′),71.80,(C-4′),77.68,(C-5′),62.96,(C-6′),98.53,(C-1″),75.56,(C-2″),78.28,(C-3″),71.65,(C-4″),77.44,(C-5″),62.79,(C-6″)。

实施例4.重组BsUGT1催化PPD糖基化活性检测

以PPD为底物，以与实施例3相同的酶促反应条件进行反应。

HPLC检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150mm，流速为1mL/min，紫外检测波长为203nm，进样30μL。流动相：0min，20％乙腈-水；20min，85％乙腈-水；30min，100％乙腈；40min，100％乙腈；41min，20％乙腈-水；50min，20％乙腈-水。

结果显示，对照组中仅检测到Rt为24.44min的PPD底物峰(图4A)；以BsUGT1粗酶液进行催化实验中，在Rt为12.93min有明显的产物峰，其紫外吸收与底物一致(图4B)。利用LC-MS对该产物进行检测，结果显示其分子量为784.5，相较于PPD分子量460.5，增加了324；¹H-NMR和¹³C-NMR确证该产物是在BsUGT1催化作用下，由PPD发生两次糖基化生成的产物3β,12β-Di-O-Glc-PPD(图4C)。

3β,12β-Di-O-Glc-PPD：ESI-MS m/z 807.48[M+Na]⁺；¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d₄)δ131.85,(C-25),126.32,(C-24),90.66,(C-3),71.67,(C-12),70.96,(C-20),57.54,(C-5),55.03,(C-14),53.19,(C-17),51.19,(C-9),49.63,(C-13),47.32,(C-22),40.97,(C-4),40.36,(C-1),40.03,(C-10),38.16,(C-8),36.71,(C-7),35.76,(C-11),31.87,(C-15),28.67,(C-2),28.39,(C-16),27.17,(C-21),26.19,(C-26),25.92,(C-28),23.30,(C-23),19.21,(C-6),17.76,(C-27),17.39,(C-19),16.78,(C-18and C-29),16.19,(C-30),106.78,(C-1′),77.68,(C-2′),79.46,(C-3′),75.14,(C-4′),78.28,(C-5′),62.81,(C-6′),100.58,(C-1″),75.66,(C-2″),78.40,(C-3″),74.77,(C-4″),78.01,(C-5″),62.37,(C-6″)。

实施例5.重组BsUGT1催化PPT糖基化活性检测

以PPT为底物，以与实施例3相同的酶促反应条件进行反应。

HPLC检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150mm，流速为1mL/min，紫外检测波长为203nm，进样30μL。流动相：0min，10％乙腈-水；20min，55％乙腈-水；30min，70％乙腈；31min，100％乙腈；40min，100％乙腈；41min，10％乙腈-水；50min，10％乙腈-水。

结果显示，对照组中仅检测到Rt为23.72min的PPT底物峰(图5A)；在BsUGT1粗酶液进行催化实验中，在Rt为15.12min有明显的产物峰，其紫外吸收与底物一致(图5B)。利用LC-MS对该产物进行检测，结果显示其分子量为800.5，相较于底物PPT分子量476.5，增加了324；¹H-NMR和¹³C-NMR确证该产物是在重组BsUGT1催化作用下，由PPT发生两次糖基化生成的产物3β,12β-Di-O-Glc-PPT(图5C)。

3β,12β-Di-O-Glc-PPT：ESI-MS m/z 823.48[M+Na]⁺；¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d₄)δ131.85,(C-25),126.29,(C-24),90.68,(C-3),74.76,(C-20),70.97,(C-12),68.79,(C-6),62.82,(C-5),55.05,(C-17),53.02,(C-14),50.54,(C-9),47.10,(C-13),46.95,(C-7),41.93,(C-8),40.94,(C-4),40.00,(C-10),39.82,(C-1),36.64,(C-22),31.82,(C-11),31.19,(C-28),28.60,(C-15),27.60,(C-2),26.94,(C-21),26.14,(C-16),25.92,(C-26),23.29,(C-23),17.76,(C-18and C-27),17.63,(C-19),17.40,(C-30),16.80,(C-29),107.00,(C-1′),78.28,(C-2′),79.31,(C-3′),71.68,(C-4′),78.00,(C-5′),62.35,(C-6′),100.55,(C-1″),75.14,(C-2″),75.71,(C-3″),77.69,(C-4″),78.43,(C-5″),62.38,(C-6″)。

实施例6.重组BsUGT1催化3β-O-Glc-DM糖基化活性检测

以实施例3制备的3β-O-Glc-DM为底物，按照实施例3的酶促方法和检测方法进行反应和检测。结果表明，重组BsUGT1催化3β-O-Glc-DM生成3β,20S-Di-O-Glc-DM。

实施例7.重组BsUGT1催化20S-O-Glc-DM糖基化活性检测

7.1底物20S-O-Glc-DM的制备

根据文献，Yan等在人参中克隆到了一个糖基转移酶基因UGTPg1(SEQ ID NO:7)，建立了其原核表达系统(Yan X，Fan Y，Wei W等，Cell Research，2014，24：770-773，以引用的方式将其整体并入本文)。体外酶促反应证明，在UGTPg1的催化作用下，PPD的C20位羟基糖基化生成稀有人参皂苷Compound K，且原人参二醇合酶CYP1和糖基转移酶UGTPg1的催化反应顺序可以发生前后调换，即UGTPg1先催化DM的C20位羟基糖基化生成20S-O-Glc-DM，也称为DMG，进而在原人参二醇合酶CYP1的催化作用下C12位羟基化，生成稀有人参皂苷Compound K。有鉴于此，利用UGTPg1催化DM的C20位羟基糖基化制备20S-O-Glc-DM作为BsUGT1的催化底物。

根据GenBank注册的UGTPg1的CDS序列(GenBank：KF377585.1)，采用基因合成方法直接合成基因UGTPg1，两端引入BamH I和Sal I酶切位点，连接到pUC57克隆载体，构建了克隆质粒pUC57-UGTPg1。

将质粒pUC57-UGTPg1和载体pET-32a(+)分别用限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切处理，分别切胶回收酶切目的片段和表达载体。建立T4DNA Ligase连接体系，将目的片段连接到pET-32a(+)，转化Trans1-T1感受态细胞。

挑取转化子，进行菌落PCR，提取质粒并测序，验证目的基因正确插入以及读码框架正确。表达质粒命名为pET-32a(+)-UGTPg1。

然后根据实施例2的方法，表达糖基转移酶UGTPg1，SDS-PAGE检测结果见图6。

以DM为底物，UDPG为糖基供体，利用重组UGTPg1粗酶液进行催化，HPLC检测反应产物。

HPLC检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150mm，流速为1mL/min，紫外检测波长为203nm，进样30μL。流动相：0min，20％乙腈-水；20min，95％乙腈-水；30min，100％乙腈；40min，100％乙腈；41min，20％乙腈-水；50min，20％乙腈-水。

结果显示，对照组中仅检测到Rt为25.37min的DM底物峰(图7A)；在UGTPg1粗酶液进行催化实验中，在Rt为17.11min有明显的产物峰，其紫外吸收与底物一致(图7B)。利用LC-MS对该产物进行检测，结果显示，该产物分子量为606.5，与DM分子量444.5相比，增加了162；¹H-NMR和¹³C-NMR确证该产物是在重组UGTPg1催化作用下，由DM发生一次糖基化反应生成的产物20S-O-Glc-DM(图7C)。

20S-O-Glc-DM：ESI-MS m/z 629.44[M+Na]⁺；¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d₄)δ131.70,126.31,98.53,83.75,79.64,78.55,77.44,75.56,71.79,62.95,57.39,52.18,51.51,49.62,43.49,41.63,40.83,40.39,40.07,38.26,36.48,32.29,28.85,28.60,28.06,25.97,25.92,23.74,22.75,21.69,19.44,17.94,17.04,16.84,16.11,16.07。

7.2重组BsUGT1催化20S-O-Glc-DM生成3β,20S-Di-O-Glc-DM

以7.1制备的20S-O-Glc-DM为底物，按照实施例3的酶促方法和检测方法进行反应和检测。结果表明，重组BsUGT1催化20S-O-Glc-DM生成3β,20S-Di-O-Glc-DM。

实施例8.重组BsUGT1催化Rh2和3β-O-Glc-PPT糖基化活性检测

以Rh2和3β-O-Glc-PPT为底物，按照实施例3的酶促方法、以及实施例4和实施例5的检测方法进行反应和检测。结果表明，重组BsUGT1催化Rh2和3β-O-Glc-PPT生成3β,12β-Di-O-Glc-PPD和3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

实施例9.重组BsUGT1催化12β-O-Glc-PPD和12β-O-Glc-PPT糖基化活性检测

以12β-O-Glc-PPD和12β-O-Glc-PPT为底物，按照实施例3的酶促方法、以及实施例4和实施例5的检测方法进行反应和检测。结果表明，重组BsUGT1催化12β-O-Glc-PPD和12β-O-Glc-PPT生成3β,12β-Di-O-Glc-PPD和3β,12β-Di-O-Glc-PPT。

实施例10糖基转移酶BsUGT1的纯化和制备

根据实施例2的方法，制备羧基末端连接有6×His的糖基转移酶BsUGT1。

然后，按照Recombinant Protein Purification handbook(Principles andMethods)操作手册，建立BsUGT1纯化方法。纯化过程中所有步骤，均在4℃下操作。纯化步骤如下：

(1)制备蛋白样品：用适量结合缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mMimidazole，pH 8.0)将菌体重悬，超声破碎细胞(15min，40％，5s，5s)。4℃，13000rpm，离心30min，上清用0.22μm滤膜过滤。

(2)Ni亲和层析柱的处理：用10倍柱体积的双蒸水冲洗，用10倍柱体积结合缓冲液平衡。

(3)将过膜后的蛋白样品上柱，流速控制在0.5～1.0mL/min。用5倍柱体积结合缓冲液冲洗杂蛋白，再用结合缓冲液配制50mM咪唑洗脱液，冲洗5倍柱体积，收集洗脱液，SDS-PAGE蛋白电泳检测。

合并含目的蛋白洗脱液，用30kDa超滤管超滤浓缩目的蛋白，最后补加脱盐缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM DTT，1.5％甘油，pH 8.0)脱盐，浓缩至1mL，-80℃保存。

结果表明，BsUGT1(61.48kDa)基本被50mM咪唑全部洗脱，且条带单一(见图8)。

实施例11细胞毒活性评价

以Compound K、Rg3和Rh2为对照，采用MTT方法检测3β-O-Glc-DM、3β,20S-Di-O-Glc-DM、3β,12β-Di-O-Glc-PPD、3β,12β-Di-O-Glc-PPT、12β-O-Glc-PPD和12β-O-Glc-PPT对体外培养的肿瘤细胞HCT116(人结肠癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、NCI-H460(人肺癌细胞株)和Capan2(人胰腺癌细胞株)的生长抑制作用。

结果表明，3β-O-Glc-DM和20S-O-Glc-DM对HCT116(人结肠癌细胞株)表现出较强的生长抑制作用，且3β-O-Glc-DM活性强于20S-O-Glc-DM，两者活性均强于阳性对照Compound K、Rg3和Rh2；3β,12β-Di-O-Glc-PPD和12β-O-Glc-PPD对NCI-H460(人肺癌细胞株)表现出较强的生长抑制作用，两者活性均强于阳性对照Compound K、Rg3和Rh2(见表3)。

表3人参皂苷对肿瘤细胞的细胞毒活性评价

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 枯草芽孢杆菌糖基转移酶及其应用

<130> 002

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

Met Lys Lys His His Ile Ser Met Ile Asn Ile Pro Ala Tyr Gly His

1 5 10 15

Val Asn Pro Thr Leu Ala Leu Val Glu Lys Leu Cys Glu Lys Gly His

20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Phe Ala Pro Ala Val Gln Gln

35 40 45

Ala Gly Gly Glu Ala Leu Ile Tyr His Thr Ser Leu Asn Ile Asp Pro

50 55 60

Lys Gln Ile Arg Glu Met Met Glu Lys Asn Asp Ala Thr Leu Ser Leu

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ser Leu Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu Glu Leu Tyr Lys

85 90 95

Asp Asp Gln Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Val Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Asp Lys Leu Asn Val Pro Val Ile Lys Leu Cys Ser

115 120 125

Ser Tyr Ala Gln Asn Glu Ser Phe Gln Leu Gly Asn Glu Asp Met Leu

130 135 140

Lys Lys Ile Lys Glu Ala Glu Ala Glu Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Gln

145 150 155 160

Glu Gln Leu Pro Ala Val Ser Phe Glu Gln Leu Ala Val Pro Glu Ala

165 170 175

Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Lys Ser Phe Gln Ile Gln His Glu Thr

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Phe Cys Phe Val Gly Pro Ser Leu Gly Lys Arg Thr

195 200 205

Glu Gln Glu Ser Leu Leu Ile Asp Lys Gly Asp Arg Pro Leu Met Leu

210 215 220

Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro Glu Phe Tyr Lys Met

225 230 235 240

Cys Ile Asp Ala Phe Arg Asp Ser Ser Trp Gln Val Ile Met Ser Val

245 250 255

Gly Lys Ser Ile Asp Pro Glu Ser Leu Asp Asp Thr Pro Ala Asn Phe

260 265 270

Thr Ile Arg Gln Ser Val Pro Gln Leu Glu Val Leu Ala Lys Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ile Ser His Gly Gly Met Asn Ser Thr Met Glu Ala Met Asn

290 295 300

Ala Gly Val Pro Leu Val Val Ile Pro Gln Met Tyr Glu Gln Glu Leu

305 310 315 320

Thr Ala Lys Arg Val Asp Glu Leu Gly Leu Gly Val Tyr Leu Gln Arg

325 330 335

Glu Glu Val Thr Val Ser Lys Leu Gln Glu Ala Val Gln Ala Val Ser

340 345 350

Gly Asp Gln Glu Leu Leu Ser Arg Val Lys Ser Met Gln Lys Asp Val

355 360 365

Lys Glu Ala Gly Gly Ala Glu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Glu Ala Phe

370 375 380

Met Lys Lys Ser Ala Val Pro Gln

385 390

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<220>

<223> BsUGT1

<400> 2

atgaaaaagc accatatttc gatgatcaat atccctgcgt acgggcatgt caatcctacg 60

ctagcattag tggagaagct ttgtgagaaa gggcatcgtg tcacgtatgc gacgactgag 120

gaatttgcgc ccgctgttca gcaagccggt ggagaagcat tgatttatca tacatccttg 180

aatattgatc ctaagcaaat cagggagatg atggaaaaga atgacgcgac gctcagtcta 240

ttgaaagaat cactcagcat tctgccgcag cttgaggagt tatataaaga tgatcagcct 300

gatctgatca tctatgactt tgtcgcactt gcgggaaaat tgtttgctga taaacttaat 360

gtgccggtca tcaagctctg ttcatcatat gcccaaaatg aatcctttca gcttggaaat 420

gaagacatgc tgaaaaagat aaaagaagcc gaggctgaat ttaaagccta cttggagcaa 480

gagcaattgc cggctgtttc atttgaacaa ttagctgtgc cggaagcatt aaatattgtc 540

tttatgccga aatcctttca gattcagcat gagacgttcg atgaccgttt ctgttttgtc 600

ggcccttccc ttggaaaacg gacggaacaa gaaagcctgt tgattgacaa gggtgatcgt 660

ccgcttatgc tgatttcttt gggaacggca tttaacgcat ggccggaatt ttacaagatg 720

tgcatcgatg catttcggga ttcttcatgg caagtgatca tgtcggtcgg gaaatcgatt 780

gatcctgaaa gcttggatga tacccctgct aactttacca ttcgccaaag cgtgccgcag 840

cttgaggtgt tagcgaaagc cgatttgttt atttctcatg gcgggatgaa cagtacgatg 900

gaagcgatga atgccggtgt gccgctcgtc gtcattccgc aaatgtatga gcaggagctc 960

accgcaaagc gtgtcgatga gttaggtctt ggcgtttatt tgcaaagaga agaagttact 1020

gtttccaagc tgcaggaagc ggttcaggcc gtatccggtg atcaagagct gctcagccgc 1080

gtcaagagta tgcaaaagga tgtaaaagaa gcaggcggag cggagcgtgc ggcagctgag 1140

attgaagcgt ttatgaaaaa atccgctgta ccgcaataa 1179

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BsUGT1-F

<400> 3

ataaggagac tggagattc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BsUGT1-R

<400> 4

attgatttcg gtttttatg 19

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BsUGT1-F1

<400> 5

gccatggctg atatcggatc catgaaaaag caccatattt c 41

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BsUGT1-R1

<400> 6

gcggccgcaa gcttgtcgac ttattgcggt acagcgg 37

<210> 7

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UGTPg1

<400> 7

atgaagtctg agttgatatt cttgcctgca cctgctattg gacacttggt cggaatggtc 60

gagatggcaa agttattcat ttctaggcac gagaatttgt cagttacagt tttgatagca 120

aaattctaca tggatactgg agtcgataac tataataagt ctttgttgac aaaccctact 180

ccaaggttga ctattgtcaa cttgcctgag actgaccctc agaactatat gttgaagcca 240

aggcatgcaa tatttccatc tgttattgag acacagaaga cacacgtcag ggacattata 300

tcaggaatga cacagtctga gtcaacaagg gtcgtcggat tgttggctga cttattgttt 360

ataaacatta tggacatagc aaacgagttc aacgtcccta catacgtcta ctcacctgct 420

ggtgcaggac acttgggatt ggcattccac ttacaaacat tgaatgataa aaaacaggat 480

gttacagagt tcaggaactc tgacacagag ttattagtcc cttcttttgc aaacccagtc 540

ccagctgagg tcttgccatc aatgtacgtt gacaaggagg gaggttacga ctatttgttc 600

tctttgttta gaaggtgcag ggaatctaag gcaataatta ttaacacttt cgaggaatta 660

gagccatacg ctattaattc tttgaggatg gattcaatga taccaccaat atacccagtc 720

ggtcctattt taaacttgaa tggtgatggt cagaactctg acgaggctgc tgtcatattg 780

ggttggttgg acgaccagcc accatcatca gtcgtcttct tgtgcttcgg ttcatacgga 840

actttccagg agaaccaggt taaggaaatt gcaatgggat tggagaggtc aggtcacagg 900

ttcttgtggt ctttgaggcc atcaattcct aagggtgaaa ctaaattgca attgaaatac 960

tcaaacttag aggaaatatt gccagtcgga ttcttggaca ggacatcatg cgtcggtaag 1020

gtcattggat gggctccaca ggttgcagtt ttgggacacg aggcagttgg tggtttcttg 1080

tctcattgcg gttggaactc tacattggag tctgtctggt gcggtgttcc agtcgcaaca 1140

tggcctatgt acggagagca gcagttgaac gcttttgaga tggtcaagga gttgggtata 1200

gctgtcgaga ttgaggttga ctacaagaac gactacttca acatgaaaaa cgactttata 1260

gtcagggctg aggaaattga gactaaaatt aagaagttga tgatggacga gaataactct 1320

gagattagga agaaggtcaa ggagatgaag gagaagtcta gggctgcaat gtctgagaac 1380

ggttcttctt ataactcttt ggctaagttg ttcgaggaga taatgtaa 1428

Claims (11)

1.一种使达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化的糖基转移酶BsUGT1，其特征在于，所述糖基转移酶BsUGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的序列。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码如权利要求1所述的糖基转移酶BsUGT1的多核苷酸。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有如权利要求3所述的载体，或所述重组细胞的基因组中整合有如权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种糖基化方法，所述方法包括：在如权利要求1所述的糖基转移酶BsUGT1的存在下，进行糖基化反应。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于，使达玛烷型四环三萜类化合物的C3、C12和/或C20位上的羟基糖基化。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述达玛烷型四环三萜类化合物为达玛烷型人参皂苷前体或达玛烷型人参皂苷；所述达玛烷型人参皂苷前体为达玛烯二醇-II(DM)、原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)；所述达玛烷型人参皂苷为Compound K、12β-O-Glc-PPD、12β-O-Glc-PPT、Rh2或3β-O-Glc-PPT。

8.一种稀有人参皂苷的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在糖基供体的存在下，使用如权利要求1所述的糖基转移酶BsUGT1催化下述一种或多种反应，以生产稀有人参皂苷；

其中，R¹和R²为H或羟基基团，R³为H或糖基，R⁴为糖基；

其中，R¹为H或羟基基团，R²和R³相同或不同，各自独立地为糖基；

其中，R¹和R³相同或不同，各自独立地为糖基，R²为H或羟基基团；

其中，R¹为H或羟基，R²和R³相同或不同，各自独立地为糖基；

其中，R¹和R²相同或不同，各自独立地为糖基；或者

其中，R¹和R²相同或不同，各自独立地为糖基。

9.根据权利要求8的生产方法，其特征在于，所述糖基包括葡萄糖糖基、鼠李糖糖基、半乳糖糖基、乙酰基葡萄糖糖基、阿拉伯呋喃糖糖基、阿拉伯吡喃糖糖基或木糖糖基。

10.根据权利要求8的生产方法，其特征在于，

当式(2)的化合物为达玛烯二醇-II，式(3)的化合物为3β-O-Glc-DM；

当式(2)的化合物为原人参二醇，式(3)的化合物为3β-O-Glc-PPD；

当式(2)的化合物为原人参三醇，式(3)的化合物为3β-O-Glc-PPT；

当式(2)的化合物为Compound K，式(3)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-PPD；

当式(4)的化合物为12β-O-Glc-PPD，式(5)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD；

当式(4)的化合物为12β-O-Glc-PPT，式(5)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT；

当式(6)的化合物为Rh2，式(7)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD；

当式(6)的化合物为3β-O-Glc-PPT，式(7)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT；

当式(8)的化合物为原人参二醇，式(9)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPD；

当式(8)的化合物为原人参三醇，式(9)的化合物为3β,12β-Di-O-Glc-PPT；

当式(10)的化合物为达玛烯二醇-II，式(11)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-DM；或者

当式(12)的化合物为20S-O-Glc-DM，式(13)的化合物为3β,20S-Di-O-Glc-DM。

11.权利要求1所述的糖基转移酶BsUGT1在生产稀有人参皂苷中的应用。