CN109868265B

CN109868265B - 新型糖基转移酶及其应用

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Publication number: CN109868265B
Application number: CN201711250803.2A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 孙雨伟; 陈卓; 李建华
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN109868265A

Abstract

本发明涉及新型糖基转移酶及其应用。所述的糖基转移酶能够特异和高效地催化四环二萜类化合物的特定位点加上糖基，从而产生一类糖基化的四环二萜化合物。

Description

新型糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于植物学及化工领域，更具体地，本发明涉及新型UDP-糖基转移酶及其应用。

背景技术

糖基化修饰是天然产物中广泛存在的一类后修饰反应，往往发生在生物合成途径的终端，因此对天然产物的理化性质和生理活性有着重要影响。许多植物来源的活性次级代谢产物以糖苷的形式存在于自然界中。植物次级代谢产物的糖基化修饰反应主要由尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶催化发生。UDP-糖基转移酶(UGT)将糖基从活化的糖基供体分子转移到糖基受体分子上。

甜菊糖苷(steviol glycosides)是一类贝壳杉烯型四环二萜类糖苷化合物，原产自菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana)，具有甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，因此成为天然甜味剂的佼佼者，广泛应用于食品、饮料、调味剂加工等生产工业中，可以避免蔗糖等传统糖料长期或过量食用引发的肥胖病、高血压、糖尿病和龋齿等危害健康的疾病。欧盟于2011年批准甜菊糖可作为食品添加剂使用。

甜菊糖苷迄今为止仅在四个植物物种中被报道过，分别是菊科甜菊属的甜叶菊S.rebaudiana和Stevia phlebophylla A.Gray、蔷薇科悬钩子属甜叶悬钩子Rubussuavissimus S.Lee以及伞形科当归属明日叶Angelica keiskei(Miq.)Koidz.。

随着近十年合成生物学技术的进步，利用微生物异源合成的方法生产某些化合物成为可能，它具有成本低，占地面积少，产品质量易控等优点。因此，本领域有必要发现和鉴定新的糖基转移酶，以更为精确、专一地进行糖基转移，高效生产工业上或食品行业中有用的化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供新型UDP-糖基转移酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供分离的多肽，所述多肽选自：(a)具有SEQ ID NO:1，SEQID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；(b)(a)的保守性变异多肽。

在一个优选例中，所述的保守性变异多肽选自：

(1)由(a)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；

(2)氨基酸序列与(a)多肽的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)相同性，且具有多肽(a)功能的多肽；或

(3)在(a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽来源于明日叶。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，它编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：培养所述的宿主细胞；收集含有所述的多肽的培养物。

在一个优选例中，所述的方法还包括：从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于在具有母核(I)结构的化合物上转移上一个糖基，形成如式(II)结构的化合物；其中，所述的多肽为SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽；

其中，R独立地选自：H，OH，O-β-D-葡萄糖基，O-β-D-葡萄糖基-(2→1)-β-D-葡萄糖基。

在一个优选例中，所述的具有母核(I)结构的化合物包括：对映-贝壳杉烯酸，甜菊醇，甜菊醇单糖苷，甜菊醇双糖苷；和/或所述的式(II)结构的化合物包括：对映-贝壳杉烯酸-19-O-葡萄糖酯，甜菊醇-19-O-葡萄糖酯，甜叶悬钩子苷，甜菊苷。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于在具有母核(III)结构的化合物上转移上一个糖基，形成如式(IV)结构的化合物；其中，所述的多肽为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽；

其中，R独立地选自：H，O-β-_D-葡萄糖基。

在一个优选例中，所述的具有母核(III)结构的化合物包括：甜菊醇，甜菊醇-19-O-葡萄糖酯；和/或所述的式(IV)结构的化合物包括：甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷。

在另一优选例中，所述的糖基的供体是含有糖基的化合物；较佳地，所述的供体包括(但不限于)：UDP-葡萄糖，UDP-鼠李糖，UDP-木糖；或者概括为UDP-糖。

在本发明的另一方面，提供一种用于糖基转移的组合物，它含有所述的多肽或含有所述的宿主细胞、其培养物或裂解产物。

在本发明的另一方面，提供一种在具有母核(I)结构的化合物上转移上一个糖基的方法，所述方法包括：以多肽，表达该多肽的宿主细胞、其培养物或裂解产物，或含有该多肽的组合物将糖基转移到具有母核(I)结构的化合物，从而形成如式(II)结构的化合物；

其中，R独立地选自：H，OH，O-β-D-葡萄糖基，O-β-D-葡萄糖基-(2→1)-β-D-葡萄糖基；其中，所述的多肽为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽。

在本发明的另一方面，提供一种在具有母核(III)结构的化合物上转移上一个糖基的方法，所述方法包括：以多肽，表达该多肽的宿主细胞、其培养物或裂解产物，或含有该多肽的组合物将糖基转移到具有母核(III)结构的化合物，形成如式(IV)结构的化合物；

其中，R独立地选自：H，O-β-D-葡萄糖基；

其中，所述的多肽为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽。

在一个优选例中，所述的糖基的供体是含有糖基的化合物；较佳地，所述的供体包括(但不限于)：UDP-葡萄糖，UDP-鼠李糖，UDP-木糖；或者概括为UDP-糖。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、以甜菊醇为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图1B、以甜菊醇为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的核磁共振氢谱和碳谱分析。

图1C、以甜菊醇为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的二维核磁异核多重键相关谱(HMBC)。

图2、Ak13GT体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图3、以对映-贝壳杉烯酸(ent-kaur-16-en-19-oic acid)为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图4、以甜菊醇单糖苷(steviolmonoside)为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图5、以甜菊醇双糖苷(steviolbioside)为底物，Ak19GT1和Ak19GT2体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图6A～H、分别以甜菊醇(steviol)、对映-贝壳杉烯酸(ent-kaur-16-en-19-oicacid)、甜菊醇单糖苷(steviolmonoside)、甜菊醇双糖苷(steviolbioside)为底物，以Ak19GT1或Ak19GT2进行体外酶催化，获得的产物的LC-MS鉴定结果。

图7、以甜菊醇为底物，Ak13GT体外酶催化反应转化产物的HPLC分析。

图8A、以甜菊醇-19-O-葡萄糖酯为底物，Ak13GT体外酶催化反应转化产物的LC-MS分析结果。

图8B、以甜菊醇为底物，Ak13GT体外酶催化反应转化产物的LC-MS分析结果。

具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选和深入的研究，从明日叶(Angelica keiskei)这一物种中筛选出一系列新型的参与萜类糖基化的尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶。所述的糖基转移酶能够特异和高效地催化四环二萜类化合物的C-4羧基或C-13羟基的糖基化，从而产生一类糖基化的四环二萜化合物。

活性多肽、其编码基因、载体及宿主

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明揭示了一组新的、参与萜类糖基化的尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶，它们分别具有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。

本发明的多肽优选来自于明日叶。明日叶又名明日草、八丈草，原产于日本太平洋沿海的伊豆、八丈等海外离岛，因其生长迅速、生命力强盛，被发现“今日摘叶，明日又长新芽”而得名。明日叶已被引进中国。近年来发现明日叶中富含活性成分查尔酮、香豆素、黄酮，以及人体所需的多种矿物质、蛋白质、维生素等，具有抗癌、调节血糖血脂、抗氧化、抗炎等功效。

本发明也包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的保守性变异多肽。所述的“保守性变异多肽”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

所述的“保守性变异多肽”可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述的“保守性变异多肽”可以包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较20个或10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。例如，在本发明的优选实施例中，将糖基转移酶基因Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT克隆并异源表达在大肠杆菌中，产生的N端或/和C端连有标签的融合蛋白，能够特异和高效地催化四环二萜类化合物贝壳杉烯酸、甜菊醇及其衍生物的C-4羧基或C-13羟基的糖基化，从而产生一类糖基化的四环二萜化合物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在本发明的多肽的氨基端添加上信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明的多肽(含其保守性变异多肽)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，枯草杆菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母，植物细胞，灵芝细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是原核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括(但不限于)：大肠杆菌。

本发明的方法中，所述的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明的较佳实施例中，本发明人通过挖掘明日叶的转录组信息，将新型糖基转移酶基因Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT克隆并异源表达在大肠杆菌中，发现异源表达的重组蛋白能够特异和/或高效地催化四环二萜类化合物贝壳杉烯酸、甜菊醇及其衍生物的C-4羧基或C-13羟基的糖基化，从而产生甜叶悬钩子苷(rubusoside)等糖基化的四环二萜化合物。

因此，可通过将本发明的新型UDP糖基转移酶应用于人工构建的重组宿主系统，通过发酵工程生产甜菊糖苷类化合物。例如，在本发明的实施例中，将携带明日叶新型糖基转移酶Ak19GT1，Ak19GT2和Ak13GT的质粒与携带构建甜菊醇(steviol)骨架所需关键功能基因的质粒，共转于大肠杆菌中，获得大肠杆菌工程菌。此外，应理解，本发明的新型UDP糖基转移酶的应用不受工程化宿主细胞种属的限制，也可被应用于其他工程化宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞，如细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等，从而获得可以合成甜菊糖苷类化合物的工程化细胞。

在本发明的较佳实施例中，将构建的大肠杆菌工程菌，在TB培养基中低温培养发酵，获得发酵液。发酵液离心，获得上清液和菌体。菌体用水混悬，经破碎后用正丁醇萃取；上清液用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液。将正丁醇萃取液蒸发后用甲醇复溶，进行HPLC分析。

应用

本发明的Ak19GT1，Ak19GT2或Ak13GT多肽或它们的保守性变异多肽，可应用于特异和高效地催化四环二萜类化合物的C-4羧基或C-13羟基的糖基化，从而产生一类糖基化的四环二萜化合物。

作为本发明的一种优选方式，发挥催化活性的多肽为Ak19GT1或Ak19GT2，并且能够催化下述反应：

此处，所述的四环二萜类化合物例如但不限于对映-贝壳杉烯酸，甜菊醇，甜菊醇单糖苷，甜菊醇双糖苷及其衍生物；其加上一个糖基后的产物分别为对映-贝壳杉烯酸-19-葡萄糖酯，甜菊醇-19-O-葡萄糖酯，甜叶悬钩子苷，甜菊苷。

作为本发明的一种优选方式，发挥催化活性的多肽为Ak13GT，并且能够催化下述反应：

此处，所述的四环二萜类化合物例如但不限于：甜菊醇，甜菊醇-19-O-葡萄糖酯。其加上一个糖基后的产物分别为甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的Ak19GT1，Ak19GT2或Ak13GT多肽或它们的保守性变异多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

生物材料与仪器设备

明日叶(Angelica keiskei(Miq.)Koidz.)植物叶片取自上海辰山植物园。

寡核苷酸引物购自生工科技(Sangon Biotech)有限公司。

AxyPrep总RNA小量制备试剂盒，多聚酶链式反应(PCR)胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒均为美国Axygen产品。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)聚合酶试剂盒，聚合酶链式反应(PCR)高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase为日本宝生物公司(TAKARA)产品。

限制性内切酶均为NEB产品。

大肠杆菌DH10B、Rosetta(DE3)菌株和pET21a载体用于基因克隆及蛋白表达。

标准品化合物甜菊醇购自上海源叶生物科技有限公司。

甜叶悬钩子苷购自南京广润生物制品有限公司。

UDP葡萄糖购自北京中泰生物有限公司。

PCR使用Arktik Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific)。

恒温培养使用ZXGP-A2050恒温培养箱(智城)和ZWY-211G恒温培养振荡器(智城)。

离心使用5418R高速冷冻式离心机和5418小型离心机(Eppendorf)。

真空浓缩使用Concentrator plus浓缩仪(Eppendorf)。

OD₆₀₀使用UV-1200紫外可见分光光度计检测(上海美谱达仪器有限公司)。

旋转蒸发系统由IKA RV 10digital旋转蒸发仪(IKA)和MZ 2C NT化学隔膜泵、CVC3000真空控制器(vacuubrand)组成。

高效液相色谱使用Dionex UltiMate 3000液相色谱系统(Thermo FisherScientific)。

核磁共振波谱由Bruker DRX 400测定得到。

高分辨质谱由Thermo Fisher Scientific静电场轨道阱组合质谱Q Exactive测得。

实施例1、新型的糖基转移酶

在后续实施例中所涉及的新型的糖基转移酶氨基酸序列如下：

>Ak19GT1(SEQ ID NO:1)

MANQRHILLITFPAQGHINPSLQFSKKLTRMGVEVTFATSLSAHSRMANTLAATKGLNIAPFSDGYDDGFKLTDDAKHFMSSIRNHGSESVKQILRSSAEQGRPVSCVVYTLLLPWVAEVAREFHVPSALLWIQPASVLDIYYYYFNGYGEAMNDCLDDPSWSIQLPGLPLLHARDLPSFILPTCHEMYSFALPSFKEQLDALNADERPMVLVNSFDALESEALKAIKKLELIAIGPVLPSAFLDGKDPSDTSVGGDLFQKSRNYRDWLDAKPPKSVIYISFGSILTLSKPQMNEIGKGLLKSGMPFLWVIRKKEGESSGQQVEEEELSGREELEKQGMIVPWCSQLEVLSHPALGCFVTHCGWNSTLESLVSRVPVVAFPHWTDQTTNAKLIEDVWKTGVRVRVNGNEGMVDGDEVDRCIEMVMGNEELRSNAKKWGDLAREAISEGGSSDKNLKAFVEHVDHQVTPTGCLESSGA*

>Ak19GT2(SEQ ID NO:2)

MNGKRFLLLSLTAQSHINPTLQLAKILTRHGAQVTFATTISGLSRLNDLPTIRGLSYATFSDSNEQDSDESEDGKKKVDINDYLSTLGRVGPQNLKKLLHQLSIDGSPVNFIVYTVLLPWVAEVARDVHIPSAFLFIQCAIAFTIFHRFFNSHDGLHAYNDDFKLDTSIELPKLSSFTSHDIPSFLVPGNDYHSSMIPVFREHIQILEKDPNPCVLINTFDALEKDFIHSFPSIELLPIGPLLPSAISDKHDLDDKSFGGHIFQSPKEDYLSWLDSQPDRSVMYVSFGSIMVLTETQKEEILQGLRESGRLFLWVIREIKDEELSSIREKSCISEEIGMIVPWCSQVEVLSHRATGCFVTHCGWNSTLESITSGVPVVGCPSFSEQKTNMKIIEELWGNGIRVKENEEGVFVREEIRRCLDIVMGEEKQGNEIKGNATKWKSLAIEAVKEGGSSHNNLLHFLEK*

>Ak13GT(SEQ ID NO:3)

MESLARLSGKQAHVVCIAYPAQSHIKSLLKLAKLLHIKGVFVTFVNTEFNHKRLLKSGALEPLDNLPGFRFDTIPDGLPPSDNNSNQDLLALTESLLNKNMLPPFQNLVEKLNAGVPPVTSILSDAFMPFPTDAAHSLGIPIFSIWTVSAYGLMGFFQVQNLIEKGFAPMKDESYLTNGDLDTIIDWIPGMKDIRLKDLPTFLRTTDPNDLMLKYTKEAMANAGESTGHVIHTFDDLEQEVVNAISSMFPNV YTIGPQQLLLNQLESDHEDFKGIGYNLWGEEKTCLQWLDSKEAGSVVYVNFGSLAALSPEKLVEFGWGLANSNQNFLWVIKPHFIVDESKTTLGLEFMECIKGRGYISSWCPQEQVLNHKSVGGFLTHGGWNSMIESLSAGVPMLCLPFFGDQQTNCKYICTEWECGMEVDNNVRRDDVEKLVRVLMEGVEGKNLKKKATEWKQMAEKACGPDGSSSRNLSKLVHLLTS*

实施例2、新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶的重组制备

1、明日叶叶片cDNA的制备

取明日叶成熟叶片，清水清洗干净表面污渍，用吸水纸轻轻擦拭干叶片表面水渍，称重备用。使用锡箔纸包裹，液氮速冻，-80℃超低温保存备用。参考Axygen的AxyPrep总RNA小量制备试剂盒说明书制备叶片总RNA。参考TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书，反转录RNA制备cDNA。

2、Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT基因克隆和表达质粒构建

设计表1所示的引物并在上游引入酶切位点Nde I，下游引入酶切位点Not I。

PCR扩增体系(50μL)：PrimeSTAR Max Premix，25μL；Primer 1/Primer2终浓度0.2～0.3μM；cDNA<200ng；剩余体积用灭菌蒸馏水补足。

PCR反应条件：98℃预变性2min，然后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，28个循环。

琼脂糖电泳检测，扩增得到约1.5kb的片段，纯化后用Nde I和Not I双酶切消化。

消化后片段连入相同酶消化过的pET21a载体，连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒经构建时引入酶切位点双酶切验证和基因测序，筛选得到重组质粒。

表1、用于Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT基因克隆的引物

3、Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT的表达

将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)的感受态细胞中，LB固体培养基(氯霉素34μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL)37℃培养过夜。挑取单个克隆到2mL LB液体培养基(氯霉素34μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL)，转接过夜培养的菌液到新的LB液体抗性培养基中37℃，250r/min培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5，水浴降温至16℃左右，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，转至16℃低温诱导培养，在摇床转速180r/min条件下继续培养20h。携带未连入外来基因的pET21a空质粒的Rosetta(DE3)重组菌株作为空白对照，培养操作同上。

表达结束后，使用SDS-PAGE检验表达情况。菌液离心(12000r/min，1min)，弃去上清，用等体积无菌水重悬，置冰上超声破碎至澄清，超声过后粗酶液冷冻离心(10000r/min，10min，4℃)，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE验证蛋白表达情况。

实施例3、Ak19GT1、Ak19GT2和Ak13GT的体外功能鉴定

1、获得粗酶液

转接保存的单克隆(表达Ak19GT1、Ak19GT2或Ak13GT)甘油菌到2mL LB液体培养基(其中包含氯霉素34μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃、250rpm过夜培养，按1％(v/v)转接过夜培养的菌液到新的50mL LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5，加入IPTG至终浓度0.1mM，16℃，180rpm诱导培养20h。携带pET21a空质粒的Rosetta(DE3)重组菌株作为空白对照，操作同上。离心收菌，使用5mL破菌缓冲液Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.0；100mM NaCl)重悬，加入DNase至终浓度为5μg/mL，Mg²⁺终浓度为2mM，蛋白酶抑制剂PMSF终浓度为1mM，冰上孵育30min后超声破碎；离心(10000rpm，30min，4℃)，通过0.2μm滤膜过滤，获得上清粗酶液，其中含有Ak19GT1、Ak19GT2或Ak13GT。

2、体外酶催化反应

体外酶催化测定体系为500μL，反应体系包括：0.25mM的糖基受体，1.5mM的UDP葡萄糖，10mM MgCl₂，200μL上清粗酶液，用Buffer A补足体积到500μL。37℃反应2h。待反应结束后，加等体积乙酸乙酯(以甜菊醇和贝壳杉烯酸为底物时)或正丁醇(其他底物时)终止反应，用等体积的乙酸乙酯或正丁醇萃取3次，将3次萃取的有机相混合，在真空浓缩仪中离心蒸干，然后使用500μL甲醇或甲醇-水(50/50，v/v)复溶，使用HPLC进行产物分析。HPLC检测条件：色谱柱：反相C18column[TSKgel ODS-100V

]，检测波长为205nm；流动相：乙腈-水混合物梯度洗脱，在0到25min内比例由30:70升到80:20，流速1mL/min。

3、Ak19GT1和Ak19GT2的催化作用

根据HPLC检测结果1(图1A)，Ak19GT1或Ak19GT2可以将底物甜菊醇(steviol)转化为其糖基化产物。

该糖基化产物经UPLC串联ESI高分辨质谱负离子模式检测确认分子式为C₂₆H₄₀O₈，核磁共振氢谱和碳谱显示贝壳杉烯型四环二萜母核特征信号和糖基特征信号(图1B)；在二维核磁异核多重键相关谱(HMBC)中证实该化合物葡萄糖1’位端基氢与甜菊醇母核19位羧基碳具有远程相关峰(图1C)。

综合上述结果，鉴定糖基化产物为甜菊醇-19-O-葡萄糖酯(steviol19-O-β-D-glucoside)。

*上述结构式中，母核19位羧基碳即对应于前面所述的四环二萜类化合物的C-4位置。

4、Ak13GT的催化作用

根据HPLC检测结果2(图2)，Ak13GT可以将底物甜菊醇-19-O-葡萄糖酯(steviol19-O-β-D-glucoside)转化为其糖基化产物。该产物经高分辨质谱负离子模式检测确认分子式为C₃₂H₅₀O₁₃，与甜叶悬钩子苷(rubusoside)的分子式一致，且其HPLC保留时间亦与甜叶悬钩子苷标准品一致。因此，鉴定该产物为甜叶悬钩子苷(rubusoside)。

实施例4、Ak19GT1、Ak19GT2对于甜菊醇的结构类似物的催化作用

Ak19GT1或Ak19GT2不仅可以识别甜菊醇、催化产生甜菊醇-19-O-葡萄糖酯(steviol 19-O-β-D-glucoside)，同时对于甜菊醇的结构类似物对映-贝壳杉烯酸(ent-kaur-16-en-19-oic acid)，甜菊醇单糖苷(steviolmonoside)，甜菊醇双糖苷(steviolbioside)具有19位的糖基化催化活性，分别生成对映-贝壳杉烯酸-19-葡萄糖酯(β-D-glucosyl-ent-kaur-16-en-19-oate)，甜叶悬钩子苷(rubusoside)和甜菊苷(stevioside)。HPLC分析图分别如图3～图5。LC-MS分析结果如图6。

实施例5、Ak13GT对于甜菊醇-19-O-葡萄糖酯的结构类似物的催化作用

Ak13GT不仅可以识别甜菊醇-19-O-葡萄糖酯(steviol19-O-β-D-glucoside)，同时对于甜菊醇也具有糖基化催化活性，生成甜菊醇单糖苷(steviolmonoside)。HPLC分析图分别如图7。LC-MS分析结果如图8A～B。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 新型糖基转移酶及其应用

<130> 179257

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 明日叶(Angelica keiskei)

<400> 1

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1 5 10 15

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Leu Leu Pro Trp Val Ala Glu Val Ala Arg Glu Phe His Val Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

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Ser Trp Ser Ile Gln Leu Pro Gly Leu Pro Leu Leu His Ala Arg Asp

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<212> PRT

<213> 明日叶(Angelica keiskei)

<400> 2

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<211> 481

<212> PRT

<213> 明日叶(Angelica keiskei)

<400> 3

Met Glu Ser Leu Ala Arg Leu Ser Gly Lys Gln Ala His Val Val Cys

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Ile Ala Tyr Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ser Leu Leu Lys Leu Ala

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Ser

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<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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ggaattccat atggcaaacc aacgtcacat cc 32

<210> 5

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<212> DNA

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<400> 5

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ataagaatgc ggccgcttac ttttctaaaa aatgtagaag attgttatgt gaag 54

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ataagaatgc ggccgcctag cttgtcaaaa gatgaaccaa tttg 44

Claims

1.分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多肽；

(b) (a)的保守性变异多肽；所述的保守性变异多肽为在(a)多肽的N或C末端添加标签，或在其N末端添加信号肽后形成的多肽。

2.分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种用于发酵生产甜菊糖苷类化合物的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞中含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸；该宿主细胞为真菌细胞。

5.一种用于发酵生产甜菊糖苷类化合物的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞中含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸；该宿主细胞为细菌细胞。

6.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：培养权利要求4或5所述的宿主细胞；收集含有权利要求1所述的多肽的培养物。

7.权利要求1所述的多肽的用途，用于在具有母核(I)结构的化合物上转移上一个糖基，形成如式(II)结构的化合物；

；

(I) (II)

其中，R独立地选自：H，OH，O-β-_D-葡萄糖基，O-β-_D-葡萄糖基-(2→1)-β-_D-葡萄糖基。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的具有母核(I)结构的化合物包括：对映-贝壳杉烯酸，甜菊醇，甜菊醇单糖苷，甜菊醇双糖苷。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的式(II)结构的化合物包括：对映-贝壳杉烯酸-19-O-葡萄糖酯，甜菊醇-19-O-葡萄糖酯，甜叶悬钩子苷，甜菊苷。

10.如权利要求7～9任一所述的用途，其特征在于，所述的糖基的供体是含有糖基的化合物。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的供体包括：UDP-葡萄糖，UDP-鼠李糖，UDP-木糖。

12.一种用于糖基转移的组合物，其特征在于，它含有权利要求1任一所述的多肽或含有权利要求4或5所述的宿主细胞。

13.一种在具有母核(I)结构的化合物上转移上一个糖基的方法，其特征在于，所述方法包括：以多肽或表达该多肽的宿主细胞将糖基转移到具有母核(I)结构的化合物，从而形成如式(II)结构的化合物；

；

(I) (II)

其中，R独立地选自：H，OH，O-β-_D-葡萄糖基，O-β-_D-葡萄糖基-(2→1)-β-_D-葡萄糖基；

其中，所述的多肽为权利要求1所述的多肽。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的糖基的供体是含有糖基的化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的供体包括：UDP-葡萄糖，UDP-鼠李糖，UDP-木糖。