JP7000327B2

JP7000327B2 - 小分子グリコシル化のための方法

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Publication number: JP7000327B2
Application number: JP2018535237A
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Inventors: グディミンチ，ラマ・クリシュナ; ニデツキー，ベルント
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Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2022-02-04
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Description

[0001]本発明は、スクロースホスホリラーゼが仲介する２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸の産生法に関する。

背景技術
[0002]２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－２Ｇ）は、すべての既知のＬ－アスコルビン酸誘導体の中で非常に安定な型である。Ｌ－アスコルビン酸の２位のヒドロキシル基（その生物学的活性および安定性に関与する）の修飾は、Ｌ－アスコルビン酸（Ｌ－ＡＡ）の安定性を有意に改善してきた。Ｌ－アスコルビン酸の２位のヒドロキシル基のグリコシル化は、リン酸および硫酸誘導体などの他の誘導体に勝る、いくつかの利点を提供する。Ｌ－ＡＡグルコシドの他のアイソフォーム、すなわち、３－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－３Ｇ）、５－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－５Ｇ）および６－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－６Ｇ）が合成されてきたが、これらのいずれも、ＡＡ－２Ｇと同程度に優れた安定性は示さなかった。

ａ. ＡＡ－２Ｇは、いかなる生物学的活性および還元力も示さない、極度に不活性な型であり、そしてしたがって、極度の物理的および化学的安定性を所持する。
ｂ. ＡＡ－２Ｇが、生体によって分泌されるα－グルコシダーゼ酵素の作用によってＬ－アスコルビン酸およびＤ－グルコースに加水分解され、そしてＬ－アスコルビン酸に固有の生物学的活性を示した際に、Ｌ－アスコルビン酸の特性が顕示される。

ｃ. 何らかの特定の状態下で、ｉｎｖｉｖｏでＡＡ－２Ｇが合成され、そして代謝されることが証明されてきている。したがって、ＡＡ－２Ｇは、非常に安定化されたＬ－ＡＡの最も安全な型と認識される。

ｄ. 水および油性物質中で高い溶解度を有するため、ＡＡ－２Ｇは、ビタミンＣ補足剤として、経口および局所配合物中で好適に用いられる。
[0003]グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、天然のグリコシド合成に関与する酵素である一方、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）は、これらを分解するように進化してきている。グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシルヒドロラーゼの両方が、非常に多様なグリコシドの産生にうまく用いられてきている。これらの酵素はまた、ＡＡ－２Ｇの酵素合成においても用いられてきている。

[0004]ＧＨに属するラット腸およびイネ種子α－グルコシダーゼは、マルトースおよびＬ－ＡＡを、それぞれ、ドナーおよびアクセプター基質として用いた際、ＡＡ－２Ｇを産生した。しかし、これらの２つの酵素は常に、ＡＡ－２Ｇとともに、不可避的にＡＡ－６Ｇ、ＡＡ－５Ｇアイソフォームを産生する。該酵素は、ドナー基質として、商業適用のために関心が持たれる安価なマルトースを用いて１つのグルコシドのみを産生するが、該酵素は安価には入手可能でなく、そしてアイソフォームの存在は、ＡＡ－２Ｇの単離および精製を困難なものにした。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のα－グルコシダーゼは、大部分ＡＡ－６Ｇを産生し、そして非常にわずかなＡＡ－２Ｇを産生する。

[0005]ＧＴに属するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）は、ＡＡ－２Ｇの大規模産生のための別のよく研究される酵素である。ＥＰ０４２５０６６は、ＡＡ－２Ｇを産生するためのプロセスを開示し、該プロセスは、産業規模で実施可能であり、糖類トランスファー酵素、例えばＣＧＴアーゼがＬ－アスコルビン酸およびα－グルコシル糖類を含有する溶液に作用して、ＡＡ－２Ｇおよび副産物を形成することを可能にする。ＣＧＴアーゼを、ドナー基質としてのシクロデキストリン（最も好ましいドナー基質）またはデンプンとともに用いると、直鎖化マルトオリゴ糖の全部または一部がＬ－ＡＡにトランスファーされるため、いくつかのＡＡ－２－マルトオリゴ糖副産物が不可避的に形成された。異なる重合度を有する、生成されたいくつかの副産物は、さらなるグルコアミラーゼ処理で、ＡＡ－２Ｇにさらにトリミングされた。ＣＧＴアーゼの使用は、比較的より少ない量で、常に、ＡＡ－３ＧおよびＡＡ－６Ｇなどの他のアイソフォームを産生した。これらのアイソフォームの存在はやはり、下流プロセス、特に他のアイソフォームからＡＡ－２Ｇの分離を複雑なものにした。いくつかの副産物の形成およびさらなるグルコアミラーゼ処理を回避するため、ＣＧＴアーゼは、ドナー基質としてマルトースを受け入れるよう操作されたが、成功はほとんど達成されず、そして収率はまったく魅力的ではなかった（Ｈａｎら、参考文献）。

[0006]ＷＯ２００４０１３３４４は、アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα－イソマルトシルグルコサッカライド形成酵素（ＩＭＧ）を用いてＡＡ－２Ｇを産生するためのプロセスを開示し、ここでＡＡ－５ＧまたはＡＡ－６Ｇは形成されないか、またはこれらの形成が検出不能であるほど少量（乾燥固体ベースで＜０．１％重量／重量）でしか形成されない。このプロセスにおいて、ＩＭＧは、ＣＧＴアーゼおよびドナー基質としてのデンプン部分的加水分解物とともに（デンプンをオリゴ糖に分解するため）、トランスグリコシル化酵素として用いられた。これらの２つの酵素の組み合わせは収率を改善し、そしてＡＡ－５ＧおよびＡＡ－６Ｇ形成量を０．１％未満まで減少させた。しかし、いくつかの副産物の形成は回避されなかった。副産物はさらにグルコアミラーゼで処理され、ＡＡ－２Ｇに変換された。したがって、このシステムは、全プロセスを効率的に実行するために、総数３つの酵素を必要とした。

[0007]現在利用可能な酵素的方法は、大規模に、ＡＡ－２Ｇを産生可能である。反応終了時のいくつかの副産物および異なるアイソフォームの存在はなお、全プロセスにおけるボトルネックであり、そしてＡＡ－２Ｇ単離および精製に干渉する。副産物は、グルコアミラーゼ処理によってＡＡ－２Ｇに変換可能であり、そしてＡＡ－２Ｇは、強酸性陽イオン交換樹脂を用いて、Ｌ－ＡＡおよびグルコースから容易に分離可能である。しかし、ＡＡ－２Ｇと一緒に形成されたＡＡ－５ＧおよびＡＡ－６Ｇアイソフォームは、溶解性およびクロマトグラフィ特性が似ているため、ほとんど分離されない。ＥＰ０５３９１９６は、その還元力に由来する、酸化可能性を好適に利用して、ＡＡ－２ＧからＡＡ－５ＧおよびＡＡ－６Ｇを分離する方法を開示している。このプロセスは、ＡＡ－５ＧおよびＡＡ－６Ｇのみを酸化するが、ＡＡ－２Ｇに影響を及ぼし、ＡＡ－２Ｇ収量の減少を生じうる、過剰な酸化は可能にしないように、反応条件の正確な調節を必要とする。

[0008]したがって、ＡＡ－２Ｇを高収率で産生するための改善されたプロセスがなお必要である。
発明の要旨
[0009]本発明の目的は、ＡＡ－２Ｇの大規模製造のための効率的な一工程産生プロセスを提供することである。

[0010]該目的は、本発明の主題によって解決される。
[0011]本発明にしたがって、２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－２Ｇ）を産生するための方法であって：
ａ. グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターを含む混合物を提供し；
ｂ. 前記混合物をスクロースホスホリラーゼとインキュベーションし；
ｃ. インキュベーション中、ｐＨを７．０未満に維持し；そして
ｄ. 場合によって、反応中、さらなるグルコシルドナーおよび／またはスクロースホスホリラーゼを添加し、そして
ｅ. ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を単離および／または精製する
一連の工程を含む、前記方法を提供する。

[0012]図１は、２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－２Ｇ）の化学構造を示す。 [0013]図２は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）のスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対するｐＨの影響を示す。 [0014]図３は、ビフィドバクテリウム・ロングムのスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対する温度の影響を示す。 [0015]図４は、ビフィドバクテリウム・ロングムのスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対するドナー（スクロース）およびアクセプター（Ｌ－ＡＡ）基質濃度の影響を示す。 [0016]図５は、異なるスクロースホスホリラーゼによって触媒されるＬ－アスコルビン酸のトランスグルコシル化を示す。

[0017]本発明は、２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を産生するための新規のそして改善された方法であって：
ａ. グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターを含む混合物を提供し；
ｂ. 前記混合物をスクロースホスホリラーゼとインキュベーションし；
ｃ. インキュベーション中、ｐＨを７．０未満に維持し；そして
ｄ. 場合によって、反応中、さらなるグリコシルドナーならびにスクロースホスホリラーゼを添加し；そして
ｅ. ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を単離および／または精製する
一連の工程を含む、前記方法を提供する。

[0018]したがって、ドナー基質として単純でそして低コストの二糖または単糖を用い、そしてＬ－ＡＡの２位でのみトランスグリコシル化を実行することが可能な酵素を発見することが目的であった。

[0019]ＧＴおよびＧＨクラスの中で、グリコシドホスホリラーゼ（ＧＰ）は、いくつかの観点で特別である。ＧＰは、αおよびβ－Ｄ－グリコシド、主に二糖を含むグルコシド（Ｇｌｃ－ＯＲ）および多様な重合度のオリゴ糖または多糖の加リン酸分解を触媒する。リン酸（Ｐｉ）へのグルコシルトランスファーは、ｉｎｖｉｖｏで、熱力学的に好ましい、これは、リン酸が通常、α－Ｄ－グルコース－１－リン酸（Ｇｌｃ－１－Ｐ）よりも過剰に存在するためである。しかし、ＧＰが触媒する反応の熱力学的平衡定数（Ｋ_ｅｑ）は、ＧＴ（Ｋ_ｅｑ＜＜１）およびＧＨ（Ｋ_ｅｑ＞＞１）の反応に関するＫ_ｅｑ値の間に属する。比較的好ましいＫ_ｅｑ、およびリン活性化糖が、大部分のＧＴに必要とされるヌクレオチド活性化糖よりもより安価であるという事実によって、ＧＰは、グルコシドの立体および位置特異的合成のために関心が持たれる生体触媒となっている。

[0020]スクロースホスホリラーゼ（ＳＰアーゼ；ＥＣ２．４．１．７）は、グルコシルホスホリラーゼであり、スクロースおよびリン酸のＤ－フルクトースおよびα－Ｄ－グルコース－１－リン酸（Ｇｌｃ－１－Ｐ）への変換を触媒する。ＳＰアーゼは、いくつかの細菌供給源から単離されてきている。ＳＰアーゼをコードする遺伝子が異なる細菌からクローニングされ、そして異種発現されている（ＫａｗａｓａｋｉＨら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）６０：３２２－３２４；ＫｉｔａｏＳおよびＮａｋａｎｏＥ，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９２）７３：１７９－１８４；ｖａｎｄｅｎＢｒｏｅｋＬＡＭら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）６５：２１９－２２７）。グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）の体系的な配列に基づく分類にしたがって、ＳＰアーゼは、しばしばα－アミラーゼファミリーと称される、ファミリーＧＨ１３（クランＧＨ－Ｈ）に属する。ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のＳＰアーゼの三次元構造は、最近、解明され、（ベータ／アルファ）８バレルフォールド、ならびに２つのカルボキシレート基が求核（Ａｓｐ１９２）および一般酸／塩基（Ｇｌｕ２３２）の役割をおそらく達成する触媒部位が明らかになった。

[0021]「スクロースホスホリラーゼ」は、本明細書において、ＥＣ２．４．１．７クラスの酵素だけでなく、基質および産物に関連する同じ特性を示す分子またはその機能的同等物も指す。「機能的同等物」または酵素の類似体は、本発明の範囲内で、望ましい生物学的機能または活性、例えば酵素活性をさらに持つ、多様なポリペプチドである。

[0022]本発明の１つの態様は、ＡＡ－２Ｇ産生法であって、ＳＰアーゼがメタゲノム、微生物または細菌起源のものである、前記方法に関する。本明細書において、用語「メタゲノム」は、環境試料から直接回収された遺伝子材料を指す。

[0023]本発明のさらなる態様は、ＳＰアーゼが微生物または細菌起源、好ましくは細菌起源のものである、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。
[0024]ホモ二量体酵素は、２つの同一分子によって形成される酵素複合体を指す。ＳＰアーゼのいくつかはホモ二量体を形成可能である。ホモ二量体性ＳＰアーゼの例は、とりわけ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、またはビフィドバクテリウム・ロングム由来である。驚くべきことに、ホモ二量体性ＳＰアーゼは、Ｌ－ＡＡのグリコシル化において、高い部位選択性を示す。したがって、本発明の１つの態様において、スクロースホスホリラーゼは、ホモ二量体性スクロースホスホリラーゼである。ホモ二量体性ＳＰアーゼの高い部位選択性のため、ＡＡ－６Ｇ副産物は実質的に形成されない。したがって、本発明の１つの態様において、副産物が実質的に形成されないＡＡ－２Ｇ産生法を提供する。本発明のさらなる態様にしたがって、インキュベーション工程中、ＡＡ－３Ｇ、ＡＡ－５ＧまたはＡＡ－６Ｇは実質的に形成されない。

[0025]本明細書において、用語「副産物」は、任意の望ましくない産物を指し、特にＡＡ－３Ｇ、ＡＡ－５ＧまたはＡＡ－６Ｇを指す。用語「副産物を実質的に含まない」は、副産物含量が重量２５％未満、２０％未満、１５％、１０％、５％、または１％未満であることを意味する。

[0026]本発明の１つの態様は、７未満のｐＨ、好ましくは６未満のｐＨ、より好ましくは５未満のｐＨ、そして最も好ましくは４未満のｐＨで高い安定性を示す、スクロースホスホリラーゼに関する。

[0027]特定の態様において、本発明のスクロースホスホリラーゼは、６０℃で４８時間、そして２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、および７．０より選択されるｐＨでインキュベーションした後、０時間（インキュベーション開始前）でのスクロースホスホリラーゼ活性に比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、９０％、９２％、または少なくとも９４％の相対スクロースホスホリラーゼ活性を有する。好ましい態様において、インキュベーションｐＨは、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５または７．０である。さらにより好ましい態様において、インキュベーションｐＨは５．２であり、そして残存活性は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または少なくとも８２％である。

[0028]ＳＰアーゼ活性は、連続共役酵素アッセイを用いて３０℃で測定され、ここで、実施例２に記載するように、スクロースおよび無機リン酸からのＧｌｃ１－Ｐの産生を、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）およびグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ－ＤＨ）の存在下で、ＮＡＤ＋の還元に共役させる。

[0029]本発明の１つの態様は、環境試料から直接得られる遺伝材料を用いて組換え的に産生されたスクロースホスホリラーゼに関する。
[0030]微生物スクロースホスホリラーゼを用いる利点は、産生および単離が単純であり、そしてこれらの酵素が安定であることである。これらは、天然にまたは組換え的にＳＰアーゼを発現している微生物から得られうる。

[0031]本発明の１つの態様は、アグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌０６、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエキー亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プトレファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、ロドピレルラ・バルティカ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａｂａｌｔｉｃａ）、シェワネラ・バルティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｂａｌｔｉｃａ）、シェワネラ・フリジディマリナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ）、ソリバクター・ウシタトゥス（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｕｓｉｔａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ムタンスまたはシネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種より得られるスクロースホスホリラーゼに関する。

[0032]本発明の１つの態様は、好ましくは全長タンパク質またはその触媒活性断片、あるいは融合タンパク質として、組換え的に産生されたスクロースホスホリラーゼに関する。酵素の組換え体産生法は、当業者に知られる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０－８７９６９－３０９－６）。

[0033]本明細書において、「全長タンパク質」は、例えば上記に列挙するような生物由来の遺伝子によってコードされる、スクロースホスホリラーゼタンパク質を指す。前記天然存在遺伝子、特に前記遺伝子のスクロースホスホリラーゼコード領域を、ＳＰアーゼの組換え体産生に直接使用する。

[0034]スクロースホスホリラーゼの「触媒活性断片」は、天然ＳＰアーゼと同じかまたは実質的に同じ活性および基質特異性を有するスクロースホスホリラーゼのタンパク質断片を指す。断片が天然スクロースホスホリラーゼと同じかまたは類似の基質特異性を有し、そして同じ産物の形成を触媒するならば、断片の長さはそれほど重要ではない。

[0035]用語「融合タンパク質」は、少なくとも１つのさらなるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに組換え的に融合された、スクロースホスホリラーゼまたはその触媒活性断片を指す。前記の少なくとも１つのさらなるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、任意の種類（例えば酵素）であってもよい。

[0036]スクロースホスホリラーゼの機能性変異体（すなわち欠失、置換および挿入を含む突然変異）が天然スクロースホスホリラーゼと同じかまたは実質的に同じ活性を有するならば、これらの機能性変異体もまた、本発明の範囲内に含まれることが注目される。

[0037]しかし、スクロースホスホリラーゼを天然に産生する生物から直接得られるスクロースホスホリラーゼを用いることもまたもちろん可能である。
[0038]ＳＰアーゼは、部分的に精製されていなくてもよい細胞不含酵素、細胞膜の透過性改善（透過処理）および物理的安定性のために物理的または化学的に前処理された全細胞系、好ましくはゲル様構造中に、前記遊離酵素または全細胞系が封入された被包触媒、あるいはキャリアー上に固定されたもののいずれかとして、インキュベーション工程中で使用可能である。好適には、ＳＰアーゼは、好ましくは固体支持体であるキャリアー上に固定される。キャリアーは、好ましくはクロマトグラフィ樹脂であり、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂、アフィニティクロマトグラフィ樹脂（例えば固定ＳＰアーゼ特異的抗体を含むもの）および疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂からなる群より選択される。

[0039]本発明のＳＰアーゼは、該酵素の酵素活性が、その基質特異性が変化するかまたはその活性が低変換率に減少するような方式で影響を受けないならば、任意のキャリアー、好ましくは粒子（例えばビーズ）、特にクロマトグラフィ樹脂上に（一時的にまたは共有的に）固定されていてもよい。

[0040]本発明のさらなる態様において、全細胞、無細胞抽出物、粗精製（ｃｒｕｄｅ）、精製または固定型のスクロースホスホリラーゼを用いる。
[0041]ＳＰアーゼの反応は、アノマー立体配置の正味保持を伴って進行し、そして２つの立体配置的に反転した工程を伴う二重置換機構：グルコシルドナーの炭素－酸素結合の切断および共有β－グルコシル酵素（β－Ｇｌｃ－Ｅ）中間体の形成；ならびにＧｌｃ１－Ｐを生じる中間体とリン酸の反応を通じて起こる。副反応において、β－Ｇｌｃ－Ｅ中間体は、水によって妨害され、加水分解を生じうる。スクロースの加水分解的変換は不可逆性であるが、加リン酸分解的反応よりもほぼ２桁遅く進行する。ＳＰアーゼはまた、トランスグルコシル化反応も触媒し、該反応は、加水分解と競合して起こり、そしてそれによって、外部求核剤によってβ－Ｇｌｃ－Ｅ中間体が攻撃され、そして新たなα－Ｄ－グルコシドが産生される。

[0042]生化学的研究によって、ＳＰアーゼがグルコシル部分のトランスファーに厳密に特異的であり、そしてエピマー化および脱酸素を含む、グルコピラノシル環に対する構造修飾を許容しないことが示されてきている。

[0043]本発明の方法に使用されるグルコシルドナーは、ＳＰアーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応の基質として働く、任意のものであってもよい。
[0044]ＳＰアーゼの既知のグルコシルドナーのリストは短く：スクロース、Ｇｌｃ１－Ｐおよびα－Ｄ－グルコース１－フルオリドである。３つの既知のグリコシルドナーのうち、スクロースは安価であり、そして非常に安定な高エネルギーグルコシルドナーであり、そしてＳＰアーゼによって弱く加水分解される。

[0045]しかし、グルコシルドナーはまた、スクロース、およびフルクトシル部分が修飾されるかまたは別のケトシル残基によって置換されているスクロース類似体、あるいはさらに安定な活性化されたグルコシルドナー、例えばα－Ｄ－グルコース－１－アジド、および／またはその混合物からなる群より選択されることも可能である。

[0046]本発明の１つの態様は、グルコシルドナーがスクロース、Ｇｌｃ１－Ｐまたはα－Ｄ－グルコース１－フルオリドであり、好ましくはグルコシルドナーがスクロースまたはＧｌｃ１－Ｐ、より好ましくはスクロースである、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。

[0047]対照的に、グルコシルアクセプターに対するＳＰアーゼの特異性は、比較的緩やかである。
[0048]本発明の１つの態様は、グルコシルアクセプターがアスコルビン酸またはその機能性変異体である、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。

[0049]グリセロールアクセプターが典型的にはスクロースの≦２．５倍モル過剰である際、立体化学的に純粋であるグルコシルグリセロールが≧９０％ドナー基質変換の高収率で得られ、そして濃度は１Ｍ（２５０ｇ／Ｌ）に近かった（Ｇｏｅｄｌら，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ．２００８；４７（５２）：１００８６－９）。異なる研究グループによって測定された異なるＳＰアーゼ酵素のアクセプター混乱状態が、Ｇｏｅｄｌら（ＢｉｏｃａｔａｌＢｉｏｔｒａｎｓ．２０１０；２８（１）：１０－２１）によって優れて概説されている。ＳＰアーゼを用いたグリコシルトランスファー反応の最適ｐＨは、６．５～７．５であった。興味深いことに、リン酸およびヒドロキノンのグルコシル化に関するスクロースホスホリラーゼ（ストレプトコッカス・ムタンス由来）の６．５の最適ｐＨは、グルコシルアクセプターとして酢酸を用いた際には５．０未満のｐＨにシフトし、これによって、グルコシル単位の有効なトランスファーのためには、アクセプターの相互作用基がプロトン化型である必要があることが示される。

[0050]Ｋｗｏｎら（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔ．２００７Ａｐｒ；２９（４）：６１１－６１５）は、組換え産生ビフィドバクテリウム・ロングム・スクロースホスホリラーゼを用いて、Ｌ－ＡＡおよびスクロースから一工程でＡＡ－２Ｇを産生する可能性を開示した。用いたＬ－ＡＡおよびスクロースの濃度は、それぞれ、０．５％（ｗ／ｖ）および３０％（ｗ／ｖ）であり、そして大規模には試みられなかった。結果は、達成されたＡＡ－２Ｇ濃度を開示しなかった。Ａｅｒｔｓら（ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ．２０１１Ｓｅｐ２７；３４６（１３）：１８６０－７）は、８０の推定されるアクセプターに対して、６つの異なるＳＰ酵素のトランスグルコシル化活性を比較した。それぞれ、アクセプターおよびドナー基質として、６５ｍＭのＬ－ＡＡおよび５０ｍＭのスクロースを用いた際、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス由来のスクロースホスホリラーゼを用いて、トランスグルコシル化産物は明らかには観察可能であったが、トランスグルコシル化率は、加水分解率の約１００倍低かった。したがって、Ｌ－ＡＡは、スクロースホスホリラーゼの弱いアクセプターと記載された。タンパク質操作アプローチを使用して、Ｌ－アスコルビン酸のトランスグルコシル化のため、スクロースホスホリラーゼ中にタンパク質リガンド相互作用が導入されたが、成功しなかった。これらの研究は、ＡＡ－２Ｇの産生におけるスクロースホスホリラーゼの現実的な適用を証明しなかった。上述の研究において、反応は３７℃およびｐＨ７．０～７．５で行われ、これはＬ－ＡＡへのグルコシル単位のトランスファーにまったく好ましくない。酸性ｐＨでの可能性をチェックする試みは行われなかった。

[0051]本発明の目的は、ＳＰアーゼを用い、いくつかの副産物またはＡＡ－２Ｇのアイソフォームを産生することなく、Ｌ－ＡＡをグリコシル化して、一工程でＡＡ－２Ｇを産生することであった。ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ラクトバチルス・アシドフィルスおよびストレプトコッカス・ムタンス由来のスクロースホスホリラーゼ酵素を用いて、Ｌ－ＡＡのグリコシル化効率および特異性をチェックした。すべてのＳＰアーゼは、酸性ｐＨでＬ－ＡＡのグリコシル化に成功した。ストレプトコッカス・ムタンス、Ｂ．アドレセンティスＳＰアーゼおよびＢ．ロングムＳＰアーゼは、ＡＡ－２Ｇのみを産生した。高収率のＡＡ－２Ｇ産生のため、試薬濃度および反応条件を体系的に最適化した。その結果、本発明者らは、予期せぬことに、反応をｐＨ約５、４０～５０℃の間で、そして１．５倍過剰Ｌ－ＡＡで行うと、ＡＡ－２Ｇが驚くべき量で形成されることを見出した。反応終了時、３％ｗ／ｗ未満の同定されない不純物とともに、反応混合物中に、ＡＡ－２Ｇ、Ｌ－ＡＡ、スクロース、フルクトース、および非常にわずかのグルコースが観察された。他の副産物またはアイソフォームは形成されないか、または検出可能な量では形成されなかった。

[0052]本発明のさらなる態様は、インキュベーション工程を、４．０～７．０のｐＨ範囲、または４．０～６．５の範囲、または４．５～６．５の範囲、または４．８～６．２の範囲、または５．０～５．５の範囲で行う、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。驚くべきことに、部位選択性は、約４．０～７．０の範囲のｐＨ、または約４．５～６．０の範囲のｐＨ、または約４．８～５．５の範囲のｐＨ、または約５．２のｐＨで働くことによって、強く改善される。不適切なｐＨでの反応は、劣った部位選択性を導く。本発明のさらなる態様において、インキュベーション工程を約５．２のｐＨで行う。

[0053]単純な有機および無機材料を用いて、または異なるタイプの緩衝剤混合物を用いて、反応媒体のｐＨを調節可能である。酵素添加によって反応を開始する前に、ｐＨを調節してもよい。また、反応中に、望ましいｐＨを維持するために、ｐＨを調節してもよい。手動または自動的にｐＨを調節してもよい。

[0054]本発明のさらなる態様は、約３０～７０℃の温度範囲で、または約３５～６５℃の範囲で、または約４０～６０℃の範囲で、または約４０～５０℃の範囲で、インキュベーション工程を行う、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。さらなる態様において、インキュベーション工程を約４０℃の温度で行う。

[0055]本発明のさらなる態様は、インキュベーション工程を少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７２時間行う、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。

[0056]本発明のさらなる態様は、グルコシルアクセプターをグルコシルドナーの０．３～３倍モル過剰で用いる、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。本発明のさらなる態様において、グルコシルアクセプターをグルコシルドナーの０．５～２．５倍モル過剰で、または１．０～２倍モル過剰で用いる。本発明のさらなる態様において、グルコシルアクセプターをグルコシルドナーの１．５倍モル過剰で用いる。本発明のさらなる態様において、グルコシルアクセプターはアスコルビン酸であり、そしてグルコシルドナーはスクロースである。

[0057]本発明のさらなる態様は、反応混合物中のスクロースホスホリラーゼの量が、１Ｕ／ｍＬ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲である、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。本発明のさらなる態様において、スクロースホスホリラーゼを約３０Ｕ／ｍＬの量で用いる。

[0058]本発明のさらなる態様は、さらなるスクロースホスホリラーゼおよびスクロースを、インキュベーション中に反応混合物に添加して、スクロースホスホリラーゼを１Ｕ／ｍＬ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲、または約３０Ｕ／ｍＬに、そしてスクロースを１００～２，０００ｍＭの範囲、または２５０ｍＭ～１，０００ｍＭの範囲または約８００ｍＭに維持する、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。

[0059]本発明のさらなる態様は、スクロースホスホリラーゼおよびスクロースを同時にまたは異なる時点で反応混合物に添加して、上記のような必要量を維持する、ＡＡ－２Ｇ産生法に関する。

[0060]本発明は、制限されることなく、以下の図および実施例によってさらに例示される。
[0061]図１は、２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ－２Ｇ）の化学構造を示す。

[0062]図２は、ビフィドバクテリウム・ロングムのスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対するｐＨの影響を示す。ＡＡ－２Ｇ合成の異常なｐＨ依存性が観察された。ｐＨ７．０～７．５では、ほぼいかなるＡＡ－２Ｇも形成されなかった。活性は、ｐＨを低下させた際に急激に増加し、ｐＨ５．２で明確な最大に達した。ｐＨのさらなる減少は、強い活性喪失を生じた。

[0063]図３は、ビフィドバクテリウム・ロングムのスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対する温度の影響を示す。ＡＡ－２Ｇ合成の最適温度は５０℃であった。しかし、プロセス中、Ｌ－アスコルビン酸分解を最小にするため、４０℃のより低い温度が好ましい。

[0064]図４は、ビフィドバクテリウム・ロングムのスクロースホスホリラーゼ酵素のＡＡ－２Ｇ形成活性に対するドナー（スクロース）およびアクセプター（Ｌ－ＡＡ）基質濃度の影響を示す。ＡＡ－２Ｇ合成は、Ｌ－ＡＡ濃度が増加するにつれて有意に増加した。ＡＡ－２Ｇの濃度および収率は、１．５倍過剰のＬ－ＡＡが反応に添加された際に最大であった。

[0065]図５は、異なるスクロースホスホリラーゼによって触媒されるＬ－アスコルビン
酸のトランスグルコシル化を示す。タンパク質ファミリー内の配列および構造多様性を示
す、選択されたスクロースホスホリラーゼは、部位選択性において、明らかな相違を示し
た。結果を表１で比較する。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を産生するための方法であって：
ａ. グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターを含む混合物を提供し；
ｂ. 該混合物をスクロースホスホリラーゼとインキュベーションし；
ｃ. インキュベーション中、ｐＨを７．０未満に維持し；
ｄ. 反応中、さらなるグリコシルドナーおよび／またはスクロースホスホリラーゼを添加してもよい；そして
ｅ. ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を単離および／または精製する一連の工程を含む、前記方法。
［実施形態２］前記スクロースホスホリラーゼがメタゲノム、微生物、好ましくは細菌起源のものである、実施形態１記載の方法。
［実施形態３］前記スクロースホスホリラーゼがホモ二量体性である、実施形態１または２記載の方法。
［実施形態４］前記スクロースホスホリラーゼが、ｐＨ＜７、好ましくはｐＨ＜６、より好ましくはｐＨ＜５、最も好ましくはｐＨ＜４で非常に安定である、実施形態１～３のいずれか記載の方法。
［実施形態５］前記細菌スクロースホスホリラーゼが、アグロバクテリウム・ビティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、大腸菌、大腸菌０６、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・デルブルエキー亜種ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、リステリア菌、シュードモナス・プトレファシエンス、シュードモナス・サッカロフィラ、ロドピレルラ・バルティカ、シェワネラ・バルティカ、シェワネラ・フリジディマリナ、ソリバクター・ウシタトゥス、ストレプトコッカス・ムタンスおよび／またはシネココッカス属種より得られる、実施形態１～４のいずれか記載の方法。
［実施形態６］前記スクロースホスホリラーゼが天然タンパク質または突然変異体である、実施形態１～５のいずれか記載の方法。
［実施形態７］前記スクロースホスホリラーゼが、全長タンパク質またはその触媒的活性断片、あるいは融合タンパク質として組換え的に産生される、実施形態１～６のいずれか記載の方法。
［実施形態８］前記スクロースホスホリラーゼが、全細胞、無細胞抽出物、粗精製、精製または固定型で用いられる、実施形態１～７のいずれか記載の方法。
［実施形態９］前記グルコシルドナーがグルコース１－リン酸またはスクロースである、実施形態１～８のいずれか記載の方法。
［実施形態１０］前記グルコシルアクセプターがアスコルビン酸である、実施形態１～９のいずれか記載の方法。
［実施形態１１］前記インキュベーションを、４．０～７．０、好ましくは４．５～６．５、より好ましくは４．８～６．２のｐＨ範囲、特に５．２のｐＨで行う、実施形態１～１０のいずれか記載の方法。
［実施形態１２］前記インキュベーション工程を少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７２時間行う、実施形態１～１１のいずれか記載の方法。
［実施形態１３］前記インキュベーションを約３０～７０℃、好ましくは約４０～６０℃、より好ましくは約４０～５０℃の温度範囲で行う、実施形態１～１２のいずれか記載の方法。
［実施形態１４］前記アスコルビン酸を、スクロースに対して０．３～３倍モル過剰で用いる、実施形態１～１３のいずれか記載の方法。
［実施形態１５］前記反応混合物中のスクロースホスホリラーゼの量が、１Ｕ／ｍｌ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲、または３０Ｕ／ｍＬである、実施形態１～１４のいずれか記載の方法。
［実施形態１６］前記のさらなるスクロースホスホリラーゼおよびスクロースを、インキュベーション中にインキュベーション混合物に添加して、スクロースホスホリラーゼを１Ｕ／ｍｌ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲、または３０Ｕ／ｍＬに、そしてスクロースを１００～２，０００ｍＭの範囲、または２５０ｍＭ～１，０００ｍＭの範囲または８００ｍＭに維持する、実施形態１～１５のいずれか記載の方法。
［実施形態１７］前記スクロースホスホリラーゼおよびスクロースを同時にまたは異なる時点で添加する、実施形態１６記載の方法。

以下の実施例は、本発明の理解を補助するために示されるが、いかなる点でも、本発明の範囲を限定することは意図されず、そして限定すると見なされてはならない。実施例には、慣用法、例えばクローニング、トランスフェクション、および微生物宿主細胞においてタンパク質を発現するための方法の基本的な側面の詳細な説明は含まれない。こうした方法は、一般の当業者に周知である。

実施例１－スクロースホスホリラーゼ酵素の産生
[0066]ＳＰアーゼ遺伝子挿入物をｈｉｓタグ下に含むｐＣ２１Ｅベクターを所持する大腸菌ＢＬ２１宿主株を、ＳＰアーゼ産生に用いた。該遺伝子は、ｔａｃ１プロモーター系下にクローニングされ、そしてＩＰＴＧで誘導された。グリセロールストックから培養を少量、マイクロピペットチップでスクラッチし、そしてアンピシリン（１２０μｇ／ｍＬ）を含有する５０ｍＬのＬＢ培地内に接種した。フラスコを、１２０ｒｐｍの振盪装置上、約１２時間、３０℃で一晩インキュベーションした。一晩培養物を、アンピシリン（１２０μｇ／ｍＬ）を含有する２００ｍＬＬＢ培地内に接種して、０．０１のＯＤ_６００を生じた。ＯＤ_６００が０．８～１．０に到達するまで、フラスコを３７℃、１２０ｒｐｍで数時間インキュベーションした。最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧをフラスコに添加した。フラスコを２５℃、１２０ｒｐｍでほぼ２０時間、振盪装置上でインキュベーションした。５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって細胞を採取した。上清をデカントし、そしてペレットを１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．２で洗浄した（湿細胞重量各１ｇに、５ｍＬの緩衝液を用いた）。１ｇの湿細胞を５ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．５ｍＭＤＴＴを含有する１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．２）中に再懸濁した。懸濁物をフレンチプレスに２回通過させた。生じた細胞溶解物を８，０００ｘｇで遠心分離して、破壊されなかった細胞および細胞破片から、可溶性分画を分離した。上清中のＳＰアーゼ酵素活性を定量化し、アリコットし、そして将来使用するために、－２０℃で保存した。

実施例２：酵素アッセイ
[0067]スクロースおよび無機リン酸からのＧｌｃ１－Ｐの産生を、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）およびグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ－ＤＨ）の存在下でＮＡＤ＋の還元と共役させる、連続共役酵素アッセイを用いて、ＳＰアーゼ活性を３０℃で測定した。１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２および１０μＭ α－Ｄグルコース１，６－二リン酸を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０中で、本質的に別の箇所に記載されるように標準アッセイを行った。反応混合物は、２５０ｍＭスクロース、２．５ｍＭＮＡＤ^＋、３Ｕ／ｍＬＰＧＭ、３．４Ｕ／ｍＬＮＡＤ＋依存性Ｇ６Ｐ－ＤＨおよび適切な希釈の酵素溶液を含有した。経時的なＮＡＤＨ形成を３４０ｎｍで分光光度的に監視した。１単位のＳＰアーゼ活性は、上述の条件下で、１分あたり、１マイクロモルのＮＡＤ^＋の還元を引き起こす酵素の量に相当する。標準としてウシ血清アルブミンを用いたＢｉｏＲａｄ色素結合法を用いて、タンパク質濃度を決定した。

実施例３：２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸の合成
[0068]水中で１，２００ｍＭのＬ－ＡＡおよび８００ｍＭのスクロースまたはグルコース－１－リン酸および３０Ｕ／ｍＬのＳＰアーゼを含有する反応混合物を５０℃および３００ｒｐｍで４８～７２時間インキュベーションした。空気密封容器中、暗所条件下、好ましくはｐＨ５．２で、反応を行った。ＢｉｏＲａｄＨＰＸ－８７Ｈカラムを使用したＨＰＬＣを用いて、産物分析を行い、そしてピークの溶出プロファイルをＵＶおよびＲＩ検出装置で監視した。カラムを２５℃で維持し、そして２０ｍＭ硫酸を０．４ｍＬ／分の流速で溶出剤として用いた。これらの条件下で、＞３０％のＬ－ＡＡがグルコシル化された。単離され、そして精製された産物のＮＭＲ分析によって、ＡＡ－２Ｇのα－１－２グリコシド連結が確認された。

実施例４：２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸の収率の改善
[0069]水中で１，２００ｍＭのＬ－ＡＡおよび８００ｍＭのスクロースまたはグルコース－１－リン酸および３０Ｕ／ｍＬのＳＰアーゼを含有する反応混合物を５０℃および３００ｒｐｍでインキュベーションした。反応中、スクロースの枯渇およびＳＰアーゼ活性の喪失を監視した。さらなるスクロースおよびＳＰアーゼを、２４時間、４８時間および７２時間後に添加して、スクロース濃度およびＳＰアーゼ活性を最初の量、すなわちそれぞれ８００ｍＭおよび３０Ｕ／ｍＬに回復させた。この方式で、収率は約１．５ｘ増加した。

実施例５：さらなるスクロースホスホリラーゼの評価
[0070]ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ストレプトコッカス・ムタンス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ロイコノストック・メセンテロイデス由来の、タンパク質ファミリー内の配列多様性を示す、４つのさらなるスクロースホスホリラーゼを評価した。ホモ二量体性スクロースホスホリラーゼは、２－ＯＨでＬ－アスコルビン酸のグリコシル化に高い部位選択性を示し、ＡＡ－２ＧおよびＡＡ－６Ｇの混合物が形成される単量体型に比較して、ＡＡ－２Ｇ形成を生じた。単量体性スクロースホスホリラーゼは、総産物のかなりの比率でＡＡ－６Ｇを放出した一方、ホモ二量体性タンパク質では、検出限界を超えるＡＡ－６Ｇは形成されなかった。しかし、ｐＨ７．５では本質的に欠けている、ｐＨ５．２でのＡＡ－２Ｇ合成は、試験したすべてのスクロースホスホリラーゼの本質的な特性であった。

Claims

２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を産生するための方法であって：
ａ. グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターを含む混合物を提供し；
ｂ. 該混合物をスクロースホスホリラーゼとインキュベーションし；
ｃ. インキュベーション中、ｐＨを４．８～５．５の範囲に維持し；
ｄ. 反応中、さらなるグリコシルドナーおよび／またはスクロースホスホリラーゼを添加してもよい；そして
ｅ. ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸を単離および／または精製する
一連の工程を含み、
前記グルコシルドナーがグルコース１－リン酸またはスクロースであり、
前記グルコシルアクセプターがアスコルビン酸である、
前記方法。
前記スクロースホスホリラーゼがメタゲノム、微生物、好ましくは細菌起源のものである、請求項１記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼがホモ二量体性である、請求項１または２記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼが、ｐＨ＜７、好ましくはｐＨ＜６、より好ましくはｐＨ＜５、最も好ましくはｐＨ＜４で非常に安定である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼが、アグロバクテリウム・ビティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、大腸菌、大腸菌０６、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・デルブルエキー亜種ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、リステリア菌、シュードモナス・プトレファシエンス、シュードモナス・サッカロフィラ、ロドピレルラ・バルティカ、シェワネラ・バルティカ、シェワネラ・フリジディマリナ、ソリバクター・ウシタトゥス、ストレプトコッカス・ムタンスおよび／またはシネココッカス属種より得られる細菌スクロースホスホリラーゼである、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼが天然タンパク質または突然変異体である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼが、全長タンパク質またはその触媒的活性断片、あるいは融合タンパク質として組換え的に産生される、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼが、全細胞、無細胞抽出物、粗精製、精製または固定型で用いられる、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
前記インキュベーション工程を少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７２時間行う、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
前記インキュベーションを約３０～７０℃、好ましくは約４０～６０℃、より好ましくは約４０～５０℃の温度範囲で行う、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
前記アスコルビン酸を、スクロースに対して０．３～３倍モル過剰で用いる、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
前記反応混合物中のスクロースホスホリラーゼの量が、１Ｕ／ｍＬ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲、または３０Ｕ／ｍＬである、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
さらなるスクロースホスホリラーゼおよびスクロースを、インキュベーション中にインキュベーション混合物に添加して、スクロースホスホリラーゼを１Ｕ／ｍＬ～１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲、または５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲、または１０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬの範囲、または２０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬの範囲、または３０Ｕ／ｍＬに、そしてスクロースを１００～２，０００ｍＭの範囲、または２５０ｍＭ～１，０００ｍＭの範囲または８００ｍＭに維持する、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
前記スクロースホスホリラーゼおよびスクロースを同時にまたは異なる時点で添加する、請求項１３記載の方法。
前記細菌スクロースホスホリラーゼがビフィドバクテリウム・アドレセンティスより得られる、請求項５記載の方法。
前記細菌スクロースホスホリラーゼがビフィドバクテリウム・ロングムより得られる、請求項５記載の方法。
前記細菌スクロースホスホリラーゼがストレプトコッカス・ムタンスより得られる、請求項５記載の方法。