CN113980932B - 一种定点突变的α-葡萄糖苷酶 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，公开了一种定点突变的α‑葡萄糖苷酶。本发明所述定点突变的α‑葡萄糖苷酶是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α‑葡萄糖苷酶中制造两个氨基酸取代而产生的；所述的氨基酸取代是第120位和第215位的取代。本发明提供了所述的定点突变的α‑葡萄糖苷酶在制备2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸中的应用。本发明所述定点突变的α‑葡萄糖苷酶能够降低合成AA‑2G时副产物AA‑6G的含量，且提高了AA‑2G产量，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

Description

一种定点突变的α-葡萄糖苷酶
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，涉及一种定点突变的α-葡萄糖苷酶及其应用。
背景技术
L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)又称维生素C(Vitamin C，L-AA，VC)，是人体必需的维生素和天然抗氧化剂，具有保护作用的抗氧化剂，在维持人体健康中承担重要的角色。此外，维生素C对皮肤的保养有一定的功效，经过多年的发展，目前维生素C在全球食品和化妆品行业得到广泛应用。但是VC的理化性质极其不稳定，其2号碳上的氢氧根非常容易氧化还原反应而发生降解，导致维生素C的生理活性迅速减弱甚至失活。2-O-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的维生素C替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，AG，EC 3.2.1.20)，又称α-D-葡萄糖苷水解酶，是最早发现能产生2-O-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)的酶。不像环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)合成AA-2G过程中容易产生副产物AA-2Gn(n是连在L-抗坏血酸的2号碳上的糖基个数)，相比于其他AA-2G的生物合成法，α-葡萄糖苷酶合成AA-2G的副产物已经属于较少的一类，但是主要副产物AA-6G的存在，会给AA-2G的分离纯化带来极大的困难，如综述文献(https://doi.org/10.1007/s00253-012-4150-9)报道：α-葡萄糖苷酶的转糖苷反应容易产生副产物AA-6G，影响了该酶的应用。另外，α-葡萄糖苷酶合成AA-2G的效率很低。如名称为“一种α-糖苷酶基因突变体及在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用”的发明专利申请(公开号：CN112695021A)，该专利申请公开了粳稻α-葡萄糖苷酶的五种突变体，实现了催化生成AA-2G的产量的提高。该发明针对产量的提高进行了研究，但未涉及减少AA-6G副产物的改进。
6-O-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-6G)，是维生素C的6号碳上连接上一个葡萄糖分子的维生素C的糖类衍生物，与AA-2G是同分异构体(AA-2G的紫外光最大吸收波长为238nm，AA-6G紫外光最大吸收波长为243nm，紫外光最大吸收波长是区分AA-2G和AA-6G的一个指标。参考文献DOI：10.1080/00021369.1990.10870201)，极难用一般的分离方法进行分离。副产物AA-6G的存在极大的限制了α-葡萄糖苷酶在合成AA-2G中的应用。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种定点突变的α-葡萄糖苷酶，它可被作为催化酶，利用麦芽糖以及L-抗坏血酸做为底物合成AA-2G且无副产物AA-6G，且提高了AA-2G产量。
本发明是对粳稻α-葡萄糖苷酶(称为JrAG基因)进行定点突变，由粳稻(Oryzasativa Japonica Group)中获得定点突变的α-葡萄糖苷酶，
本发明所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶中制造两个氨基酸取代而产生的；所述的氨基酸取代是第120位和第215位的取代。
本发明是通过蛋白质工程技术对粳稻α-葡萄糖苷酶(Japonica riceα-D-Glucosidase，JrAG)的两个位点的氨基酸残基进行改造后得到的一种新的定点突变的α-葡萄糖苷酶。JrAG的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
根据本发明所述的定点突变改造的α-葡萄糖苷酶的进一步特征，所述第120位的取代是精氨酸突变为丝氨酸，所述第215位的取代是酪氨酸突变为色氨酸，简称为R120S/Y215W；所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的是提供一种DNA分子，其编码所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶。
优选地，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。
本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。
上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。
本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母GS115；本发明优选的目的基因表达载体为pPIC3.5k。
本发明还提供了所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶的生产方法，包括：在适于α-葡萄糖苷酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所述的α-葡萄糖苷酶。
本发明还提供了所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶的用途。
本发明所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶可应用于制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸。具体地，以本发明所述的所述的α-葡萄糖苷酶作为催化剂，麦芽糖为糖基供体、L-抗坏血酸为糖基受体，转化生成2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)。
经产物分析，本发明所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶(R120S/Y215W)合成AA-2G的转糖苷反应液无副产物AA-6G，其他酶学性质与野生型酶基本一致，因此实现了合成AA-2G同时减少副产物的目的，同时还提高了AA-2G产量。
本发明合成AA-2G的转糖苷反应以麦芽糖为糖基供体、L-抗坏血酸为糖基受体，转化生成2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸。所述糖基供体为500mM的麦芽糖。所述糖基受体为100mM的L-抗坏血酸，催化剂质量为50μg。所述反应在40℃、pH为5.0条件下反应16h。
附图说明
图1是利用粳稻α-葡萄糖苷酶野生型催化生成AA-2G的HPLC色谱图，三个产物峰分别命名为峰A、峰B、峰C，其中峰B为AA-2G峰，峰A为副产物，峰C为副产物AA-6G峰。
图2是利用本发明所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶R120S/Y215W催化生成AA-2G的HPLC色谱图，产物峰命名为峰D，峰D为AA-2G峰。
图3是利用粳稻α-葡萄糖苷酶野生型或本发明所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶R120S/Y215W催化生成AA-2G的产物峰的高分辨液质联用(ESI)分析结果，Peak B为峰B，Peak D为峰D。两个峰均有分子量(M-1)＝337.077的物质，表明两个峰的物质均为AA-2G。
图4是利用粳稻α-葡萄糖苷酶野生型催化生成AA-2G的副产物峰C的高分辨液质联用(ESI)分析结果，峰C含有分子量(M-1)＝337.077的物质，结合图5表明峰内物质为AA-6G。
图5是利用粳稻α-葡萄糖苷酶野生型催化生成AA-2G的副产物峰C紫外最大吸收波长的检测图，结果显示峰C的紫外最大吸收波长为243nm，结合图4的结果表明峰C为AA-6G峰。
具体实施方式
本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
“wtJrAG”表示野生型α-葡萄糖苷酶，其基因以斜体wtJrAG表示。
“JrAGR120S/Y215W”表示突变体α-葡萄糖苷酶JrAGR120S/Y215W，其基因以JrAGR120S/Y215W表示。
YPG培养基：酵母提取物10g·L-1，大豆蛋白胨20g·L-1，甘油10g·L-1。
本实验采用的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商品化产品，可从Invitrogen公司购得。载体pPIC3.5k为商品化产品。本领域技术人员也可以参照本发明的说明而采用其他载体。
AA-2G的高效液相色谱(HPLC)检测：色谱柱为Acclaim 120C18(5μm，4.6×250mm)。紫外检测波长为238/243nm。流动相为75mM的KH2PO4，用磷酸调pH至2.0，流速0.8mL/min，时间为20min，进样量10μL，柱温为25℃。HPLC图谱中AA-2G的峰面积和浓度成正比，以此绘制AA-2G标准曲线。利用标准曲线及样品中的AA-2G的峰面积，得出样品中AA-2G的浓度。
实施例1：wtJrAG重组载体(pPIC3.5k-JrAG)质粒的构建
来源于Oryza sativa Japonica Group(Rice)的α-葡萄糖苷酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明使用α-factor信号肽代替JrAG自身原有的信号肽，并且加上三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)，以实现其在毕赤酵母GS115中的组成型分泌表达。在C-末端添加6-his标签，基因的5′端和3′端分别添加Sac I和EcoR I限制性核酸内切酶的酶切位点，将目的基因序列进行毕赤酵母密码子优化且选择pPIC3.5k作为表达载体，得到重组载体pPIC3.5k-JrAG。
由上海捷瑞生物工程有限公司合成该重组载体。
实施例2：突变体JrAGR120S/Y215W重组载体(pPIC3.5k-JrAGR120S/Y215W)质粒的构建
以pPIC3.5k-JrAG为基础，将第120位精氨酸突变为丝氨酸，同时将第215位酪氨酸突变为色氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到重组载体pPIC3.5k-JrAGR120S/Y215W。
由上海捷瑞生物工程有限公司合成该重组载体。
实施例3：α-葡萄糖苷酶重组菌的制备
将实施例1和2中得到的重组质粒wtJrAG、JrAGR120S/Y215W经限制性内切酶Sal I酶切线性化后，使用电脉冲法将线性化质粒电转至毕赤酵母GS115感受态细胞。得到α-葡萄糖苷酶重组菌wtJrAG、JrAGR120S/Y215W。
电脉冲法电转具体步骤：
(1)将保种的毕赤酵母GS115菌种划线于YPG平板培养基中，28℃，培养2-3天。
(2)从平板上挑取单克隆菌落，接种于5mL YPG培养基，28℃，200rpm培养两天。
(3)无菌操作下取出少量毕赤酵母GS115于载玻片，在显微镜下40×倍物镜镜检菌液是否染菌。若未染菌，则取50μL GS115菌液于50mL YPG液体培养基中，28℃，200r/min培养至菌液OD600值在1.6-2.0范围内。收集菌液，4℃，4 000g，离心5min，弃上清。
(4)用8mL溶液I(10mM Tris-HCl,pH＝7.4；10mM DTT；1M山梨醇；100mM LiAc；无菌水)重悬毕赤酵母GS115细胞，冰上放置30min。
(5)4℃，4 000g，离心5min，弃上清。
(6)用4mL 1M山梨醇溶液洗涤3次，4℃，4 000g，离心5min，弃上清。
(7)用400μL 1M山梨醇溶液重悬细胞即为制备好的感受态细胞，现做现用。
(8)将20μL线性化DNA溶液(约300ng)加入到80μL感受态细胞中，并温和地充分混匀。将混合液转移到预冷的0.2cm型电转杯底部中，将电转杯冰浴5min。
(9)接通电源，电转仪电压设置为1.5kV，Field Strength设为7.5kV/cm，时间为5ms，擦干电转杯表面水分后，插入电转槽孔内并启动电脉冲。
(10)电击结束后立刻向电转杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，迅速混匀，再冰浴5min。
实施例4：摇瓶发酵产α-葡萄糖苷酶
将实施例3中得到的重组毕赤酵母菌wtJrAG、JrAGR120S/Y215W分别接种于YPG试管培养基中，在28℃、200rpm培养24h得到活化的种子液；以1％的接种量转接到300mL YPG培养基并培养72h。发酵结束后，将菌液10000g离心5min，上清液即为重组的wtJrAG、JrAGR120S /Y215W的粗酶液。
实施例5：α-葡萄糖苷酶的分离纯化
利用镍柱亲和层析对经实施例4得到的重组α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W的粗酶液进行纯化。
首先，粗酶液进行硫酸铵沉淀，将粗酶液置于磁力搅拌器上中速搅拌，并缓慢加入研磨精细的硫酸铵粉末，使溶液硫酸铵饱和度达到80％(每100mL上清液加56.1g硫酸铵粉末)。待硫酸铵全部溶解后将溶液保存于4℃冰箱沉淀过夜对目的蛋白进行初步分离。
其次，将15mL Ni-NTA柱安装至蛋白纯化仪，用缓冲液A(20mMPB，150mM NaCl，10mM咪唑，pH＝7.0)冲洗管路以及平衡柱子。将硫酸铵沉淀10000g，离心5min，弃上清，使用缓冲液A重悬沉淀，既得到纯化样品。将样品以0.5mL/min的流速上样，带有His标签的蛋白能与Ni柱中的硫酸镍结合，将蛋白截留。上样完成后利用缓冲液B(20mMPB，150mM NaCl，300mM咪唑，pH＝7.0)以3mL/min的流速进行梯度洗脱，缓冲液B中的咪唑也可以与Ni柱中的硫酸镍结合，从而与带有His标签的蛋白形成竞争关系。收集穿透峰和目标峰。洗脱结束后分别用纯水和20％乙醇清洗Ni柱。洗脱液用超滤离心管4℃、4000g，离心10min，脱盐除咪唑，得到纯酶液。超滤离心管的截留分子量为50KDa。蛋白电泳结果显示在100-150KDa处有一条与理论分子量一致的条带。
实施例6：α-葡萄糖苷酶及其突变体合成AA-2G的产物比较
将经过实施例5纯化的重组α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W进行转糖苷反应合成AA-2G。糖基供体为500mM的麦芽糖，糖基受体为100mM的L-抗坏血酸，酶蛋白浓度为0.05mg/mL，反应体积为1mL。反应在40℃、pH为5.0避光条件下反应16h。置于0℃冰箱停止反应，反应液直接进行HPLC分析。
wtJrAG、JrAGR120S/Y215W转糖苷反应液的HPLC色谱图。wtJrAG反应液的色谱图出现三个峰(图1)，分别命名为峰A、峰B、峰C；JrAGR120S/Y215W反应液的色谱图出现一个峰(图2)，命名为峰D。分别收集4个峰的洗脱液进行高分辨液质联用(ESI)分析。
ESI结果(图3)表示峰B和峰D检测出337.077(M-1)(C12H17O11)的物质，结合在HPLC这三个峰与AA-2G标品保留时间一致(t＝8.92)、最大吸收波长相等(238nm)，表明这两个峰为AA-2G，其余的峰均为合成AA-2G的副产物峰。其中野生型独有的峰C(图4)检测出337.077(M-1)(C12H17O11)的物质，结合峰C在HPLC的出峰时间较AA-2G标品延后0.3min、峰C的最大吸收波长为243nm(图5)，这与AA-6G的最大吸收波长一致，表明峰C为AA-6G的峰。
结果表明wtJrAG合成AA-2G时产生两个副产物峰，其中包括AA-6G副产物且峰面积较大；突变体没有AA-6G峰和其他副产物，利于后续AA-2G的分离纯化(参见图2)。
实施例7：温度对定点突变的α-葡萄糖苷酶的影响
分别将10μL经实施例5纯化的重组α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W加至800μL反应体系中(5mM pNPG，0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)，反应在不同温度下进行(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)，15min后反应液加入200μL的预冷1M Na2CO3溶液，增强显色并终止反应，每个反应做三组平行样。利用酶标仪检测样品中生成的pNP的量，取酶活最高的一组作为相对酶活100％。
结果表明温度对不同α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W的影响基本一致，均为50℃条件下酶活力最高，所述α-葡萄糖苷酶在温度范围为30℃-60℃条件下较为稳定。
以野生型为催化剂，合成AA-2G的量为2.13g/L，突变体生成AA-2G的量达到3.56g/L以上。
实施例8：pH对定点突变的α-葡萄糖苷酶的影响
将10μL经实施例5纯化的重组α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W加至加至不同pH(3.0-7.0)的800μL反应体系中(5mM pNPG，0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液)，反应在40℃进行，15min后反应液加入200μL的预冷1M Na2CO3溶液，增强显色并终止反应，每个反应做三组平行样。利用酶标仪检测样品中生成的pNP的量，取酶活最高的一组作为相对酶活100％。
结果表明pH对不同α-葡萄糖苷酶wtJrAG、JrAGR120S/Y215W的影响基本一致，均在pH4.0-6.0的条件范围内催化效率较高，最适反应pH为5.0。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学，开平牵牛生化制药有限公司
<120> 一种定点突变的α-葡萄糖苷酶
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 852
<212> PRT
<213> 粳稻
<400> 1
Gly Tyr Asn Val Ala Ser Val Ala Gly Ser Lys Asn Arg Leu Arg Ala
1 5 10 15
Arg Leu Glu Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Glu Leu Gly
20 25 30
Pro Asp Val Arg Arg Leu Ser Leu Thr Ala Ser Leu Glu Thr Asp Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Thr Gly Asp Val Leu Phe Asp Thr Thr Pro Asn Leu Val Phe Lys
115 120 125
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130 135 140
Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Glu Gln Thr Lys Arg Thr Phe Arg Leu Gln
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Asn Ser Asn Gly Met Asp Val Ile Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Thr Tyr
210 215 220
Lys Val Ile Gly Gly Val Leu Asp Phe Tyr Phe Phe Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Pro Leu Ala Val Val Asp Gln Tyr Thr Gln Leu Ile Gly Arg Pro Ala
245 250 255
Pro Met Pro Tyr Trp Ser Phe Gly Phe His Gln Cys Arg Tyr Gly Tyr
260 265 270
Lys Asn Val Ala Asp Leu Glu Gly Val Val Ala Gly Tyr Ala Lys Ala
275 280 285
Arg Ile Pro Leu Glu Val Met Trp Thr Asp Ile Asp Tyr Met Asp Ala
290 295 300
Tyr Lys Asp Phe Thr Leu Asp Pro Val Asn Phe Pro Ala Asp Arg Met
305 310 315 320
Arg Pro Phe Val Asp Arg Leu His Arg Asn Gly Gln Lys Phe Val Val
325 330 335
Ile Ile Asp Pro Gly Ile Asn Val Asn Thr Thr Tyr Gly Thr Phe Val
340 345 350
Arg Gly Met Lys Gln Asp Ile Phe Leu Lys Trp Asn Gly Ser Asn Tyr
355 360 365
Leu Gly Val Val Trp Pro Gly Asn Val Tyr Phe Pro Asp Phe Leu Asn
370 375 380
Pro Arg Ala Ala Glu Phe Trp Ala Arg Glu Ile Ala Ala Phe Arg Arg
385 390 395 400
Thr Leu Pro Val Asp Gly Leu Trp Val Asp Met Asn Glu Ile Ser Asn
405 410 415
Phe Val Asp Pro Pro Pro Leu Asn Ala Ile Asp Asp Pro Pro Tyr Arg
420 425 430
Ile Asn Asn Ser Gly Val Arg Arg Pro Ile Asn Asn Lys Thr Val Pro
435 440 445
Ala Ser Ala Val His Tyr Gly Gly Val Ala Glu Tyr Asp Ala His Asn
450 455 460
Leu Phe Gly Phe Leu Glu Ala Arg Ala Thr His Asp Ala Leu Leu Arg
465 470 475 480
Asp Thr Gly Arg Arg Pro Phe Val Leu Ser Arg Ser Thr Phe Val Gly
485 490 495
Ser Gly Arg Tyr Thr Ala His Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ala Thr Trp
500 505 510
Glu Asp Leu His Tyr Ser Ile Asn Thr Met Leu Ser Phe Gly Leu Phe
515 520 525
Gly Ile Pro Met Ile Gly Ala Asp Ile Cys Gly Phe Gly Gly Asn Thr
530 535 540
Thr Glu Glu Leu Cys Ser Arg Trp Ile Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro
545 550 555 560
Phe Ser Arg Asp His Ser Ala Ile Gly Thr Val Arg Arg Glu Leu Tyr
565 570 575
Leu Trp Glu Ser Val Ala Arg Ser Ala Arg Lys Ala Leu Gly Leu Arg
580 585 590
Tyr Arg Leu Leu Pro Tyr Leu Tyr Thr Leu Met Tyr Glu Ala His Thr
595 600 605
Thr Gly Ala Pro Ile Ala Arg Pro Leu Phe Phe Ser Tyr Pro Gly Asp
610 615 620
Val Glu Thr Tyr Gly Ile Asp Arg Gln Phe Leu Leu Gly Arg Gly Val
625 630 635 640
Leu Val Ser Pro Val Leu Glu Pro Gly Ala Thr Thr Val Thr Ala Tyr
645 650 655
Phe Pro Ala Gly Arg Trp Phe Ser Leu Tyr Asp Phe Ser Leu Ala Val
660 665 670
Ala Thr Lys Thr Gly Lys Arg Val Thr Leu Pro Ala Pro Ala Asp Thr
675 680 685
Val Asn Val His Val Ala Gly Gly Asn Ile Leu Thr Leu Gln Gln Pro
690 695 700
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705 710 715 720
Ala Leu Ala Asp Asp Gly Thr Ala Thr Gly Asp Leu Phe Leu Asp Asp
725 730 735
Gly Glu Ser Pro Glu Met Ala Gly Pro Arg Ser Arg Trp Ser Gln Ile
740 745 750
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770 775 780
Gly Lys Val Val Leu Met Gly Leu Arg Ser Ala Ala Pro Pro Lys Gly
785 790 795 800
Phe Ala Val Tyr Ala Asn Gly Val Gln Val Asn Ala Ser Thr Ala Val
805 810 815
Gly Gly Ala Ala Gly Ser Pro Glu Lys Gly Ala Leu Gly Val Ala His
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Val Ser Gly Leu Thr Leu Val Val Gly Gln Glu Phe Asp Leu Lys Val
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<213> 人工合成
<400> 2
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Glu Gln Thr Lys Arg Thr Phe Arg Leu Gln
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Arg Asn Asp Thr Phe Thr Leu Trp Asn Ser Asp Ile Ala Ala Gly Asn
165 170 175
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180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala His Gly Val Leu Leu Leu
195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
Pro Met Pro Tyr Trp Ser Phe Gly Phe His Gln Cys Arg Tyr Gly Tyr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Pro Phe Val Asp Arg Leu His Arg Asn Gly Gln Lys Phe Val Val
325 330 335
Ile Ile Asp Pro Gly Ile Asn Val Asn Thr Thr Tyr Gly Thr Phe Val
340 345 350
Arg Gly Met Lys Gln Asp Ile Phe Leu Lys Trp Asn Gly Ser Asn Tyr
355 360 365
Leu Gly Val Val Trp Pro Gly Asn Val Tyr Phe Pro Asp Phe Leu Asn
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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465 470 475 480
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485 490 495
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
Leu Val Ser Pro Val Leu Glu Pro Gly Ala Thr Thr Val Thr Ala Tyr
645 650 655
Phe Pro Ala Gly Arg Trp Phe Ser Leu Tyr Asp Phe Ser Leu Ala Val
660 665 670
Ala Thr Lys Thr Gly Lys Arg Val Thr Leu Pro Ala Pro Ala Asp Thr
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Val Asn Val His Val Ala Gly Gly Asn Ile Leu Thr Leu Gln Gln Pro
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Ala Leu Thr Ser Ser Arg Val Arg Gln Ser Val Val His Leu Leu Val
705 710 715 720
Ala Leu Ala Asp Asp Gly Thr Ala Thr Gly Asp Leu Phe Leu Asp Asp
725 730 735
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740 745 750
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770 775 780
Gly Lys Val Val Leu Met Gly Leu Arg Ser Ala Ala Pro Pro Lys Gly
785 790 795 800
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Val Ser Gly Leu Thr Leu Val Val Gly Gln Glu Phe Asp Leu Lys Val
835 840 845
Val Met Thr Tyr
850
<210> 3
<211> 2556
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggatacaacg ttgcttccgt tgctggttct aagaacagat tgagagctag attggaattg 60
gctggtggag gtggaggagc tgctcctgaa ttgggacctg atgttagaag attgtccttg 120
actgcttcct tggaaactga ttcccggttg catgttagaa ttactgatgc tgatcatcca 180
agatgggaag ttcctcaaga tgttattcca agaccatccc cagattcctt tttggctgct 240
actagaccag gaggaggttc tgttttgtcc actgctactt ccgatttgac ttttgctatt 300
catacttccc catttagatt tactgttact agaagatcaa ctggtgatgt tttgtttgat 360
actactccaa acttggtttt taaggataga tacttggaat tgacttcttc cttgccacct 420
ccaggtagag cttccttgta cggattgggt gaacaaacta agagaacttt tagattgcaa 480
agaaacgata cttttacttt gtggaactcc gatattgctg ctggtaacgt tgatttgaac 540
ttgtggggtt cacatccatt ttacatggat gttagatccg gaggaggagg tggaggagga 600
gctgctcatg gagttttgtt gttgaactct aacggtatgg atgttattta cggtggttct 660
tacgttactt acaaggttat tggaggagtt ttggattttt acttttttgc tggaccatcc 720
ccattggctg ttgttgatca atacactcaa ttgattggta gaccagctcc tatgccatac 780
tggtcctttg gatttcatca atgtagatac ggatacaaga acgttgctga tttggaagga 840
gttgttgctg gatacgctaa ggctcgcatc ccattggaag ttatgtggac tgatattgat 900
tacatggatg cttacaagga ttttactctc gacccagtta actttccagc tgatagaatg 960
agaccatttg ttgatagatt gcatagaaac ggtcaaaagt ttgttgttat tattgatcca 1020
ggtattaacg ttaacactac ttacggaact tttgttagag gtatgaagca agatattttt 1080
ttgaagtgga acggttctaa ctacttggga gttgtttggc caggaaacgt ttactttcct 1140
gattttttga acccaagagc tgctgaattt tgggctagag aaattgctgc ttttagaaga 1200
actttgccag ttgatggttt gtgggttgat atgaacgaaa tttcaaactt tgttgatcca 1260
ccaccattga acgctattga tgatccacct tacagaatta acaactcagg agttcgacgt 1320
cctattaaca acaagactgt tccagcttcc gctgttcatt acggaggagt tgctgaatac 1380
gatgctcata acttgtttgg atttttggaa gctagagcta ctcacgatgc tttgttgaga 1440
gatactggta ggcgaccatt tgttttgtcc agatccactt ttgttggttc aggtagatac 1500
actgctcatt ggactggtga taacgctgct acttgggaag atttgcatta ctctattaac 1560
actatgttgt cctttggttt gtttggtatt cctatgattg gagctgatat ttgtggattt 1620
ggtggtaaca ctactgaaga attgtgttca agatggattc aattgggagc tttttaccca 1680
ttttcccgtg atcattccgc tattggaact gttagaagag aattgtactt gtgggaatcc 1740
gttgctagat ccgctagaaa ggctttggga ttgagataca gattgttgcc atacttgtac 1800
actttgatgt acgaagctca tactactggt gctccaattg ctagaccatt gtttttttct 1860
tacccaggtg atgttgaaac ttacggtatt gatagacaat ttttgttggg tagaggagtt 1920
ttggtttccc cagttttgga accaggagct actactgtta ctgcttactt tccagctggt 1980
agatggtttt ccttgtacga tttttcattg gctgttgcta ctaagactgg taagagagtt 2040
actttgccag ctccagctga tactgttaac gttcatgttg ctggtggtaa cattttgact 2100
ttgcaacaac cagctttgac ttcttcaaga gttagacaat ccgttgttca tttgttggtt 2160
gctttggctg atgatggaac tgctactggt gatttgtttt tggatgatgg tgaatcacct 2220
gaaatggctg gaccacgcag cagatggtca caaattaagt tttcaggtgc tactgaatcc 2280
ggaggtggag ttgttagagt tagatcacat gttgttcacg attcttacgc tccttcaaga 2340
actatggcta ttggtaaggt tgttttgatg ggattgagat ccgctgctcc acctaaggga 2400
tttgctgttt acgctaacgg agttcaagtt aacgcttcaa ctgctgttgg tggagctgct 2460
ggttcacctg aaaagggtgc tttgggagtt gctcatgttt ccggattgac tttggttgtt 2520
ggtcaagaat ttgatttgaa ggttgttatg acttac 2556

Claims (7)

1.一种定点突变的α-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求1所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种载体，其特征在于：其含有权利要求2或3所述的DNA分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2或3所述的DNA分子或者含有权利要求4所述的载体。
6.如权利要求1所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于α-葡萄糖苷酶表达的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所述的α-葡萄糖苷酶。
7.根据权利要求1所述的定点突变的α-葡萄糖苷酶在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。
CN202111231828.4A 2021-07-15 2021-10-22 一种定点突变的α-葡萄糖苷酶 Active CN113980932B (zh)

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