CN114032222B - 糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们的应用。该基因工程菌含有编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4‑香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，编码UDP葡萄糖脱氢酶的基因，编码UDP木糖合酶和基因和糖链延伸糖基转移酶突变体的基因CaUGT3‑TN。该基因工程菌可发酵生产络塞维E(式I)，产量最高可达0.47g/L。

Description

糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和 它们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们在制备络塞维E中的应用。

背景技术

络塞、络塞维和络塞琳统称为络塞维复合物，是濒危植物玫瑰红景天中一类重要的活性成分，具有抗氧化，保护心脏，增强学习和记忆等功能。其中络塞维是主要活性成分，也是常用来评价玫瑰红景天提取物质量的重要标志物。研究发现络塞维复合物具有多种有益的药理作用，如益智、抗癌、增强免疫、抗抑郁、抗紫外辐射等。

Cinnamyl-(6'-O-β-D-xylopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，2003年首次从玫瑰红景天中分离得到的络塞维类化合物（Tolonen, A.,Pakonen, M., Hohtola, A., and Jalonen, J. (2003) Phenylpropanoid glycosidesfrom Rhodiola rosea. Chem. Pharm. Bull.51, 467-470.），与络塞维结构类似，将其命名为络塞维E。

目前，络塞维E的生产主要来源于植物提取。红景天生长于高寒地区，野生资源珍稀。近年来，因过度开采，玫瑰红景天已被包括中国在内多个国家列为濒危物种。受生长条件、病虫害等的制约，红景天至今未实现大规模人工种植；且植物红景天中活性成分积累周期很长，约需生长5-7年才能获得足够的活性成分。2006年，Patov等人报道了络塞维的化学合成（Kishida, M., Akita, H. (2005) Simple synthesis of phenylpropenoid β-D-glucopyranoside congeners based on Mizoroki-Heck type reaction of organoboronreagents. Tetrahedron Lett. 46, 4123-4125.）。但是化学合成步骤较多，产率低成本高，环境污染较严重。因此，需要开发一种能够高效生产络塞维E化合物的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们在制备络塞维E中的应用，利用本发明的突变体，能够高产络塞维E。

本发明的发明人通过前期的研究，构建了含有编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，实现了肉桂醇单葡萄糖苷络塞的微生物从头合成。在此基础上引入使糖链延伸的糖基转移酶的编码基因CaUGT3，得到了一种新的化合物，络塞葡糖苷（肉桂醇双葡萄糖苷，新化合物，命名为络塞维B或Rosavin B）。

本发明的发明人在前期研究的基础上，通过理性设计，将上述糖链延伸糖基转移酶CaUGT3的145位和/或375位进行突变，并通过引入编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因、编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，编码UDP葡萄糖脱氢酶UGD的基因，编码UDP木糖合酶UXS的基因，实现了络塞维E的合成，构建了基因工程菌，表达获得的如上产物的产量较高，最高可达472.86 mg。

基于如上的发现，第一方面，本发明提供了一种糖链延伸糖基转移酶突变体，该突变体为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过如下突变且酶活力不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第145位的苏氨酸经非极性氨基酸取代；和/或

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第375位的天冬氨酸经极性中性氨基酸取代。

第二方面，本发明提供了如上所述的突变体的编码基因。

第三方面，本发明提供了一种基因工程菌，该基因工程菌含有编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，编码UDP葡萄糖脱氢酶的基因，编码UDP木糖合酶的基因和如上所述的编码基因。

第四方面，本发明提供了如上所述的糖链延伸糖基转移酶突变体，或如上所述的编码基因，或者如上所述的基因工程菌在制备络塞维E中的应用；

其中，络塞维E的结构式如式I所示：

式I。

本发明的基因工程菌，可以发酵生产络塞维E（式I），产量最高可达472.86 mg/L。因此，本发明提供了一种高产络塞维E的新的生物合成途径，为络塞维E的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的科研价值和社会效益。

此外，在本发明基因工程菌的摇瓶发酵中还可以同时产络塞，在罐发酵中还可以同时产络塞维B和络塞，以及肉桂醇。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成络塞维E的途径示意图。

图2为大肠杆菌菌株BPHE-RETN和BPHE-RE的发酵产物的HPLC结果，其中，A是菌株BPHE-RETN的摇瓶发酵产物HPLC检测图，B是菌株BPHE-RE的发酵产物HPLC检测图，C是菌株BPHE-RETN的罐发酵产物HPLC检测图。

图3为峰1-4的MS图谱，A是化合物1肉桂醇，B是化合物2络塞，C是化合物3络塞维E，D是化合物4络塞维B。

图4为络塞维E的NMR图，A为¹H NMR，B为¹³C NMR。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，所述络塞维E具有如下式I所示的结构，为肉桂醇-葡萄糖-木糖苷，本发明命名为络塞维E，英文命名为Rosavin E，化学名称trans-cinnamyl-(6'-O-β-D-xylopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₂₀H₂₈O₁₀，分子量428.18。

式I。

第一方面，本发明提供了一种糖链延伸糖基转移酶突变体，该突变体为SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列经过如下突变且酶活力不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第145位的苏氨酸经非极性氨基酸取代；和/或

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第375位的天冬氨酸经极性中性氨基酸取代。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和脯氨酸（Pro）；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asn）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）（参见“生物化学”（第二版）上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月）。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用（比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用）没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述的特定位点上。

根据本发明，优选的，所述非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸，优选为缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。

根据本发明，优选的，所述极性中性氨基酸为苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸或甘氨酸；优选为谷氨酰胺或酪氨酸。

根据本发明一种更为优选的实施方式，所述突变体在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第145位和第375位均有取代，进一步优选的，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

第二方面，本发明提供了如上所述的突变体的编码基因。

公知的，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met（ATG）或Trp（TGG）分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码（Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D）。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，根据相应酶的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如PCR方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列，这些序列均应该视为在本发明的保护范围内。

根据本发明一种更为优选的实施方式，为了进一步提高络塞维E在基因工程菌，特别是大肠杆菌中的表达量，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

第三方面，本发明提供了一种基因工程菌，该基因工程菌含有编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，编码UDP葡萄糖脱氢酶的基因，编码UDP木糖合酶的基因和如上所述的编码基因。

根据本发明，术语“苯丙氨酸解氨酶PAL”为苯丙氨酸解氨酶phenylalanineammonia-lyase，缩写PAL，是催化直接脱掉苯丙氨酸上的氨而生成反式肉桂酸的酶，其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“4-香豆酸:辅酶A连接酶4CL”为hydroxycinnamate:CoAligase，缩写4CL，是单木质醇类和黄酮类生物合成中苯丙素代谢途径中的一个关键酶。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“肉桂酰辅酶A还原酶CCR”为cinnamyl-CoA reductase，缩写CCR，负责催化木质素单体生物合成中最重要的代谢反应，它将类苯丙酸类代谢物转移到木质素的合成途径中。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“UDP葡萄糖基转移酶UGT”为UDP-glycosyltransferase，缩写为UGT，其在生物体内催化活化的葡萄糖基连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，从而赋予糖基化的产物具有很多生物学功能。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。优选的，所述UDP葡萄糖基转移酶UGT为UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5。

根据本发明，术语“UDP-葡萄糖脱氢酶”为UDP-glucose 6-dehydrogenase，缩写为UGD，其在生物体内催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“UDP木糖合酶”为UDP-xylose synthase，缩写为UXS，其在生物体内催化UDP-葡萄糖醛酸生成UDP-木糖。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库（如NCBI）中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

公知的，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met（ATG）或Trp（TGG）分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码（Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D）。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，根据相应酶的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如PCR方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因为来自拟南芥的AtPAL基因，GenBank：AY133595.1。

根据本发明一种优选的实施方式，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因如SEQ IDNo.5所示，或者为来自欧芹的Pc4CL基因，GenBank: X13325.1，优选如SEQ ID No.5所示。

根据本发明一种优选的实施方式，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因为来自拟南芥的AtCCR基因，GenBank: AF332459.1。

根据本发明一种优选的实施方式，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因如SEQID No.4所示，或者为来自拟南芥的AtUGT73C5基因，GenBank: KJ138865.1，优选如SEQ IDNo.4所示。

根据本发明一种优选的实施方式，编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因为来自大肠杆菌内源的EcUGD基因，Gene ID 946571。

根据本发明一种优选的实施方式，编码UDP木糖合酶的基因如SEQ ID No.6所示，或者为来自中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti的SmUXS基因，Genbank：GU062741，优选如SEQ ID No.6所示。

根据本发明，用于构建所述基因工程菌的菌株可以为本领域常规使用的各种菌株，例如，可以真菌，如酵母，也可以为细菌，如杆菌。根据本发明一种优选的实施方式，所述菌株为大肠杆菌，对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α，更优选为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明的发明人在研究中发现，与使用野生型的大肠杆菌相比，当将大肠杆菌中构建为高产苯丙氨酸的大肠杆菌后，在引入本发明如上的各基因，获得目标产物的效率能够进一步提高。

其中，所述高产苯丙氨酸的大肠杆菌可以为不表达tyrR（DNA-bindingtranscriptional dual regulator TyrR）、tyrA（fused chorismate mutase/prephenatedehydrogenase）和trpE（anthranilate synthase subunit TrpE）基因的大肠杆菌，其构建可以采用多种方法实现，例如，可以包括λRed重组系统、CRISPR-Cas9重组系统以及RNAi等。优选的，本发明高产苯丙氨酸大肠杆菌构建采用λRed重组系统。本发明构建的高产苯丙氨酸的大肠杆菌更适用于合成Rosavin E。

根据本发明，所述基因工程菌的构建方法可以通过本领域常规的技术手段完成，例如，通过在相应的菌株中导入插入有相应基因的载体为获得，本发明对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。

其中，用于构建本发明基因工程菌的基因可以通过克隆在一个载体中导入大肠杆菌，也可以克隆在不同的载体中导入大肠杆菌中，出于载体的承受能力以及大肠杆菌外源载体个数的承受能力，优选的，将用于构建本发明基因工程菌的基因克隆至2-3个载体中导入大肠杆菌。

其中，用于构建本发明基因工程菌的基因在载体中的排列顺序没有特别的限制，只要能够进行有效地表达即可。

第三方面，本发明提供了如上所述的糖链延伸糖基转移酶突变体，或如上所述的编码基因，或者如上所述的基因工程菌在制备络塞维E中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种生产络塞维E的方法，在含葡萄糖的培养基中培养如上所述的基因工程菌，并诱导外源基因的表达以生产络塞维E。

根据本发明，所述培养条件为常规的培养条件，如使用含有作为筛选标记用抗生素的培养基，在35-40℃下培养至OD₆₀₀为0.5-0.7，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在14-20℃进行诱导表达。在发酵培养时，上述基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。

其中，以所述基因工程菌为大肠杆菌为例，所述培养基可以为LB培养基（溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：Tryptone 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L），也可以为改良M9Y（Na₂HPO₄•12H₂O 15.12 g/L，KH₂PO₄ 3.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，NH₄Cl 1.0 g/L，Tryptone 15 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L）液体培养基，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。

根据本发明，在培养所得基因工程菌生产络塞维E时，还优选对构建的基因工程进行活化处理制备种子液，例如，在含有作为筛选标记用抗生素的培养基中，35-40℃培养12-20小时。

根据本发明一种优选的实施方式，如上LB培养基可以用于基因工程菌的活化，也即，制备种子液，如上M9培养基可以用于络塞维E的生产。其中，所述种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1体积%，也即，每100 mL的M9液体培养基中加入1 mL所述种子液。

此外，本发明对IPTG的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在M9液体培养基中的终浓度为0.08-0.12 mM。

根据本发明，所述抗生素为表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，以大肠杆菌常用转化载体为例，所述抗生素，例如，可以为链霉素和卡那霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述链霉素的加入量使其终浓度为80-120 mg/L；所述卡那霉素的加入量使其终浓度为40-60 mg/L；所述氨苄青霉素的加入量使其终浓度为50-100 mg/L。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，大肠杆菌菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。

大肠杆菌表达载体pCDFduet-1，pRSFDuet-1，pETDuet-1购自Novagen公司。

Phusion高保真DNA聚合酶、2× High-fidelity Master Mix购自Thermo公司。

ClonExpress Multis One Step Cloning Kit购自Vazyme公司。

所用引物以及基因均由深圳华大基因科技有限公司合成。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

苯丙氨酸解氨酶基因PAL来自拟南芥（AtPAL，GenBank: AY133595.1）。

4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL如SEQ ID No.5所示。

肉桂酰辅酶A还原酶基因CCR来自拟南芥（AtCCR，GenBank: AF332459.1）。

UDP葡萄糖基转移酶UGT基因UGT73C5如SEQ ID No.4所示。

糖链延伸糖基转移酶突变体基因CaUGT3TN如SEQ ID No.3所示。

编码葡萄糖磷酸变位酶的基因来自大肠杆菌内源基因EcPgm，Gene ID 945271。

编码UTP-葡萄糖1-磷酸尿苷基转化酶的基因来自大肠杆菌内源基因EcGalU，GeneID 945231。

编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因来自大肠杆菌内源基因EcUGD，Gene ID 946571。

编码UDP木糖合酶的基因SmUXS如SEQ ID No.6所示。

质粒pKD46（温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因，Amp^r)、pKD4（含有两端带有FRT位点的卡那抗性基因，Kan^r )、pCP20（温度敏感型，编码能够识别FRT位点的FLP重组酶，Amp^r）均为市售。

实施例1

本实施例用于说明糖链延伸糖基转移酶突变体CaUGT3-TN的获得

以合成的CaUGT3基因（SEQ ID No.1）为模板，用引物CaUGT3-5FPNde（SEQ IDNo.7）和引物CaUGT3-3RPBam（SEQ ID No.8）进行PCR扩增，扩增产物经NdeI和BamHI酶切后连入经NdeI和BamHI酶切后的质粒pET28a中，转入大肠杆菌DH5α，扩增后抽提质粒，测序验证CaUGT3序列正确，构建得到pET28a-CaUGT3。

通过 Tang method （Tang, L., Gao, H., Zhu, X., Wang, X., Zhou, M.,Jiang, R., 2012. Construction of “small-intelligent” focused mutagenesislibraries using well-designed combinatorial degenerate primers. BioTechniques52, 149-158.），设计四条突变引物将二十种天然氨基酸均一且无冗余地引入到突变库中，分别构建CaUGT3的145位点和375位点的饱和突变体库。PCR体系与程序与普通PCR无异，但是由于PCR是为了构建突变库，因此所用引物需使用混合引物。因为NDT/VMA/ATG/TGG分别编码了12/6/1/1种氨基酸，因此在进行引物混合时，所加入的NDT/VMA/ATG/TGG引物比例为12:6:1:1，这样才能保证所有氨基酸残基的均一性。以pET28a-CaUGT3为模板，将引物T145-F1（SEQ ID No.9）、T145-F2（SEQ ID No.10）、T145-F3（SEQ ID No.11）和T145-F4（SEQ IDNo.12）按12：6：1：1混合好，作为正向引物，T145-R（SEQ ID No.13）为反向引物，进行PCR扩增，获得长度为200-300bp的PCR产物。以该PCR产物片段为引物，pET28a-CaUGT3为模板，进行重叠延伸PCR，PCR体系如下：2× High-fidelity Master Mix 25 μL，上述PCR产物22 μL，pET28a-CaUGT3质粒1 μL，ddH₂O 22 μL。PCR 产物加入Dpn I 酶处理 2-3 个小时后电转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中。选取2块菌落数量大于突变库95%覆盖率的平板，其中一块平板用无菌ddH2O洗下平板上的菌落，提取混合质粒后送测序，测序结果显示在突变位点T145出现相应叠峰，说明突变库构建成功；另一块平板用于后续挑单克隆验证酶活。

N375位点饱和突变体库构建方法与此相同，所用模板为pET-CaUGT3^T145V，所用正向引物为N375-F1（SEQ ID No.14）、N375-F2（SEQ ID No.15）、N375-F3（SEQ ID No.16）和N375-F4（SEQ ID No.17），反向引物为N375-R1（SEQ ID No.18）经过迭代饱和突变和活性验证，得到最优突变体质粒pET28a-CaUGT3^T145V/N375Q，命名为pET28a-CaUGT3-TN，经测序验证，所述突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

测试例1

用于说明CaUGT3T145位点饱和突变体库的活性筛选以及产物的鉴定

（1）CaUGT3T145位点饱和突变体库的活性筛选

挑取上述建库成功平板单克隆转移至含有 200 μL LB 培养基的96孔深孔培养板，加入卡那霉素使终浓度为 50 mg/L，封膜后37℃，800 rpm，振荡培养12 h。取100 μL过夜培养菌液转移至96孔甘油板，加入50 μL 60%甘油，密封后于-80℃保存。向余下的过夜培养的96孔深孔培养板中加入800 μL LB培养基(含卡那霉素 50 mg/L)，并加入0.1 mMIPTG，30℃，800 rpm，振荡培养12 h诱导蛋白表达。4℃，4000 rpm，离心10 min收集菌体。用300 μL 50 mM pH7.4 的磷酸钾缓冲液洗涤菌体。向洗涤后的菌体中加入400 μL 50 mMpH7.4 的磷酸钾缓冲液重悬菌体，30℃振荡培养 1 h 以破碎细胞，4℃ 4000 rpm 30 min离心收集上清。取100 μL上清，加入2 mM 络塞和UDP-木糖作为底物，30℃反应2 h。加入100μL甲醇终止反应，4℃，4000 rpm，离心30 min，取上清HPLC检测。

（2）产物的检测

产物的HPLC检测：发酵液1 mL，12000 rpm离心5 min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱（4.6×250 mm）；检测波长254 nm；流动相A =水(含0.1%体积甲酸)，B=乙腈；流速=1 mL/min；梯度洗脱条件：0-5min 20 %体积B；6-25 min 20 %体积B到100 %体积B（6-25 min内B的浓度均匀增加）；25-30min，100% B；31-40 min，20% B。进样量50 μL。

通过检测，获得可以识别UDP-木糖，催化络塞生成络塞维E的突变体若干个，其对底物络塞的转化率表1所示：

表1

测试例2

用于说明CaUGT3^T145V/N375位点饱和突变体库的活性筛选以及产物的鉴定

CaUGT3^T145VN375位点饱和突变体库的活性筛选

挑取上述CaUGT3^T145VN375位点建库成功平板单克隆,利用上述测试例1所述方法，进行活性筛选及HPLC检测。

通过检测，获得可以识别UDP-木糖，催化络塞生成络塞维E的活性进一步提高的优选突变体CaUGT3^T145V/N375Q，其对底物络塞的转化率同等条件下提高到12%。

实施例2

本实施例用于说明络塞维E合成途径在高产苯丙氨酸大肠杆菌中的重构

高产苯丙氨酸大肠杆菌菌株BPHE不表达tyrR（DNA-binding transcriptionaldual regulator TyrR），tyrA（fused chorismate mutase/prephenate dehydrogenase）， trpE（anthranilate synthase subunit TrpE）基因，其构建方法参考专利申请号201910403327.6（刘涛，毕慧萍，王帅，庄以彬，马延和. 络塞维类似物和生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用）。

大肠杆菌表达载体V1为pCDFDuet-4CL-PAL-CCR，该载体的制备方法参考专利申请号201611179577.9（刘涛，周威，毕慧萍，庄以彬，殷华，马延和. 生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用）。

大肠杆菌表达载体V2为pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3，该载体的制备方法参考专利申请号201910403327.6（刘涛，毕慧萍，王帅，庄以彬，马延和. 络塞维类似物和生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用）。

大肠杆菌表达载体V3为pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3-TN，该载体的制备方法参考专利申请号201910403327.6（刘涛，毕慧萍，王帅，庄以彬，马延和. 络塞维类似物和生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用），将原表达载体pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3中的CaUGT3基因片段替换为其突变体CaUGT3-TN，具体方法如下：

（1）以引物73C5-5FPBam（SEQ ID No. 19）/ 73C5-3RPSal（SEQ ID No. 20）为引导，以合成的AtUGT73C5基因（SEQ ID No.4）为模板进行PCR，扩增得到AtUGT73C5基因，经BamHI和SalI酶切后连入经BamHI和SalI酶切后的质粒pRSDet1中，构建得到pRSFDuet-AtUGT73C5。

（2）以引物CaUGT3-5FPKpn（SEQ ID No. 21）/ CaUGT3-3RPXho（SEQ ID No. 22）为引导，以实施例1中载体pET28a-CaUGT3-TN为模板进行PCR，扩增得到CaUGT3-TN基因，经KpnI和XhoI酶切后连入经KpnI和XhoI酶切后的质粒pRSFDuet-AtUGT73C5中，构建得到pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3-TN。

大肠杆菌表达载体V4为pETDuet-EcUGD-SmUXS，该载体的制备方法如下：

（1）以引物EcUGD-5FPNco（SEQ ID No. 23）/ EcUGD-3RPNot（SEQ ID No. 24）为引导，以大肠杆菌BL21（DE3）菌液为模板进行PCR，扩增得到EcUGD基因，经NcoI和NotI酶切后连入经NcoI和NotI酶切后的质粒pETDuet-1中，构建得到pETDuet-EcUGD。

（2）以引物SmUXS-5FPNde（SEQ ID No. 25）/ SmUXS-3RPKpn（SEQ ID No. 26）为引导，以合成的密码子优化的SmUXS基因（SEQ ID No.6）为模板进行PCR，扩增得到SmUXS基因，经NdeI和KpnI酶切后连入经NdeI和KpnI酶切后的质粒pETDuet-EcUGD中，构建得到pETDuet-EcUGD-SmUXS。

将所述载体V1（pCDFDuet-4CL-PAL-CCR）、V3（pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3-TN）和V4（pETDuet-EcUGD-SmUXS）共同转化高产苯丙氨酸大肠杆菌BPHE，得到生产络塞维E的大肠杆菌菌株BPHE-RETN。从葡萄糖到络塞维E的合成通路如图1所示。

如上步骤（1）和（2）中，PCR扩增反应的反应体系为：5×phusion HF缓冲液 10 μL，2.5 mM dNTP 2.5 μL，50 μM 正向引物0.5 μL，50 μM 反向引物0.5 μL，模板0.5 μL，Phusion DNA聚合酶0.5 μL，水35.5 μL。

PCR扩增反应的反应程序为：98 ℃预变性2分钟；98 ℃变性20秒，56 ℃退火45秒，72 ℃延伸2分钟，30个循环；72 ℃延伸10分钟。

本发明菌株：如上步骤中，将质粒V1（pCDFDuet-4CL-PAL-CCR）、V3（pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3-TN）和V4（pETDuet-EcUGD-SmUXS）用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，所述转化方法具体为：取100 μL大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞于冰上，10分钟后加入2 μL质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR，2 μL质粒pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3-TN和2 μL质粒pETDuet-EcUGD-SmUXS，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42 ℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600 μL LB液体培养基，37 ℃，150 rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上。利用链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素抗性筛选同时携带三种表达载体的转化菌株BPHE-RETN，并通过提取质粒进行酶切验证，得到能够合成络塞维E的重组大肠杆菌菌株BPHE-RETN。

对照菌株：将所述载体V1（pCDFDuet-4CL-PAL-CCR）、V2（pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3）和V4（pETDuet-EcUGD-SmUXS）共同转化高产苯丙氨酸大肠杆菌BPHE，得到对照菌株，生产络塞维B的大肠杆菌菌株BPHE-RE。

测试例2

本实施例用于说明大肠杆菌重组菌株BPHE-RETN的发酵培养以及产物的鉴定

（1）发酵培养

A 摇瓶发酵

1）将如上实施例2中构建的大肠杆菌表达菌株BPHE-RETN及对照菌株BPHRE-RE分别接种至2 ml含有作为筛选标记用抗生素（链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度分别为100 mg/L、50 mg/L和100 mg/L）的LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母提取物5 g/L）中，并在37 ℃下培养12小时，得到大肠杆菌种子液。

2）将步骤（1）中得到的大肠杆菌种子液以1体积%的接种量分别接种至50 mL含有所述作为筛选标记用抗生素（链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度分别为100 mg/L、50mg/L和100 mg/L）的发酵培养基（胰蛋白胨15 g/L，酵母提取物5 g/L， Na₂HPO₄•12H₂O15.12 g/L，KH₂PO₄ 3.0 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，NH₄Cl 1.0 g/L）液体培养基中，并在37℃下培养，当OD600达到0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为0.1 mM，16 ℃下诱导培养16小时，加入终浓度为20 g/L葡萄糖，30 ℃下发酵48小时得到含有发酵液。

B 5L发酵罐发酵

1）将如上实施例2中构建的大肠杆菌表达菌株BPHE-RETN接种至50 ml含有作为筛选标记用抗生素（链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度分别为100 mg/L、50 mg/L和100mg/L）的LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母提取物5 g/L）中，并在37 ℃下培养12小时，得到大肠杆菌种子液。

2）将步骤（1）中得到的大肠杆菌种子液以2体积%的接种量接种至2.5 L含有所述作为筛选标记用抗生素（链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度分别为100 mg/L、50 mg/L和100 mg/L）的发酵培养基（胰蛋白胨15 g/L，酵母提取物5 g/L， Na₂HPO₄•12H₂O 15.12 g/L，KH₂PO₄ 3.0 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，NH₄Cl 1.0 g/L）液体培养基中；pH设定为7.0，用5M氨水流加调节；葡萄糖浓度诱导前约1 g/L，诱导后控制在5-10 g/L，通过流加600 g/L葡萄糖流加液控制。37℃下培养至OD600达到16时加入IPTG使其终浓度为0.1 mM，16 ℃下诱导培养16小时后，30 ℃下发酵48小时，得到含有络塞维E的发酵液。其中，发酵液a为摇瓶发酵菌株BPHE-RETN发酵液；发酵液b为摇瓶发酵菌株BPHE-RE发酵液，发酵液c为罐发酵菌株BPHE-RETN发酵液。

（2）产物的检测

1）产物的HPLC检测：发酵液1 mL，12000 rpm离心5 min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱（4.6×250 mm）；检测波长254 nm；流动相A =水(含0.1%体积甲酸)，B=乙腈；流速=1 mL/min；梯度洗脱条件：0-5 min 20 %体积B；6-25 min 20 %体积B到100 %体积B（6-25 min内B的浓度均匀增加）；25-30 min，100% B；31-40 min，20% B。进样量50 μL。

发酵液HPLC检测结果见图2。其中，发酵液a（摇瓶发酵菌株BPHE-RETN）中出现3个产物峰（峰1，2，3，图2A）；发酵液b（摇瓶发酵菌株BPHE-RE）中出现3个产物峰（峰1，2，4，图2B），发酵液c（罐发酵菌株BPHE-RETN）中出现4个产物峰（峰1，2，3，4，图2C）。

2）产物的LC-MS以及NMR分析：对步骤（1）中各发酵液中监测的峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱（4.6×250 mm）；检测波长254 nm；梯度洗脱条件：0-5 min 20 %体积B；6-25 min 20 %体积B到100 %体积B（6-25 min内B的浓度均匀增加）；25-30 min，100% B；31-40 min，20% B。进样量50 μL。ESI正离子源，分子量扫描范围50-1000。

结果如图3所示，发酵液a中产物峰1-3的扫描结果见图3a-c。峰1的MS图谱（图3A）上有肉桂醇的MS特征峰117.0700；峰2的MS图谱（图3B）上有络塞的MS特征峰319.1151；峰3的MS图谱（图3C）上有络塞维E的MS特征峰446.1997和451.1500。通过进一步的一维和二维NMR可以确定峰3为Trans-Cinnamyl-(6'-O-β-D-xylopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，是玫瑰红景天重要活性成分络塞维的类似物，将其命名为络塞维E。NMR数据如下，具体如图4所示，其中，A为¹H NMR，B为¹³C NMR。

¹H NMR (600 MHz, CD₃OD) δ7.42 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, H-2, 6), 7.30 (dd,J = 7.5 Hz, H-3, 5), 7.26 (d, J = 7.5 Hz, H-7), 6.69 (d, J = 15.9 Hz, H-7),6.36 (dt, J = 15.9 Hz, 6.1 Hz, H-8), 4.51 (ddd, J = 12.8, 5.7, 1.6 Hz, H-9α),4.37 (d, J = 7.8 Hz, H-1′), 4.34 (d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.32 (ddd, J = 12.8,5.6, 1.5 Hz, H-9β), 4.11 (dd, J = 11.5, 2.1 Hz, H-6′α), 3.86 (dd, J = 11.5,5.4 Hz, H-5′′α), 3.75 (dd, J = 11.5, 5.9 Hz, H-6′β), 3.49 (m, H-4′′), 3.45(m, H-5′), 3.35 (m, H-3′′), 3.34 (m, H-4′), 3.32 ( H-3′), 3.24 ( H-2′), 3.22( H-2′′), 3.19 (d, J = 10.2 Hz, H-5′′β). ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD) δ138.2 (C-1), 133.9 (C-7), 129.6 (C-3,5), 128.7 (C-4), 127.5 (C-2, 6), 126.6 (C-8),105.6 (C-1′′), 103.4 (C-1′), 77.9 (C-3′′), 77.7 (C-3′), 77.0 (C-5′), 75.1 (C-2′), 74.9 (C-2′′), 71.5 (C-4′), 71.2 (C-4′′), 70.9 (C-9), 69.8 (C-6′), 66.9(C-5′′).

峰4的MS图谱（图3D）上有络塞维B的MS特征峰476.2126和481.1686。

且经测定，菌株BPHE-RETN摇瓶发酵液a中络塞维E的产量最高可达82.78 ± 1.40mg/L，剩余络塞和肉桂醇的量分别为392.34 ± 38.49 mg/L和80.08 ± 0.58 mg/L；罐发酵液c中络塞维E的产量最高可达472.86 ± 16.58 mg/L，络塞维B的产量最高可达442.47± 9.45 mg/L，剩余络塞和肉桂醇的量分别为343.82 ± 26.96 mg/L和4.20 ± 0.24 mg/L。

本发明的大肠杆菌可以发酵生产络塞维E、络塞、肉桂醇等3种化合物，其中络塞维E产量最高可达0.47 g/L。因此，本发明提供了一种高产络塞维E的新的生物合成途径，络塞维E作为红景天重要活性成分或其类似物，具有很好的应用前景，为大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们的应用

<130> I69132TIB

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> 糖链延伸糖基转移酶野生型

<400> 1

Met Ala Thr Glu Gln Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ile Leu Met

1 5 10 15

Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Ser Ser Phe Leu Gln Leu Ala

20 25 30

Lys Lys Leu Ser Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Tyr Ile Cys Ser Thr Pro

35 40 45

Ile Asn Leu Asp Ser Ile Lys Asn Lys Ile Asn Gln Asn Tyr Ser Ser

50 55 60

Ser Ile Gln Leu Val Asp Leu His Leu Pro Asn Ser Pro Gln Leu Pro

65 70 75 80

Pro Ser Leu His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro His Leu Met Ser Thr

85 90 95

Leu Lys Asn Ala Leu Ile Asp Ala Asn Pro Asp Leu Cys Lys Ile Ile

100 105 110

Ala Ser Ile Lys Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Leu His Gln Pro Trp

115 120 125

Thr Glu Ala Leu Ala Ser Arg His Asn Ile Pro Ala Val Ser Phe Ser

130 135 140

Thr Met Asn Ala Val Ser Phe Ala Tyr Val Met His Met Phe Met Asn

145 150 155 160

Pro Gly Ile Glu Phe Pro Phe Lys Ala Ile His Leu Ser Asp Phe Glu

165 170 175

Gln Ala Arg Phe Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ala Lys Asn Asp Ala Ser

180 185 190

Ala Lys Asp Pro Glu Leu Gln Gly Ser Lys Gly Phe Phe Asn Ser Thr

195 200 205

Phe Ile Val Arg Ser Ser Arg Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Val Asp Tyr

210 215 220

Leu Ser Glu Ile Leu Lys Ser Lys Val Ile Pro Val Cys Pro Val Ile

225 230 235 240

Ser Leu Asn Asn Asn Asp Gln Gly Gln Gly Asn Lys Asp Glu Asp Glu

245 250 255

Ile Ile Gln Trp Leu Asp Lys Lys Ser His Arg Ser Ser Val Phe Val

260 265 270

Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Asn Met Gln Glu Ile Glu Glu Ile

275 280 285

Ala Ile Gly Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Leu Arg

290 295 300

Phe Pro Lys Gly Glu Asp Thr Lys Ile Glu Glu Val Leu Pro Glu Gly

305 310 315 320

Phe Leu Asp Arg Val Lys Thr Lys Gly Arg Ile Val His Gly Trp Ala

325 330 335

Pro Gln Ala Arg Ile Leu Gly His Pro Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser

340 345 350

His Cys Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser Ile Gln Ile Gly Val Pro

355 360 365

Ile Ile Ala Met Pro Met Asn Leu Asp Gln Pro Phe Asn Ala Arg Leu

370 375 380

Val Val Glu Ile Gly Val Gly Ile Glu Val Gly Arg Asp Glu Asn Gly

385 390 395 400

Lys Leu Lys Arg Glu Arg Ile Gly Glu Val Ile Lys Glu Val Ala Ile

405 410 415

Gly Lys Lys Gly Glu Lys Leu Arg Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Gln

420 425 430

Lys Leu Arg Asp Arg Glu Lys Gln Asp Phe Asp Glu Leu Ala Ala Thr

435 440 445

Leu Lys Gln Leu Cys Val

450

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> 糖链延伸糖基转移酶突变体

<400> 2

Met Ala Thr Glu Gln Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ile Leu Met

1 5 10 15

Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Ser Ser Phe Leu Gln Leu Ala

20 25 30

Lys Lys Leu Ser Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Tyr Ile Cys Ser Thr Pro

35 40 45

Ile Asn Leu Asp Ser Ile Lys Asn Lys Ile Asn Gln Asn Tyr Ser Ser

50 55 60

Ser Ile Gln Leu Val Asp Leu His Leu Pro Asn Ser Pro Gln Leu Pro

65 70 75 80

Pro Ser Leu His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro His Leu Met Ser Thr

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

Gln Ala Arg Phe Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ala Lys Asn Asp Ala Ser

180 185 190

Ala Lys Asp Pro Glu Leu Gln Gly Ser Lys Gly Phe Phe Asn Ser Thr

195 200 205

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Asn Met Gln Glu Ile Glu Glu Ile

275 280 285

Ala Ile Gly Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Leu Arg

290 295 300

Phe Pro Lys Gly Glu Asp Thr Lys Ile Glu Glu Val Leu Pro Glu Gly

305 310 315 320

Phe Leu Asp Arg Val Lys Thr Lys Gly Arg Ile Val His Gly Trp Ala

325 330 335

Pro Gln Ala Arg Ile Leu Gly His Pro Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser

340 345 350

His Cys Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser Ile Gln Ile Gly Val Pro

355 360 365

Ile Ile Ala Met Pro Met Gln Leu Asp Gln Pro Phe Asn Ala Arg Leu

370 375 380

Val Val Glu Ile Gly Val Gly Ile Glu Val Gly Arg Asp Glu Asn Gly

385 390 395 400

Lys Leu Lys Arg Glu Arg Ile Gly Glu Val Ile Lys Glu Val Ala Ile

405 410 415

Gly Lys Lys Gly Glu Lys Leu Arg Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Gln

420 425 430

Lys Leu Arg Asp Arg Glu Lys Gln Asp Phe Asp Glu Leu Ala Ala Thr

435 440 445

Leu Lys Gln Leu Cys Val

450

<210> 3

<211> 1365

<212> DNA

<213> 糖链延伸糖基转移酶突变体编码基因

<400> 3

atggccaccg aacagcagca ggcaagcatt agctgtaaaa ttctgatgtt tccgtggctg 60

gcatttggtc atattagtag ttttctgcaa ctggcaaaaa agctgagcga tcgcggcttt 120

tatttttata tttgcagcac cccgattaat ctggatagca ttaagaataa gatcaaccag 180

aattacagca gcagcattca gctggttgat ctgcatctgc cgaatagtcc gcagctgccg 240

ccgagcctgc ataccaccaa tggcctgccg ccgcatctga tgagtaccct gaaaaatgcc 300

ctgattgatg caaatccgga tctgtgtaaa attattgcca gcattaagcc ggatctgatt 360

atctatgatc tgcatcagcc gtggaccgaa gcactggcaa gtcgtcataa tattccggca 420

gttagtttta gtgttatgaa tgcagttagc tttgcctatg tgatgcacat gtttatgaat 480

ccgggcattg aatttccgtt taaagccatt catctgagtg attttgaaca ggcacgcttt 540

ctggaacagc tggaaagcgc caaaaatgat gccagtgcca aagatccgga actgcaaggc 600

agcaaaggtt tctttaatag tacctttatc gtgcgcagca gccgcgaaat tgaaggtaaa 660

tatgttgatt atctgagcga aattctgaaa agtaaagtga ttccggtgtg tccggttatt 720

agcctgaata ataatgatca gggccagggt aataaggatg aagatgaaat tattcagtgg 780

ctggataaaa aatctcatcg cagtagcgtg tttgttagtt ttggtagtga atatttcctg 840

aatatgcagg aaattgaaga aattgcaatc ggcctggaac tgagcaatgt gaattttatt 900

tgggtgctgc gctttccgaa aggtgaagat accaaaattg aagaagtgct gccggaaggc 960

tttctggatc gtgttaaaac caaaggccgt attgttcatg gctgggcacc gcaggcacgc 1020

attctgggcc atccgagtat tggtggtttt gtgagccatt gtggttggaa tagcgtgatg 1080

gaaagcattc agattggcgt gccgattatt gcaatgccga tgcaactgga tcagccgttt 1140

aatgcccgcc tggtggtgga aattggtgtg ggtattgaag ttggccgcga tgaaaatggc 1200

aaactgaaac gcgaacgtat tggtgaagtg attaaggaag tggcaattgg caaaaaaggc 1260

gaaaaactgc gcaaaaccgc caaagatctg ggtcagaaac tgcgtgatcg cgaaaaacag 1320

gattttgatg aactggcagc aaccctgaaa cagctgtgtg tgtaa 1365

<210> 4

<211> 1506

<212> DNA

<213> 编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因

<400> 4

atggtgagcg aaaccaccaa atctagtccg ttacattttg tgctgtttcc gtttatggca 60

cagggtcaca tgattccgat ggtggatatt gcacgcttac tggcccagcg cggcgttatt 120

attaccattg tgaccacccc gcataatgca gcacgcttta aaaatgtgct gaatcgcgcc 180

attgaaagtg gcctgccgat taacctagtt caggttaaat ttccgtatct ggaagccggc 240

ttacaggaag gccaggaaaa tattgatagc ttagatacca tggaacgcat gattccgttt 300

tttaaagcag ttaattttct ggaagaaccg gttcagaaac tgattgaaga gatgaatccg 360

cgcccgtctt gtctgattag cgatttttgt ctgccgtata cctctaaaat tgccaaaaaa 420

ttcaatattc cgaaaattct gtttcatggc atgggctgtt tttgtctgtt atgtatgcat 480

gtgctgcgca aaaatcgcga aattctggat aatctgaaat cagataaaga actgtttacc 540

gtgccggatt ttccggatcg tgttgagttc acccgcaccc aggttccggt ggaaacctat 600

gttccggcag gcgattggaa agatattttt gatggtatgg ttgaagccaa cgagacctct 660

tatggcgtga ttgttaatag ctttcaggaa ctggaaccgg cctatgccaa agattataag 720

gaagttcgct caggcaaagc ctggaccatt ggcccggtga gcctgtgtaa taaggtgggt 780

gcagataaag ccgaacgcgg caacaaatca gatattgatc aggatgaatg tctgaaatgg 840

ttagatagca agaaacatgg tagtgtgctg tatgtgtgtc tgggtagcat ttgtaatctg 900

ccgctgtcac agctgaaaga actgggctta ggcttagaag aatcacagcg cccgtttatt 960

tgggtaattc gcggttggga aaaatacaag gaattagttg aatggtttag cgaatcaggc 1020

tttgaagatc gtattcagga tcgcggctta ctgattaaag gttggtcacc gcagatgctg 1080

attctgagtc atccgagcgt gggcggcttt ctgacccatt gtggttggaa tagtacctta 1140

gaaggcatta ccgccggcct gccgttactg acctggccgc tgtttgcaga tcagttttgt 1200

aacgagaaac tggttgttga agtgctgaaa gcaggcgttc gtagcggcgt ggaacagccg 1260

atgaaatggg gcgaagaaga aaaaattggc gtgttagtgg ataaagaagg tgttaaaaaa 1320

gcagtggaag aactgatggg cgaatcagat gatgccaaag aacgtcgtcg tcgcgccaaa 1380

gaattaggcg atagcgcaca taaagcagtt gaagaaggtg gctcaagtca tagcaatatt 1440

agctttctgc tgcaggatat tatggaactg gccgaaccga ataatcacca ccaccaccac 1500

cactaa 1506

<210> 5

<211> 1686

<212> DNA

<213> 编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因

<400> 5

atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180

ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240

aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300

cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420

ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480

gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540

accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600

ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660

atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720

aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780

gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840

aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960

agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020

gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080

ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140

tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200

ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320

gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380

atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440

cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500

gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620

cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680

ttgtga 1686

<210> 6

<211> 1047

<212> DNA

<213> 编码UDP木糖合酶的基因

<400> 6

atgaactact tccgtaacga cttccgtggt actctgttcg gtactaacga agctaccgac 60

tctctgcgtc gtcgttctct gcaaaaacgt atcctggtta ccggtggtgc tggtttcctg 120

ggttctcacc tgtgcgaact gctgctgggt gctggtcacg aagttatctg cctggacaac 180

ttctctaccg gtctgcgtcg taacatcgct ccgctgaaac gtttcgacac cttccgtgtt 240

atcgctcacg acgttgttga accgatcgac ctggaagttg acgaaatcta caacctggct 300

tgcccggctt ctccgccgca ctaccaggct gacccgatcc agaccaccaa aacctgcgtt 360

atcggttctc tgaacctgct ggacctggct gctcgtcgtg gtgctcgtat cttccaggct 420

tctacctctg aaatctacgg tgacccgcac gttcacccgc aggttgaatc ttactggggt 480

aacgttaacc cgttcggtcc gcgttcttgc tacgacgaag gtaaacgttg cgctgaaacc 540

ctgttcttcg acttccacaa atctcacggt gttgaaatca aaatcgttcg tatcttcaac 600

acctacggtc cgcgtatgcg tccggacgac ggtcgtgttg tttctaactt catcgttcag 660

gctctgaaag gtgaagacat caccatctac ggtgacggtt ctcagacccg ttctttctgc 720

ttcgttgaag acctgatcga cggtttcgtt cgtctgatgg cttctccgcc gtctctgacc 780

ggtccggtta acctgggtaa cccggctgaa tttaccatcg gtgaactggc tgaagaagtt 840

atccgtctga ccggttctcg ttctaaaatc gttcgtcgtc cgctgccggt tgacgacccg 900

cgtcagcgtc gtccggacat ctctctggct accgaagaac tgggttggcg tccgaaagtt 960

aacctggctg aaggtctggc tcacaccatc cgttacttcg acgacctgct gtctcgttct 1020

atgcgtgaat ctgctgaact ggtttaa 1047

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物CaUGT3-5FPNde

<400> 7

gcagccatat ggccaccgaa cagcagcagg caagc 35

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物CaUGT3-3RPBam

<400> 8

aattcggatc cttacacaca cagctgtttc agggttgc 38

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 T145-5F1

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

cggcagttag ttttagtndt atgaatgcag ttagctttgc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 T145-5F2

<400> 10

cggcagttag ttttagtvma atgaatgcag ttagctttgc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 T145-5F3

<400> 11

cggcagttag ttttagtatg atgaatgcag ttagctttgc 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 T145-5F4

<400> 12

cggcagttag ttttagttgg atgaatgcag ttagctttgc 40

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物 T145-3R

<400> 13

tgaataattt catcttcatc cttattaccc tgg 33

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 N375-5F1

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

ttattgcaat gccgatgndt ctggatcagc cgtttaatgc 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 N375-5F2

<400> 15

ttattgcaat gccgatgvma ctggatcagc cgtttaatgc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 N375-5F3

<400> 16

ttattgcaat gccgatgatg ctggatcagc cgtttaatgc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物 N375-5F4

<400> 17

ttattgcaat gccgatgtgg ctggatcagc cgtttaatgc 40

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物 N375-R1

<400> 18

ttattacaca cacagctgtt tcagggttgc tgc 33

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物 73C5-5FPBam

<400> 19

aaatacatat gccagtcgac gtagcctcac c 31

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物 73C5-3RPSal

<400> 20

aaataggtac ctcaagaccc gatcttaatg cca 33

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物 CaUGT3-5FPKpn

<400> 21

gacgtcggta ccatggccac cgaacagcag caggcaagc 39

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物 CaUGT3-3RPXho

<400> 22

accagactcg agttacacac acagctgttt cagggttgc 39

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物 EcUGD-5FPNco

<400> 23

atatccatgg caatgaaaat caccatttcc ggtactgg 38

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物 EcUGD-3RPNot

<400> 24

aaagacgcgg ccgcttagtc gctgccaaag agatcgcggg tg 42

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物 SmUXS-5FPNde

<400> 25

tatacatatg aactacttcc gtaacgactt ccg 33

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物 SmUXS-3RPKpn

<400> 26

ttacggtacc ttaaaccagt tcagcagatt cacgc 35

Claims (12)

1.一种糖链延伸糖基转移酶突变体，其特征在于，该突变体为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过如下突变且酶活力不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第145位的苏氨酸经非极性氨基酸取代，所述非极性氨基酸选自缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸或异亮氨酸；或者

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第145位的苏氨酸经非极性氨基酸取代，所述非极性氨基酸选自缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸或异亮氨酸，且第375位的天冬氨酸经谷氨酰胺取代。

2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1或2所述的突变体的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.一种基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，编码UDP葡萄糖脱氢酶UGD的基因，编码UDP木糖合酶UXS的基因和权利要求3或4所述的编码基因。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其中，所述UDP葡萄糖基转移酶UGT为UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其中，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因如SEQ ID No.4所示，或者为来自拟南芥的AtUGT73C5基因，GenBank: KJ138865.1。

8.根据权利要求5所述的基因工程菌，其中，编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因为来自拟南芥的AtPAL基因，GenBank：AY133595.1；和/或

编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因如SEQ ID No.5所示，或者为来自欧芹的Pc4CL基因，GenBank: X13325.1；和/或

编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因为来自拟南芥的AtCCR基因，GenBank:AF332459.1；和/或

编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因为来自大肠杆菌内源的EcUGD基因，GeneID 946571；和/或

编码UDP木糖合酶的基因如SEQ ID No.6所示，或者为来自苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti的SmUXS基因，Genbank：GU062741。

9.根据权利要求5-8中任意一项所述的基因工程菌，其中，使用大肠杆菌构建所述基因工程菌。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α。

11.根据权利要求10所述的基因工程菌，其中，所述大肠杆菌为高产苯丙氨酸的大肠杆菌；其中，所述高产苯丙氨酸的大肠杆菌不表达tyrR、tyrA和trpE基因。

12.权利要求1或2所述的糖链延伸糖基转移酶突变体，或权利要求3或4所述的编码基因，或者权利要求5-11中任意一项所述的基因工程菌在制备络塞维E中的应用；

其中，络塞维E的结构式如式I所示：

式I。

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