CN111979163B

CN111979163B - 一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111979163B
Application number: CN201910438947.3A
Authority: CN
Inventors: 尹进; 白超弦; 张浩千; 李腾
Original assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2039-05-24
Also published as: CN111979163A

Abstract

本发明涉及一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用。与出发菌无法以葡萄糖为碳源生长的情况相比，本发明的重组罗氏真氧菌能够以葡萄糖为碳源生长，且能够合成含量超过80％的PHA。

Description

一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌领域，具体而言，涉及一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用。

背景技术

罗氏真氧菌(Ralstonia eutropha，也叫Cupriavidus necator)是研究PHA(聚羟基脂肪酸酯，一种完全可降解的生物基材料)合成的重要模式细菌，有潜力作为PHA工业生产的菌株。

罗氏真氧菌能够以多种碳源作为底物生长，例如果糖、葡萄糖酸钠、N-乙酰葡糖胺、各种脂肪酸等。然而，罗氏真氧菌不能利用最常见的碳源——葡萄糖作为底物生长，这限制了其作为工业生产菌株的应用。

罗氏真氧菌经过诱变筛选可以得到能够利用葡萄糖生长的突变菌株，研究结果阐释了突变菌株能够利用葡萄糖的机理(Orita,I.,Iwazawa,R.,Nakamura,S.,Fukui,T.,2012.Identification of mutation points in Cupriavidus necator NCIMB 11599andgenetic reconstitution of glucose-utilization ability in wild strain H16forpolyhydroxyalkanoate production.J.Biosci.Bioeng.113,63-69)。一个转录因子基因nagR的一个氨基酸突变为终止密码子，导致nagR基因失去功能。nagR基因原本抑制nag操纵子的表达，而nagR失去功能使得nag操纵子始终处于激活状态。nag操纵子中的一个基因nagE，表达N-乙酰葡糖胺特异性的PTS转运蛋白亚基，其中第265位的甘氨酸突变为了精氨酸，从而产生了对葡萄糖的转运能力。简而言之，nagR基因的失活与nagE基因的氨基酸突变使得突变菌株获得了对葡萄糖的转运能力从而能够利用葡萄糖作为底物生长。

经过诱变的罗氏真氧菌会在基因上随机发生突变，与葡萄糖利用相关的基因以外的其他基因也有可能发生突变，从而影响到细菌的其他特性，甚至影响其工业生产等应用。经过诱变后会得到大量不一样的突变株，需要从中筛选出性能表现最优的菌株，这一过程耗时耗力。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明不使用诱变筛选，而是通过基因编辑精确改造的方法构建了一种重组罗氏真氧菌，其能够利用葡萄糖作为底物生长。具体而言，敲除了nagR基因上游的启动子序列并将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为了精氨酸，所构建的重组罗氏真氧菌能够以葡萄糖作为底物生长。

因此，本发明的一个目的是提供一种重组罗氏真氧菌。

本发明的另一个目的是提供一种重组罗氏真氧菌的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述重组罗氏真氧菌用于制备PHA的用途。

本发明的又一个目的是提供一种制备PHA的方法。

本发明的还一个目的是提供一种重组罗氏真氧菌的基因组的核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种突变的nagE基因。

根据一个方面，本发明提供了一种重组罗氏真氧菌，其是以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑使nagR基因失活并使nagE基因的氨基酸突变使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力而得到的。

本发明人发现，与现有技术的突变方式不同，将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸能够有效地让重组菌获得对葡萄糖的利用能力。因此，本发明的重组罗氏真氧菌中，优选地，使nagE基因的氨基酸突变使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力为：将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

作为一个实施方式，本发明的重组罗氏真氧菌中，优选地，以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因上游189bp的启动子序列并将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

所敲除的nagR基因上游启动子的189bp序列为atttttccaaatcacagcagcattttccgacgccataatcagcagaaccatttcaataccaattgacgtaaagcgaagcgatggcgatgttatcgcccagatgacgcaatgccgcaccatcgacgtcaaatgtcctaaagtggtatcatcacctccacactctggtacctacgaggattcgcaatggat(SEQ ID NO:11)。

或者，作为一个实施方式，本发明的重组罗氏真氧菌中，优选地，以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因序列并将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

本发明的重组罗氏真氧菌中，优选地，所述出发菌为罗氏真氧菌H16。

根据另一个方面，本发明提供了一种重组罗氏真氧菌的制备方法，包括以下步骤：以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑使nagR基因失活并使nagE基因的氨基酸突变使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力。

上述制备方法中，优选地，使nagE基因的氨基酸突变使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力为：将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

作为一个实施方式，上述制备方法包括以下步骤：以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因上游189bp的启动子序列并将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

或者，作为一个实施方式，上述制备方法包括以下步骤：以罗氏真氧菌为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因序列并将nagE基因的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

上述制备方法中，优选地，所述出发菌为罗氏真氧菌H16。

根据再一个方面，本发明提供了上述重组罗氏真氧菌用于制备PHA的用途。

根据又一个方面，本发明提供了一种制备PHA的方法，该方法包括利用上述重组罗氏真氧菌得到PHA的步骤。

上述制备PHA的方法中，优选地，使用葡萄糖作为碳源。

根据还一个方面，本发明提供了一种罗氏真氧菌的基因组的核苷酸序列，其包含：相对于野生型失活的nagR基因的核苷酸序列；和相对于野生型突变的nagE基因的核苷酸序列，其中所述突变使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力。

本发明的罗氏真氧菌的基因组的核苷酸序列中，优选地，所述失活的nagR基因的核苷酸序列如下所示：

atggatcaacggctgcaggctctcaagccggacgaagcggaggcgacgccgatctacctgcaagtggcgcgcaggctggccgcggccatccaggccggccaatggcgggttggcgacgcgctgccgtccgagcgcacgctggtggattcactggagatttcacgcgtcacggcgcggcgcgcgctgcaggtgctggcagaggaaggcgcgatcacgcgcagccgcggcgcgggcacctttgtcgcgccgcgccctgagcagaaggcggcgcggctggacaacttcagcgagctggcgcgccggcgcggcatgacgccggccagcgaactggtggcgttcgaacgccgccgcgccacgccccaggaggctgcggcgctggcgctgcaggaaggggaagagattgtcagcctgacccgcctgcgcaaggccgacgggcaggtcttctggatggatgtcaccacgctggcactggccgtgctgcccgacgccagcgccatcggcgaatcgctgtacgcctacctggagcggatcggcaagccggtgctgcgcgtcaccgaaaggctgcgcgcgatcgtcgccggcgaagcactggccgcgcgcctgcagatcgcgcccggcgagccgctgctgcatatcctgcgcaccggctacacccatggcg accagccggtcgaactgaccgacggctactgcctgaacgatttctacgagctgaagcagtag(SEQ ID NO:14)。

本发明的罗氏真氧菌的基因组的核苷酸序列中，优选地，所述突变的nagE基因的核苷酸序列如下所示：

atgaagatggacctgctgcccagggtgcaacgcctgggcgccacgctgatgctgccgattgccgtgctgcccgtggccggcctgctgctgcgcctgggccagcccgacgtattcgacatcaagctgatggccgaggccggcaacgcggtctttgccaacctggccctgctgttcgcgatcggcgtggcggtgggctttgcgcgcgacaacaacggcgcggcggcactggccggcaccatcggctacctggtgctgaccacggtgctgaagaccatcgacaaatcgctcgacatgggcgtgctggccggcatcgtcgccggcgcggtggcgggcgggctctacaatcgctatcgcaatgtcgcgctgccaccctatctgggcttcttttccggcaagcgcttcgttcccatcgtcaccgcgctgtgctgcctgctgctgggcatcgtgctggcctatgcgtgggcgccggtgcaggccggcattaacgcggccggcgcgtggctgaccacggcgggctcggccggcgccttggtgttcgggctgctgaaccggctgctgctggtcaccgggctgcaccacctgatcaataccctggcgtggttcgtgttcggcaactacgccgatccggccacgggggcggcggtatcgggcgacctgcaccgctactttgccggcgaccccggcgcaggcctgttcatgaccggctttttcccggtgatgatgttcggcctgcccgcggcctgcctggcgatgtaccacgagacgccgccggcgcggcgcgcgctggttcgcggcatgctgttctcgatggcactgacctcgttcctgaccggcatcaccgagccgatcgagttcagcttcatgttcctggcgccggtgctgtacggcctgcatgcgctgatgaccggcctgtcgatggcgctgtgccatgcgctcgatatccggctgggcttcaccttctcggccggcgcgatcgactatgtgctgggctacgggctgtccagccgcggctggctggcgattccgctggggctggcctatgcgctggtctattacgggctgttccgcttctttatccgccgcttcaacctgctgacgccgggccgcgatgaagtggtgcccgtggcggccgccggcggtgccgcgcagccggccgcgggcagcgtggcgcaacagtatgtcgaagcgctgggcggccctgccaacctggtcgtggtcgatgcctgcaccacgcgtctgcggctgaacgtggccgacatcggcgcggtgtccgagccgcggctcaaggcactgggcgtacgcggcgtgctcaagcgcccgcccaatgtggtgcaggtggtgatcgggccgcaggccgagcaggttgccggtgatatccgcgcggtgctgcagcaggcgccgcaggccacggccgtggtggctgctgcgcccgccgttgctacccaggcgtccgtgccggctgccggtgctttcgatcccgcctggtggatcgatgcgctgggcggcgccgccaatatcgcctcggtcggcgtggtggcactgacgcggctgcgcgtggtggtgcgcgagcgcgcccgggtgcgcgccgaccaccttgcgggcagccagctgatgtggatcggcgatgacaccgcccatatcgccttcggccatgcggcagacggacacgctgccgccttcgagcgcgccctgcaggccatgcccacctga(SEQ ID NO:12)。

根据又一个方面，本发明提供了一种突变的nagE基因，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:13所示。

同时，本发明提供了一种突变的nagE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

与出发菌无法以葡萄糖为碳源生长的情况相比，本发明的重组罗氏真氧菌能够以葡萄糖为碳源生长，且能够合成含量超过80％的PHA。本发明的重组菌拓宽了可利用的碳源的种类，比出发菌更加有潜力作为PHA工业生产的菌株。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。

培养基配方：

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

MMG培养基：25g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L NH₄Cl，0.2g/L MgSO₄，9.65g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl₂，用1M HCl配制。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO₄·7H₂O，30mg/L MnCl₂·4H₂O，300mg/L H₃BO₃，200mg/L CoCl₂·6H₂O，10mg/L CuSO₄·5H₂O，20mg/L NiCl₂·6H₂O，30mg/L NaMoO₄·2H₂O，用1M HCl配制。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。

在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL卡那霉素或100μg/mL安普霉素。

实施例1：构建敲除nagR上游启动子序列的重组罗氏真氧菌

以罗氏真氧菌H16(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC 1.7092)基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB(Orita,I.,Iwazawa,R.,Nakamura,S.,Fukui,T.,2012.Identification of mutation points in Cupriavidusnecator NCIMB 11599and genetic reconstitution of glucose-utilization abilityin wild strain H16for polyhydroxyalkanoate production.J.Biosci.Bioeng.113,63-69)为模板PCR扩增得到载体片段，将H1、H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-ΔPnagR。使用的引物如下表：

将重组质粒pK18mobsacB-ΔPnagR转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))中，再通过接合转化方法转入罗氏真氧菌H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物H1-primer 1和H2-primer 4进行PCR鉴别出nagR上游启动子敲除的重组菌，得到的重组菌为罗氏真氧菌PnagR。

所敲除的上游启动子的189bp序列为

atttttccaaatcacagcagcattttccgacgccataatcagcagaaccatttcaataccaattgacgtaaagcgaagcgatggcgatgttatcgcccagatgacgcaatgccgcaccatcgacgtcaaatgtcctaaagtggtatcatcacctccacactctggtacctacgaggattcgcaatggat(SEQ ID NO:11)

实施例2：构建nagE基因里氨基酸突变的重组罗氏真氧菌

以罗氏真氧菌H16基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，将H1、H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-nagE。使用的引物如下表：

将重组质粒pK18mobsacB-nagE转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例1得到的罗氏真氧菌PnagR中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物H1-primer 7和H2-primer 10进行PCR和测序鉴别出nagE的第264位甘氨酸变为精氨酸的重组菌，得到的重组菌为RE01。

所突变的nagE核苷酸序列为(SEQ ID NO:12)：

atgaagatggacctgctgcccagggtgcaacgcctgggcgccacgctgatgctgccgattgccgtgctgcccgtggccggcctgctgctgcgcctgggccagcccgacgtattcgacatcaagctgatggccgaggccggcaacgcggtctttgccaacctggccctgctgttcgcgatcggcgtggcggtgggctttgcgcgcgacaacaacggcgcggcggcactggccggcaccatcggctacctggtgctgaccacggtgctgaagaccatcgacaaatcgctcgacatgggcgtgctggccggcatcgtcgccggcgcggtggcgggcgggctctacaatcgctatcgcaatgtcgcgctgccaccctatctgggcttcttttccggcaagcgcttcgttcccatcgtcaccgcgctgtgctgcctgctgctgggcatcgtgctggcctatgcgtgggcgccggtgcaggccggcattaacgcggccggcgcgtggctgaccacggcgggctcggccggcgccttggtgttcgggctgctgaaccggctgctgctggtcaccgggctgcaccacctgatcaataccctggcgtggttcgtgttcggcaactacgccgatccggccacgggggcggcggtatcgggcgacctgcaccgctactttgccggcgaccccggcgcaggcctgttcatgaccggctttttcccggtgatgatgttcggcctgcccgcggcctgcctggcgatgtaccacgagacgccgccggcgcggcgcgcgctggttcgcggcatgctgttctcgatggcactgacctcgttcctgaccggcatcaccgagccgatcgagttcagcttcatgttcctggcgccggtgctgtacggcctgcatgcgctgatgaccggcctgtcgatggcgctgtgccatgcgctcgatatccggctgggcttcaccttctcggccggcgcgatcgactatgtgctgggctacgggctgtccagccgcggctggctggcgattccgctggggctggcctatgcgctggtctattacgggctgttccgcttctttatccgccgcttcaacctgctgacgccgggccgcgatgaagtggtgcccgtggcggccgccggcggtgccgcgcagccggccgcgggcagcgtggcgcaacagtatgtcgaagcgctgggcggccctgccaacctggtcgtggtcgatgcctgcaccacgcgtctgcggctgaacgtggccgacatcggcgcggtgtccgagccgcggctcaaggcactgggcgtacgcggcgtgctcaagcgcccgcccaatgtggtgcaggtggtgatcgggccgcaggccgagcaggttgccggtgatatccgcgcggtgctgcagcaggcgccgcaggccacggccgtggtggctgctgcgcccgccgttgctacccaggcgtccgtgccggctgccggtgctttcgatcccgcctggtggatcgatgcgctgggcggcgccgccaatatcgcctcggtcggcgtggtggcactgacgcggctgcgcgtggtggtgcgcgagcgcgcccgggtgcgcgccgaccaccttgcgggcagccagctgatgtggatcggcgatgacaccgcccatatcgccttcggccatgcggcagacggacacgctgccgccttcgagcgcgccctgcaggccatgcccacctga

所突变的nagE氨基酸序列为(SEQ ID NO:13)：

MKMDLLPRVQRLGATLMLPIAVLPVAGLLLRLGQPDVFDIKLMAEAGNAVFANLALLFAIGVAVGFARDNNGAAALAGTIGYLVLTTVLKTIDKSLDMGVLAGIVAGAVAGGLYNRYRNVALPPYLGFFSGKRFVPIVTALCCLLLGIVLAYAWAPVQAGINAAGAWLTTAGSAGALVFGLLNRLLLVTGLHHLINTLAWFVFGNYADPATGAAVSGDLHRYFAGDPGAGLFMTGFFPVMMFGLPAACLAMYHETPPARRALVRGMLFSMALTSFLTGITEPIEFSFMFLAPVLYGLHALMTGLSMALCHALDIRLGFTFSAGAIDYVLGYGLSSRGWLAIPLGLAYALVYYGLFRFFIRRFNLLTPGRDEVVPVAAAGGAAQPAAGSVAQQYVEALGGPANLVVVDACTTRLRLNVADIGAVSEPRLKALGVRGVLKRPPNVVQVVIGPQAEQVAGDIRAVLQQAPQATAVVAAAPAVATQASVPAAGAFDPAWWIDALGGAANIASVGVVALTRLRVVVRERARVRADHLAGSQLMWIGDDTAHIAFGHAADGHAAAFERALQAMPT*(其中，*代表终止密码子)

实施例3：重组菌RE01以葡萄糖为碳源生长

重组菌RE01与出发菌罗氏真氧菌H16均在LB培养基中200rpm，30℃培养12小时后按5％接种至50mL MMG培养基，200rmp，30℃，培养48小时。

48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，方法如下：

用量筒量取30mL菌液放入50mL离心管，10000rpm离心10min收集菌体。用去离子水重悬细胞洗涤一次，10000rpm离心10min，弃掉上清。将菌体在-80℃冷冻1h后，进行真空冷冻干燥12h以上至完全去除水分。称量取样前后离心管重量，其差值为细胞干重CDW。

酯化液的配制：取485mL无水甲醇，加入1g/L苯甲酸，缓慢加入15mL浓硫酸，即制成约500mL的酯化液。

样品制备：称取30至60mg冷冻干燥后的菌体，精确称重后置于酯化管中，加入2mL酯化液和2mL氯仿。称取10mg左右的PHA样品，同样方式处理作为标准样品。酯化管加盖密封后100℃反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1mL去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(GC)分析。

GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，丙酮为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240℃，检测器温度250℃，柱温起始温度为80℃，维持1.5分钟；以30℃/分钟的速率升至140℃并维持0分钟；以40℃/分钟的速率升至240℃并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHA组成及含量。

重组菌RE01与出发菌罗氏真氧菌H16在以葡萄糖为碳源的培养基中生长的结果如下表所示：

ND：无法检测

出发菌罗氏真氧菌H16无法以葡萄糖为碳源生长，经过基因编辑得到的重组菌RE01能够以葡萄糖为碳源生长，且能够合成含量超过80％的PHA。该重组菌拓宽了可利用的碳源的种类，比出发菌更加有潜力作为PHA工业生产的菌株。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司

<120> 一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用

<130> DI19-0844-XC37

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1-primer 1

<400> 1

acacaggaaa cagctatgac gacatccatc cagaagacct g 41

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1-primer 2

<400> 2

gataggtaag caacggctgc aggctctcaa g 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H2-primer 3

<400> 3

gcagccgttg cttacctatc tccgtgggtt atg 33

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H2-primer 4

<400> 4

gttgtaaaac gacggccagt ctgcgccacg caaggcgcaa ag 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer 5

<400> 5

gtcatagctg tttcctgtgt g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer 6

<400> 6

actggccgtc gttttacaac 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1-primer 7

<400> 7

acacaggaaa cagctatgac gtgctgacca cggtgctgaa g 41

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1-primer 8

<400> 8

gaacagcatg ccgcgaacc 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H2-primer 9

<400> 9

ggttcgcggc atgctgttc 19

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H2-primer 10

<400> 10

gttgtaaaac gacggccagt acaccgcgcc gatgtcgg 38

<210> 11

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 敲除的上游启动子的189bp序列

<400> 11

atttttccaa atcacagcag cattttccga cgccataatc agcagaacca tttcaatacc 60

aattgacgta aagcgaagcg atggcgatgt tatcgcccag atgacgcaat gccgcaccat 120

cgacgtcaaa tgtcctaaag tggtatcatc acctccacac tctggtacct acgaggattc 180

gcaatggat 189

<210> 12

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的nagE核苷酸序列

<400> 12

atgaagatgg acctgctgcc cagggtgcaa cgcctgggcg ccacgctgat gctgccgatt 60

gccgtgctgc ccgtggccgg cctgctgctg cgcctgggcc agcccgacgt attcgacatc 120

aagctgatgg ccgaggccgg caacgcggtc tttgccaacc tggccctgct gttcgcgatc 180

ggcgtggcgg tgggctttgc gcgcgacaac aacggcgcgg cggcactggc cggcaccatc 240

ggctacctgg tgctgaccac ggtgctgaag accatcgaca aatcgctcga catgggcgtg 300

ctggccggca tcgtcgccgg cgcggtggcg ggcgggctct acaatcgcta tcgcaatgtc 360

gcgctgccac cctatctggg cttcttttcc ggcaagcgct tcgttcccat cgtcaccgcg 420

ctgtgctgcc tgctgctggg catcgtgctg gcctatgcgt gggcgccggt gcaggccggc 480

attaacgcgg ccggcgcgtg gctgaccacg gcgggctcgg ccggcgcctt ggtgttcggg 540

ctgctgaacc ggctgctgct ggtcaccggg ctgcaccacc tgatcaatac cctggcgtgg 600

ttcgtgttcg gcaactacgc cgatccggcc acgggggcgg cggtatcggg cgacctgcac 660

cgctactttg ccggcgaccc cggcgcaggc ctgttcatga ccggcttttt cccggtgatg 720

atgttcggcc tgcccgcggc ctgcctggcg atgtaccacg agacgccgcc ggcgcggcgc 780

gcgctggttc gcggcatgct gttctcgatg gcactgacct cgttcctgac cggcatcacc 840

gagccgatcg agttcagctt catgttcctg gcgccggtgc tgtacggcct gcatgcgctg 900

atgaccggcc tgtcgatggc gctgtgccat gcgctcgata tccggctggg cttcaccttc 960

tcggccggcg cgatcgacta tgtgctgggc tacgggctgt ccagccgcgg ctggctggcg 1020

attccgctgg ggctggccta tgcgctggtc tattacgggc tgttccgctt ctttatccgc 1080

cgcttcaacc tgctgacgcc gggccgcgat gaagtggtgc ccgtggcggc cgccggcggt 1140

gccgcgcagc cggccgcggg cagcgtggcg caacagtatg tcgaagcgct gggcggccct 1200

gccaacctgg tcgtggtcga tgcctgcacc acgcgtctgc ggctgaacgt ggccgacatc 1260

ggcgcggtgt ccgagccgcg gctcaaggca ctgggcgtac gcggcgtgct caagcgcccg 1320

cccaatgtgg tgcaggtggt gatcgggccg caggccgagc aggttgccgg tgatatccgc 1380

gcggtgctgc agcaggcgcc gcaggccacg gccgtggtgg ctgctgcgcc cgccgttgct 1440

acccaggcgt ccgtgccggc tgccggtgct ttcgatcccg cctggtggat cgatgcgctg 1500

ggcggcgccg ccaatatcgc ctcggtcggc gtggtggcac tgacgcggct gcgcgtggtg 1560

gtgcgcgagc gcgcccgggt gcgcgccgac caccttgcgg gcagccagct gatgtggatc 1620

ggcgatgaca ccgcccatat cgccttcggc catgcggcag acggacacgc tgccgccttc 1680

gagcgcgccc tgcaggccat gcccacctga 1710

<210> 13

<211> 569

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的nagE氨基酸序列

<400> 13

Met Lys Met Asp Leu Leu Pro Arg Val Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu

1 5 10 15

Met Leu Pro Ile Ala Val Leu Pro Val Ala Gly Leu Leu Leu Arg Leu

20 25 30

Gly Gln Pro Asp Val Phe Asp Ile Lys Leu Met Ala Glu Ala Gly Asn

35 40 45

Ala Val Phe Ala Asn Leu Ala Leu Leu Phe Ala Ile Gly Val Ala Val

50 55 60

Gly Phe Ala Arg Asp Asn Asn Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Leu Val Leu Thr Thr Val Leu Lys Thr Ile Asp Lys Ser Leu

85 90 95

Asp Met Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Ala Gly Ala Val Ala Gly Gly

100 105 110

Leu Tyr Asn Arg Tyr Arg Asn Val Ala Leu Pro Pro Tyr Leu Gly Phe

115 120 125

Phe Ser Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Val Thr Ala Leu Cys Cys Leu

130 135 140

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ala Tyr Ala Trp Ala Pro Val Gln Ala Gly

145 150 155 160

Ile Asn Ala Ala Gly Ala Trp Leu Thr Thr Ala Gly Ser Ala Gly Ala

165 170 175

Leu Val Phe Gly Leu Leu Asn Arg Leu Leu Leu Val Thr Gly Leu His

180 185 190

His Leu Ile Asn Thr Leu Ala Trp Phe Val Phe Gly Asn Tyr Ala Asp

195 200 205

Pro Ala Thr Gly Ala Ala Val Ser Gly Asp Leu His Arg Tyr Phe Ala

210 215 220

Gly Asp Pro Gly Ala Gly Leu Phe Met Thr Gly Phe Phe Pro Val Met

225 230 235 240

Met Phe Gly Leu Pro Ala Ala Cys Leu Ala Met Tyr His Glu Thr Pro

245 250 255

Pro Ala Arg Arg Ala Leu Val Arg Gly Met Leu Phe Ser Met Ala Leu

260 265 270

Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe Met

275 280 285

Phe Leu Ala Pro Val Leu Tyr Gly Leu His Ala Leu Met Thr Gly Leu

290 295 300

Ser Met Ala Leu Cys His Ala Leu Asp Ile Arg Leu Gly Phe Thr Phe

305 310 315 320

Ser Ala Gly Ala Ile Asp Tyr Val Leu Gly Tyr Gly Leu Ser Ser Arg

325 330 335

Gly Trp Leu Ala Ile Pro Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Leu Val Tyr Tyr

340 345 350

Gly Leu Phe Arg Phe Phe Ile Arg Arg Phe Asn Leu Leu Thr Pro Gly

355 360 365

Arg Asp Glu Val Val Pro Val Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gln Pro

370 375 380

Ala Ala Gly Ser Val Ala Gln Gln Tyr Val Glu Ala Leu Gly Gly Pro

385 390 395 400

Ala Asn Leu Val Val Val Asp Ala Cys Thr Thr Arg Leu Arg Leu Asn

405 410 415

Val Ala Asp Ile Gly Ala Val Ser Glu Pro Arg Leu Lys Ala Leu Gly

420 425 430

Val Arg Gly Val Leu Lys Arg Pro Pro Asn Val Val Gln Val Val Ile

435 440 445

Gly Pro Gln Ala Glu Gln Val Ala Gly Asp Ile Arg Ala Val Leu Gln

450 455 460

Gln Ala Pro Gln Ala Thr Ala Val Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala

465 470 475 480

Thr Gln Ala Ser Val Pro Ala Ala Gly Ala Phe Asp Pro Ala Trp Trp

485 490 495

Ile Asp Ala Leu Gly Gly Ala Ala Asn Ile Ala Ser Val Gly Val Val

500 505 510

Ala Leu Thr Arg Leu Arg Val Val Val Arg Glu Arg Ala Arg Val Arg

515 520 525

Ala Asp His Leu Ala Gly Ser Gln Leu Met Trp Ile Gly Asp Asp Thr

530 535 540

Ala His Ile Ala Phe Gly His Ala Ala Asp Gly His Ala Ala Ala Phe

545 550 555 560

Glu Arg Ala Leu Gln Ala Met Pro Thr

565

<210> 14

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 失活的nagR基因的核苷酸序列

<400> 14

atggatcaac ggctgcaggc tctcaagccg gacgaagcgg aggcgacgcc gatctacctg 60

caagtggcgc gcaggctggc cgcggccatc caggccggcc aatggcgggt tggcgacgcg 120

ctgccgtccg agcgcacgct ggtggattca ctggagattt cacgcgtcac ggcgcggcgc 180

gcgctgcagg tgctggcaga ggaaggcgcg atcacgcgca gccgcggcgc gggcaccttt 240

gtcgcgccgc gccctgagca gaaggcggcg cggctggaca acttcagcga gctggcgcgc 300

cggcgcggca tgacgccggc cagcgaactg gtggcgttcg aacgccgccg cgccacgccc 360

caggaggctg cggcgctggc gctgcaggaa ggggaagaga ttgtcagcct gacccgcctg 420

cgcaaggccg acgggcaggt cttctggatg gatgtcacca cgctggcact ggccgtgctg 480

cccgacgcca gcgccatcgg cgaatcgctg tacgcctacc tggagcggat cggcaagccg 540

gtgctgcgcg tcaccgaaag gctgcgcgcg atcgtcgccg gcgaagcact ggccgcgcgc 600

ctgcagatcg cgcccggcga gccgctgctg catatcctgc gcaccggcta cacccatggc 660

gaccagccgg tcgaactgac cgacggctac tgcctgaacg atttctacga gctgaagcag 720

tag 723

Claims

1.一种重组罗氏真氧菌，其是以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑使nagR基因失活并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力而得到的。

2.一种重组罗氏真氧菌，其是以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因上游189bp的启动子序列并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸而得到的。

3.一种重组罗氏真氧菌，其是以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因序列并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸而得到的。

4.一种重组罗氏真氧菌的制备方法，包括以下步骤：以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑使nagR基因失活并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸使得重组菌株获得对葡萄糖的转运能力。

5.一种重组罗氏真氧菌的制备方法，包括以下步骤：以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因上游189bp的启动子序列并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

6.一种重组罗氏真氧菌的制备方法，包括以下步骤：以罗氏真氧菌H16为出发菌，通过基因编辑敲除nagR基因序列并将nagE基因所编码的氨基酸序列的第264位的甘氨酸突变为精氨酸。

7.权利要求1-3中任一项所述的重组罗氏真氧菌用于制备PHA的用途。

8.一种制备PHA的方法，该方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的重组罗氏真氧菌得到PHA的步骤。

9.一种突变的nagE基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。

10.一种突变的nagE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。