CN110904062B

CN110904062B - 一株高产l-丙氨酸的菌株

Info

Publication number: CN110904062B
Application number: CN201811087267.3A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 马延和; 郭恒华; 刘萍萍; 张冬竹; 徐洪涛; 唐思青; 刘洋
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS; Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS; Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN110904062A

Abstract

本发明公开了一株高产L‑丙氨酸的菌株。本发明提供的高产L‑丙氨酸的菌株的制备方法为使出发菌中蛋白质的表达量和/或活性提高，得到的重组菌。所述蛋白质为将alaD蛋白氨基酸序列中第10位、第239位和第197位这3位中至少一位的氨基酸残基进行替换，得到具有丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质；所述alaD蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列4所示。实验证明，本发明提供的菌株的L‑丙氨酸产量和L‑丙氨酸脱氢酶的酶活性均大大提高，可以有效改善L‑丙氨酸工程菌株的发酵能力和L‑丙氨酸的产量。本发明具有重大的应用价值。

Description

一株高产L-丙氨酸的菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产L-丙氨酸的菌株。

背景技术

L-丙氨酸在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。作为人体非必需氨基酸，L-丙氨酸在食品及医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸可提高食品的营养价值，加入L-丙氨酸后能够明显提高食品及饮料中蛋白质利用率。L-丙氨酸能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。另外，L-丙氨酸还能够改善有机酸的酸味，使其更接近自然味道。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养药。同时L-丙氨酸也是合成维生素B6的关键前体，也是合成泛酸钙和其他有机化合物的重要原料。随着L-丙氨酸应用潜力的进一步挖掘，全球L-丙氨酸需求量正日益递增。

传统生物技术生产L-丙氨酸主要是以L-天冬氨酸为原料，在天冬氨酸-β-脱羧酶的催化下进行脱羧反应生产L-丙氨酸。该方法是目前国内L-丙氨酸生产厂家主要使用的生产技术。但该方法中的原材料天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本受困于石油价格。随着石油资源的匮乏和价格的提升，顺酐资源的紧张和价格上涨将导致天冬氨酸的供给存在巨大的隐患，从而会影响到L-丙氨酸的生产及成本。

通过微生物发酵，以可再生的木质纤维素为原料生产L-丙氨酸则可以摆脱对石油基原材料的依赖，减少二氧化碳的排放，实现低成本、环境友好的生产L-丙氨酸。目前已有多株能够生产L-丙氨酸的菌株的报道。Smith等构建了一株E.coli ALS929(pTrc99A-alaD)菌株，其中在质粒中表达的丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase，AlaD)能够将胞内生成的丙酮酸转化为L-丙氨酸，该菌株经过48h发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。Lee等构建了一株E.coli ALA887(pTrc99A-alaD)菌株，发酵生产时能够在27h内生产32g/L的L-丙氨酸。

本发明的发明人通过在大肠杆菌中引入来自Geobacillus stearothermophilusXL-65-6的丙氨酸脱氢酶，并失活丙酮酸的竞争性代谢途径实现了在大肠杆菌中高水平的L-丙氨酸合成，并在全球首次实现了工业化生产。在这些菌株中，丙氨酸脱氢酶是生产L-丙氨酸的关键步骤。该酶的专一性和催化活性直接限制了工程菌株L-丙氨酸的生产能力。因此，对丙氨酸脱氢酶酶活性的改造将对L-丙氨酸工程菌株的改造具有重要的意义。本发明的发明人还通过代谢工程改造的方法在大肠杆菌中建立了L-丙氨酸生产和细胞生长的藕连。在厌氧发酵条件下，L-丙氨酸生产成为厌氧条件下胞内唯一消耗NADH的代谢途径。因此，L-丙氨酸生产能力越强的菌株，细胞生长能力越好。这为通过代谢驯化实现快速筛选L-丙氨酸脱氢酶突变体提供了基础。

发明内容

本发明的目的是生产丙氨酸。

本发明首先保护一种蛋白质。所述蛋白质可为K1)或K2)：

K1)将alaD蛋白氨基酸序列中第10位、第239位和第197位这3位中至少一位的氨基酸残基进行替换，得到具有丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质；

K2)在K1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述alaD蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列4所示。

其中，序列表中序列4由372个氨基酸残基组成。

为了使K1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质中，所述第10位的赖氨酸残基可替换为天冬酰胺残基。所述第239位的亮氨酸残基替换可为甲硫氨酸残基。所述第197位的天冬氨酸残基可替换为谷氨酸残基。

所述蛋白质具体可为突变蛋白1。突变蛋白1的氨基酸序列可如序列表中的序列6所示。突变蛋白1与alaD蛋白的不同在于将后者的第10位所示的赖氨酸残基替换为天冬酰胺残基，第239位所示的亮氨酸残基替换为甲硫氨酸残基。

所述蛋白质具体可为突变蛋白2。突变蛋白2的氨基酸序列可如序列表中的序列8所示。突变蛋白2与alaD蛋白的不同在于将后者的第197位所示的天冬氨酸残基替换为谷氨酸残基。

所述蛋白质具体可为突变蛋白3。突变蛋白3的氨基酸序列可如序列表中的序列10所示。突变蛋白3与alaD蛋白的不同在于将后者的第10位所示的赖氨酸残基替换为天冬酰胺残基，第239位所示的亮氨酸残基替换为甲硫氨酸残基，第197位所示的天冬氨酸残基替换为谷氨酸残基。

上述任一所述蛋白质中，所述蛋白质的丙氨酸脱氢酶活性高于所述alaD蛋白。

编码上述任一所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码上述任一所述蛋白质的核酸分子具体可为编码突变蛋白1的核酸分子(即突变基因1)、编码突变蛋白2的核酸分子(即突变基因2)或编码突变蛋白3的核酸分子(即突变基因3)。

所述编码突变蛋白1的核酸分子可为如下A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：

A1)编码区是序列表中序列5所示的DNA分子；

A2)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于大肠杆菌且编码突变蛋白1的DNA分子；

A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码突变蛋白1的DNA分子。

所述编码突变蛋白2的核酸分子可为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的DNA分子：

B1)编码区是序列表中序列7所示的DNA分子；

B2)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于大肠杆菌且编码突变蛋白2的DNA分子；

B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码突变蛋白2的DNA分子。

所述编码突变蛋白3的核酸分子可为如下C1)或C2)或C3)或C4)所示的DNA分子：

C1)编码区是序列表中序列9所示的DNA分子；

C2)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子；

C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于大肠杆菌且编码突变蛋白3的DNA分子；

C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码突变蛋白3的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质的基因及其调控序列形成的核酸分子。

其中，序列表中序列5由1119个核苷酸组成，序列表中序列5所示的核苷酸编码序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由1119个核苷酸组成，序列表中序列7所示的核苷酸编码序列表中序列8所示的氨基酸序列。序列表中序列9由1119个核苷酸组成，序列表中序列9所示的核苷酸编码序列表中序列10所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同源性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。

含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例中提及的质粒alaD^*-1(含有序列表中序列5所示的DNA分子)、质粒alaD^*-2(含有序列表中序列7所示的DNA分子)或质粒alaD^*(含有序列表中序列9所示的DNA分子)。

所述重组微生物可为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为实施例提及的XZ-A51菌株或XZ-A53菌株。所述重组微生物具体可为实施例提及的XZ-A51(alaD^*-1)、XZ-A51(alaD^*-2)、XZ-A51(alaD^*)、XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)或XZ-A53(alaD^*)。

上述任一所述蛋白质、或、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在生产丙氨酸和/或制备丙氨酸脱氢酶中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述丙氨酸脱氢酶的丙氨酸脱氢酶活性高于alaD蛋白。

本发明还保护一种能够生产丙氨酸的重组菌乙，其代谢产生丙氨酸的途径中涉及的丙氨酸脱氢酶可包括上述任一所述蛋白质。

所述“丙氨酸脱氢酶可包括上述任一所述蛋白质”表示其中涉及的丙氨酸脱氢酶可以全部是上述任一所述蛋白质，也可以部分是上述任一所述蛋白质。

当全部是上述蛋白质时，表示重组菌乙中所有的丙氨酸脱氢酶都是突变后的本发明的丙氨酸脱氢酶(即上述任一所述蛋白质)。

当部分是上述任一所述蛋白质时，表示菌体中一部分是突变后的本发明的丙氨酸脱氢酶(即上述任一所述蛋白质)，另一部分是突变前的丙氨酸脱氢酶(如alaD蛋白)。

其中，现有的能够生产丙氨酸的重组菌，可以是本领域技术人员知道的，现有技术中任何具有生产丙氨酸的性能且产丙氨酸的途径中涉及丙氨酸脱氢酶的菌。

关于现有的能够生产丙氨酸的重组菌，本发明涉及的一个例子是，将大肠杆菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因)、富马酸还原酶基因(frd基因)、乙醇脱氢酶基因(adhE基因)、乙酸激酶(ackA基因)、甲基乙二醛合酶(mgsA基因)和丙氨酸消旋酶基因(dadX基因)敲除后得到的重组菌。其中大肠杆菌可以是野生型的，也可以是不影响生产丙氨酸目的的任何突变类型的大肠杆菌。

关于现有的能够生产丙氨酸的重组菌，本发明涉及的另一个例子是，将大肠杆菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因)、富马酸还原酶基因(frd基因)、乙醇脱氢酶基因(adhE基因)、乙酸激酶(ackA基因)、甲基乙二醛合酶(mgsA基因)和丙氨酸消旋酶基因(dadX基因)敲除后，再将alaD基因导入后的重组菌。同样的，其中大肠杆菌可以是野生型的，也可以是不影响生产丙氨酸目的的任何突变类型的大肠杆菌。

本领域技术人员，可利用本领域常规技术手段，在上述任何现有的能够生产丙氨酸的重组菌基础上，将其中的丙氨酸脱氢酶和其编码基因改变成上述本发明的丙氨酸脱氢酶和其编码基因。比如同源重组、定点突变等。本发明涉及的一个例子是，向现有的能够生产丙氨酸的重组菌中导入本发明突变后的丙氨酸脱氢酶(即上述任一所述蛋白质)的编码基因。

本发明还保护一种生产丙氨酸的方法，依次可包括如下步骤：

(1)使出发菌中上述任一所述蛋白质的表达量和/或活性提高，得到的重组菌甲；与所述出发菌相比，重组菌甲生产丙氨酸的能力提高；

(2)发酵培养重组菌甲，得到丙氨酸。

上述方法中，所述重组菌甲可为所述重组菌乙。

上述方法中，所述“使出发菌中上述任一所述蛋白质的表达量和/或活性提高”可通过向出发菌中导入编码所述蛋白质的核酸分子实现。所述出发菌可为大肠杆菌。

上述方法中，所述发酵使用的培养基的溶剂可为自来水或蒸馏水。具体的，当重组菌甲为XZ-A51(alaD^*-1)、XZ-A51(alaD^*-2)或XZ-A51(alaD^*)时，发酵使用的培养基的溶剂可为蒸馏水。当重组菌甲为XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)或XZ-A53(alaD^*)时，发酵使用的培养基的溶剂可为自来水。

上述任一所述重组菌甲或重组菌乙具体可为实施例提及的XZ-A51(alaD^*-1)、XZ-A51(alaD^*-2)、XZ-A51(alaD^*)、XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)或XZ-A53(alaD^*)。

上述任一所述重组菌甲也属于本发明的保护范围。

上述任一所述XZ-A51菌株可为将XZ-A12菌株染色体上的alaD基因敲除获得。所述XZ-A12菌株可为将Geobacillus stearothermophilus XL-65-6染色体上的丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因)、富马酸还原酶基因(frd基因)、乙醇脱氢酶基因(adhE基因)、乙酸激酶(ackA基因)、甲基乙二醛合酶(mgsA基因)和丙氨酸消旋酶基因(dadX基因)，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。

上述任一所述XZ-A53菌株可为将XZ-A47菌株染色体上的alaD基因敲除获得。所述XZ-A47菌株已在中国发明专利文献CN 103898089B中公开，在文献中的名称为XZ-A47。XZ-A47菌株是一株能够耐受自来水并在自来水配置的培养基中高效生产L-丙氨酸的工程菌株。

上述任一所述XZ-A51(alaD^*-1)具体可为将所述质粒alaD^*-1导入所述XZ-A51菌株，得到的重组菌。

上述任一所述XZ-A51(alaD^*-2)具体可为将所述质粒alaD^*-2导入所述XZ-A51菌株，得到的重组菌。

上述任一所述XZ-A51(alaD^*)具体可为将所述质粒alaD^*导入所述XZ-A51菌株，得到的重组菌。

上述任一所述XZ-A53(alaD^*-1)具体可为将所述质粒alaD^*-1导入所述XZ-A53菌株，得到的重组菌。

上述任一所述XZ-A53(alaD^*-2)具体可为将所述质粒alaD^*-2导入所述XZ-A53菌株，得到的重组菌。

上述任一所述XZ-A53(alaD^*)具体可为将所述质粒alaD^*导入所述XZ-A53菌株，得到的重组菌。

上述任一所述alaD基因的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。

上述任一所述丙氨酸具体可为L-丙氨酸。

实验证明，XZ-A51(alaD^*)的L-丙氨酸产量达到11.2g/L，相对于XZ-A12菌株提高了84％；XZ-A51(alaD^*)的L-丙氨酸脱氢酶的酶活性为3.4μmol/min/mg蛋白，相对于XZ-A12菌株酶活性提高了113％；与XZ-A47菌株相比，XZ-A53(alaD^*)的L-丙氨酸产量提高了43％。由此可见，通过定向进化和代谢驯化相结合获得的L-丙氨酸脱氢酶突变体(即蛋白质)的活性相对于XZ-A12菌株或XZ-A47菌株大幅提高，突变位点K10N、D197E和L239M对L-丙氨酸脱氢酶的活性具有显著作用，可以有效改善L-丙氨酸工程菌株的发酵能力和L-丙氨酸的产量。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为质粒PalaD001的图谱

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

制备感受态细胞的方法记载于如下文献中：Dower et al.，1988，Nucleic AcidsRes16：6127-6145。

pKD46质粒(Datsenko and Wanner 2000，Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645)为美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心的产品，产品目录号为CGSC#7739。MicroPulser电穿孔仪为Bio-Rad公司的产品。pEASY Blunt simple vector为北京全式金生物技术有限公司的产品。Phusion 5×缓冲液为NEB公司的产品。

下述实施例中的大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739保藏于美国模式培养物集存库(简称ATCC，地址：American Type Culture Collection(ATCC)10801University BoulevardManassas，VA 20110USA)，公众可从美国模式培养物集存库获得该菌株。大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739在下文中简称ATCC 8739菌株。

下述实施例中涉及的引物见表2。

表2

名称	序列
		alaD-184up	CCCGTATTGTTAGCATGTACatgaagatcggcattccaaaag
alaD-184down	CGAATTCCATGGGTTTAAACtcatccctgcagcaacgaatg
		184-alaDup	cttttggaatgccgatcttcatGTACATGCTAACAATACGGG
184-alaDdown	cattcgttgctgcagggatgaGTTTAAACCCATGGAATTCG
		XZ-ldhA-up	GATAACGGAGATCGGGAATG
XZ-ldhA-down	CTTTGGCTGTCAGTTCACCA
		M13F	GTAAAACGACGGCCAGT
M13R	CAGGAAACAGCTATGAC
		PalaD002-YZ-up	GACATGCAAAAGCACCACTG
PalaD002-YZ-down	GCTTAATTTGATGCCTGGCAG
		alaD*-2-up	gcggacgtgacgattttggagattaacgccgagcggctgcgc
alaD*-2-down	gcgcagccgctcggcgttaatctccaaaatcgtcacgtccgc
		ldhA-cat-up	TTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAATGTGACGGAAGATCACTTCGCA
ldhA-sacB-down	AGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT
		ldhA-del-up	TTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAATCTGGAAAAAGGCGAAACCT

下述实施例中使用的大肠杆菌菌株见表3。

表3.本发明使用的大肠杆菌菌株

下述实施例中使用的质粒见表4。

表4.本发明中使用的质粒

PalaD001质粒是通过将PCR方法获得的来自pACYC184质粒的含有氯霉素抗性基因cat和P15A复制子的片段、PCR方法获得的来自M1-93菌株中的M93启动子片段和PCR获得的丙氨酸脱氢酶基因alaD通过同源重组方法连接获得。质粒PalaD001的图谱具体见图1。

下述实施例中涉及的培养基如下：

种子培养基：溶剂为蒸馏水；溶质及其浓度为葡萄糖20g/L、氯化铵5g/L、NaH₂PO₄5g/L、Na₂HPO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、CaCl₂·2H₂O 0.1g/L和微量无机盐5mL/L，pH值为6.5。微量无机盐组成为：将FeCl₃·6H₂O1.5mg、CoCl₂·6H₂O 0.1mg、CuCl₂·2H₂O 0.1mg、ZnCl₂0.1mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg和MnCl₂·4H₂O 0.2mg用蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

发酵培养基1：与种子培养基的唯一不同在于葡萄糖的浓度为50g/L。

发酵培养基2：与种子培养基的不同在于：1、葡萄糖的浓度为170g/L；2、将蒸馏水替换为自来水。

来自Geobacillus stearothermophilus XL-65-6的丙氨酸脱氢酶的alaD基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。alaD基因编码的蛋白(即alaD蛋白)的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

实施例1、XZ-A51菌株的构建

从XZ-A12菌株出发，通过两步同源重组的方法敲除整合在ldhA位点的来自Geobacillus stearothermophilus XL-65-6的丙氨酸脱氢酶alaD基因。

一、通过同源重组构建XZ-A50菌株

1、以质粒pXZ-CS(Tan et al.，Appl Environ Microbiol.2013，9:4838-4844)为模板，采用ldhA-cat-up和ldhA-sacB-down组成的引物对进行PCR扩增，获得约2719bp的DNA片段I(序列表中序列1所示)。

反应体系为50μL，由10μLPhusion 5×缓冲液、1μL dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP均为10mM)、1μL质粒pXZ-CS(约20ng)、2.5μLldhA-cat-up水溶液(浓度为10μM)、2.5μLldhA-sacB-down水溶液(浓度为10μM)、0.5μLPhusion High-Fidelity DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)和32.5μL蒸馏水组成。

反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

DNA片段I包括编码乳酸脱氢酶LDH的ldhA基因上游同源臂50个碱基(序列1自5’末端第1-50位核苷酸)、cat-sacB基因的DNA片段(序列1自5’末端第51-2669位核苷酸)和编码乳酸脱氢酶LDH的ldhA基因下游同源臂50个碱基(序列1自5’末端第2670-2719位核苷酸)。

2、通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至XZ-A12菌株，得到含pKD46质粒的XZ-A12菌株。

3、完成步骤2后，取含pKD46质粒的XZ-A12菌株，制备感受态细胞。

4、完成步骤3后，将50μL步骤3得到的感受态细胞置于冰上，再加入50ng DNA片段I，冰上放置2min，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；然后使用MicroPulser电穿孔仪进行电击(电击参数为电压2.5kv)，电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次转移至试管中，30℃、75rpm培养2h，得到培养菌液。

5、将200μL步骤4得到的培养菌液均匀涂布在含氯霉素(浓度为34μg/mL)的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，得到若干单克隆。

6、随机挑取步骤5中得到的单克隆进行菌落PCR(进行菌落PCR的引物为XZ-ldhA-up和XZ-ldhA-down)。如果某单克隆的PCR扩增产物中含有约3807bp的DNA片段，则该单克隆为阳性单克隆。

挑取一个阳性单克隆保存，将其命名为XZ-A50菌株。

二、通过同源重组构建XZ-A51菌株

1、以ATCC 8739菌株的基因组DNA为模板，采用ldhA-del-up和XZ-ldhA-down组成的引物对进行PCR扩增，获得约453bp的DNA片段II(序列表中序列2所示)。

2、通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至XZ-A50菌株，得到含pKD46质粒的XZ-A50菌株。

3、完成步骤2后，取含pKD46质粒的XZ-A50菌株，制备感受态细胞。

4、完成步骤3后，将50μL步骤3得到的感受态细胞置于冰上，再加入50ng DNA片段II，冰上放置2min，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；然后使用MicroPulser电穿孔仪进行电击(电击参数为电压2.5kv)，电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次转移至试管中，30℃、75rpm培养4h，得到培养菌液。

5、将步骤4得到的培养菌液全部转移至装有50mL培养基(该培养基与LB液体培养基的不同在于将氯化钠替换为蔗糖，蔗糖浓度为10％(m/v))的三角瓶(规格为250mL)中，37℃、200rpm培养16-24h，得到培养菌液。

6、将步骤5得到的培养菌液均匀涂布在固体平板(该固体平板与LB固体平板的不同在于将氯化钠替换为蔗糖，蔗糖浓度为6％(m/v))上，37℃倒置培养过夜，得到若干单克隆。

7、随机挑取步骤6中得到的单克隆进行菌落PCR(进行菌落PCR的引物为XZ-ldhA-up和XZ-ldhA-down)。如果某单克隆的PCR扩增产物中含有约847bp的DNA片段，则该单克隆为阳性单克隆。

挑取一个阳性单克隆保存，将其命名为XZ-A51菌株。

XZ-A51菌株敲除了丙氨酸脱氢酶alaD基因。

实施例2、alaD基因突变文库的构建

一、质粒Pala002的构建

1、以质粒PalaD001为模板，采用alaD-184up和alaD-184down组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR扩增产物中含有约1159bp的DNA片段。

反应体系为50μL，由10μLPhusion 5×缓冲液、1μL dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP均为10mM)、质粒PalaD001水溶液(约20ng)、2.5μL alaD-184up水溶液(浓度为10μM)、2.5μLalaD-184down水溶液(浓度为10μM)、0.5μLPhusion High-Fidelity DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)和蒸馏水组成。

反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

2、将PCR扩增产物和pEASY Blunt simple vector进行连接，得到质粒PalaD002。具体步骤如下：将1μLpEASY Blunt simple vector和3μLPCR扩增产物轻轻混匀，室温反应5min得到连接产物；将5μL连接产物加入50μL TransT-T1感受态细胞中，并轻轻混匀，然后冰浴30min，42℃热激30s后立即置于冰上放置2min；加入500μL的LB液体培养基，37℃、200rpm孵育1h；孵育完成后涂布于含有氨苄霉素的LB平板上。使用M13F和M13R进行PCR验证和测序，阳性单克隆保存抽提质粒，即质粒PalaD002。

二、alaD基因的突变

alaD基因突变采用GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit(AgilentTechnologies公司的产品，Catalog#200552)进行。10×MutazymeII缓冲液和Mutazyme IIDNA聚合酶均为GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit中的组件。

1、制备反应体系。反应体系为50μL，由5μL10×MutazymeII缓冲液、1μL dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP均为10mM)、1μL质粒PalaD002(约200ng)、1μL alaD-184up水溶液(浓度为125ng/μL)、1μL alaD-184down水溶液(浓度为125ng/μL)、1μL Mutazyme II DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)和40μL蒸馏水组成。

2、完成步骤1后，取所述反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸80s，25个循环；72℃延伸10min。

三、alaD质粒突变库的构建

1、取步骤二中2得到的PCR扩增产物，回收约1159bp的alaD突变片段。

2、以质粒PalaD001为模板，采用184-alaDup和184-alaDdown组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PCR扩增产物为不含alaD基因的PalaD001质粒骨架，该质粒骨架两端含有与alaD同源的20bp碱基)。

3、完成步骤2后，向PCR扩增产物中加入1μL DpnI(NEB公司的产品)，混匀，37℃消化2h(目的为消除质粒PalaD001)，得到PalaD001的质粒骨架。

4、通过CPEC的方法将PalaD001的质粒骨架和alaD突变片段连接成含有缺刻的质粒文库，即alaD质粒突变库。

反应体系为50μL，由10μL NewEngland Biolabs Phusion 5×缓冲液、1μL dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP均为10mM)、200ngPalaD001的质粒骨架、alaD突变片段58ng、0.5μLPhusion High-Fidelity DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)、1.5μL DMSO和蒸馏水组成。

反应条件：98℃预变性2min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。

四、alaD基因突变文库的构建

将步骤三中获得的alaD质粒突变库通过电转化转入XZ-A51菌株中，获得alaD基因突变文库。

1、取XZ-A51菌株，制备感受态细胞。

2、完成步骤1后，将50μL步骤1得到的感受态细胞置于冰上，再加入8μLalaD质粒突变库，冰上放置2min，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；然后使用MicroPulser电穿孔仪进行电击(电击参数为电压2.5kv)，电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次转移至试管中，37℃、200rpm培养1h，得到培养菌液。

3、将步骤1得到的培养菌液均匀涂布在含氯霉素(浓度为34μg/mL)的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，得到若干单克隆。

4、随机挑取20个单克隆，使用PalaD002-YZ-up和PalaD002-YZ-down进行测序。测序结果表明，突变率控制在1-4.5个碱基/kb，满足建库要求。

实施例3、alaD基因突变文库的筛选

一、使用代谢驯化进行初筛

由于含alaD基因或alaD基因突变文库的XZ-A51菌株中细胞生长速率和L-丙氨酸的生产能力成正比，L-丙氨酸脱氢酶活性越高，L-丙氨酸的生产能力越强，则细胞生长越好(zhangxueli，et al，.App Microbiol Biotechnol，2007，77:355-366)。因此，alaD突变后酶活性越高的菌株生长速率就越快，在连续传代过程中就越容易富集被筛选。以此为基础，将实施例2制备的alaD基因突变文库的克隆从平板上收集，用种子培养基洗涤2次后转接至装有250mL发酵培养基1的发酵罐(规格为500mL)中(初始OD_550nm值为0.1)，30℃、250rpm发酵(发酵过程中，滴加5M的氨水维持pH值为7.0)并连续转接传代。经过连续传代10-15次后，取发酵液稀释涂布与含有氯霉素的LB平板上。

二、复筛

1、将经过代谢驯化初筛后稀释涂布的克隆接种于96孔深孔板中，2mL的深孔中加入1.5mL的含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基，振荡培养。

2、完成步骤1后，4℃、4000rpm离心，收集菌体。

3、取步骤2收集的菌体，先加入500μL浓度为100mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液洗涤两次，再加入Lysozyme和DNase I裂解细胞并离心。上清液用于酶活测定。

4、另取一新的96孔酶标板，每孔加入200μL酶反应液(含100mM丙酮酸钠、100mM氯化铵和0.3mM NADH的pH7.5、100mM Tris-HCl缓冲液)，加入上清液起始反应。用酶标仪检测340nm处NADH吸光值的变化，并计算酶活性。

三、alaD突变体酶活性比较

1、L-丙氨酸发酵性能的评价

将步骤二中筛选后酶活性变化最显著的10个alaD突变体分别在500mL发酵罐中发酵并检测L-丙氨酸的产量。同时，取发酵对数期的发酵液进行酶活性测定。具体步骤为：

(1)将10个克隆分别接种于装有50mL种子培养基的三角瓶(规格为250mL)中，37℃、250rpm培养至对数期，得到种子液。

(2)完成步骤(1)后，将种子液接种至装有250mL发酵培养基1的发酵罐(规格为500mL)中，初始OD_550nm值为0.1；然后30℃、250rpm发酵培养72h(发酵期间，滴加5M的氨水维持发酵罐内pH值为7.0)，得到发酵液。

(3)分析

使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))进行。

2、AlaD酶活性评价

(1)在步骤1中发酵对数期时取30mL发酵液，4℃、5000rpm离心，收集菌体。

(2)取所述菌体，用30mL pH7.5、100mM Tris-HCl缓冲液洗涤两次，然后加入1mLpH7.5、100mM Tris-HCl缓冲液悬浮，得到细胞悬浮液。

(3)取所述细胞悬浮液，超声破碎(35％，1s/3s，6min)，然后4℃、12000rpm离心40min，获得酶的粗提液。

酶活测定体系：1mL反应液中包含100mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，100mM的丙酮酸钠，100mM的氯化铵，20μL酶的粗提液。向反应液中加入NADH起始反应(NADH在反应体系中的浓度为0.3mM)。检测NADH在340nm处吸光值的变化。

经过L-丙氨酸发酵性能和酶活性的评价，选取L-丙氨酸发酵性能和酶活性都显著提高且提高最显著的两个克隆抽提质粒(分别命名为质粒alaD^*-1和质粒alaD^*-2)并测序。测序引物为PalaD002-YZ-up和PalaD002-YZ-down。

测序结果表明，质粒alaD^*-1中含有序列表中序列5所示的突变基因1；突变基因1与alaD基因的不同在于将后者的第30位所示的A替换为C，第715位所示的T替换为A。质粒alaD^*-2中含有序列表中序列7所示的突变基因2；突变基因2与alaD基因的不同在于将后者的第591位所示的C替换为G。根据测序结果，获得alaD基因的突变位点见表5。

AlaD的酶活性和L-丙氨酸产量检测结果见表5。结果表明，相对于XZ-A12菌株(野生型)，含有质粒alaD^*-1的突变体(即XZ-A51(alaD^*-1))和含有质粒alaD^*-2的突变体(即XZ-A51(alaD^*-2))的L-丙氨酸脱氢酶的酶活性分别提高了56％和75％，L-丙氨酸产量分别提高了49％和61％。

表5

实施例4、alaD突变位点的协同表达

为了进一步提高AlaD的酶活性，将质粒alaD^*-1和质粒alaD^*-2中的突变位点进行组合。

1、以质粒alaD^*-1为模板，采用alaD*-2-up和alaD*-2-down组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为50μL，由10μLPhusion 5×缓冲液、1μL dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP均为10mM)、1μL质粒alaD^*-1(约50ng)、2.5μLalaD*-2-up水溶液(浓度为10μM)、2.5μLalaD*-2-down水溶液(浓度为10μM)、0.5μLPhusion High-Fidelity DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)和32.5μL蒸馏水组成。

反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min。

2、完成步骤1后，向PCR扩增产物中加入1μL DpnI(NEB公司的产品)，混匀，37℃消化1h，得到反应混合物。

3、完成步骤2后，将反应混合物转化大肠杆菌TransT-T1感受态(北京全式金生物技术有限公司的产品)，得到质粒alaD^*。

采用PalaD002-YZ-up和PalaD002-YZ-down对质粒alaD^*进行测序。

测序结果表明，质粒alaD^*中含有序列表中序列9所示的突变基因3；突变基因3与alaD基因的不同在于将后者的第30位所示的A替换为C，第715位所示的T替换为A，第591位所示的C替换为G。根据测序结果，获得alaD基因的突变位点见表5。

实施例5、质粒alaD^*中AlaD的酶活性和在L-丙氨酸发酵中的应用

1、取XZ-A51菌株，制备感受态细胞。

2、完成步骤1后，将质粒alaD^*电转化至步骤1得到的感受态细胞，得到含有质粒alaD^*的XZ-A51菌株。

3、按照实施例3中步骤三的方法，将alaD突变体替换为含有质粒alaD^*的XZ-A51菌株，其它步骤均不变。

结果如表5所示。结果表明，含有质粒alaD^*的XZ-A51菌株(即XZ-A51(alaD^*))中L-丙氨酸产量达到11.2g/L，相对于XZ-A12菌株提高了84％；含有质粒alaD^*的XZ-A51菌株的L-丙氨酸脱氢酶的酶活性为3.4μmol/min/mg蛋白，相对于XZ-A12菌株酶活性提高了113％。

上述结果表明，通过定向进化和代谢驯化相结合获得的L-丙氨酸脱氢酶突变体的活性相对于XZ-A12菌株(野生型)大幅提高，突变位点K10N、D197E和L239M对L-丙氨酸脱氢酶的活性具有显著作用，可以有效改善L-丙氨酸工程菌株的发酵能力和L-丙氨酸的产量。

实施例6、alaD突变体在工业化L-丙氨酸发酵中的应用

使用自来水配置的培养基进行发酵生产L-丙氨酸能够极大的降低L-丙氨酸的生产成本。

本实施例中的XZ-A47菌株已在中国发明专利文献CN 103898089B中公开，在文献中的名称为XZ-A47。XZ-A47菌株是一株能够耐受自来水并在自来水配置的培养基中高效生产L-丙氨酸的工程菌株。

一、XZ-A53菌株的构建

1、按照实施例1中步骤一的方法，将XZ-A12菌株替换为XZ-A47菌株，其它步骤均不变，构建成XZ-A52菌株。

2、按照实施例1中步骤二的方法，将XZ-A50菌株替换为XZ-A52菌株，其它步骤均不变，构建成XZ-A53菌株。

XZ-A53菌株敲除了丙氨酸脱氢酶alaD基因。

二、重组菌的制备

1、取XZ-A53菌株，制备感受态细胞。

2、完成步骤1后，分别将质粒alaD^*-1、质粒alaD^*-2和质粒alaD^*电转化至步骤1得到的感受态细胞，依次得到XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)和XZ-A53(alaD^*)。

3、将XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)或XZ-A53(alaD^*)分别接种于装有50mL种子培养基的三角瓶(规格为250mL)中，37℃、250rpm培养至对数期，得到种子液。

4、完成步骤3后，将种子液接种至装有2.4L发酵培养基2的发酵罐(规格为3L)中，初始接种量为0.1％(V/V)；然后30℃、100rpm发酵培养48h(发酵期间，中和剂为氨水，使发酵罐pH控制在6.5)，得到发酵液。

5、使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))进行。

检测结果见表6。结果表明，XZ-A53(alaD^*-1)、XZ-A53(alaD^*-2)和XZ-A53(alaD^*)在工业化生产中均具有良好的活性。与XZ-A47菌株相比，XZ-A53(alaD^*)的L-丙氨酸产量提高了43％。

表6

	L-丙氨酸产量(g/L)	alaD基因的突变位点
			XZ-A47菌株	114	野生型
XZ-A53(alaD<sup>*</sup>-1)	132	K10N，L239M
			XZ-A53(alaD<sup>*</sup>-2)	138	D197E
XZ-A53(alaD<sup>*</sup>)	162	K10N，D197E，L239M

<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株高产L-丙氨酸的菌株

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agcggcaaga ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttatttgtta 60

actgttaatt gtccttgttc aaggatgctg tctttgacaa cagatgtttt cttgcctttg 120

atgttcagca ggaagcttgg cgcaaacgtt gattgtttgt ctgcgtagaa tcctctgttt 180

gtcatatagc ttgtaatcac gacattgttt cctttcgctt gaggtacagc gaagtgtgag 240

taagtaaagg ttacatcgtt aggatcaaga tccattttta acacaaggcc agttttgttc 300

agcggcttgt atgggccagt taaagaatta gaaacataac caagcatgta aatatcgtta 360

gacgtaatgc cgtcaatcgt catttttgat ccgcgggagt cagtgaacag gtaccatttg 420

ccgttcattt taaagacgtt cgcgcgttca atttcatctg ttactgtgtt agatgcaatc 480

agcggtttca tcactttttt cagtgtgtaa tcatcgttta gctcaatcat accgagagcg 540

ccgtttgcta actcagccgt gcgtttttta tcgctttgca gaagtttttg actttcttga 600

cggaagaatg atgtgctttt gccatagtat gctttgttaa ataaagattc ttcgccttgg 660

tagccatctt cagttccagt gtttgcttca aatactaagt atttgtggcc tttatcttct 720

acgtagtgag gatctctcag cgtatggttg tcgcctgagc tgtagttgcc ttcatcgatg 780

aactgctgta cattttgata cgtttttccg tcaccgtcaa agattgattt ataatcctct 840

acaccgttga tgttcaaaga gctgtctgat gctgatacgt taacttgtgc agttgtcagt 900

gtttgtttgc cgtaatgttt accggagaaa tcagtgtaga ataaacggat ttttccgtca 960

gatgtaaatg tggctgaacc tgaccattct tgtgtttggt cttttaggat agaatcattt 1020

gcatcgaatt tgtcgctgtc tttaaagacg cggccagcgt ttttccagct gtcaatagaa 1080

gtttcgccga ctttttgata gaacatgtaa atcgatgtgt catccgcatt tttaggatct 1140

ccggctaatg caaagacgat gtggtagccg tgatagtttg cgacagtgcc gtcagcgttt 1200

tgtaatggcc agctgtccca aacgtccagg ccttttgcag aagagatatt tttaattgtg 1260

gacgaatcga attcaggaac ttgatatttt tcattttttt gctgttcagg gatttgcagc 1320

atatcatggc gtgtaatatg ggaaatgccg tatgtttcct tatatggctt ttggttcgtt 1380

tctttcgcaa acgcttgagt tgcgcctcct gccagcagtg cggtagtaaa ggttaatact 1440

gttgcttgtt ttgcaaactt tttgatgttc atcgttcatg tctccttttt tatgtactgt 1500

gttagcggtc tgcttcttcc agccctcctg tttgaagatg gcaagttagt tacgcacaat 1560

aaaaaaagac ctaaaatatg taaggggtga cgccaaagta tacactttgc cctttacaca 1620

ttttaggtct tgcctgcttt atcagtaaca aacccgcgcg atttacttag atctagcggc 1680

tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca 1740

ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac 1800

tgccttaaaa aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa 1860

gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca 1920

tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt 1980

tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga 2040

cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg 2100

ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga 2160

gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc 2220

atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc 2280

gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta 2340

aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa 2400

atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga 2460

tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc 2520

ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt 2580

ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct tcccggtatc aacagggaca ccaggattta 2640

tttattctgc gaagtgatct tccgtcacat ttgtgctata aacggcgagt ttcataagac 2700

tttctccagt gatgttgaa 2719

<210> 2

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ttcaacatca ctggagaaag tcttatgaaa ctcgccgttt atagcacaaa tctggaaaaa 60

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa tcttgccgct cccctgcatt ccaggggagc 120

tgattcagat aatccccaat gacctttcat cctctattct taaaatagtc ctgagtcaga 180

aactgtaatt gagaaccaca atgaagaaag tagccgcgtt tgttgcgcta agcctgctga 240

tggcgggatg tgtaagtaat gacaaaattg ctgttacgcc agaacagcta cagcatcatc 300

gctttgtgct ggaaagcgta aacggtaagc ccgtgaccag cgataaaaat ccgccagaaa 360

tcagctttgg tgaaaaaatg atgatttccg gcagcatgtg taaccgcttt agcggtgaag 420

gcaaactgtc taatggtgaa ctgacagcca aag 453

<210> 3

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaagatcg gcattccaaa agaaatcaaa aacaatgaaa accgcgtcgc catcactccg 60

gcaggcgtga tgacgctcgt caaagcgggg catgacgtgt atgtggagac ggaagccggc 120

gctgggtcgg gtttttccga ttccgagtat gaaaaagccg gggcagtgat cgtgacgaaa 180

gcggaagatg cctgggcggc ggagatggtg ttgaaagtga aagaaccgct ggctgaggag 240

ttccgctatt ttcgccccgg attgattttg tttacgtatt tgcatttagc cgcggccgaa 300

gcgctcacga aagcgctcgt cgagcaaaaa gtggtcggca tcgcttacga gacggtgcag 360

cttgcgaacg gctcgctgcc gctgttgacg ccgatgagtg aagtcgccgg ccgcatgtcg 420

gtgcaagtcg gcgcccagtt tctcgagaag ccgcacggcg ggaaaggcat tttgcttggc 480

ggcgtgcccg gggtgcggcg cggcaaagtg acgatcatcg gcggcggcac agcggggacg 540

aacgcggcga aaatcgcggt cggcctcggg gcggacgtga cgattttgga cattaacgcc 600

gagcggctgc gcgagctcga tgatttgttc ggcgaccaag tgacgacgtt gatgtccaac 660

tcgtatcata tcgccgagtg cgtgcgcgaa tccgatttgg tcgtcggcgc cgtcttgatc 720

ccgggggcga aagcgccgaa gcttgtgacg gaagagatgg tgcgctcgat gacgccaggc 780

tcggtgttgg tcgacgtcgc cattgaccaa ggcggcattt ttgaaacgac cgaccgcgtc 840

acgacgcacg acgatccgac atacgtcaag cacggcgtcg tccattacgc cgtcgcgaac 900

atgccgggcg ctgtgccgcg tacgtcaaca ttcgcgctta cgaacgtcac gatcccatac 960

gccttgcaaa tcgccaacaa aggctaccgc gccgcttgcc tcgacaatcc ggcgctgtta 1020

aaagggatca acacgctcga cgggcacatc gtgtacgaag cggtcgcggc ggcgcacaac 1080

atgccgtata cggatgttca ttcgttgctg cagggatga 1119

<210> 4

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp

20 25 30

Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser

35 40 45

Glu Tyr Glu Lys Ala Gly Ala Val Ile Val Thr Lys Ala Glu Asp Ala

50 55 60

Trp Ala Ala Glu Met Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Leu Ala Glu Glu

65 70 75 80

Phe Arg Tyr Phe Arg Pro Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

85 90 95

Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Val Glu Gln Lys Val Val

100 105 110

Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Ala Asn Gly Ser Leu Pro Leu

115 120 125

Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Val Gln Val Gly

130 135 140

Ala Gln Phe Leu Glu Lys Pro His Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly

165 170 175

Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp

180 185 190

Val Thr Ile Leu Asp Ile Asn Ala Glu Arg Leu Arg Glu Leu Asp Asp

195 200 205

Leu Phe Gly Asp Gln Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile

210 215 220

Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Leu Ile

225 230 235 240

Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser

245 250 255

Met Thr Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly

260 265 270

Ile Phe Glu Thr Thr Asp Arg Val Thr Thr His Asp Asp Pro Thr Tyr

275 280 285

Val Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Val Thr Ile Pro Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Ala Ala Cys Leu Asp Asn

325 330 335

Pro Ala Leu Leu Lys Gly Ile Asn Thr Leu Asp Gly His Ile Val Tyr

340 345 350

Glu Ala Val Ala Ala Ala His Asn Met Pro Tyr Thr Asp Val His Ser

355 360 365

Leu Leu Gln Gly

370

<210> 5

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

atgaagatcg gcattccaaa agaaatcaac aacaatgaaa accgcgtcgc catcactccg 60

gcaggcgtga tgacgctcgt caaagcgggg catgacgtgt atgtggagac ggaagccggc 120

gctgggtcgg gtttttccga ttccgagtat gaaaaagccg gggcagtgat cgtgacgaaa 180

gcggaagatg cctgggcggc ggagatggtg ttgaaagtga aagaaccgct ggctgaggag 240

ttccgctatt ttcgccccgg attgattttg tttacgtatt tgcatttagc cgcggccgaa 300

gcgctcacga aagcgctcgt cgagcaaaaa gtggtcggca tcgcttacga gacggtgcag 360

cttgcgaacg gctcgctgcc gctgttgacg ccgatgagtg aagtcgccgg ccgcatgtcg 420

gtgcaagtcg gcgcccagtt tctcgagaag ccgcacggcg ggaaaggcat tttgcttggc 480

ggcgtgcccg gggtgcggcg cggcaaagtg acgatcatcg gcggcggcac agcggggacg 540

aacgcggcga aaatcgcggt cggcctcggg gcggacgtga cgattttgga cattaacgcc 600

gagcggctgc gcgagctcga tgatttgttc ggcgaccaag tgacgacgtt gatgtccaac 660

tcgtatcata tcgccgagtg cgtgcgcgaa tccgatttgg tcgtcggcgc cgtcatgatc 720

ccgggggcga aagcgccgaa gcttgtgacg gaagagatgg tgcgctcgat gacgccaggc 780

tcggtgttgg tcgacgtcgc cattgaccaa ggcggcattt ttgaaacgac cgaccgcgtc 840

acgacgcacg acgatccgac atacgtcaag cacggcgtcg tccattacgc cgtcgcgaac 900

atgccgggcg ctgtgccgcg tacgtcaaca ttcgcgctta cgaacgtcac gatcccatac 960

gccttgcaaa tcgccaacaa aggctaccgc gccgcttgcc tcgacaatcc ggcgctgtta 1020

aaagggatca acacgctcga cgggcacatc gtgtacgaag cggtcgcggc ggcgcacaac 1080

atgccgtata cggatgttca ttcgttgctg cagggatga 1119

<210> 6

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Asn Asn Asn Glu Asn Arg Val

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Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp

20 25 30

Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser

35 40 45

Glu Tyr Glu Lys Ala Gly Ala Val Ile Val Thr Lys Ala Glu Asp Ala

50 55 60

Trp Ala Ala Glu Met Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Leu Ala Glu Glu

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Phe Arg Tyr Phe Arg Pro Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

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Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Val Glu Gln Lys Val Val

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Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Ala Asn Gly Ser Leu Pro Leu

115 120 125

Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Val Gln Val Gly

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Ala Gln Phe Leu Glu Lys Pro His Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Gly

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Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly

165 170 175

Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp

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Val Thr Ile Leu Asp Ile Asn Ala Glu Arg Leu Arg Glu Leu Asp Asp

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Leu Phe Gly Asp Gln Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile

210 215 220

Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Met Ile

225 230 235 240

Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser

245 250 255

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Ala Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Ala Ala Cys Leu Asp Asn

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Leu Leu Gln Gly

370

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<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

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tcgtatcata tcgccgagtg cgtgcgcgaa tccgatttgg tcgtcggcgc cgtcttgatc 720

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<210> 8

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

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Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp

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Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser

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Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly

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Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp

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Leu Phe Gly Asp Gln Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile

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Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Leu Ile

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Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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<223>

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Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Asn Asn Asn Glu Asn Arg Val

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Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp

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340 345 350

Glu Ala Val Ala Ala Ala His Asn Met Pro Tyr Thr Asp Val His Ser

355 360 365

Leu Leu Gln Gly

370

Claims

1.蛋白质，为K1)-K4)中任一种：

K1)突变蛋白3；所述突变蛋白3的氨基酸序列如序列表中的序列10所示；

K2)突变蛋白2；所述突变蛋白2的氨基酸序列如序列表中的序列8所示；

K3)突变蛋白1；所述突变蛋白1的氨基酸序列如序列表中的序列6所示；

K4)在K1)或K2)或K3)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

4.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述核酸分子或含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在生产丙氨酸和/或制备丙氨酸脱氢酶中的应用。

5.一种能够生产丙氨酸的重组菌乙，其特征在于：其代谢产生丙氨酸的途径中涉及的丙氨酸脱氢酶包括权利要求1所述蛋白质。

6.一种生产丙氨酸的方法，依次包括如下步骤：

(1)使出发菌中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性提高，得到的重组菌甲；与所述出发菌相比，重组菌甲生产丙氨酸的能力提高；

(2)发酵培养重组菌甲，得到丙氨酸；

所述使出发菌中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性提高是通过向出发菌中导入编码所述蛋白质的核酸分子实现。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述出发菌为大肠杆菌。