CN113462666A

CN113462666A - 羰基还原酶突变体及其构建方法和应用

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Publication number: CN113462666A
Application number: CN202110946154.XA
Authority: CN
Inventors: 俞鑫焱; 胡文烨
Original assignee: Hangzhou Wendejie Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Wendejie Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-08-18
Also published as: CN113462666B

Abstract

本发明涉及生物化工领域，公开了一种羰基还原酶突变体及其构建方法和应用，本发明通过将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第143位亮氨酸突变为丙氨酸，136位亮氨酸突变为丙氨酸以及135甘氨酸突变为异亮氨酸，使得羰基还原酶突变体的酶活提高8倍，且e.e.值提高到了99％，与甲酸脱氢酶偶联成功实现了辅酶循环，最终在菌体终浓度为20g(dcw)/L能将450g/L的底物在12h之内转化率以及e.e.值均在99％以上，有效解决了底物浓度不高、转化率低、产率低以及e.e.值低以及生产成本较高等问题。

Description

羰基还原酶突变体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化工领域，尤其涉及了一种羰基还原酶突变体、基因以及含有该基因的重组载体和重组载体转化制备的重组基因工程菌，以及羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯中的应用。

背景技术

硫辛酸(α-Lipoic acid)是一种具有生物活性的天然产物，1951年由Reed首次从猪肝中分离得到。硫辛酸在欧美已广泛地用于临床医学领域，如肝病、老年痴呆、白内障、心脏病、糖尿病、艾滋病、牛皮癣、湿疹、帕金森氏症、风湿病、心脏病、神经性疾病、亚急性坏死脑病、放射性伤害症、重金属中毒等疾病的治疗，被誉为“万能抗氧剂”。

随着硫辛酸的药理药效学的深入研究发展，医学界研究人员对各种硫辛酸的衍生物及其它们盐类进行了应用开发，极大的丰富和扩展了硫辛酸系列产品的适应症范围和治疗效果，以满足医药临床和市场需求。

硫辛酸含有一个手性中心，研究表明，硫辛酸的两个对映异构体，R-型对映体具有生物活性，而S-型对映体基本没有活性，亦没有毒性，显然，R-型对映体具有更高的应用价值。

6-羟基-8-氯辛酸乙酯为合成硫辛酸的重要中间体，过去近30年间，以单一构型的6-羟基-8-氯辛酸乙酯出发通过氯代、硫化环化以及构型反转后得到(R)-α-硫辛酸具有高立体选择性以及相对较高的收率的，为目前工业生产(R)-α-硫辛酸的主流路线。

其中，6-羟基-8-氯辛酸乙酯的不对称合成方法主要包括化学合成法以及生物法，但是化学合成中复杂的反应过程以及普遍存在的立体选择性不足需要后续拆分提高e.e.值等，生物法中通过脂肪酶的动力学拆分的理论收率不超过50％，这些大大增加了(R)-α-硫辛酸的生产成本，限制了他们的应用价值。单一构型的6-羟基-8-氯辛酸乙酯通过还原酶进行不对称合成理论产率可达到100％，越来越受到研究者的青睐。

目前已有的还原酶法不对称合成单一构型6-羟基-8-氯辛酸乙酯报道中，存在底物浓度较低(45g/L)且转化率只有95％，e.e.值未提及以及需要添加昂贵的辅酶(WO2007028729)。

专利公告号为CN103451124B，专利名称为一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途的中国发明专利中公开了用其制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯在底物浓度为66g/L下转化率为99％但e.e.值仅为93％。

2020年，Xu等从Candida parapsilosis中筛选出羰基还原酶突变体CpAR2S131Y/Q252I，并构建了pAR2S131Y/Q252I/BmGDH工程菌，使得羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶GDH在同一个菌株中共表达，最终在110g/L的底物浓度下产率85％，e.e.值为99％(10.1002/cbic.201900693)为目前较高水平，但其底物浓度、转化率、产率以及e.e.值仍有待提高。

发明内容

本发明针对现有技术中还原酶法不对称合成单一构型6-羟基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸过程中存在的问题，提供了一种羰基还原酶突变体、重组载体、重组基因工程菌及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

羰基还原酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第135位甘氨酸，第136位亮氨酸，第143位亮氨酸进行单点单突变或多点组合突变获得；其中第135位甘氨酸突变为异亮氨酸，第136位亮氨酸突变为丙氨酸，第143位亮氨酸突变为丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

羰基还原酶突变体的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、构建重组载体：将羰基还原酶的编码基因与甲酸脱氢酶的编码基因通过融合PCR连接，将连接后的双酶基因片段与线性化载体片段通过一步克隆手段构建羰基还原酶与甲酸脱氢酶共表达载体，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

步骤S2、构建重组基因工程菌：以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，进行易错PCR，得到羰基还原酶突变序列；然后以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，羰基还原酶突变序列为引物进行全质粒扩增后转化至宿主细胞中，然后涂布含卡那霉素的LB平板，培养得到含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌；

步骤S3、将步骤S2中的含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌通过高通量筛选方法获得含羰基还原酶突变基因的重组菌的突变体，所述的含羰基还原酶突变基因的重组菌的突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第135位甘氨酸、第136位亮氨酸和第143位亮氨酸三突变体。

作为优选，步骤S1中融合PCR引物为：

P1:5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

P2:5’-CCGTGGTAACTCGAGGCACCACAAGAAGGAGATATACCTATGGCAACCGT-3’

P3:5’-CATAGGTATATCTCCTTCTTGTGGTGCcTCGAGTTACCACGGCAGGGTACG-3’

P4:5’-GGATCTCAGTGTTAGGTCAGGCGATA-3’；

步骤S2中易错PCR引物为：

上游引物：5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTACCACGGCAGGGTACGAC-3’。

羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用。

作为优选，羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，具体为以重组基因工程菌催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，然后通过(S)-6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(R)-α-硫辛酸。

作为优选，合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的具体方法为：

以所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以6-羰基-8-氯辛酸乙酯为底物，于pH 6.0-10.0的水-有机溶剂双相微水体系为反应介质构成的反应体系中反应，在300-700rpm，37℃条件下进行反应，反应结束后，获得含(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的反应液，将反应液分离纯化，获得(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯。

作为优选，水-有机溶剂双相微水体系是由体积比1：19-1：1的200mM和140mM、pH为8.0的磷酸钠、甲酸钠缓冲液和异丙醇组成。

作为优选，所述催化剂用量以湿菌体的重量计为100-300g/L缓冲液，所述6-羰基-8-氯辛酸乙酯初始加入浓度为0.5-3M。

作为优选，所述湿菌体的具体制备方法包括以下步骤：

步骤S1、将所述重组工程菌接种到含有终浓度为50mg/L卡那霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；

步骤S2、将步骤S1中得到的种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养约1.5-2.5h，使得菌体浓度OD600为0.4-0.8；

步骤S3、向培养液中加入终浓度为0.1-1.0mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，26℃诱导表达12h后，温度4℃、转速4000rpm下离心10-20min，收集湿菌体。

作为优选，LB液体培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，其中溶剂为去离子水，pH为7.0。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明通过143位亮氨酸突变为丙氨酸，136位亮氨酸突变为丙氨酸以及135甘氨酸突变为异亮氨酸，使得羰基还原酶突变体的酶活提高8倍，且e.e.值提高到了99％，最终在菌体终浓度为20g(dcw)/L能将450g/L的底物在12h之内转化率以及e.e.值均在99％以上，与甲酸脱氢酶偶联成功实现了辅酶循环，有效解决了底物浓度不高、转化率低、产率低以及e.e.值低以及生产成本较高等问题。

具体实施方式

实施例1

本实施例中提供了一种羰基还原酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第135位甘氨酸，第136位亮氨酸，第143位亮氨酸进行单点单突变或多点组合突变获得；其中第135位甘氨酸突变为异亮氨酸，第136位亮氨酸突变为丙氨酸，第143位亮氨酸突变为丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本实施例中提供了一种羰基还原酶突变体的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、构建重组载体：

将羰基还原酶的编码基因与甲酸脱氢酶的编码基因通过融合PCR连接，将连接后的双酶基因片段与线性化载体片段通过一步克隆手段构建羰基还原酶与甲酸脱氢酶共表达载体，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

具体为首先通过筛选获得蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)来源的羰基还原酶基因(PMCR)，NCBI号为WP_060395036.1(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和洋葱博克氏霍尔德菌(Burkholderia stabilis strain 15516)来源的甲酸脱氢酶基因(BstFDH)，GenBank:EU825923.1(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)；

然以P1、P2引物和P3、P4引物分别扩增编码羰基还原酶PMCR和甲酸脱氢酶的基因片段BstFDH，基于融合PCR技术，将上述基因相连接，获得带有同源臂的扩增产物。

进一步地，通过引物P5、P6，以pET30a质粒载体为模板扩增，获得片段为线性化载体，以融合的PMCR和BstFDH基因片段与线性化载体片段通过一步克隆手段构建羰基还原酶、甲酸脱氢酶共表达载体pET3a-PMCR-BstFDH，转化至E.coli感受态细胞后，获得E.coliBL21(DE3)/pET3a-PMCR-BstFDH重组细胞。

本实施例中pET30a质粒载体为优选表达载体，实际实验过程中的表达载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等。

本实施例中表达宿主选用大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21细胞。

本实施例中所采用的融合PCR引物，即P1、P2引物和P3、P4引物分别为：

P1:5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

P2:5’-CCGTGGTAACTCGAGGCACCACAAGAAGGAGATATACCTATGGCAACCGT-3’

P3:5’-CATAGGTATATCTCCTTCTTGTGGTGCcTCGAGTTACCACGGCAGGGTACG-3’

P4:5’-GGATCTCAGTGTTAGGTCAGGCGATA-3’。

一步克隆引物，即P5、P6引物分别为：

P5:5’-TCGCCTGACCTAACACTGAGATCCGGCTG-3’

P6:5’-AATGCGGTTTTAGATGCTGACATGGATCC-3’。

步骤S2、构建重组基因工程菌；

以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，进行易错PCR，得到羰基还原酶突变序列；然后以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，羰基还原酶突变序列为引物进行全质粒扩增后转化至宿主细胞中，然后涂布含卡那霉素的LB平板，培养得到含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌。

本实施例中易错PCR引物为：

上游引物：5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTACCACGGCAGGGTACGAC-3’。

具体为：

先以pET3a-PMCR-BstFDH基因为模板，根据上述引物进行易错PCR。

其中PCR扩增体系为：50μL反应体系：2×T5 Taq DNA Polymerase：1μL；MnCl2(1mM)：2.5μL；上游引物(50μM)：1μL；下游引物(50μM)：1μL；模板DNA(质粒)：1μL；ddH2O：13.5μL。

易错PCR反应程序为95℃预变性5min，随后进入循环：94℃变性1min，以55℃为退火温度运行15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环，最后72℃终延伸10min，4℃保存。

易错PCR结束后，取3μL易错PCR产物与2μL Loding buffer混合，用凝胶电泳进行条带大小验证易错PCR是否成功。将验证成功后的易错PCR产物根据Clean up试剂盒进行纯化，将纯化后的产物存于4℃冰箱以备下一轮使用。

然后再以pET3a-PMCR-BstFDH基因为模板，以易错PCR产物为引物进行全质粒扩增。

其中全质粒扩增体系为：2×phantamax Buffera:25μL；dNTP Mix(10Mm each):1μL；上游引物(50μM)：1μL；下游引物(50μM)：1μL；Phanta Max super-Fidelity DNAPolymerase:1μL；模板DNA(质粒)：0.5μL；ddH2O：18.5μL。

PCR反应条件为：预变性95℃10min，随后进入温度循环95℃30s，55℃30s，72℃6min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析验证后，在PCR产物中加入1μL DpnI、5μLbuffer，37℃消化2h去除模板质粒DNA，在65℃灭活10min后采用PCR cleanup Kit对产物进行纯化后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，得到羰基还原酶的突变文库，此时LB平板上呈现出许多不同突变的单菌落，这些单菌落即为含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌。

本实施例中LB培养基为蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH7.0。LB平板是在LB液体培养基添加15g/L琼脂。

本实施例中重组基因工程菌的构建，即重组大肠杆菌的构建方式如下所示：

首先制备大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞，具体制备方法包括以下步骤：

步骤一、从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；

步骤二、挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；

步骤三、从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4-0.6；

步骤四、将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；

步骤五、将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；

步骤六、4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

然后将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，在超净台内分别加入5μL的易错PCR后的重组质粒，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；

最后涂布于含有50μg/ml卡娜霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌。

步骤S3、将步骤S2中的重组基因工程菌进行通过高通量筛选；

将含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌通过高通量筛选方法获得含羰基还原酶突变基因的重组菌的突变体，所述的含羰基还原酶突变基因的重组菌的突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第135位甘氨酸、第136位亮氨酸和第143位亮氨酸三突变体。

本实施例中所采用的对重组基因工程菌进行高通量筛选的方法为将突变序列整合替换原来野生型的序列。

具体为：首先以突变前野生型PMCR为参考，由羰基还原酶突变文库中挑取单菌落克隆子至2mL深96孔板中进行培养，事先加入含终浓度50μg/mL卡那霉素的600μL的LB培养液，同时挑取2个亲本菌株在96孔板的最后2个孔中作为对照。

然后将2mL的96孔板置于37℃条件下培养8h作为种子液，然后取200μL种子液加入新的无菌的含有终浓度50μg/mL卡那霉素及0.1mM的IPTG的600μL的LB培养液中，含有种子液的26℃诱导表达12h后，4000rpm离心20min，弃上清，收集湿菌体，进行下一步的高通量筛选。

本实施例中采用了有效的高通量筛选方法，大大节约了从含几万个突变体的文库中获得高催化特性突变子的时间成本：由于从酮转化为醇是一个加氢还原的步骤，羰基还原酶在催化羰基形成醇的同时会释放出一分子的H+,因此随着反应的进行，反应体系中氢离子浓度发生改变。通过选择有效范围内能发生颜色变化的溴百里香芬蓝作为指示剂，在酶标仪下可以快速地、直接地检测各个突变体对酮类物质的活性以及手性选择性。

其中96孔板离心收集的湿菌体在每孔中加入200μL的PB缓冲液(pH＝8.0、200mM)制成细胞悬浮液。比色反应在96孔石英板中进行，反应体系为200μL：80μL的细胞悬浮液，终浓度20mM 6-羰基-8-氯辛酸乙酯及终浓度0.09mg/ml溴百里香酚蓝，以体积比6:4的乙酸乙酯和磷酸钠缓冲液(200mM、pH＝8.0)补足至200μL，混合后，在37℃条件下保温20min，反应相同时间，根据反应液的颜色(由蓝色到黄色)的变化速度确定羰基还原酶的酶活。

筛菌过程中，每轮突变文库共筛约400个单菌落，在相同时间内，根据pH指示剂的颜色变化快慢及深浅，与亲本PMCR对照组进行比较发现，酶活比亲本酶活高的反应液的颜色比亲本反应液所呈现的颜色更黄，从而初筛获得活性较高的含羰基还原酶突变基因的重组菌的突变体，经过测序得到三突变体E.coli BL21(DE3)/pET3a-PMCR-BstFDH-G135I-L136A-L143A，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，

本实施例中亲本菌株为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET3a-PMCR-BstFDH，其具体制备方法为：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内分别加入5μL的质粒pET3a-PMCR-BstFDH，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml卡娜霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET3a-PMCR-BstFDH。

本实施例中给出了羰基还原酶不对称催化合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的活性比较结果，具体为：

单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯所需要的酶量为一个酶活单位U。

反应体系：终浓度1M的6-羰基-8-氯辛酸乙酯，终浓度20g/L的实施例5制备的湿菌体，终浓度为10g/L的甲酸钠和50mM、pH7.5PBS缓冲液为反应介质10mL构成反应体系。在37℃，600rpm反应10min，取500μL反应液加入1mL乙酸乙酯的进行萃取，12000rpm离心1min，取有机相用无水硫酸钠干燥后，气相检测(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯峰面积以及残留底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯，通过产物和底物的峰面积之比计算产物生成量以及底物的消耗量，根据酶活定义，进行酶活的计算。

(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯检测方法：采用Agilent GC-7890A系统，，色谱柱类型：HYDRODEXβ-TBDAc Column(25m×0.25mm,Diacel,Japan)毛细管柱，色谱条件：柱温200℃，进样室温度280℃，FID检测器280℃，N2:0.1MPa；

H2:0.1MPa；Air:0.1MPa.

计算(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的对映体过剩(e.e.)为[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]，其中(S)为(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的峰面积，R为(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的峰面积所有实验数据均来自三次重复实验

实验结果表明，三突变体的酶活由100U/g湿菌体提高至800U/g湿菌体，提高了8倍，e.e.值由原来的70％提高至99.9％以上。

由以上实验结果可知，本发明得到的含有羰基还原酶基因的重组大肠杆菌具有较强的催化能力，可以利用6-羰基-8-氯辛酸乙酯为底物，进行生物转化反应制备高光学纯的(R)-α-硫辛酸关键中间体——(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯。

本发明所述羰基还原酶突变体编码基因以及甲酸脱氢酶编码基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌，实现了羰基还原酶与甲酸脱氢酶在大肠杆菌工程菌中的共表达。与现有技术相比较，通过143位Leu突变为Ala，136位Leu突变为Ala以及135Gly突变为Ile这几个突变位点的叠加突变使得突变体酶活提高8倍，且ee值提高到了99％。最终在菌体终浓度为20g(dcw)/L能将450g/L的底物在12h之内转化率以及e.e.值均在99％以上，解决了转化率低、产率低、e.e.值低的问题。

另外甲酸脱氢酶能从甲酸体系中将NAD+还原成NADH,实现了辅酶的循环，实现了辅酶的零添加。此外甲酸脱氢后生成的二氧化碳较现有技术更加绿色环保，对后续反应也无影响。

实施例2

本实施例中提供了一种将实施例1中羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，具体为将含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，以(S)-6-羰基-8-氯辛酸乙酯为底物进行生物转化反应制备(R)-α-硫辛酸。

本实施例中合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的具体方法为：

步骤一、羰基还原酶及其突变体的重组菌菌体的制备

以实施例1中所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以6-羰基-8-氯辛酸乙酯为底物，于pH 6.0-10.0的水-有机溶剂双相微水体系为反应介质构成的反应体系中反应，在300-700rpm，37℃条件下进行反应，反应结束后，获得含(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的反应液，将反应液分离纯化，获得(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯。

其中，水-有机溶剂双相微水体系是由体积比1：19-1：1的200mM和140mM、pH为8.0的磷酸钠、甲酸钠缓冲液和异丙醇组成。所述催化剂用量以湿菌体的重量计为100-300g/L缓冲液，所述6-羰基-8-氯辛酸乙酯初始加入浓度为0.5-3M。

本实施例中湿菌体的具体制备方法包括以下步骤：

步骤S2、将步骤S1中得到的种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养约1.5-2.5h，使得菌体浓度OD600为0.4-0.8；LB液体培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，其中溶剂为去离子水，pH为7.0。

本发明所述的羰基还原酶突变体以及甲酸脱氢酶可以以全细胞形式完成催化，也可以通过细胞破碎的粗酶液或者完全破碎的纯酶进行催化。此外，还可以利用特定的固定化技术将上述两酶制备成固定化酶或者固定化细胞形式的酶。

步骤二、羰基还原酶不对称催化合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯

通过发酵获得的羰基还原酶突变体菌体E.coliBL21(DE3)/pET3a-PMCR-BstFDH-G135I-L136A-L143A 200g/L，加入终浓度为1M的6-羰基-8-氯辛酸乙酯，终浓度10g/L的甲酸钠构成1L的微水异丙醇反应体系，在37℃、200rpm搅拌下反应底物转化率高达99.9％，产率99％，e.e.值99％以上。

步骤三、以(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸

通过(S)-6-羰基-8-氯辛酸乙酯以现有的方法合成高光学纯的(R)-α-硫辛酸。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

序列表

<110> 杭州文德阶生物科技有限公司

<120> 羰基还原酶突变体及其构建方法和应用

<130> 20210816

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> Pseudomonas monteilii

<400> 1

atgagcgcat ccaaaaccgc gctggtcatc ggcgcttccc gtggcctggg cttgggcctg 60

gtccagcggc tacacgagca gggctggaac gtcatcgcca ccgtgcgtga tccggccaag 120

gccacggcgc tgcacgcgtt ggcgggtgta cgggtcgaag ccctggagat gaacgatgcg 180

tcacagctcg atgcgctcgg acaacgcctc gaaggcgagg tgctcgacct gctgttcgtc 240

aacgccggtg tcatgggccc cctgccccag tctgccgaca ccattcacct cgagcaggtc 300

ggcgagctgt tcatgaccaa tgcggtctcg cccattcgcg tcgcccgccg cctggtcgat 360

caggtgcgcc ccggtacggg ggtggtggcc ttcatgagtt cgggcctggg cagcgtggcc 420

agcccggatg cgggtgagat ctgcttgtac aaagccagca aggctgcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggtggc gttgcaacgc ccggacctct gcgtgctggc catgcaccct 540

ggctgggtgc gtaccgaaat gggcggggaa aacgccgaga tcgacgtgct gaccagtacc 600

caggggatcc tcgcgcaggt cgaggcccag gccggtcacg gtgggcttcg cttcctggac 660

tacgccggca ggaccctgcc ctggtaa 687

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> Pseudomonas monteilii

<400> 2

Met Ser Ala Ser Lys Thr Ala Leu Val Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu His Glu Gln Gly Trp Asn Val Ile

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asp Pro Ala Lys Ala Thr Ala Leu His Ala Leu Ala

35 40 45

Gly Val Arg Val Glu Ala Leu Glu Met Asn Asp Ala Ser Gln Leu Asp

50 55 60

Ala Leu Gly Gln Arg Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Leu Leu Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Ser Ala Asp Thr Ile His

85 90 95

Leu Glu Gln Val Gly Glu Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Asp Gln Val Arg Pro Gly Thr Gly Val

115 120 125

Val Ala Phe Met Ser Ser Gly Leu Gly Ser Val Ala Ser Pro Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Ala Leu Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Arg Thr Glu Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Leu Thr Ser Thr Gln Gly Ile Leu Ala Gln Val Glu

195 200 205

Ala Gln Ala Gly His Gly Gly Leu Arg Phe Leu Asp Tyr Ala Gly Arg

210 215 220

Thr Leu Pro Trp

225

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgtcagcat ctaaaaccgc attagttatt ggcgcaagtc gcggtctggg tttaggctta 60

gttcagcgct tacatgaaca gggttggaat gtgattgcaa ccgtgcgcga tccggccaaa 120

gccaccgcct tacatgcatt agccggcgtt cgcgtggaag cattagaaat gaatgatgca 180

agtcagttag atgccctggg ccagcgcctg gaaggcgaag tgctggattt actgtttgtt 240

aatgccggtg tgatgggccc gttaccgcag agtgccgata ccattcatct ggaacaggtt 300

ggtgaactgt ttatgaccaa tgcagtgtct ccgattcgcg tggcacgtcg cttagtggat 360

caggttcgtc cgggtactgg cgttgttgcc tttatgtcgt caattgcggg tagcgtggca 420

agtccggcgg caggcgaaat ttgtctgtat aaagcctcta aagcagcact gaatagtatg 480

attaatagct ttgttgttgc cttacagcgt ccggatctgt gtgtgctggc catgcatccg 540

ggctgggttc gtaccgaaat gggcggtgaa aatgcagaaa ttgatgtgct gacctcaacc 600

cagggtattc tggcacaggt tgaagcccag gcaggtcatg gtggtctgcg ctttttagat 660

tatgccggtc gtaccctgcc gtggtaa 687

<210> 4

<211> 228

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ser Ala Ser Lys Thr Ala Leu Val Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu His Glu Gln Gly Trp Asn Val Ile

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asp Pro Ala Lys Ala Thr Ala Leu His Ala Leu Ala

35 40 45

Gly Val Arg Val Glu Ala Leu Glu Met Asn Asp Ala Ser Gln Leu Asp

50 55 60

Ala Leu Gly Gln Arg Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Leu Leu Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Ser Ala Asp Thr Ile His

85 90 95

Leu Glu Gln Val Gly Glu Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Asp Gln Val Arg Pro Gly Thr Gly Val

115 120 125

Val Ala Phe Met Ser Ser Ile Ala Gly Ser Val Ala Ser Pro Ala Ala

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Ala Leu Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Arg Thr Glu Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Leu Thr Ser Thr Gln Gly Ile Leu Ala Gln Val Glu

195 200 205

Ala Gln Ala Gly His Gly Gly Leu Arg Phe Leu Asp Tyr Ala Gly Arg

210 215 220

Thr Leu Pro Trp

225

<210> 5

<211> 1161

<212> DNA

<213> Burkholderia stabilis strain 15516

<400> 5

atggcaaccg tgctgtgtgt gctgtatcca gacccggtgg atggctatcc gccgcattat 60

gttcgcgata ccattccggt tattacccgc tatgcagatg gccagaccgc accgaccccg 120

gcaggcccgc cgggctttcg ccctggtgaa ctggtgggtt cagtgagcgg cgcactgggc 180

ctgcgcggct atctggaagc acatggtcat accctgattg ttaccagtga taaagatggt 240

ccggatagcg aatttgaacg tcgtctgccg gatgcagatg ttgtgatttc tcagccgttt 300

tggccggcat atctgaccgc agaacgtatt gcacgcgcac cgaaactgcg tctggcactg 360

accgcaggca ttggtagcga tcatgtggat ctggatgcag cagcacgtgc acatattacc 420

gttgcagaag ttaccatgag taatagtatt agcgttgcag aacatgttgt tatgaccacc 480

ctggcactgg tgcgtaatta tctgccgagc catgcaattg cacagcaggg cggttggaat 540

attgcagatt gtgtgtctcg tagctatgat gtggaaggta tgcattttgg tactgtgggc 600

gcaggtcgta ttggtctggc agtgctgcgt cgcctgaaac cgtttggcct gcatctgcat 660

tatacccagc gtcatcgcct ggatgcagca attgaacagg aactgggtct gacctatcat 720

gcagatccgg caagcctggc agcagcagtt gatattgtta atcttcaaat tccgctgtat 780

ccgtcaaccg aacatctgtt tgatgcagca atgattgcac gtatgaaacg cggcgcatat 840

ctgattaata ccgcacgcgg taaactggtt gatcgcgatg cagttgttcg cgcagtgacc 900

tcaggccatc tggcaggcta tggcggcgat gtttggtttc cgcagccggc accggcagat 960

catccgtggc gcgcaatgcc gtttaatggt atgaccccgc atatttcagg gacatcactg 1020

tcagcacagg cacgctatgc agcagggacg ctggaaattc tacagtgttg gtttgatggt 1080

cgtccgattc gtaatgaata tctgattgtg gatggcggca ccctggcagg tacgggcgca 1140

cagtcttatc gcctgaccta a 1161

<210> 6

<211> 386

<212> PRT

<213> Burkholderia stabilis strain 15516

<400> 6

Met Ala Thr Val Leu Cys Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Tyr

1 5 10 15

Pro Pro His Tyr Val Arg Asp Thr Ile Pro Val Ile Thr Arg Tyr Ala

20 25 30

Asp Gly Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Arg Pro

35 40 45

Gly Glu Leu Val Gly Ser Val Ser Gly Ala Leu Gly Leu Arg Gly Tyr

50 55 60

Leu Glu Ala His Gly His Thr Leu Ile Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly

65 70 75 80

Pro Asp Ser Glu Phe Glu Arg Arg Leu Pro Asp Ala Asp Val Val Ile

85 90 95

Ser Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg

100 105 110

Ala Pro Lys Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His

115 120 125

Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala His Ile Thr Val Ala Glu Val

130 135 140

Thr Met Ser Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Thr

145 150 155 160

Leu Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Ala Ile Ala Gln Gln

165 170 175

Gly Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser Arg Ser Tyr Asp Val Glu

180 185 190

Gly Met His Phe Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val

195 200 205

Leu Arg Arg Leu Lys Pro Phe Gly Leu His Leu His Tyr Thr Gln Arg

210 215 220

His Arg Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr His

225 230 235 240

Ala Asp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Val Asp Ile Val Asn Leu Gln

245 250 255

Ile Pro Leu Tyr Pro Ser Thr Glu His Leu Phe Asp Ala Ala Met Ile

260 265 270

Ala Arg Met Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys

275 280 285

Leu Val Asp Arg Asp Ala Val Val Arg Ala Val Thr Ser Gly His Leu

290 295 300

Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp

305 310 315 320

His Pro Trp Arg Ala Met Pro Phe Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser

325 330 335

Gly Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Leu Glu

340 345 350

Ile Leu Gln Cys Trp Phe Asp Gly Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu

355 360 365

Ile Val Asp Gly Gly Thr Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Tyr Arg

370 375 380

Leu Thr

385

Claims

1.羰基还原酶突变体，其特征在于：所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第135位甘氨酸，第136位亮氨酸，第143位亮氨酸进行单点单突变或多点组合突变获得；其中第135位甘氨酸突变为异亮氨酸，第136位亮氨酸突变为丙氨酸，第143位亮氨酸突变为丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.羰基还原酶突变体的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤S2、构建重组基因工程菌：以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，进行易错PCR，得到羰基还原酶突变序列；

然后以步骤S1中的共表达载体的基因为模板，羰基还原酶突变序列为引物进行全质粒扩增后转化至宿主细胞中，然后涂布含卡那霉素的LB平板，培养得到含羰基还原酶突变基因的重组基因工程菌；

3.根据权利要求2所述的羰基还原酶突变体的构建方法，其特征在于：步骤S1中融合PCR引物为：

P1:5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

P2:5’-CCGTGGTAACTCGAGGCACCACAAGAAGGAGATATACCTATGGC AACCGT-3’

P3:5’-CATAGGTATATCTCCTTCTTGTGGTGCcTCGAGTTACCACGGCAG GGTACG-3’

P4:5’-GGATCTCAGTGTTAGGTCAGGCGATA-3’；

步骤S2中易错PCR引物为：

上游引物：5’-GATCCATGTCAGCATCTAAAACCGCA-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTACCACGGCAGGGTACGAC-3’。

4.羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用。

5.根据权利要求4所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：以权利要求2所述的重组基因工程菌不对称催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，然后通过(S)-6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成(R)-α-硫辛酸。

6.根据权利要求5所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：合成(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的具体方法为：

以所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以6-羰基-8-氯-辛酸乙酯为底物，于pH 6.0-10.0的水-有机溶剂双相微水体系为反应介质构成的反应体系中反应，在300-700rpm，37℃条件下进行反应，反应结束后，获得含(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的反应液，将反应液分离纯化，获得(S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯。

7.根据权利要求6所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：水-有机溶剂双相微水体系是由体积比1：19-1：1的200mM和140mM、pH为8.0的磷酸钠、甲酸钠缓冲液和异丙醇组成。

8.根据权利要求6所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：所述催化剂用量以湿菌体的重量计为100-300g/L缓冲液，所述6-羰基-8-氯辛酸乙酯初始加入浓度为0.5-3M。

9.根据权利要求6所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：所述湿菌体的具体制备方法包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-α-硫辛酸的应用，其特征在于：LB液体培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，其中溶剂为去离子水，pH为7.0。