CN115029329A - 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用 - Google Patents

一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115029329A
CN115029329A CN202210521039.2A CN202210521039A CN115029329A CN 115029329 A CN115029329 A CN 115029329A CN 202210521039 A CN202210521039 A CN 202210521039A CN 115029329 A CN115029329 A CN 115029329A
Authority
CN
China
Prior art keywords
carbonyl reductase
mutant
mandelic acid
gly
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210521039.2A
Other languages
English (en)
Inventor
谷绪顶
李武威
马飞鸿
杜项龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Hanhong Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Hanhong Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Hanhong Technology Co ltd filed Critical Shanghai Hanhong Technology Co ltd
Priority to CN202210521039.2A priority Critical patent/CN115029329A/zh
Publication of CN115029329A publication Critical patent/CN115029329A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其在R‑扁桃酸合成中的应用，属于生物合成技术领域。所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列通过易错PCR引入随机突变，并通过高通量筛选获得。本发明所述羰基还原酶突变体较未突变野生型羰基还原酶KAR酶活(17U/L)显著提高，达到了60.5U/L；催化苯甲酰甲酸还原制备R‑扁桃酸，原料转化率最高可达96％，具有工业应用前景。

Description

一种羰基还原酶突变体及其在制备R-扁桃酸中的应用
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，具体涉及一种酶催化制备扁桃酸的方法。
背景技术
扁桃酸(Mandelic acid,MA)，化学名称a-羟基苯乙酸，CAS 90-64-2，化学式为C8H8O3，分子量152.15，熔点118-121℃，易溶于水和乙醇。
手性扁桃酸是重要的氨基酸合成前体和药物中间体。R-扁桃酸是合成青霉素、头孢拉定等抗生素的重要中间体，还可以用于合成抗肿瘤药物Goniothalamusstyryllactones、治疗水肿和风湿疾病药物(+)-CrassalactoneA，目前市场上对手性扁桃酸的需求远远大于对其外消旋体的需求，因而手性扁桃酸成为热点的精细化工中间体。
光学纯扁桃酸生产方法主要有物理化学方法、化学法和生物催化法。物理化学方法主要包括毛细管电泳法和色谱分离法。色谱法中主要有高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。色谱法不能够实现手性扁桃酸工业化大规模生产。化学法生产手性扁桃酸主要分为非对映体盐结晶拆分法、不对称合成法和电化学法等。采用化学法生产具有反应条件苛刻，环境污染大的缺点。
发明内容
本发明目的是用易错PCR方法对羰基还原酶基因进行改造，使改造后羰基还原酶针对苯甲酰甲酸的酶活性有所提高，使其符合在催化生产R-扁桃酸工业化应用的需求。
本发明采用的技术方案为：通过易错PCR方法随机引入突变碱基，经高通量筛选获得羰基还原酶突变体菌株。所述突变体是通过对来源于有害片球菌Pediococcus damnosus野生型羰基还原酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)引入随机突变获得。突变体序列第106位丙氨酸突变为亮氨酸。
本发明还涉及一种由所述羰基还原酶突变体构建的重组载体。
本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
本发明还提供一种所述羰基还原酶突变体在苯甲酰甲酸制备R-扁桃酸中的应用。
进一步地，在上述应用中，以苯甲酰甲酸为底物和pH＝7.5PB缓冲液为反应介质，在含有羰基还原酶突变体的重组基因工程菌存在下，进行还原反应后得到R-扁桃酸。
进一步地，在上述应用中，还原反应在水浴控温、磁力搅拌条件下进行。
进一步地，在上述应用中，酶源通过以含羰基还原酶突变体编码基因的重组工程菌经诱培养获得的菌液经裂解获得，所述酶源按如下方法制备：取不同突变体菌液以及未突变菌种18uL接种于1.8mL LB培养基(96孔板中预先加入1.8mL培养基)，同时加入2uL100mg/mLKan溶液，37℃振荡培养至菌体浓度OD 600nm约为0.6-0.8，15℃静置30min，之后加入2uL 200mg/mL IPTG溶液，16℃振荡诱导24h。使用96孔板离心机进行离心；离心后沉淀加0.2mL裂解液重悬，超声破碎，4℃，3000×g，10min离心，破碎上清保留，用于酶活分析。
突变体羰基还原酶KARase-F106L(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)的催化活力较野生型酶活(17U/L)有显著提高，分别达到了60.5U/L。本发明实施例中转化率可高达到96％，R-扁桃酸对映选择性达到100％ee，是一种全新环保节能、高效R-扁桃酸的合成工艺。
具体实施方式
本发明中实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编《分子克隆实验指南》。本发明所涉及表达酶基因的重组大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)，以及所用载体为pET-30a购自TAKARA公司。下游催化工艺所用试剂：苯甲酰甲酸，购自阿拉丁化学试剂有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。
采用高效液相色谱(HPLC)检测过程中R-扁桃酸生成，具体方法为：色谱仪为安捷伦1260；色谱柱为大赛璐Chiral OJ-H(5μm,250mm×4.6mm,5μm)，流动相为正己烷-乙醇-三氟乙酸(96:4:0.3)，检测波长：220nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。
一、构建野生型羰基还原酶基因重组表达菌株
委托北京擎科新业生物技术有限公司提供密码子优化和基因合成服务，来源于有害片球菌Pediococcus damnosus羰基还原酶(KARase)基因，基因序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将这一基因克隆于pET-30a(+)质粒上的酶切位点EcoRI和HindIII之间，获得pET-30a(+)-KARase重组质粒。将重组质粒pET-30a(+)-KARase转染到宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase。
使用LB培养基对基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase进行活化与培养。
LB培养基具体配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％琼脂。
活化与培养方案：将保存有工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase的甘油管划线至LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)平皿上，37℃静置培养12h。从平皿上挑取单菌落接入含50μg/mL卡那霉素5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12h。在获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。
二、构建羰基还原酶基因突变体表达菌株
以步骤一中提取pET-30a(+)-KARase质粒为模版，通过易错PCR向KARase基因引入随机突变，所用引物及PCR反应体系分别见表1、表2。
表1PCR所用引物
Figure BDA0003641549290000041
Figure BDA0003641549290000051
表2易错PCR扩增体系
Figure BDA0003641549290000052
以pET-30a(+)-KARase质粒为模板，用表1所示引物进行易错PCR，PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件：
表3易错PCR反应程序
Figure BDA0003641549290000053
PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，目标条带用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收。
质粒使用EcoRI和HindIII进行双酶切线性化。酶切体系如表4所示。在37℃下温育3小时。琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。
表4载体质粒的酶切体系
Figure BDA0003641549290000054
Figure BDA0003641549290000061
将易错PCR扩增片段和载体进行同源重组连接反应，反应体系如表5所示。
表5同源重组反应体系
Figure BDA0003641549290000062
重组产物化转导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，过夜培养获得不同克隆重组子。在2mL 96孔板中，挑取96个单菌落于1.8mL含抗生素液体LB培养基中，12h震荡培养后，通过以菌液为模板，载体通用引物(pET-30a(+)通用引物为T7，T7 terminator)为引物进行PCR检验，反应体系与条件同表6和表7。
表6 2×CataAmp Taq PCRMixPCR反应体系
Figure BDA0003641549290000063
表7 2×CataAmp Taq PCR Mix PCR反应程序
Figure BDA0003641549290000071
PCR产物直接上到1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物大小符合预期菌落，其产物条带足够，送PCR测序，根据测序结果确定突变位置，编辑突变体名字，并保存菌液。
突变体菌液用于后续诱导表达实验。取不同突变体菌液以及未突变菌种18uL接种于1.8mL LB培养基，同时加入2uL 100mg/mL Amp溶液，37℃振荡培养至菌体浓度OD600nm约为0.6-0.8，15℃静置30min，之后加入2uL 200mg/mL IPTG溶液，16℃振荡诱导24h。使用96孔板离心机进行离心，离心条件为4℃，3000×g，10min。保留发酵上清，尝试使用上清测酶活情况。
离心后沉淀加0.2mL裂解液重悬，超声破碎(需要摸索下破碎条件)，4℃，3000×g，10min离心，破碎上清保留。酶活分析，找出活性高的菌株，并确认突变位置。对85个突变体进行酶活检测，发现有5个菌株酶活得到了提高，反应体系如表8所示。
Figure BDA0003641549290000072
Figure BDA0003641549290000081
KARase-Mut-82突变体经测序鉴定突变体序列第106位苯丙氨酸突变为亮氨酸，将菌株命名为E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase-F106L。
实施例1酶催化苯甲酰甲酸生成R-扁桃酸
取构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase-F106L发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取0.5g湿菌体用30mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，将粗酶液和适量NAD+、葡萄糖脱氢酶一同加入到50mL圆底烧瓶中，称取1.5g苯甲酰甲酸和2.7g葡萄糖加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度30℃进行反应，用4M NaOH控制反应pH＝7.5。反应12h之后用液相色谱检测反应体系中苯甲酰甲酸和R-扁桃酸的含量；底物转化率93％，R-扁桃酸浓度为47.1g/L，Ee值100％。
实施例2酶催化苯甲酰甲酸生成R-扁桃酸
取构建基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KARase-F106L发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取0.5g湿菌体用30mL0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，将粗酶液和适量NAD+、葡萄糖脱氢酶一同加入到50mL圆底烧瓶中；称取1.5g苯甲酰甲酸和2.7g葡萄糖加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应，4M NaOH控制反应pH＝7.5。反应24h液相色谱检测反应体系中苯甲酰甲酸和R-扁桃酸含量；底物转化率大于96％，R-扁桃酸浓度为48.6g/L，Ee值100％。
对比例1
取构建好野生型基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-KAR ase发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，分别称取0.5g湿菌体用30mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，将粗酶液和适量NAD+、葡萄糖脱氢酶一同加入到50mL圆底烧瓶中；称取1.5g苯甲酰甲酸和2.7g葡萄糖加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应。用4MNaOH控制反应pH＝7.5。反应24h液相色谱检测反应体系中对应产物含量，转化率73％，R-扁桃酸产物浓度为37g/L，Ee值95％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海瀚鸿科技股份有限公司
<120> 一种羰基还原酶突变体及其在制备R-扁桃酸中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> 有害片球菌(Pediococcus damnosus)
<400> 1
atgaacgata aagaagtgct gaccctgatt accggcgcgg ataaaggcgt gggctttgaa 60
accgcgaaag aactgggcca gaaaggccag catattctgc tgggcagccg caacgtgagc 120
cgcggcgaaa aagcggtgag caaactggcg gatctgggcg tgaacgcgga tctggtgcag 180
ctggatgtga ccgatcagga aagcattaaa aaagcggcgg ataaaattaa agcggattat 240
ggccatctgg atattctgat taacaacgcg ggcatgacca acgatgcgca tcagaaaccg 300
agcgaaatgc cgaccgcgac cattcgcgaa gaatatgatg tgaacttttt tggcctgctg 360
gataccaccc aggcgatggt gccgctgctg aaaaaagcga ccagcggcaa aattattaac 420
gtgagcagca acatgggcag cctgaccctg gcgagcgatc cgaaaagccg cttttatcag 480
gtgagcagcg tgggctatca gagcagcaaa gcggcggtga actttgtgac cattgatctg 540
agcaaagaac tgaaagaatt tggcattacc gtgaacagcg tgaacccggg ctggaccgcg 600
accggctttg gcggccgcag cctggatagc ccgaaaattc cgggcatgca ggatgtggaa 660
gaaggcgcgg cgcgcattgt ggaactggcg agcgatccgg ataacaaaac caccggcacc 720
tttagcgaaa acggcggcac cctgccgtgg 750
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 有害片球菌(Pediococcus damnosus)
<400> 2
Met Asn Asp Lys Glu Val Leu Thr Leu Ile Thr Gly Ala Asp Lys Gly
1 5 10 15
Val Gly Phe Glu Thr Ala Lys Glu Leu Gly Gln Lys Gly Gln His Ile
20 25 30
Leu Leu Gly Ser Arg Asn Val Ser Arg Gly Glu Lys Ala Val Ser Lys
35 40 45
Leu Ala Asp Leu Gly Val Asn Ala Asp Leu Val Gln Leu Asp Val Thr
50 55 60
Asp Gln Glu Ser Ile Lys Lys Ala Ala Asp Lys Ile Lys Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Gly His Leu Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Met Thr Asn Asp Ala
85 90 95
His Gln Lys Pro Ser Glu Met Pro Thr Ala Thr Ile Arg Glu Glu Tyr
100 105 110
Asp Val Asn Phe Phe Gly Leu Leu Asp Thr Thr Gln Ala Met Val Pro
115 120 125
Leu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Gly Lys Ile Ile Asn Val Ser Ser Asn
130 135 140
Met Gly Ser Leu Thr Leu Ala Ser Asp Pro Lys Ser Arg Phe Tyr Gln
145 150 155 160
Val Ser Ser Val Gly Tyr Gln Ser Ser Lys Ala Ala Val Asn Phe Val
165 170 175
Thr Ile Asp Leu Ser Lys Glu Leu Lys Glu Phe Gly Ile Thr Val Asn
180 185 190
Ser Val Asn Pro Gly Trp Thr Ala Thr Gly Phe Gly Gly Arg Ser Leu
195 200 205
Asp Ser Pro Lys Ile Pro Gly Met Gln Asp Val Glu Glu Gly Ala Ala
210 215 220
Arg Ile Val Glu Leu Ala Ser Asp Pro Asp Asn Lys Thr Thr Gly Thr
225 230 235 240
Phe Ser Glu Asn Gly Gly Thr Leu Pro Trp
245 250
<210> 3
<211> 250
<212> PRT
<213> 有害片球菌(Pediococcus damnosus)
<400> 3
Met Asn Asp Lys Glu Val Leu Thr Leu Ile Thr Gly Ala Asp Lys Gly
1 5 10 15
Val Gly Phe Glu Thr Ala Lys Glu Leu Gly Gln Lys Gly Gln His Ile
20 25 30
Leu Leu Gly Ser Arg Asn Val Ser Arg Gly Glu Lys Ala Val Ser Lys
35 40 45
Leu Ala Asp Leu Gly Val Asn Ala Asp Leu Val Gln Leu Asp Val Thr
50 55 60
Asp Gln Glu Ser Ile Lys Lys Ala Ala Asp Lys Ile Lys Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Gly His Leu Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Met Thr Asn Asp Ala
85 90 95
His Gln Lys Pro Ser Glu Met Pro Thr Leu Thr Ile Arg Glu Glu Tyr
100 105 110
Asp Val Asn Phe Phe Gly Leu Leu Asp Thr Thr Gln Ala Met Val Pro
115 120 125
Leu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Gly Lys Ile Ile Asn Val Ser Ser Asn
130 135 140
Met Gly Ser Leu Thr Leu Ala Ser Asp Pro Lys Ser Arg Phe Tyr Gln
145 150 155 160
Val Ser Ser Val Gly Tyr Gln Ser Ser Lys Ala Ala Val Asn Phe Val
165 170 175
Thr Ile Asp Leu Ser Lys Glu Leu Lys Glu Phe Gly Ile Thr Val Asn
180 185 190
Ser Val Asn Pro Gly Trp Thr Ala Thr Gly Phe Gly Gly Arg Ser Leu
195 200 205
Asp Ser Pro Lys Ile Pro Gly Met Gln Asp Val Glu Glu Gly Ala Ala
210 215 220
Arg Ile Val Glu Leu Ala Ser Asp Pro Asp Asn Lys Thr Thr Gly Thr
225 230 235 240
Phe Ser Glu Asn Gly Gly Thr Leu Pro Trp
245 250

Claims (7)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，该菌株羰基还原酶基因经测序突变位点为：将SEQ ID NO.2所示有害片球菌Pediococcus damnosus野生型氨基酸序列第106位丙氨酸突变为亮氨酸，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.一种重组载体，其特征在于：采用权利要求1所述羰基还原酶突变体构建。
3.一种重组基因工程菌，其特征在于：采用权利要求2所述重组载体转化制备。
4.权利要求1所述羰基还原酶突变体在制备R-扁桃酸中的应用。
5.根据权利要求4所述羰基还原酶突变体在制备R-扁桃酸中的应用，其特征在于：以苯甲酰甲酸为底物和pH＝7.5PB缓冲液为反应介质，在含有羰基还原酶突变体的重组基因工程菌存在下，进行还原反应后得到R-扁桃酸。
6.根据权利要求5所述羰基还原酶突变体在制备R-扁桃酸中的应用，其特征在于：还原反应在水浴控温、磁力搅拌条件下进行。
7.根据权利要求5所述羰基还原酶突变体在制备R-扁桃酸中的应用，其特征在于：酶源通过以含羰基还原酶突变体编码基因的重组工程菌经诱培养获得的菌液经裂解获得，所述酶源按如下方法制备：取不同突变体菌液以及未突变菌种18uL接种于1.8mL LB培养基，同时加入2uL 100mg/mL Kan溶液，37℃振荡培养至菌体浓度OD 600nm为0.6-0.8，15℃静置30min，之后加入2uL 200mg/mL IPTG溶液，16℃振荡诱导24h；使用96孔板离心机进行离心，离心后沉淀加0.2mL裂解液重悬，超声破碎，4℃，3000×g，10min离心，破碎上清保留，用于酶活分析。
CN202210521039.2A 2022-05-12 2022-05-12 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用 Pending CN115029329A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210521039.2A CN115029329A (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210521039.2A CN115029329A (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115029329A true CN115029329A (zh) 2022-09-09

Family

ID=83122032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210521039.2A Pending CN115029329A (zh) 2022-05-12 2022-05-12 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115029329A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086090A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 浙江工业大学 一种两步微生物转化法制备r‑扁桃酸的方法
CN112941043A (zh) * 2021-05-17 2021-06-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 羰基还原酶突变体及在制备手性β’-羟基-β-氨基酸酯中的应用
CN113462666A (zh) * 2021-08-18 2021-10-01 杭州文德阶生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086090A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 浙江工业大学 一种两步微生物转化法制备r‑扁桃酸的方法
CN112941043A (zh) * 2021-05-17 2021-06-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 羰基还原酶突变体及在制备手性β’-羟基-β-氨基酸酯中的应用
CN113462666A (zh) * 2021-08-18 2021-10-01 杭州文德阶生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其构建方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11535839B2 (en) Encoding genes of nitrilase mutants and application thereof
CN113249366B (zh) 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及应用
CN108823179B (zh) 一种源自放线菌的转氨酶、突变体、重组菌及应用
CN109837317B (zh) 一种手性双芳基醇化合物的合成方法
US10837036B2 (en) Method for preparing L-aspartic acid with maleic acid by whole-cell biocatalysis
CN108048416B (zh) 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用
CN113774036B (zh) 一种亚胺还原酶突变体及其应用
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN114134134B (zh) L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用
CN112322606B (zh) 一种腈水合酶突变体及其应用
CN110592035B (zh) 一种羰基还原酶的突变体、重组表达载体及其在生产手性醇中的应用
CN110577940B (zh) 马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用
CN111100851B (zh) 醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用
CN113444702B (zh) 烯酮还原酶突变体及其应用
CN115029329A (zh) 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用
CN111154746B (zh) 酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN114854714A (zh) 一种菜豆源环氧化物酶突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用
CN110343728B (zh) 一种生物转化合成六氢哒嗪-3-羧酸的方法
CN113322248A (zh) 一种耐高温的l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用
CN112725322A (zh) 天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌
CN115747194B (zh) 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法
CN113444700B (zh) 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用
CN111575258B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN113444699B (zh) 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用
CN114606212B (zh) 一种圆锥铁线莲来源的香豆素合酶、基因、载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination