CN113322248A

CN113322248A - 一种耐高温的l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

Info

Publication number: CN113322248A
Application number: CN202110517682.3A
Authority: CN
Inventors: 吴杰群; 李淑英; 刘峰帆; 施志豪
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-05-12
Also published as: CN113322248B

Abstract

本发明涉及酶工程技术领域，公开了一种耐高温的L‑苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。本发明所涉及的来源于Pelosinus sp.的LTA基因的L‑苏氨酸醛缩酶经大肠杆菌中表达后，在pH值为7‑10的条件下催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛合成L‑对甲砜基苯丝氨酸，ee值>99%，该过程具有反应条件温和、步骤简单等优点。并且L‑苏氨酸醛缩酶PsLTA在65℃下具有较高的催化活性，在55℃下温育2h后仍保留90%的催化活性，该酶具有较高的热稳定性和催化活性，具有工业意义。

Description

一种耐高温的L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种耐高温的L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

背景技术

β-羟基-α-氨基酸在化学合成和药物生产中具有重要作用，例如苯丝氨酸及其衍生物可用做合成氟苯尼考和甲砜霉素等抗生素的重要中间体。但是由于β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心和四个异构体，难于合成光学纯的β-羟基-α-氨基酸。采用化学方法如由甘氨酸和硫酸铜在碱性条件下生成甘氨酸铜，经Schiff碱衍生再与对甲砜基苯甲醛羟醛缩合生成DL-对甲砜基苯丝氨酸铜，再经化学手性拆分后最终酯化获得，但是化学方法具有试剂昂贵、步骤繁琐和环境污染严重等问题，而生物催化是在温和的反应条件和高度立体选择性下合成β-羟基-α-氨基酸，而且苏氨酸醛缩酶在自然界中普遍存在，例如细菌、酵母和真菌中，使其在合成非天然化合物和药物前体中具有优势。

苏氨酸醛缩酶(TAs)是一种5'-磷酸吡哆醛(PLP)依赖性的酶，可以催化脂肪族和芳香族的醛与α-氨基酸发生羟醛缩合反应，生成具有2个手性中心的β-羟基-α-氨基酸，苏氨酸醛缩酶对C_α原子的构型具有绝对的高度选择性，但是对C_β原子通常只具有中等的立体选择性。因此挖掘高催化活性和高立体选择性的苏氨酸醛缩酶来合成氟苯尼考等抗生素的中间体具有重要意义。

目前，已知文献报道的L-苏氨酸醛缩酶在55℃左右的反应条件下温度稳定性非常差或者会失去活性，本发明提供的新的L-苏氨酸醛缩酶，即L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在65℃下具有较高的催化活性，而且在55℃下温育2h后仍保留90％的催化活性，该酶具有较高的热稳定性和催化活性，具有工业意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种L-苏氨酸醛缩酶。从Pelosinus sp.中克隆L-苏氨酸醛缩酶基因(WP_038671764.1)，利用其编码的酶可催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛羟醛缩合合成L-对甲砜基苯丝氨酸，ee值>99％，该过程具有反应条件温和、步骤简单等优点。并且L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在65℃下具有较高的催化活性，该酶在55℃下温育2h后仍保留90％的催化活性，具有工业应用意义。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种具有催化合成对甲砜基苯丝氨酸的活性和耐高温的L-苏氨酸醛缩酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述L-苏氨酸醛缩酶的多核苷酸，具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

作为优选，所述核苷酸序列和氨基酸序列来源于Pelosinus sp.。

进一步地，所述核苷酸序列来源于Pelosinus sp.的LTA基因。

第三方面，本发明提供了一种重组表达质粒载体，包含上述的多核苷酸。

第四方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，包含上述的重组表达质粒载体。

第五方面，本发明提供了上述重组大肠杆菌的全细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1：将具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目的基因克隆到载体pET-28a的BamHI和HindIII的限制性酶切位点之间，构建重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a；

S2：将S1中所述重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，培养得到重组菌E.coli BL21/PsLTA-pET-28a；

S3：收集S2中培养后的重组菌E.coli BL21/PsLTA-pET-28a，获得所述的重组大肠杆菌的全细胞。

第六方面，本发明提供了上述L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

作为优选，以包含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组大肠杆菌的全细胞为催化剂，所述L-苏氨酸醛缩酶为所述重组大肠杆菌的全细胞通过基因工程手段表达。

作为优选，所述对甲砜基苯丝氨酸合成的反应体系包括：甘氨酸、对甲砜基苯甲醛、氯化钠、5'-磷酸吡哆醛和上述的重组大肠杆菌的全细胞。

作为优选，反应温度为20-75℃，pH为7-10，反应时间为0.5-3h。

与现有技术对比，本发明的有益效果是采用基因工程方法在大肠杆菌中表达了Pelosinus sp.来源的L-苏氨酸醛缩酶，重组大肠杆菌全细胞催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛合成L-对甲砜基苯丝氨酸，ee值>99％，该过程具有反应条件温和、步骤简单等优点。并且L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在65℃下具有较高的催化活性，该酶在55℃下温育2h后仍保留90％的催化活性，具有工业应用意义。

附图说明

图1是本发明的重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a；

图2是本发明的重组菌E.coli BL21/PsLTA-pET-28a粗酶的蛋白表达；

图3是本发明的L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在25℃下催化合成L-对甲砜基苯丝氨酸反应的HPLC色谱图；

图4是本发明的L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在65℃下催化合成L-对甲砜基苯丝氨酸反应的HPLC色谱图；

图5是本发明的L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在55℃下温育2h后催化合成L-对甲砜基苯丝氨酸反应的HPLC色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。在本发明中所涉及的装置、连接结构和方法，若无特指，均为本领域公知的装置、连接结构和方法。

总实施例

一种具有催化合成对甲砜基苯丝氨酸的活性和耐高温的L-苏氨酸醛缩酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种编码上述L-苏氨酸醛缩酶的多核苷酸，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1

ATGTATTCATTTAAAAATGATTACAGTGAAGGCGCGCATCCGAAAATCTTGCGGGCACTGATTGAGACTAATCTGGAGCAGGTAGAAGGTTATGGCGAAGATTATTATACCCGTAAAGCGGTCGAGTTGCTGAAAGAGAACATTAAGAAGAAGGACATCGATATCCATCTCTTTAGCGGAGGTACCCAGACCAATCTGACCGCGCTGTCTGCGTTTTTGCGTCCGCATGAAGCGGCAATTGCAGCTAATACCGGTCATATCCTGGTGCATGAAACCGGCGCGATTGAGGCGACGGGTCACAAAATAATCAGCATTGAGGTTCAGGACGGCAAAATCGGCCCGGAACACTTGAAGACCGTTCTGGAGATCCACGCCGATGAACACATGGTGAAACCGAAGCTGGTTTACATTTCCAACCCGACCGAAATTGGCTCCATCTATAAAAAGAAGGAGTTGGCTGAACTGTCCCAATTCTGCCGCGAAAACCAACTGTTCCTGTACGTTGACGGTGCGCGCCTGGGCAGCGCTCTCTGCTCTAACGAGAACGATATGGAATTAAGTGATCTGGCCATGCTGGTTGACGCGTTTTATATCGGTGGCACTAAGAACGGGGCTTTGATGGGTGAAGCGCTAGTGATTTGTCGTGATTCTCTGAAGGAGGACTTCCGTTTTCACATGAAACAGAAAGGTGCCCTGCTGGCGAAAGGTCGTCTGCTTGGTATTCAGTTCCTGGAGCTGTTTAGAGACGGTTTGTACTTCGATCTTGCGACGCACGCCAACGAGATGGCTAGCCTCCTGCGTGAAGGTATTTCGCAAGCGGGTTACCTGTTCTTAACCCACAGCCCGAGCAATCAGATCTTCCCGATCCTGCCAAACGGCATTATCACGAAGCTGCAAGAAAAGTACTCCTTTTACGTGTGGAGCCAAGTTGATAGCGAACACTCTGCCATTCGTTTGGTCACCAGCTGGGCAACCAAAGAGGACGCAGTGCGCGAGTTCATCGAGGACCTGAAGGGCCTGTGCAATAAAAACAACATGTAA

SEQ ID NO:2

MYSFKNDYSEGAHPKILRALIETNLEQVEGYGEDYYTRKAVELLKENIKKKDIDIHLFSGGTQTNLTALSAFLRPHEAAIAANTGHILVHETGAIEATGHKIISIEVQDGKIGPEHLKTVLEIHADEHMVKPKLVYISNPTEIGSIYKKKELAELSQFCRENQLFLYVDGARLGSALCSNENDMELSDLAMLVDAFYIGGTKNGALMGEALVICRDSLKEDFRFHMKQKGALLAKGRLLGIQFLELFRDGLYFDLATHANEMASLLREGISQAGYLFLTHSPSNQIFPILPNGIITKLQEKYSFYVWSQVDSEHSAIRLVTSWATKEDAVREFIEDLKGLCNKNNM

作为优选，上述核苷酸序列和氨基酸序列来源于螺菌属(Pelosinus sp.)。进一步地，所述核苷酸序列来源于Pelosinus sp.的LTA基因。

一种重组表达质粒载体，包含上述的多核苷酸。

一种重组大肠杆菌，包含上述的重组表达质粒载体。

上述重组大肠杆菌的全细胞的制备方法，包括以下步骤：

上述L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

作为优选，所述对甲砜基苯丝氨酸合成的反应体系包括：甘氨酸、对甲砜基苯甲醛、氯化钠、5'-磷酸吡哆醛和所述的重组大肠杆菌的全细胞。

作为优选，反应温度为20-75℃，pH为7-10，反应时间为0.5-3h。

实施例1：重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a的构建

质粒的构建是由南京金斯瑞有限公司将来源于Pelosinus sp.的LTA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)进行密码子优化，然后克隆至载体pET-28a的BamHI和HindIII的限制性酶切位点之间，构建重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a(图1)。

实施例2：重组菌E.coli BL21/PsLTA-pET-28a的构建及培养将本发明构建的质粒载体PsLTA-pET-28a转化到E.coli DH5α的感受态细胞进行克隆，再提取质粒转化到E.coliBL21感受态细胞中，构建表达菌株进行蛋白表达。从平板上挑取单菌落接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基试管中，在37℃、220rpm下恒温震荡培养约12h后，按照1％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中。紫外分光光度法检测培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加0.2mM诱导剂IPTG诱导蛋白表达。在16℃、220rpm条件下诱导表达22h。

实施例3：L-苏氨酸醛缩酶PsLTA的蛋白表达

在4℃，12000rpm离心10min收集重组大肠杆菌菌体，每1g菌体悬浮于5mL的破胞缓冲液(50mM的K₂HPO₄，300mM的NaCl，5mM咪唑，10％甘油超声溶解后，pH＝8.0)中，在4℃条件下用低温超高压细胞破碎仪裂解细胞，在4℃、12000rpm离心30min分离，经SDS-PAGE验证蛋白表达，结果表明目的蛋白有可溶性表达(图2)。

实施例4：L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在25℃下催化合成L-对甲砜基苯丝氨酸如图3所示：采用30mL反应体系：向pH＝7.5的缓冲液(33mmol甘氨酸、2.7mmol对甲砜基苯甲醛、1.5mmol的NaCl)中加1.5μmol的PLP，2％菌体重悬液(1g菌体用5mL水重悬，体积比)。将上述酶催化反应体系在25℃下磁力搅拌反应2h，反应结束后在反应体系中加10倍体积的甲醇并4℃静置过夜来析出大部分的甘氨酸。酶在25℃下催化反应的HPLC色谱结果如图3，结果表明L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在25℃下能够催化合成L-对甲砜基苯丝氨酸，ee值>99％。

实施例5：L-苏氨酸醛缩酶PsLTA的最适反应温度的测定

采用1mL反应体系：向pH＝7.5的缓冲液(1.1mmol甘氨酸、0.09mmol对甲砜基苯甲醛、0.05mmol的NaCl)中加0.05μmol的PLP，2％菌体重悬液(1g菌体用5mL水重悬，体积比)。将上述酶催化反应体系分别在20、30、35、40、45、50、55、60、65、70和75℃下磁力搅拌反应0.5h，酶催化反应结果表明65℃时L-苏氨酸醛缩酶PsLTA具有较高催化活性(催化反应温度65℃的HPLC色谱结果如图4)，相比较其他的L-苏氨酸醛缩酶，该酶可耐受更高的反应温度。

实施例6：L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在55℃下的温度稳定性

首先分别将L-苏氨酸醛缩酶：WP_047941397.1、PsLTA(WP_038671764.1)、WP_094365954.1、WP_066825157.1、CCY83782.1于55℃水浴锅温育2h，然后冷却至室温。采用1mL反应体系：向pH＝7.5的缓冲液(1.1mmol甘氨酸、0.09mmol对甲砜基苯甲醛、0.05mmol的NaCl)中加0.05μmol的PLP，2％菌体重悬液(1g菌体用5mL水重悬，体积比)。将上述酶催化反应体系在25℃下磁力搅拌反应0.5h。酶催化反应结果表明L-苏氨酸醛缩酶PsLTA在55℃下温育2h后仍保留90％的催化活性(图5)，相比较其他四种酶，L-苏氨酸醛缩酶PsLTA具有更优的温度稳定性和催化活性，具有工业应用意义。

具体酶催化反应结果见表1(数据为催化合成产物L-对甲砜基苯丝氨酸的HPLC吸收峰面积)。

表1 L-苏氨酸醛缩酶在55℃下温度稳定性的酶催化反应HPLC色谱数据

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种耐高温的L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1041

<212> DNA

<213> 螺菌属(Pelosinus sp.)

<400> 1

atgtattcat ttaaaaatga ttacagtgaa ggcgcgcatc cgaaaatctt gcgggcactg 60

attgagacta atctggagca ggtagaaggt tatggcgaag attattatac ccgtaaagcg 120

gtcgagttgc tgaaagagaa cattaagaag aaggacatcg atatccatct ctttagcgga 180

ggtacccaga ccaatctgac cgcgctgtct gcgtttttgc gtccgcatga agcggcaatt 240

gcagctaata ccggtcatat cctggtgcat gaaaccggcg cgattgaggc gacgggtcac 300

aaaataatca gcattgaggt tcaggacggc aaaatcggcc cggaacactt gaagaccgtt 360

ctggagatcc acgccgatga acacatggtg aaaccgaagc tggtttacat ttccaacccg 420

accgaaattg gctccatcta taaaaagaag gagttggctg aactgtccca attctgccgc 480

gaaaaccaac tgttcctgta cgttgacggt gcgcgcctgg gcagcgctct ctgctctaac 540

gagaacgata tggaattaag tgatctggcc atgctggttg acgcgtttta tatcggtggc 600

actaagaacg gggctttgat gggtgaagcg ctagtgattt gtcgtgattc tctgaaggag 660

gacttccgtt ttcacatgaa acagaaaggt gccctgctgg cgaaaggtcg tctgcttggt 720

attcagttcc tggagctgtt tagagacggt ttgtacttcg atcttgcgac gcacgccaac 780

gagatggcta gcctcctgcg tgaaggtatt tcgcaagcgg gttacctgtt cttaacccac 840

agcccgagca atcagatctt cccgatcctg ccaaacggca ttatcacgaa gctgcaagaa 900

aagtactcct tttacgtgtg gagccaagtt gatagcgaac actctgccat tcgtttggtc 960

accagctggg caaccaaaga ggacgcagtg cgcgagttca tcgaggacct gaagggcctg 1020

tgcaataaaa acaacatgta a 1041

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 螺菌属(Pelosinus sp.)

<400> 2

Met Tyr Ser Phe Lys Asn Asp Tyr Ser Glu Gly Ala His Pro Lys Ile

1 5 10 15

Leu Arg Ala Leu Ile Glu Thr Asn Leu Glu Gln Val Glu Gly Tyr Gly

20 25 30

Glu Asp Tyr Tyr Thr Arg Lys Ala Val Glu Leu Leu Lys Glu Asn Ile

35 40 45

Lys Lys Lys Asp Ile Asp Ile His Leu Phe Ser Gly Gly Thr Gln Thr

50 55 60

Asn Leu Thr Ala Leu Ser Ala Phe Leu Arg Pro His Glu Ala Ala Ile

65 70 75 80

Ala Ala Asn Thr Gly His Ile Leu Val His Glu Thr Gly Ala Ile Glu

85 90 95

Ala Thr Gly His Lys Ile Ile Ser Ile Glu Val Gln Asp Gly Lys Ile

100 105 110

Gly Pro Glu His Leu Lys Thr Val Leu Glu Ile His Ala Asp Glu His

115 120 125

Met Val Lys Pro Lys Leu Val Tyr Ile Ser Asn Pro Thr Glu Ile Gly

130 135 140

Ser Ile Tyr Lys Lys Lys Glu Leu Ala Glu Leu Ser Gln Phe Cys Arg

145 150 155 160

Glu Asn Gln Leu Phe Leu Tyr Val Asp Gly Ala Arg Leu Gly Ser Ala

165 170 175

Leu Cys Ser Asn Glu Asn Asp Met Glu Leu Ser Asp Leu Ala Met Leu

180 185 190

Val Asp Ala Phe Tyr Ile Gly Gly Thr Lys Asn Gly Ala Leu Met Gly

195 200 205

Glu Ala Leu Val Ile Cys Arg Asp Ser Leu Lys Glu Asp Phe Arg Phe

210 215 220

His Met Lys Gln Lys Gly Ala Leu Leu Ala Lys Gly Arg Leu Leu Gly

225 230 235 240

Ile Gln Phe Leu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Leu Tyr Phe Asp Leu Ala

245 250 255

Thr His Ala Asn Glu Met Ala Ser Leu Leu Arg Glu Gly Ile Ser Gln

260 265 270

Ala Gly Tyr Leu Phe Leu Thr His Ser Pro Ser Asn Gln Ile Phe Pro

275 280 285

Ile Leu Pro Asn Gly Ile Ile Thr Lys Leu Gln Glu Lys Tyr Ser Phe

290 295 300

Tyr Val Trp Ser Gln Val Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Arg Leu Val

305 310 315 320

Thr Ser Trp Ala Thr Lys Glu Asp Ala Val Arg Glu Phe Ile Glu Asp

325 330 335

Leu Lys Gly Leu Cys Asn Lys Asn Asn Met

340 345

Claims

1.一种具有催化合成对甲砜基苯丝氨酸的活性和耐高温的L-苏氨酸醛缩酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码如权利要求1所述L-苏氨酸醛缩酶的多核苷酸，其特征在于，具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。

3.一种重组表达质粒载体，其特征在于：包含如权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组大肠杆菌，其特征在于：包含如权利要求3所述的重组表达质粒载体。

5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌的全细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目的基因克隆到载体pET-28a的BamHI和HindIII的限制性酶切位点之间，构建重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a；

S2：将S1中所述重组表达质粒载体PsLTA-pET-28a转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，培养得到重组菌E. coli BL21/PsLTA-pET-28a；

S3：收集S2中培养后的重组菌E. coli BL21/PsLTA-pET-28a，获得所述的重组大肠杆菌的全细胞。

6.如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以包含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组大肠杆菌的全细胞为催化剂，所述L-苏氨酸醛缩酶为所述重组大肠杆菌的全细胞通过基因工程手段表达。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述对甲砜基苯丝氨酸合成的反应体系包括：甘氨酸、对甲砜基苯甲醛、氯化钠、5'-磷酸吡哆醛和所述的重组大肠杆菌的全细胞。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，反应温度为20-75℃，pH为7-10，反应时间为0.5-3h。