CN112143718B

CN112143718B - 一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112143718B
Application number: CN202010364953.1A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 李珊珊; 陈倩; 石山; 李阳; 王鑫
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: CN112143718A

Abstract

本发明提供一种双功能酶生物催化剂，其具有羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个功能，能同时催化羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个生物转化过程，生物转化时间短，转化催化效率高，同时减少参与(S)‑环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量。本发明双功能酶生物催化剂通过基因重组技术，质粒表达制得。将本发明的双功能酶生物催化剂，用(S)‑环丙基甘氨酸的生物催化不对称合成，无需按照化学反应计量添加昂贵的辅酶NADH。

Description

一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用。

背景技术

非天然氨基酸是一类非常重要的有机化合物，是合成多种手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的重要原料和关键中间体。特别是，(S)-环丙基甘氨酸(分子式：C₅H₉NO₂，分子量为：115.13，CAS：49606-99-7)是一种含环丙基的非天然氨基酸，被广泛用于多肽类似物和药物设计与合成(参见文献Chem.Rev.,2007,107,4538-4583；Russ.Chem.Bull.,2013,62,928-952；J.Med.Chem.,2016,59,8712-8756)。(S)-环丙基甘氨酸主要有化学合成和酶拆分两种制备途径。化学合成(S)-环丙基甘氨酸，如利用Strecker反应引入手性中心(J.Med.Chem.,2009,52,7653-7668；Org.Process Res.Dev.,2010,14,1221-1228)或利用Strecker型手性辅助试剂合成(J.Org.Chem.,1983,48(26),5369-5373)，合成过程须使用昂贵的原料和剧毒KCN以及大量的有机溶剂，同时制备工艺路线较长，反应时间长，收率较低。酶拆分制备(S)-环丙基甘氨酸，如利用Acylase I酶(J.Am.Chem.Soc.,1989,111,6354-6364)或Papain酶(Adv.Synth.Catal.,2006,348,1071-1078)拆分消旋体进行分离合成，酶拆分的缺陷在于最大理论产率只有50％，故这些方法难以实现工业化。

生物催化合成非天然氨基酸具有立体选择性高、催化活性高、环境友好、反应条件温和等独特优势。Hanson等(Org.Process Res.Dev.,2012,16,464-469)选用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶借助还原型辅酶(NADH)，利用酶偶联方法(如图1所示)将环丙基羰基乙酸还原氨化制备(S)-环丙基甘氨酸。酶偶联方法须分别表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，而羰基还原氨化和辅酶再生在两个独立菌体中完成，辅酶必须在两个不同菌体之间转运扩散，但受菌体自身结构限制和自由扩散影响，辅酶在两个菌体间的传质阻力导致生物转化时间长，催化效率低。同时需要两种酶才能完成生物转化过程，导致成本增加，不利于工业化。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种双功能酶生物催化剂。

本发明的目的是这样实现的：

一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明双功能酶生物催化剂具有羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个功能，能同时催化羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个生物转化过程，生物转化时间短，转化催化效率高，同时减少参与(S)-环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量。

本发明双功能酶生物催化剂为同时具有羰基还原氨化和辅酶再生能力的高效表达双功能酶的重组大肠杆菌全细胞。

本发明双功能酶在大肠杆菌中高表达，并直接以此全细胞作为生物催化剂，在单个重组大肠杆菌全细胞内同时完成羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个过程(如图2所示)，本发明双功能酶生物催化剂具有辅酶(NADH)再生能力，为羰基还原氨化过程提供所需辅酶，实现辅酶循环利用以降低生产成本。本发明减少参与(S)-环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量，可降低酶的使用成本。

根据本发明的第二方面，本发明的另一目的在于提供上述双功能酶生物催化剂的制备方法。

根据本发明的一个实施方案，上述双功能酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：

步骤(1)

用基因重组技术，将编码双功能酶(TLF)的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf。

步骤(2)

将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶TLF，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。

进一步，上述方法中，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间为24-72小时。

进一步，上述方法中，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度为16-30℃。

进一步，所述卡拉霉素的浓度为50-200μg/L；所述诱导工程菌表达双功能酶TLF的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，浓度为0.4-1.0mM。

本发明所述的LB液体培养基为本领域所熟知的培养基，含1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠。本发明所述的LB液体培养基的pH为7.0-8.0。本发明所述的缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM。

根据本发明的第三方面，本发明的另一目的在于提供上述双功能酶生物催化剂在合成(S)-环丙基甘氨酸中的应用。

根据本发明的第四方面，本发明的另一目的在于提供一种(S)-环丙基甘氨酸的合成方法，该方法使用上述双功能酶生物催化剂，催化不对称合成(S)-环丙基甘氨酸。

根据本发明的一个实施方案，一种(S)-环丙基甘氨酸的生物合成方法，其特征在于：将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶(NADH)，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液的pH值为7.2-7.4。

根据本发明的一个实施方案，所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM。

具体的，一种(S)-环丙基甘氨酸的生物催化合成方法，包括如下步骤：

步骤(1)

步骤(2)

将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导工程菌表达双功能酶TLF，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，制得双功能酶生物催化剂；

步骤(3)

将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶(NADH)，辅酶的浓度为0.1-0.3mM，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl 137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，pH值为7.2-7.4。

有益效果：

1、本发明提供一种新的双功能酶，具有羰基还原氨化和辅酶再生能力，能同时催化羰基还原氨化和辅酶再生两个生物转化过程。

2、使用本发明的双功能酶生物催化剂，用于(S)-环丙基甘氨酸的生物催化不对称合成，可同时完成羰基还原氨化和辅酶原位再生，实现辅酶循环再利用，无需按照化学反应计量添加昂贵的辅酶NADH。

3、本发明的功能酶生物催化剂，催化活性高，转化底物的浓度为80-200g/L，工艺条件温和，成本低。

4、使用本发明双功能酶生物催化剂不对称合成(S)-环丙基甘氨酸，收率为75-90％，转化率为80-95％，对映体ee值大于99.9％，经济效益大。本发明生物催化不对称合成(S)-环丙基甘氨酸所用介质为水，革除使用有机溶剂，环境友好，符合绿色化学的要求，可以节约资源，适合工业化。

附图说明

图1是酶偶联法合成(S)-环丙基甘氨酸的生物催化过程；

图2是双功能酶在单个重组大肠杆菌全细胞内同时完成羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生过程；

图3是双功能酶表达载体的结构；

图4是双功能酶的SDS-PAGE分析；

图5是温度对双功能酶生物催化剂的催化活性影响；

图6是pH值对双功能酶生物催化剂的催化活性影响；

图7是辅酶浓度对双功能酶生物催化剂的催化活性影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。

实施例1

酶活性测定

双功能酶中羰基还原氨化活性的测定：

标准反应混合体系：适量酶液，0.2mM NADH,5mM环丙基羰基乙酸钾，0.75M甲酸铵溶液，pH 8.75，测定温度40℃，总体积1mL。在λ＝340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义：40℃，1min内转化1μmol NADH所需的酶量。

双功能酶中辅酶再生活性的测定：

标准反应混合体系：适量酶液，1mM辅酶(NADH)，100mM甲酸氨，pH8.0，测定温度40℃，总体积1mL。在λ＝340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义：40℃，1min内转化1μmolNADH所需的酶量。

实施例2

表达双功能酶

表达双功能酶的质粒pET28a-tlf结构如图3。取质粒转化感受态大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，接种含100μg/mL卡拉霉素的LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠和1.5％琼脂糖)，37℃过夜培养。挑选单克隆菌落接种LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠)，37℃，转速150rpm，过夜培养。将培养液按1:50接种LB液体培养基，37℃，转速150rpm，培养至OD₆₀₀约为0.6-1.0。加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导自给式双功能融合酶表达，培养温度为16℃，转速150rpm，培养时间48小时。4℃，10000rpm离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，得双功能酶全细胞生物催化剂。本发明双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体如下：

对实施例2制备的双功能酶生物催化剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

SDS-PAGE分析结果见附图4，图中M为标准蛋白质分子量；L₁为未诱导的重组大肠杆菌；L_2-3为重组大肠杆菌的细胞裂解液，在分子量70-100kDa之间，出现明显的蛋白质条带，即为本发明双功能酶。

诱导重组大肠杆菌表达双功能酶

实施例3

参照实施例2的工程菌培养方法，考察诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度、培养时间、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度对双功能酶活性的影响。

诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度对双功能酶活性的影响结果见附表1。当培养温度从16℃上升到37℃时，双功能酶的活性降低。但当温度超过25℃时，双功能酶的活性明显减小。表明，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶需低温，适宜温度为16℃。

表1诱导重组大肠杆表达双功能酶的培养温度对双功能酶活性的影响

诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间对双功能酶活性的影响结果见附表2。当诱导时间从24h增加到48h时，双功能酶的活性增大。当诱导培养时间超过48h时，双功能酶的活性明显减小。表明，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的适宜时间为48h。

表2诱导重组大肠杆表达双功能酶的培养时间对双功能酶活性的影响

诱导剂IPTG浓度对双功能酶活性的影响结果见附表3。当IPTG的浓度增大时，双功能酶的活性降低，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的适宜IPTG浓度为0.4mM。

表3诱导剂IPTG浓度对双功能酶活性的影响

实施例4

双功能酶生物催化剂催化不对称合成(S)-环丙基甘氨酸：

反应体系：0.4g生物催化剂(参照实施例2制备的双功能酶催化剂)，3.2g环丙基羰基乙酸钾，13.28g甲酸铵，20mg辅酶(NADH)，缓冲溶液A(10mM磷酸缓冲盐溶液，PBS，含NaCl137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，pH值为7.2-7.4)，总体积20mL。反应温度40℃，以100rpm连续搅拌，反应过程中pH控制在8.0左右。用2,4-二硝基苯肼监控反应过程。反应结束后，向反应液中加入适量三氯乙酸至无沉淀生成，活性炭过滤，得到澄清溶液。将滤液加到装填有强酸型阳离子交换树脂001X7的树脂柱上，用14％氨水从树脂上洗脱产物，收集洗脱液并用旋转蒸发仪浓缩，得到淡黄色固体。将上述固体重结晶，得到白色固体((S)-2-环丙基甘氨酸)。收率85％。

¹HNMR(600MHz，D₂O)分析结果：δ2.95(1H,s),0.96-1.02(1H,m),0.55-0.62(2H,m),0.45-0.47(1H,m),0.27-0.32(1H,m)。

¹³CNMR(600MHz，D₂O)分析结果：δ174.24(C),59.51(CH),11.98(CH),3.88(CH2),3.14(CH2)。

产物(S)-2-环丙基甘氨酸的理论分子量为：115.13，质谱鉴定为：116.1。HPLC测定ee值大于99.9％。

参照实施例4的合成方法，考察温度、pH值和辅酶(NADH)浓度对双功能酶生物催化剂的催化活性影响。

温度对双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图5。当转化温度从20℃上升到40℃时，双功能酶的催化活性增大。当温度超过40℃时，双功能酶的催化活性明显降低，表明双功能酶生物催化剂适宜的温度为40℃。

pH对双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图6。转化温度40℃，当pH值从5.0上升到8.0时，双功能酶的催化活性增大，并达到最大值。当pH值超过8.0时，双功能酶的催化活性降低。表明双功能酶生物催化剂适宜的pH为8.0左右。

辅酶浓度对双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图7。当辅酶浓度从0.1mM增加到0.2mM时，双功能酶的催化活性增大。当超过0.2mM时，催化剂活性无明显变化。表明，双功能酶生物催化剂适宜的辅酶浓度为0.2mM。

<110>重庆医科大学

<120>一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

<140>2020103649531

<141>2020-04-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211> 742

<212>PRT

<213>人工序列（人工序列）

<220>

<223>氨基酸序列

<400>1

His His His His His His Met Lys Ile Phe Asp Tyr Met Glu Lys

1 5 10 15

Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val Met Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly

20 25 30

Leu Lys Ala Ile Ile Cys Ile His Val Thr Thr Leu Gly Pro Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Met Arg Met Trp Thr Tyr Ala Ser Glu Glu Glu Ala

50 55 60

Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Gly Arg Gly Met Thr Tyr Lys Asn

65 70 75

Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Thr Val Ile Ile

80 85 90

Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe Arg Ala Leu

95 100 105

Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu

110 115 120

Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Glu Glu

125 130 135

Thr Arg Tyr Val Thr Gly Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

140 145 150

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys

155 160 165

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Asp Asp Ser Leu Glu Gly Lys

170 175 180

Val Val Ala Val Gln Gly Val Gly His Val Ala Tyr Glu Leu Cys

185 190 195

Lys His Leu His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile

200 205 210

Asn Lys Glu Asn Ala Asp Arg Ala Val Gln Glu Phe Gly Ala Glu

215 220 225

Phe Val His Pro Asp Lys Ile Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ile Phe

230 235 240

Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Glu

245 250 255

Arg Leu Lys Cys Lys Val Val Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu

260 265 270

Lys Glu Glu Arg His Gly Lys Met Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val

275 280 285

Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val

290 295 300

Ala Asp Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys

305 310 315

Val Glu Gly Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Val Phe Glu Ile Ala

320 325 330

Lys Arg Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Asp Arg Met Ala

335 340 345

Glu Glu Arg Ile Glu Met Met Arg Lys Thr Arg Ser Thr Phe Leu

350 355 360

Gln Asp Gln Arg Asn Leu Ile Asn Phe Asn Asn Lys Gly Gly Gly

365 370 375

Gly Ser Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Ser Ala Gly Lys His

380 385 390

Ala Ala Asp Glu Pro Lys Leu Tyr Gly Cys Ile Glu Asn Glu Leu

395 400 405

Gly Ile Arg Gln Trp Leu Glu Lys Gly Gly His Glu Leu Val Thr

410 415 420

Thr Ser Asp Lys Glu Gly Glu Asn Ser Glu Leu Glu Lys His Ile

425 430 435

Pro Asp Ala Asp Val Ile Ile Ser Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr

440 445 450

Ile Thr Lys Glu Arg Ile Gln Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Leu

455 460 465

Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile

470 475 480

Glu Gln Asn Gly Leu Asp Ile Ser Val Leu Glu Val Thr Gly Ser

485 490 495

Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Ile Leu Asn

500 505 510

Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln Ile Val Asn His

515 520 525

Gly Trp Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr Asp Ile Glu

530 535 540

Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly Tyr Arg

545 550 555

Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu Tyr

560 565 570

Tyr Asp Tyr Gln Gly Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

575 580 585

Ala Arg Arg Val Asp Thr Val Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp

590 595 600

Val Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu

605 610 615

Val Asn Lys Glu Leu Leu Ala Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu

620 625 630

Val Asn Thr Ala Arg Gly Ala Ile Cys Asn Ala Gln Asp Val Ala

635 640 645

Asp Ala Val Ala Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val

650 655 660

Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met

665 670 675

Arg Asn Lys Tyr Gly Tyr Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser

680 685 690

Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln Val Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys

695 700 705

Asn Ile Leu Asn Ser Phe Leu Thr Lys Lys Phe Asp Tyr Arg Pro

710 715 720

Gln Asp Val Ile Leu Leu Asn Gly Lys Tyr Lys Thr Lys Ala Tyr

725 730 735

Gly Asn Asp Lys Lys Val Ala

740

Claims

1.一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂为同时具有羰基还原氨化和辅酶再生能力的高效表达双功能酶的重组大肠杆菌全细胞，所述双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述双功能酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：

步骤(1)

用基因重组技术，将编码权利要求1中所述双功能酶的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf；

步骤(2)

将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间为24-72小时。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度为16-30℃。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的卡拉霉素的浓度为50-200μg/L；所述诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.4-1.0mM。

6.权利要求1所述双功能酶生物催化剂在合成(S)-环丙基甘氨酸中的应用。

7.一种(S)-环丙基甘氨酸的合成方法，其特征在于：将权利要求1所述双功能酶生物催化剂分散在pH值为7.2-7.4的缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶NADH，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：辅酶的浓度为0.1-0.3mM。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶NADH，辅酶的浓度为0.1-0.3mM，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液PBS，含NaCl 137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，pH值为7.2-7.4。