CN112063644A - 一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤指一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用，表达载体由环二肽合成酶的基因与Pet28a(+)载体连接构成，其构建方法包括：1)选择环二肽合成酶的基因片段进行合成；2)环二肽合成酶基因与Pet28a(+)载体进行连接；3)连接产物转化入DH5a感受态细胞中；4)鉴定为阳性的菌落在含Amp的液体LB培养基中培养后提质粒；5)将提取的质粒转化入大肠杆菌感受态BL21中；本发明利用Pet28a(+)载体，构建出一种高效的环二肽合成酶表达载体，利用IPTG诱导获得高浓度的环二肽合成酶合成具有生物活性的环二肽，实现简化操作程序的效果，并解决环二肽的工业化生产成本高和收集工序昂贵和复杂等问题。

Description

一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤指一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用。
背景技术
二酮哌嗪类化合物是由两个氨基酸缩合而成的最小的环肽，即环二肽，呈六元环状，结构稳定；环二肽具有丰富的生物活性，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌具有抑制作用，同时还具备抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、神经保护、抗疟疾、抗朊病毒、抗高血糖等作用。近年来，有研究者发现环二肽还可作为细胞与细胞之间的信号交流分子，基于环二肽这些丰富的生物活性和潜在的利用价值，其已引起人们广泛的关注，具有广阔的应用前景。
目前，生产环二肽有化学合成和生物合成两种方式。生物合成环二肽主要有非核糖体合成酶途径和环二肽合成酶(CDPS)途径，这两种途径的区别在于氨基酸前体的活化方式不同，环二肽合成酶途径是一种新型合成环二肽途径，CDPSs本身不具备活化氨基酸的催化活性,而是直接以细胞内氨酰-tRNAs(aa-tRNAs)作为底物,竞争蛋白质生物合成，所需的aa-tRNAs合成次级代谢产物,将初级代谢和次级代谢直接关联以氨酰-tRNAs作为底物合成环二肽，其后修饰过程发生在环二肽形成之后。
近年来人们在环二肽有机合成方面开展了大量的研究工作，建立了组合化学、固相合成和液相合成等一系列方法与技术，并成功获得了具有多种药理活性的环二肽。与有机合成相比，有关环二肽生物合成的研究报道却屈指可数，现有技术中存在利用LBP-K06菌株中的环二肽合成酶基因构建出一种原核表达体系，但是表达量低，采用硫酸铵沉淀的方法收集环二肽合成酶，合成的环二肽采用高效液相色谱的方法进行鉴定，操作复杂，成本高，不利于工业化生产。总的来说，目前环二肽合成方法中，采用化学合成操作复杂，价格昂贵，不利于工业化；而采用生物合成过程中，通过现有的培养基和发酵方式产生环二肽产量普遍较低，分离鉴定困难，工业合成成本高。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开生物技术领域，尤指一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体由环二肽合成酶的基因与Pet28a(+)载体连接构成。
优选地，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：
1)选择环二肽合成酶的基因片段进行合成；
2)环二肽合成酶基因与Pet28a(+)载体进行连接；
3)连接产物转化入DH5a感受态细胞中；
4)鉴定为阳性的菌落在含Amp的液体LB培养基中培养后提质粒；
5)将提取的质粒转化入大肠杆菌感受态BL21中。
优选地，所述表达载体的构建方法中的步骤1)进一步包括：
选择植物乳杆菌LBP-K10中编码环二肽合成酶的基因片段进行合成，在其N端引入His标签，选用Nco I和Xho I酶切位点，在Nco I后加入碱基GC，在Xho I前加入终止密码子TAA，以构建Nco I+GC+His+CDPS+TAA+Xho I原核表达载体，序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述表达载体的构建方法中的步骤2)进一步包括：
2-1)将以上步骤合成后的Puc19-CDPS菌液在LB营养基的平板上划板进行活化；
2-2)取活化后获得的单菌落于10mL高压灭菌后的LB培养基中，培养后提质粒；
2-3)将含有Pet28a(+)载体的大肠杆菌，接种于LB培养基中，培养后提质粒；
2-4)采用NcoⅠ和XhoⅠ对上述两种质粒进行双酶切,用T4连接酶连接双酶切后的环二肽合成酶基因和Pet28a(+)载体。
优选地，所述表达载体的构建方法中的步骤3)进一步包括：
3-1)从-70℃的冰箱中取出DH5a感受态细胞100uL/支，置于冰上融化，加入10uL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；
3-2)冰浴后再42℃热应激90s，冰浴5min，再向EP管中加入500uL预热至37℃的LB培养基；
3-3)在离心力4000×g下，离心3-5min，丢弃大部分上清，剩余80uL液体，重悬细胞后，涂布于含Amp的LB培养基平板上；挑取长出的菌落，鉴定为阳性的菌落。
一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体在环二肽酶促合成的应用。
优选地，所述表达载体应用于：a)环二肽合成酶的诱导表达；b)酶促合成环二肽。
优选地，所述环二肽合成酶的诱导表达包括如下：
a1)将获得的CDPS-Pet28a(+)-BL21单菌落接种于10mL高压灭菌后的新鲜LB培养基中，然后按照1％的接菌量接种于100mL的LB培养基中，当OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，进行诱导；
a2)诱导完成后，离心收集菌体，并将菌体溶解在200mM的PBS溶液中，超声破碎后离心去细胞碎片，收集上清；
a3)纯化目的蛋白：将1mL Ni Sepharose 6Fast Flow放于空柱中，用两倍体积的Lysis buffer洗涤柱子；再将目的蛋白上清过柱；然后用5mL Wash buffer洗脱两次，去掉杂蛋白；最后用Elution buffer洗脱目的蛋白。
优选地，所述酶促合成环二肽包括如下：
b1)建立酶促合成体系；
b2)采用薄层层析的方法，对体系进行鉴定，鉴定其中是否含有环状多肽。
本发明的有益效果体现在：本发明利用Pet28a(+)载体，构建出一种高效的环二肽合成酶表达载体，利用IPTG诱导获得高浓度的环二肽合成酶合成具有生物活性的环二肽，实现简化操作程序的效果，并解决环二肽的工业化生产成本高和收集工序昂贵和复杂等问题。
本发明中，通过利用大肠杆菌表达系统诱导表达一种高活性环二肽合成酶，建立酶促合成体系，合成具有生物活性的环二肽，简化操作步骤，降低环二肽的工业化生产成本；而本发明构建一种原核表达载体，使用大肠杆菌诱导表达环二肽合成酶，以可溶的形式表达，操作简便，表达量高，从而建立酶促合成体系，用TLC方法检测出成功合成环二肽，并对大肠杆菌具有抑菌活性；同时，诱导大肠杆菌过表达，收集表达后的上清，用乙酸乙酯萃取，对萃取液进行旋干浓缩，检测出上清中也具有环二肽。
附图说明
图1是本发明的技术路线图。
图2是本发明的诱导大肠杆菌表达CDPS后SDS-PAGE图。
图3是本发明的表达CDPS纯化后SDS-PAGE图。
图4是本发明的酶促合成后的样品薄层层析结果。
图5是本发明的大肠杆菌过表达后上清的薄层层析结果。
图6是本发明的大肠杆菌过表达后萃取上清的抑菌结果。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
实施例一：
本实施例提供一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，所述表达载体由环二肽合成酶(CDPS)的基因与Pet28a(+)载体连接构成，且表达载体的构建方法包括以下步骤：
1)选择环二肽合成酶(CDPS)的基因片段进行合成：
选择植物乳杆菌LBP-K10中编码环二肽合成酶(CDPS)的基因片段进行合成，为方便纯化，在其N端引入His标签，选用Nco I和Xho I酶切位点，为避免移码情况，在Nco I后加入碱基GC，同时为使得CDPS获得获得天然的C端，在Xho I前加入终止密码子TAA，以构建NcoI+GC+His+CDPS+TAA+Xho I原核表达载体，序列如SEQ ID NO：1所示：
SEQ ID NO：1：
CCATGGGCCATCATCATCATCATCATGCTAAACTGGTTCTGATCCGTCACGGTCAGTCTGAATGGAACCTGTCTAACCAGTTCACCGGTTGGGTTGACGTTGACCTGTCTGAAAAAGGTGTTGAAGAAGCTAAAGCTGCTGGTCAGAAAGTTAAAGAAGCTGGTCTGGAATTCGACTACGCTTTCACCTCTGTTCTGACCCGTGCTATCAAAACCCTGCACTACGTTCTGGAAGAATCTGACCAGCTGTGGATCCCGGAAACCAAAACCTGGCGTCTGAACGAACGTCACTACGGTGCTCTGCAGGGTCTGAACAAAAAAGAAACCGCTGAAAAATACGGTGACGACCAGGTTCACATCTGGCGTCGTTCTTACGACGTTCTGCCGCCGCTGCTGTCTGCTGACGACGAAGGTTCTGCTGTTAACGACCGTCGTTACGCTGACCTGGACCCGAACATCGTTCCGGGTGGTGAAAACCTGAAAGTTACCCTGGAACGTGTTATGCCGTTCTGGGAAGACCAGATCGCTCCGAAACTGCTGGACGGTAAAAACGTTATCATCGCTGCTCACGGTAACTCTCTGCGTGCTCTGTCTAAATACATCGAACAGATCTCTGACGACGACATCATGGACCTGGAAATGGCTACCGGTGAACCGGTTGTTTACGACTTCGACGAAAAACTGAAAGTTCTGGGTAAAGAAAAACTGGGTAAATAACTCGAG；
2)环二肽合成酶(CDPS)基因与Pet28a(+)载体进行连接：
2-1)将以上步骤合成后的Puc19-CDPS菌液在LB营养基的平板上划板进行活化，温度为37℃，时间为14h；LB培养基的成分：1％Tryptone，1％Nacl，0.5％Yeast extract，pH＝7.4；
2-2)取活化后获得的单菌落于10mL高压灭菌后的LB培养基中，灭菌条件为：121℃，20min,培养条件为：37℃，200rpm，培养10h，培养后提质粒；
2-3)将含有Pet28a(+)载体的大肠杆菌，接种于LB培养基中，培养条件为：37℃，200rpm，培养10h，培养后提质粒；
2-4)采用NcoⅠ和XhoⅠ对上述两种质粒进行双酶切，温度时间：37℃，1h,用T4连接酶连接双酶切后的环二肽合成酶(CDPS)基因和Pet28a(+)载体，在16℃条件下过夜连接；
3)连接产物转化入DH5a感受态细胞中：
3-1)从-70℃的冰箱中取出DH5a感受态细胞100uL/支，置于冰上融化，加入10uL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；
3-2)冰浴后再42℃热应激90s，冰浴5min，再向EP管中加入500uL预热至37℃的LB培养基，条件为：37℃，200rpm，1h；
3-3)在离心力4000×g下，离心3-5min，丢弃大部分上清，剩余80uL液体，重悬细胞后，涂布于含Amp(100ug/ml)的LB培养基平板上；条件为：37℃倒置培养14h；挑取长出的菌落，鉴定为阳性的菌落；
4)鉴定为阳性的菌落在含Amp(100ug/ml)的液体LB培养基中培养后提质粒；培养条件为：37℃，200rpm，培养10h；
5)将提取的质粒转化入大肠杆菌感受态BL21中。
实施例二：
本实施例提供一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，所述表达载体在环二肽酶促合成的应用，应用于：a)环二肽合成酶(CDPS)的诱导表达；
所述环二肽合成酶(CDPS)的诱导表达包括如下：
a1)将获得的CDPS-Pet28a(+)-BL21单菌落接种于10mL高压灭菌后的新鲜LB培养基中，培养基：100ug/ml Amp,37℃，180rpm，培养12h，然后按照1％的接菌量接种于100mL的LB培养基(100ug/ml Amp)中，温度为37℃，180rpm，当OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，进行诱导，温度为37℃，诱导4h；
a2)诱导完成后，在离心力6000×g，时间10min下离心收集菌体，并将菌体溶解在200mM的PBS溶液中，超声破碎(35％)20min，破碎完之后，8000×g,10min离心，然后离心去细胞碎片，收集上清；
a3)纯化目的蛋白：将1mL Ni Sepharose 6Fast Flow(GE Healthcare)放于空柱中，用两倍体积的Lysis buffer(50mM NaH2PO4,300mM Nacl,10mM咪唑，pH＝8.0)洗涤柱子；再将目的蛋白上清过柱；然后用5mL Wash buffer(50mM NaH2PO4,300mM Nacl,20mM咪唑,pH＝8.0)洗脱两次，去掉杂蛋白；最后用Elution buffer(50mM NaH2PO4,300mM Nacl,300mM咪唑,pH＝8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE鉴定如图3所示。
实施例三：
本实施例提供一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，所述表达载体在环二肽酶促合成的应用，应用于：b)酶促合成环二肽；
所述酶促合成环二肽包括如下：
b1)建立酶促合成体系；
酶促合成体系如下：
Figure BDA0002679251440000081
在上述体系中加入CDPS合成酶100ul,设置阴性对照，37℃静置4h后，取样做薄层层析(TLC)；
b2)采用薄层层析的方法，对体系进行鉴定，鉴定其中是否含有环状多肽，方法如下：
取两块层析硅胶板，分别标记A、B，并在硅胶板离底部约1.5cm处的中心点样；
点样时应采用经酒精灯拉制的毛细玻璃管，每个样品应反复多次点样，且等上一次的样品完全干透后再点下一次，防止样品点扩散过大，影响层析效果；
配制展开液(流动相)，配方为三氯甲烷：甲醇：水＝65:25:4的混合液；
倒入适量展开液至展开缸中，放入点好样品的硅胶板，将点有样品端斜放入展开液中，注意展开液不能没过样品点：
密封，展开40min，展开缸外放置一个冰袋，降低展开缸温度，使各组分展开效果更好；
展开完成后取出硅胶板，待板上的展开液完全挥发后，A板直接喷洒0.3％茚三酮进行显色；
再将展开后的B板放入预先放有小烧杯的耐热密闭容器中，往小烧杯中加入1.5mL浓盐酸，密封容器，烘箱中100℃进行原位酸水解2h；
展开后经茚三酮显色，将A、B板进行对比，发现A、B板离原点约1.5cm处均出现显色点，表明该点物质存在游离的α-氨基，可能为线性多肽；而经过原位酸水解处理过的B板中出现了A板没有的红色点(白圈所示)，说明该点物质本身不存在游离的α-氨基，其结构可能为α-氨基闭合的肽环，经过酸水解后出现了游离的氨基酸，并与茚三酮反应显色(图4)，表明CDPS合成酶成功合成环肽。
实施例四：
大肠杆菌过表达产生环二肽：研究表明，CDPS转染的大肠杆菌培养物滤液萃取物显示出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌作用活性，而对照组则没有；这些数据表明大肠杆菌中的CDPS转染导致功能性目标CDPs表达；同时鉴于酶催化试验效率低下，设计pET28a-CDPS-BL21的过表达试验，条件为37℃，IPTG诱导4h；设置氨基酸组及空质粒组，氨基酸组中Phe/Leu/Val含量均为8mM，Pro组为16mM；上清用等体积的乙酸乙酯萃取两次，对萃取液进行旋干浓缩，进行抑菌活性及检测，同时进行薄层层析，观测结果如图5和图6。
如图所示，取大肠杆菌诱导表达后的上清做薄层层析实验，诱导表达后的上清层析实验之后出现明显的红色斑块，表明CDPS成功合成环肽。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学；广东中山市茂辉生物科技有限公司
<120> 一种环二肽合成酶的高效原核表达载体及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 722
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
CCATGGGCCATCATCATCATCATCATGCTAAACTGGTTCTGATCCGTCACGGTCAGTCTGAATGGAACCTGTCTAACCAGTTCACCGGTTGGGTTGACGTTGACCTGTCTGAAAAAGGTGTTGAAGAAGCTAAAGCTGCTGGTCAGAAAGTTAAAGAAGCTGGTCTGGAATTCGACTACGCTTTCACCTCTGTTCTGACCCGTGCTATCAAAACCCTGCACTACGTTCTGGAAGAATCTGACCAGCTGTGGATCCCGGAAACCAAAACCTGGCGTCTGAACGAACGTCACTACGGTGCTCTGCAGGGTCTGAACAAAAAAGAAACCGCTGAAAAATACGGTGACGACCAGGTTCACATCTGGCGTCGTTCTTACGACGTTCTGCCGCCGCTGCTGTCTGCTGACGACGAAGGTTCTGCTGTTAACGACCGTCGTTACGCTGACCTGGACCCGAACATCGTTCCGGGTGGTGAAAACCTGAAAGTTACCCTGGAACGTGTTATGCCGTTCTGGGAAGACCAGATCGCTCCGAAACTGCTGGACGGTAAAAACGTTATCATCGCTGCTCACGGTAACTCTCTGCGTGCTCTGTCTAAATACATCGAACAGATCTCTGACGACGACATCATGGACCTGGAAATGGCTACCGGTGAACCGGTTGTTTACGACTTCGACGAAAAACTGAAAGTTCTGGGTAAAGAAAAACTGGGTAAATAACTCGAG 722

Claims (9)

1.一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体由环二肽合成酶的基因与Pet28a(+)载体连接构成。
2.根据权利要求1所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：
1)选择环二肽合成酶的基因片段进行合成；
2)环二肽合成酶基因与Pet28a(+)载体进行连接；
3)连接产物转化入DH5a感受态细胞中；
4)鉴定为阳性的菌落在含Amp的液体LB培养基中培养后提质粒；
5)将提取的质粒转化入大肠杆菌感受态BL21中。
3.根据权利要求2所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法中的步骤1)进一步包括：
选择植物乳杆菌LBP-K10中编码环二肽合成酶的基因片段进行合成，在其N端引入His标签，选用Nco I和Xho I酶切位点，在Nco I后加入碱基GC，在Xho I前加入终止密码子TAA，以构建Nco I+GC+His+CDPS+TAA+Xho I原核表达载体，序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求2所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法中的步骤2)进一步包括：
2-1)将以上步骤合成后的Puc19-CDPS菌液在LB营养基的平板上划板进行活化；
2-2)取活化后获得的单菌落于10mL高压灭菌后的LB培养基中，培养后提质粒；
2-3)将含有Pet28a(+)载体的大肠杆菌，接种于LB培养基中，培养后提质粒；
2-4)采用NcoⅠ和XhoⅠ对上述两种质粒进行双酶切，用T4连接酶连接双酶切后的环二肽合成酶基因和Pet28a(+)载体。
5.根据权利要求2所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法中的步骤3)进一步包括：
3-1)从-70℃的冰箱中取出DH5a感受态细胞100uL/支，置于冰上融化，加入10uL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；
3-2)冰浴后再42℃热应激90s，冰浴5min，再向EP管中加入500uL预热至37℃的LB培养基；
3-3)在离心力4000×g下，离心3-5min，丢弃大部分上清，剩余80uL液体，重悬细胞后，涂布于含Amp的LB培养基平板上；挑取长出的菌落，鉴定为阳性的菌落。
6.根据权利要求1～5所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体在环二肽酶促合成的应用。
7.根据权利要求6所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体应用于：a)环二肽合成酶的诱导表达；b)酶促合成环二肽。
8.根据权利要求7所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，其特征在于，所述环二肽合成酶的诱导表达包括如下：
a1)将获得的CDPS-Pet28a(+)-BL21单菌落接种于10mL高压灭菌后的新鲜LB培养基中，然后按照1％的接菌量接种于100mL的LB培养基中，当OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，进行诱导；
a2)诱导完成后，离心收集菌体，并将菌体溶解在200mM的PBS溶液中，超声破碎后离心去细胞碎片，收集上清；
a3)纯化目的蛋白：将1mL Ni Sepharose 6Fast Flow放于空柱中，用两倍体积的Lysisbuffer洗涤柱子；再将目的蛋白上清过柱；然后用5mL Wash buffer洗脱两次，去掉杂蛋白；最后用Elution buffer洗脱目的蛋白。
9.根据权利要求7所述的一种环二肽合成酶的高效原核表达载体的应用，其特征在于，所述酶促合成环二肽包括如下：
b1)建立酶促合成体系；
b2)采用薄层层析的方法，对体系进行鉴定，鉴定其中是否含有环状多肽。
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