CN1353757A

CN1353757A - α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸的微生物学生产方法

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Publication number: CN1353757A
Application number: CN00808250A
Authority: CN
Inventors: S·德克尔; M·A·马拉希尔; P·J·L·M·夸伊德弗利格; T·松克
Original assignee: Holland Sweetener Co VOF
Current assignee: Holland Sweetener Co VOF
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2002-06-12
Also published as: BR0010398A; JP2002539835A; EP1165799A1; MXPA01009875A; AU3843900A; KR20010112931A; CA2365594A1; EA200101015A1

Abstract

本发明涉及一种用底物L－天冬氨酸(L－Asp)和L－苯丙氨酸(L－Phe)生产α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸(Asp－Phe)的新型微生物学方法,其中,在有ATP的条件下,让所述底物与包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件的非核糖体二肽合成酶接触,其中,N－、C－末端组件分别识别L－Asp和L－Phe,并且,后一种组件的N－末端与所述缩合结构域共价结合,其中,所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’－磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成,并回收所形成的Asp－Phe。本发明还涉及编码一种新型Asp－Phe二肽合成酶的新型DNA片段或DNA片段的组合,含有所述DNA片段的微生物,以及所述新型Asp－Phe二肽合成酶本身。

Description

α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的微生物学生产方法

发明领域

本发明涉及一种用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型微生物学方法。本发明还涉及编码一种新型Asp-Phe二肽合成酶的新型DNA片段或DNA片段的组合，含有所述DNA片段的微生物，以及所述新型Asp-Phe二肽合成酶本身。

发明背景

α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(以下又称之为Asp-Phe)是一种重要的二肽，特别是被用于生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(以下又称之为APM)。已知APM是一种高强度人工增甜剂，其甜度大约为蔗糖甜度的200倍。β-形式的APM立体异构体(其中，一个或两个氨基酸为D-构型)不具有甜度特征。APM被用于对各种食用材料进行增甜。

现有各种APM生产方法；现有的方法可以划分为化学和生物化学/微生物学(特别是酶学)方法。在用已知的肽合成技术生产APM的方法中，为了实现选择性的α-L，L-连接，必须进行繁琐的、并且代价昂贵的工艺，包括对α-氨基、羧基和侧链基团进行强化保护和脱保护。另一方面，发酵方法通常是廉价的，并且，它本身具有对映体-和区域选择性。因此，发酵方法一直被认为是上述化学和生物化学合成方法的有希望的替代方法。通过EP-A-0036258可以看出，到目前为止，一直认为不适合将二肽Asp-Phe作为微生物自身蛋白生产过程的一部分在微生物中生产；理论上讲，通过将核苷酸碱基序列GAC或GAT(已知是L-Asp的密码子)和TTT或TTC(已知为L-Phe密码子)插入微生物的DNA中可以实现所述生产，将所述碱基序列插入正确的读框中，在其前面和后面有合适的加工或终止密码子，并且受到合适的控制。因此，在EP-A-0036258中，尝试了通过预先生产结构式(Asp-Phe)n的蛋白片段间接合成Asp-Phe，其中，n是一个大的数字；这一目的是通过在一种克隆载体中插入编码所述聚-(Asp-Phe)蛋白的合成DNA-片段而实现的。不过，所述核糖体发酵方法仍然繁琐，并且在经济上也没有吸引力。主要问题在于从所述多肽中回收Asp-Phe二肽。类似地缺陷可归因于由Choi，S.Y.等所披露的一种方法，参见J.Microbiol.Biotechnol.，2，1992，1-6页，其中，合成了一种含有Asp-Phe-Lsy的三肽序列的片段的多肽。因此，仍然存在寻找Asp-Phe的直接发酵方法的必要性。到目前为止尚不了解Asp-Phe的直接发酵。

发明详述生产Asp-Phe的方法：

令人吃惊的是，本发明人现在发现了一种用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型的、有希望的替代的微生物学方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的条件下，让所述底物与包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件的非核糖体二肽合成酶接触，其中，所述组件的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且，其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成，并回收所形成的Asp-Phe。

因此，这种新方法提供了一种直接发酵Asp-Phe的微生物学方法，随后通过一个甲基化步骤可将其转化成高效增甜剂天冬苯丙二肽酯。到目前为止，通过直接发酵生产Asp-Phe的方法与这种二肽的非核糖体合成方法一样是未知的。因此，本发明人提供了一种生产二肽Asp-Phe的直接微生物学方法，不需要任何保护和脱保护步骤。

根据本发明，所述可用于生产Asp-Phe的所述新型非核糖体二肽合成酶在下文中又被称为Asp-Phe二肽合成酶或Asp-Phe合成酶。已知(例如，参见Zuber等，枯草芽孢杆菌和其他格兰氏阳性细菌，Sonenshein等(著)，美国微生物学协会，华盛顿特区，1993，897-916页)微生物可以通过核糖体和非核糖体机制生产生物活性肽。到目前为止，已知所述生物活性肽是由多种土壤细菌和真菌通过非核糖体途径合成的。所述生物活性肽可以具有2-48个残基，并且在结构上不同。他们具有多种生物学特性，包括抗微生物、抗病毒或抗肿瘤活性，或免疫抑制或酶抑制活性。这样，所述非核糖体合成的生物活性肽构成了一类肽次级代谢产物，这种产物可广泛应用于医药、农业、和生物学研究。到目前为止，业已发现有超过300个不同的残基整合在所述肽次级代谢产物中。不过，到目前为止，还没有发现一种非核糖体产生的肽在它里面具有二肽Asp-Phe(作为其肽序列的一部分)，也没有发现二肽Asp-Phe本身是非核糖体合成的产物。

根据本发明，现在可以通过非核糖体途径生产Asp-Phe，并可将新型非核糖体Asp-Phe合成酶用于Asp-Phe的合成。下面，在涉及编码所述新型Asp-Phe合成酶的DNA片段的说明书部分，将更详细地说明在本发明中是如何获得所述新型Asp-Phe合成酶的，以及如何加以利用。不过，为了更好地理解本发明，首先提供有关非核糖体肽合成的一些一般背景。

在迄今已知的肽非核糖体合成中，一般涉及多种载体硫模板机制(T.Stein等，J.Biol.Chem.，271，1996，15428-15435页)。根据该模型，肽键的形成是在多酶复合物上形成的，它被称为肽合成酶，并且包括氨基酸识别组件的序列。在所述肽合成酶上发生了一系列酶促反应，这些反应通过按照由识别所述同源氨基酸的组件的顺序预定的顺序将所述氨基酸顺序组装成肽，最终导致了所述肽的形成。这一系列的酶促反应大体上包括：

1.所述氨基酸底物的识别；

2.用Mg²⁺-ATP(腺苷酸化)将所述识别的氨基酸底物活化成它的氨基酰基-腺苷酸(即氨基酰基腺苷-单磷酸；aa-AMP)；

3.将它的更稳定的硫酯形式的所述氨基酰基腺苷酸结合在酶结合4’--磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)辅助因子的半胱胺基团上(硫醇化)，因此，在所述腺苷酸化反应中所利用的ATP以单磷酸酯的形成(AMP)释放。

4.根据通过非核糖体合成的肽，可以对所述硫醇-活化的底物进行修饰(例如，通过差向异构或N-甲基化)；

5.通过从N到C将所述磷酯化底物氨基酸(根据具体情况修饰过)逐步整合到生长的肽上形成所述肽产物；

6.从所述模板上释放非核糖体形成的所述肽。

假设这种通用方法同样适用于本发明的Asp-Phe的新型非核糖体合成，这意味着该合成包括以下后续步骤(i)L-Asp和L-Phe的识别，(ii)L-Asp-和L-Phe-酰基腺苷酸的形成，(iii)将其结合到相应硫醇化结构域中的4’-PP辅助因子的半胱胺基团上，(iv)通过将L-Asp的硫酯活化的羧基基团转移到L-Phe的氨基基团上形成所述Asp-Phe二肽，而所述缩合产物保持通过Phe识别组件的硫醇化结构域中的4’-PF辅助因子与所述多酶复合物共价连接，和(v)释放所形成的Asp-Phe。

根据本发明，在有有效量的ATP的条件下，让底物L-Asp和L-Phe与非核糖体Asp-Phe合成酶接触。在这里，有效量的ATP是指能确保所述二肽形成能以合适的速度进行的ATP的量。通常，所述速度至少为每分钟转换一次，即每分钟的转换数(k_cat)为1；k_cat优选为每分钟至少10。为了提供一种在经济方面具有吸引力的方法，所述肽合成反应所使用的ATP优选为能再生的。

所述底物L-Asp和L-Phe与非核糖体Asp-Phe二肽合成酶的接触可以用任何合适方法完成；例如，如果所述Asp-Phe二肽合成酶存在于微生物中的话，可将L-Asp和L-Phe添加到含有所述微生物的培养基中。另外，可以使用能够超量产生L-Asp和/或L-Phe(例如，由葡萄糖产生)的微生物中，分别用不能由该微生物产生的氨基酸(L-Asp和L-Phe)饲养所述微生物。以上所有方法可以被称为体内方法。ATP可以在能产生Asp-Phe的微生物中体内再生。

所述底物L-Asp和L-Phe与非核糖体Asp-Phe二肽合成酶的接触还可以用分离形式的所述合成酶实现，就是说通过体外方法实现。在这种体外方法中，ATP再生是分别进行的。这一目的可以通过采用ATP再生系统实现。ATP再生系统是本领域技术人员容易获得的。

在蛋白质化学研究和编码细菌和真菌来源的肽合成酶的基因的克隆和测序方面所取得的最新进展业已表明，所述已知的肽合成酶具有由所谓组件组成的高度保守的和有序的结构。这些组件被定义为肽合成酶内的半自主性单位，它携带有识别、活化和修饰一种底物所需要的所有信息。尽管原则上讲所述组件能单独起作用，但通常认为它们必须以协调方式工作，以基于模板的作用方式实现肽的延伸。

一般，肽合成酶的组件本身构成保守结构域的线性排列，这些结构域分别代表与底物识别、活化(以及根据情况为选择性地修饰)和缩合(即肽键形成)相关的酶活性，每一个组件的长度大约为1000-1400个氨基酸(即，所述组件的分子量范围为120-160kDa)。由两个不同的结构域腺苷酸化和硫醇化结构域(A-结构域和T-结构域)共同构成一个组件的最小部分，它保留了氨基酸底物的特殊活化和共价结合所需要的全部催化活性。Stachelhaus等将该组件的核心片段定义为“最小组件”(T.Stachelhaus等，J.Biol.Chem.270，1995，6163-6169页)。

因此，按照所述定义所使用的术语“最小组件”是指由腺苷酸化结构域和硫醇化结构域所组成的所述组件的组合的核心片段。

在表1中列举了已知存在于肽合成酶中的腺苷酸化和硫醇化结构域的某些高度保守的核心基序，同时列举了缩合和硫酯酶结构域的某些高度保守的核心基序(将在本说明书的后面部分对其作更详细地说明)。

所谓“腺苷酸化结构域”(A-结构域，大约550个氨基酸)是每一个组件的必须区域。业已证实所述A-结构域具有底物识别和ATP结合位点，因此，它仅仅负责识别氨基酸的活化以及通过ATP水解进行酰基腺苷酸化(T.Stachelhaus等，J.Biol.Chem.270，1995，6163-6169页)。表1.已知肽合成酶的催化结构域的高度保守的核心基序来源：M.Marahiel等，Chem.Rev.97，1997，p.2651-2673

结构域	核心注：以前的名称在括号中给出	共有序列
结构域	核心注：以前的名称在括号中给出	共有序列	腺苷酸化	A1A2(核心1)A3(核心2)A4A5A6(核心3)A7(核心4)A8(核心5)A9A10	L(TS)YxELLKAGxAYL(VL)P(LI)DLAYxxYTSG(ST)TGxPKGFDxSNxYGPTEGELxIxGxG(VL)ARGYLY(RK)TGDLGRxDxQVKIRGxRIELGEIELpxYM(IV)PNGK(VL)DR
硫醇化	T(核心6)	DxFFxxLGG(HD)S(LI)	腺苷酸化	A1A2(核心1)A3(核心2)A4A5A6(核心3)A7(核心4)A8(核心5)A9A10
硫醇化	T(核心6)	DxFFxxLGG(HD)S(LI)	缩合	C1C2C3(His)C4C5C6C7	SxAQxR(LM)(WY)xLRHExLRTxFMHHxISDG(WV)SYxD(FY)AVW(IV)GxFVNT(QL)(CA)xR(HN)QD(YV)PFERDxSRNPL
硫酯酶	TE	G(HY)SxG	缩合	C1C2C3(His)C4C5C6C7

不久以前报导了肽合成酶(来自GrsA的PheA)的腺苷酸化结构域的初级三维结构(E.Conti等，EMBO J.16，1997，4174-4183页)。该结构表明，几乎所有高度保守的核心基序都位于结合底物的活性位点周围。还可以确定在建立底物结合袋时所涉及到的主要残基；业已发现这些残基位于核心基序A3和A6之间，并且不是高度保守的。

一个组件的A-结构域在决定该组件的专一性方面是非常重要的。“组件的专一性”是指该组件对一种氨基酸的识别相对其他氨基酸或上述其他氨基酸而言具有某种优势。当然，存在于所述组件附近的每一种氨基酸的浓度也可能起作用。例如，如果特定氨基酸的浓度高于其他氨基酸(大部分)的浓度的话，对专一性的要求就不那么严格。

所谓“硫醇化结构域”(T-结构域，大约100个氨基酸；又被称为肽基载体蛋白(PCP))是直接位于所述腺苷酸化结构域下游的结构域。它构成肽合成酶的一个整体部分，并且是4’-PP辅助因子结合和底物酰化的位点。在T-结构域中，4’-PP与位于高度保守的硫醇化核心基序中的恒定丝氨酸残基的侧链共价结合(参见表1)。如果所述肽合成酶组件中的T-结构域不具有其4’-PP辅助因子，就不会发生酰基底物的共价结合，并且链的延伸也是不可能的。

业已发现，在迄今已知的肽合成酶中，通过将4’-PP部分从辅酶A转移到上述丝氨酸残基的侧链上将每一个T-结构域从无活性的脱辅基形式转化成有活性的完整形式。每一种T-结构域的翻译后启动是由最近发现的酶超家族的肽合成酶的特殊成员4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶介导的，它们利用辅酶A作为共同底物，并且似乎通过蛋白/蛋白相互作用获得专一性。

在本发明方法中所使用的Asp-Phe二肽合成酶包括两种最小组件，一种最小组件在其N-末端一侧识别L-Asp，而另一种最小组件在其C-末端一侧识别L-Phe。所使用的术语“最小组件”的含义与Stachelhaus等所下定义相同(J.Biol.Chem.270，1995，6163-6169页)。

所述最小组件中的每一个由一个腺苷酸化结构域(A-结构域)和硫醇化结构域(T-结构域)组成。

另外，本发明Asp-Phe二肽合成酶的两个最小组件是通过所谓的缩合结构域完成的，它需要共价连接在Phe组件的多肽链上，即连接在它的N-末端部分。不过，所述缩合结构域不必与两个最小组件共价连接(即与分别识别L-Asp和L-Phe的组件结合)，因为没有必要让这两种最小组件位于一个多肽链上。

因此，术语“连接”表示所述缩合结构域能确保两种最小组件能协调起作用。

在已知的肽合成酶中，所述缩合结构域以中度保守区域的形式出现。所述缩合结构域(保守区域)通常包括大约400个氨基酸残基，并被认为与非核糖体肽形成的催化相关。所述保守核心基序之一具有催化活性的组氨酸残基，参见T.Stachelhaus，J.Biol.Chem.273，1998，22773-22781页。

可以用本领域技术人员所了解的任何方法从反应介质中回收所形成的Asp-Phe。

优选的是，所述二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两种最小组件连接，使它还能够与识别L-Asp的组件共价结合。在这种情况下，所述缩合结构域不仅共价结合于L-Asp识别组件的N-末端，而且结合于L-Asp识别组件的C-末端。并形成包括L-Asp和L-Phe识别组件的单一多肽链的一部分。

非核糖体肽合成的区别特征是，在所述模板上形成的肽以肽基-(4’-PP)-T-结构域中间体的形式与C-末端组件的T-结构域共价结合。所述肽从该中间体上的释放被认为要么是通过有水进行的分子间攻击进行的，导致净水解，或者是通过肽链本身的羟基或氨基基团的分子内捕获作用进行的，产生环化肽产物和完整形式的肽合成酶。所述第一种终止途径产生了一种具有游离的C-末端羧基线性肽(对于本发明的Asp-Phe合成来说情况就是这样)。

由于Asp-Phe是以结合在Asp-Phe二肽合成酶的模板上的中间体形式存在的，优选采取其他措施来增强Asp-Phe从所述模板上的释放。

因此，特别理想的是，还存在释放在所述二肽合成酶上形成的Asp-Phe的因子。本文所使用的术语“释放因子”包括所有含义，可以是所述合成酶的部分或者与所述合成酶组合存在，它能增强在所述合成酶上形成的Asp-Phe从所述合成酶上的释放。

将最后一个氨基酸结合到生长中的肽链上的所有已知细菌和某些真菌肽合成酶组件都具有一个具有硫酯酶样功能的区域。这些大约为250个氨基酸的区域位于氨基酸识别组件的C-末端。所述硫酯酶样区域是具有与硫酯酶样蛋白同源性的整合的区域，因此，又被称作硫酯酶结构域((整合的)TE-结构域)。所有这些整合的TE-结构域包括一个活性位点丝氨酸残基，它是核心基序GxSxG的一部分(参见表1)。

最新的研究支持了这样的理论：即所述整合的TE-结构域参与了链伸长的终止和产物释放。例如，将完整的TE-结构域从枯草菌脂肽合成酶上去掉会导致体内枯草菌脂肽产量降低97％(SchneiderA.等，Arch.Microbiol.169，1998，404-410页)。另外，业已证实将整合的TE-结构域从枯草菌脂肽合成酶的组件7的C-末端置换到组件4和5的C-末端，会得到相应的四脂肽和五脂肽。同样在该研究中，除去整合的TE-结构域，会导致肽合成的几乎全面的减弱(Ferra F de等，J.Biol.Chem.，272，1997，25304-25309页)。

因此，在本发明的一种特别优选的实施方案中，所述释放因子是一种具有硫酯酶样功能的蛋白，并在其C-末端形成所述二肽合成酶的整合的结构域。

另外，优选的是Asp-Phe二肽合成酶在产生Asp-Phe之前，业已利用一种或多种翻译后修饰活性对其功能进行了优化。这一方法可用于获得Asp-Phe的最有效的非核糖体合成。

本文所说的术语为了对Asp-Phe进行有效的非核糖体合成而进行的“翻译后修饰活性”包括能在二肽合成酶形成之后对其进行修饰的任何活性，从而对其Asp-Phe的合成功能产生正面影响。

具体地讲，在生产本发明的Asp-Phe时，所使用的翻译后修饰活性是4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)转移酶。所述4’-PP转移酶能将所述肽合成酶的脱辅激酶形式有效转化成完整酶。并且将4’-PP辅助因子加载到T-结构域的核心基序的丝氨酸侧链上，并因此提高Asp-Phe的产量。如果在Asp-Phe二肽合成酶的两个T-结构域中的每一个中至少有10％的脱辅激酶被转化成完整形式的话，就能将脱辅激酶有效转化成完整形式的酶。

特别优选的是，在生产本发明的Asp-Phe时，还有一种具有硫酯酶-II样活性的非整合蛋白与所述二肽合成酶同时存在。在本文中，具有硫酯酶-II样活性的蛋白是与来源脊椎动物的II型脂肪酸硫酯酶具有高度序列相似性的蛋白。所述具有II型样硫酯酶活性的非整合蛋白与所述整合的硫酯酶(T-结构域)不同。最新研究(Schneider等，Arch.Microbiol.，1998，169，404-410)业已证实，从枯草菌脂肽合成酶操纵子上去掉编码具有II型样硫酯酶活性的所述非整合蛋白的基因，可导致肽产量降低84％。这表明，具有II型样硫酯酶活性的所述非整合蛋白能增加非核糖体肽的产量，有可能是通过释放错载的组件而复活的，所述组件是由不正确的氨基酰基基团或位于4’-PP辅助因子上的不需要的酰基基团封闭的。

所述编码具有II型样硫酯酶活性的非整合蛋白的基因可位于所述肽合成酶编码操纵子的5’或3’末端。所述蛋白的分子量为25-29kDa，长度为大约220-340个氨基酸，并具有序列GxSxG，它被认为能形成所述活性位点。已经注意到，在迄今为止已知的几乎所有原核肽合成酶编码操纵子上都检测到了所述特殊的基因。

在生产本发明的Asp-Phe时，Asp-Phe二肽合成酶优选存在于微生物的活的细胞材料中，而葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe被添加到所述发酵罐中，然后回收所产生的Asp-Phe。在本文中，术语“葡萄糖”包括葡萄糖和在活细胞材料中再生ATP所需要的任何其他能量来源和维持所述活细胞材料所需要的能量。另外，所述葡萄糖(或其他能量来源)被用作按照本发明的方法在活细胞中生产任何要生产的L-Asp和/或L-Phe的原始材料。

当然，技术人员可以理解的是，葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe的添加是在合适的温度和pH条件下进行的，包括需要合适的氮源、盐、微量元素、和诸如维生素和氨基酸的其他有机生长因子等存在于用于生产Asp-Phe的所述发酵罐或其他类型的(酶)反应器中。回收所产生的Asp-Phe。所述回收可以在生产过程或在生产结束时进行。

所述活的细胞材料可以技术人员可以获得的任何合适形式存在，例如，可以使用原始形式的或固定形式的完整细胞。所述微生物可以是任何类型的微生物，其中，可以稳定地表达本发明的Asp-Phe二肽合成酶。例如，合适的微生物是以下微生物：

(a)它能通过非核糖体合成产生肽，例如，诸如链霉菌、芽孢杆菌、放线菌、微球菌、诺卡氏菌的细菌，或诸如Tolypocladium sp.、镰孢菌、青霉菌、曲霉菌、和旋孢腔菌的真菌；或

(b)它优选能以工业规模产生氨基酸，特别是L-Asp和/或L-Phe，例如，埃希氏菌，例如大肠杆菌，和棒杆菌，例如，谷氨酸棒杆菌。

所述微生物可以在技术人员容易发现的条件下在发酵罐中生长，然后可以在相同的发酵罐中或另一个发酵罐中生产Asp-Phe。

在本文中，发酵罐是指技术人员所公知的任何类型的发酵罐(或酶)反应器。

在本发明的生产Asp-Phe的方法中，在开始表达Asp-Phe二肽合成酶之前，优选让微生物首先在发酵罐中生长到预定的细胞密度，并添加葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe，以便启动Asp-Phe二肽的合成。

技术人员很容易确定微生物的生长，例如，通过测定其光密度(0.D.)，并寻找细胞密度的最合适的水平。为了防止对微生物的生长产生任何负面影响，生长阶段与Asp-Phe合成酶的生产阶段优选是脱节的。所述脱节可以通过由诱导型严密调控型启动子表达编码Asp-Phe合成酶的基因而实现。所述Asp-Phe二肽合成酶的表达优选在达到预定的细胞密度水平之后通过添加特殊化学成分(诱导物)或通过改变诸如温度、pH或溶解氧压力的物理条件而启动的。与非诱导状态相比，如果Asp-Phe二肽合成酶的表达水平上升了至少10倍的话，就认为所述表达已经被启动。

然后开始添加需要量的底物等，并开始Asp-Phe的生产。

最优选的是，所述微生物是能产生L-苯丙氨酸的微生物，并且，除了所需量的盐和微量元素之外，仅添加葡萄糖和L-Asp。能产生L-Phe的微生物是众所周知的。例如，大肠杆菌和棒杆菌被用于生产L-Phe。通过在所述微生物中表达Asp-Phe二肽合成酶，在该微生物中产生了可供利用的L-Phe，并且根据需要仅添加葡萄糖、合适的氮源、有机生长因子、盐和微量元素等，以及L-Asp。

具体地讲，所使用的微生物是埃希氏菌或芽孢杆菌。

如果所使用的微生物是具有降低的针对Asp-Phe的蛋白酶活性或缺乏针对Asp-Phe的所述活性的菌株的话，可以获得最佳结果。通过使用这种菌株，可以避免降解所形成的Asp-Phe。可以使用缺乏蛋白酶活性的任何合适的菌株(天然的或者由于所述蛋白酶的活性被明显降低或完全消除所致)。另外，如果Asp-Phe的合成是在微生物中进行的话，还可以采取其他措施，以便改善所形成的Asp-Phe向微生物外面的反应介质中渗透，并在从该反应介质中分离出微生物之后从中回收Asp-Phe。类似地，还可以采取其他措施来改善葡萄糖和/或L-Asp和/或L-Phe的吸收。

在本发明的一种更优选的实施方案中，所使用的微生物还可以含有一种合适的输出所形成的Asp-Phe的系统，和/或一种或多种合适的吸收葡萄糖和/或L-Asp和/或L-Phe的系统。使用合适的输出系统，能确保所形成的Asp-Phe的更有效的分泌。在本文中，分泌是指在所述微生物中所产生的Asp-Phe分泌到细胞外环境中。对于Asp-Phe的回收产量的改善和将Asp-Phe二肽合成酶的活性保持在合适水平上以及防止Asp-Phe的细胞内降解来说，Asp-Phe的有效分泌是重要的。另外，对所分泌的Asp-Phe下游加工更容易些。

类似地，合适的吸收系统的存在，可以改善Asp-Phe的结合效率。

在以上部分对Asp-Phe的体内非核糖体合成方法进行了说明。它们的共同特征是，使用了活的细胞材料，并且ATP再生是在该细胞材料中进行的。本发明还可以在体外进行。在本文中，体外系统的特征是，Asp-Phe二肽合成酶不存在于活的细胞材料中；不过，它可以存在于任何其他环境中，例如，存在于透化细胞、无细胞提取物中、或作为分离的二肽合成酶。在上述情况下，ATP的再生不是在用于合成Asp-Phe的活的细胞材料中进行，并且必须采取补充有效量的ATP的特殊措施。

在本发明的一种优选实施方案中，Asp-Phe的产生是在酶反应器体外进行的，同时补充ATP并添加L-Asp和/或L-Phe，以及回收所形成的Asp-Phe。

为了改善该方法在经济上的可行性，特别优选的是提高为了合成Asp-Phe所添加的每摩尔ATP的Asp-Phe产量。这一目的可以通过连续的腺苷酸化和硫醇化反应由ATP所产生的AMP进行原位ATP再生而实现。

因此，在本发明的优选方案中，ATP的供应一部分是通过原位ATP再生系统提供的。

各种ATP再生系统(在文献中该系统又被称作ATP发生系统)为技术人员所熟知。作为ATP再生系统，可以使用完整的细胞系统(例如，酵母糖酵解系统或分离的ATP再生酶)，例如，与乙酸激酶结合的腺苷酸激酶。T.Fujio等业已披露了一种非常优秀的ATP再生系统(生物科学，生物技术，生物化学61，1997，840-845页)。它们证实了用透化产氨棒杆菌细胞由相应的单磷酸酯(AMP)再生ATP，所述AMP与透化大肠杆菌细胞中的需要ATP的反应相关。在这种优秀方法中(廉价的)，可以添加葡萄糖作为能量来源，代替大部分ATP。

因此，所述ATP再生系统优选存在于透化微生物中。该透化微生物存在于所使用的(酶)反应器中，以确保在按照本发明生产ASP-PHE的过程中经常有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在并可以利用。编码Asp-Phe二肽合成酶等的DNA片段

本发明还涉及Asp-Phe二肽合成酶的新型DNA片段。

所述新型DNA片段或DNA片段的组合编码非核糖体Asp-Phe二肽合成酶，所述合成酶包括两个通过一个缩合结构域连接在一起的最小组件，其中，所述组件中的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件中的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且其N-末端与所述缩合结构域共价连接，其中，所述最小组件中的每一个由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子。

本文所使用的术语“DNA片段或DNA片段的组合”被理解成具有最广义的可能的含义。首先，该术语与上文所提到的符合生物学材料相关(在一个或多个DNA片段上)，并且按正确顺序编码Asp和Phe的最小组件，以及编码所述缩合结构域，每一个编码序列的两侧是任何转录和翻译控制序列(例如，启动子、转录终止子)等，所述序列适合表达Asp-Phe二肽合成活性。所述控制序列可以是同源的或异源的，并且存在于所述DNA上的启动子可以是组成型的或诱导型的。

本文所使用的术语“DNA片段”还被理解成除了编码Asp和Phe最小组件和缩合结构域之外，还编码其他结构域的活性。例如，TE结构域。另外，所述片段可以编码不存在于Asp-Phe二肽合成酶多肽本身上的活性，如非整合的II型样硫酯酶蛋白，以及与Asp和Phe最小组件协调起作用的其他活性。

本文所使用的术语“DNA片段”还被理解成包括含有上文所述的DNA片段的基因结构。更确切地讲，基因结构被理解成携带有本发明DNA片段的基因或任何其他核苷酸序列。例如，合适的核苷酸序列可以是质粒、载体、染色体、或噬菌体。所述基因结构可以作为能自主复制的载体(的一部分)以单拷贝或多拷贝形式存在，或者以单拷贝或多拷贝形式整合到染色体上。

基因结构还被理解成上述基因载体的组合，如载体、染色体和噬菌体，本发明的DNA片段就分布在它上面。例如，可以将Asp-Phe二肽合成酶编码DNA片段以存在于载体上的形式导入细胞，而非整合II型样硫酯酶蛋白编码DNA片段可以插入染色体上。另外，例如其他DNA片段可以用噬菌体导入细胞。以上例子并不排除本发明具有DNA片段分布的其他组合。本发明的DNA片段能以足够高的拷贝数，例如高达50个拷贝导入微生物中。

在本专利申请的以上部分业已对Asp-Phe二肽合成酶和它所包括的两个最小组件作了详细说明。

尽管有诸如“组件”、“结构域”之类的术语，本发明DNA片段的构建不会自我实现，这会使人们产生误会，以为对其功能范围了解甚多。然而，尚没有能够合理设计(突变型、非天然)肽合成酶的详细资料。不过，业已在文献中披露了构建突变型肽合成酶的各种新的技术。文献中所披露的构建突变型肽合成酶的方法有：

De Ferra等(J.Biol.Chem.，272，1997，25304-25309页)披露了一种通过将枯草菌脂肽合成酶的整合的TE-结构域从C-末端组件置换到另一个组件的C-末端产生具有预定序列的截短的肽的方法。不过，仅仅是该技术还不社用于构建Asp-Phe二肽合成酶组件，因为还没有发现天然存在的两个连续Asp和Phe组件的天然顺序(即不存在于任何天然合成酶的N-或C-末端，又不是任何天然存在的合成酶的内部序列)。

所披露的用于生产工程肽合成酶的另一种体内技术是所谓的在一种肽产物的初级结构上进行编程改变。该方法的基础是，在遗传学水平上用一种组件取代另一种组件。A.Schneider等对该方法作了一般性说明(分子基因遗传学，257，1998，308-318页)。通过这种方法，可以在体内在不同来源的多组件肽合成酶之间成功地进行氨基酸活性最小组件的交换，并能获得确实能产生具有不同于不进行所述改变所产生的肽的初级结构的非核糖体肽。

如果该技术被用于构建Asp-Phe二肽合成酶的话，原则上讲可以有两种选择，即具有两种组件的序列，包括(i)Asp和XXX，后者表示除Phe之外的任何其他氨基酸，或(ii)YYY和Phe，前者表示除Asp之外的任何其他氨基酸。在上述二肽合成酶中，编码XXX组件的DNA被编码Phe组件的DNA所取代，或者编码YYY组件的DNA被编码Asp组件的DNA所取代。

在EP-A-0637630中披露了构建肽合成酶的其他方法。在所述专利申请中，提供了一种通过取代组件(的部分)改变底物专一性的方法，并且还可以从所述合成酶链上去掉组件或者在它上面插入组件。组件的“专一性”表示该组件在识别一种氨基酸时比识别其他氨基酸或另一种氨基酸时具有某种优势。

上述肽酶工程方法的一个特征是利用同源重组事件在天然肽产生微生物中引起基因组DNA的理想变化。由于所述同源重组事件发生在天然肽形成微生物中，所述方法的优点是，原则上讲存在所有的天然宿主酶和相关的调控因子。

不过，通过天然非核糖体肽生产菌所进行的同源重组具有若干种严重缺陷。这些缺陷中最严重的是，它通常是烦琐的并且在技术上有困难，特别是在用于具有发育较差的转化系统或缺乏其他遗传学工具的缓慢生长的微生物时尤其如此。其他缺陷是，所述天然非核糖体肽生产微生物通常不具备在工业化规模上安全利用的历史，不是L-Phe或L-Asp的生产生物，并且具有未知的发酵特征。另外，所有这些方法都得到了仅具有单拷贝的编码所需肽合成酶的DNA片段的细胞。因此，上述体内工程方法没有一个适用于制备本发明的新型Asp-Phe二肽合成酶，并将其用于工业化生产Asp-Phe。

本发明人业已发现，通过体外工程技术可以方便地获得Asp-Phe二肽合成酶。到目前为止，尚未披露构建肽合成酶的体外工程技术。构建本发明的Asp-Phe二肽合成酶的详细方案可以参见本申请的实验部分。

可以用Asp-XXX或YYY-Phe(XXX和YYY具有上文所述的含义)二肽合成酶编码DNA片段(或天然存在的肽合成酶上的所述合成酶编码片段的部分序列)体外构建Asp-Phe二肽合成酶编码DNA片段。这一目的是通过用Asp-Leu(Leu＝亮氨酸)双组件肽合成酶编码DNA片段为原材料实现的，所述DNA片段是从PCR方法从枯草芽孢杆菌ATCC21332枯草菌脂肽合成酶A基因(srfA-B)中获得的。然后用来自编码Phe最小组件的短芽孢杆菌ATCC8185短杆菌酪肽A合成酶基因(tycA)的DNA片段(通过PCR方法获得)取代编码Leu最小组件的DNA片段。然后通过用编码srfA-C硫醇化和TE结构域的PCR片段取代所述Phe组件的硫醇化结构域将整合TE-结构域添加到Asp-Phe编码DNA片段的C-末端。上述构建是用以下方法实现的：将编码所述额外TE结构域的DNA以框内形式与编码Asp-Phe合成酶的基因融合。结果，TE结构域构成了所产生的Asp-Phe合成酶的整合部分。在本申请的实验部分，这种含有TE结构域Asp-Phe合成酶被称作Asp-Phe-TE。

在构建之后，将所述编码DNA片段导入合适的宿主微生物中。例如，合适的宿主微生物有大肠杆菌和芽孢杆菌。在诱导条件下培养所述微生物，然后裂解细胞，并通过IMAC(固定化金属亲和层析)纯化所产生的合成酶，将纯化的酶制剂用于不同实验中，以证实Asp-Phe的形成。优选DNA片段

编码本发明的Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段的以下优选方面与在本说明书的前面部分所讨论的有关生产Asp-Phe的优选方法的方面密切相关。

对于编码本发明的Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段来说，特别优选的二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个最小组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

具体地讲，编码所述二肽合成酶的DNA片段或DNA组合优选还能编码释放在二肽合成酶所形成的Asp-Phe的释放因子。所使用的术语“释放因子”与在本说明书的前面部分中所使用的该术语有相同的含义。

在本发明的一种更具体的优选实施方案中，编码Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段或DNA片段的组合还编码一种具有硫酯酶样功能并在其C-末端形成该二肽合成酶的整合的结构域的蛋白。对术语“整合的结构域”等的解释可以参见本申请的前面部分。

另外，编码所述合成酶的DNA片段或DNA片段的组合优选还能表达一种或多种翻译后修饰活性，以便在所述合成酶上进行Asp-Phe的有效的非核糖体合成。所使用的术语“翻译后修饰活性”等的含义与在本说明书前面部分所使用的含义相同。

具体地讲，有所述DNA片段或DNA片段的组合所表达的翻译后修饰活性是4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)转移酶活性。这种活性的形成能够将脱辅激酶酶有效转化成完整的酶。在本说明书的前面部分业已解释了脱辅激酶向完整的酶的有效转化。

特别优选的是，所述DNA片段或DNA片段的组合还能编码具有II型样硫酯酶活性的非整合的蛋白。所使用的术语“具有II型样硫酯酶活性的非整合的蛋白”具有在本说明书前面部分所使用的相同含义。

微生物

本发明还涉及含有本发明的DNA片段或DNA片段的组合的微生物，特别是涉及能够产生L-Asp和/或L-Phe的微生物。具体地讲，所述微生物是大肠杆菌或芽孢杆菌。

Asp-Phe二肽合成酶

本发明最后还涉及新型Asp-Phe二肽合成酶。在下文所使用的有关Asp-Phe二肽合成酶术语和表达方式都具有上文所解释的相同含义。

本发明的非核糖体Asp-Phe二肽合成酶的特征是，它们包括两个通过一个缩合结构域连接在一起的最小组件，其中，所述组件中的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件中的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，而且其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述最小组件中的每一个包括一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子。

具体地讲，所述二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个最小组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

所述Asp-Phe二肽合成酶优选还包括一个用于释放在该二肽合成酶上形成的Asp-Phe的释放因子。

所述释放因子最优选是具有硫酯酶样功能的蛋白，并在其C-末端形成该二肽合成酶的整合的结构域。

下面将在实验部分对本发明作进一步说明，但并不局限于所使用的实验。所使用的氨基酸都是对映纯化的L-氨基酸。实验部分一般方法

诸如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制修饰、大肠杆菌转化等的标准分子克隆技术是按照以下文献中所披露的方法进行的：Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和Innis等，1990，PCR方法，方法和应用指南，学术出版社，SanDiego。合成的寡聚脱氧核苷酸是从MWG-Biotech AG，Debersperg获得的。按照供应商的说明在应用生物系统ABI310遗传学分析仪上进行DNA序列分子。测序反应是通过链式终止方法进行的，使用来自

PRISM ready Reaction DyeDeoxy Terminator循环侧序试剂盒的染料标记的双脱氧终止子和AmpliTaq FS聚合酶(Applied Biosystems)。构建质粒pasp-leu-His₆

用以下引物扩增(PCR)包括来自染色体枯草芽孢杆菌ATCC21332DNA的srfB基因座区域的4934 bp的片段：

5’TAA GCA TGC TGC TTT CAT CTG CAG AAA C(5’asp-leu-SphI-srfB2)，和

3’AAT GGA TCC TTC GGC ACG CTC TAC(3’asp-leu-BamHI-srfB3).

通过琼脂糖凝胶电泳证实扩增片段的正确大小。

用1单位的酶BamHI/SphI消化所述片段(20微克)(37℃，16小时)，以便产生末端的限制位点。用相同的酶消化质粒pQE70(由Qiagen，D-Hilden提供)(10微克)，然后与1单位碱性磷酸酶一起培养1小时(37℃)。通过将1微升线性化的质粒DNA转化到大肠杆菌XL1 blue的感受态细胞中证实完全消化。然后通过连接反应(10微升)以以上两种片段连接在一起，载体/插入片段的比例为1∶3，使用1单位的T4-DNA-连接酶(16℃，16小时)。

通过电穿孔用1微升所述连接混合物转化40微升的大肠杆菌XL1blue感受态细胞(Stratagene，D-Heidelberg)。在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)的2×YT琼脂平板上筛选转化体。对抗氨苄青霉素的48个转化体进行的分子表明，其中的4个插入了大约5000bp的片段。通过限制酶消化分析和插入片段的末端侧序证实了正确插入。将被称为pasp-leu-His₆的克隆用于进一步研究。构建质粒pasp-phe-His₆

按以下方法用质粒pasp-leu-His₆构建质粒pasp-phe-His₆。

用以下引物扩增(PCR)来自短芽孢杆菌ATCC 8185 DNA的1894bp染色体DNA片段：

5’ATT TGG TCA CCA ATC TCA TCG ACA A(5’BstEII-TycA-NLID)，和

5’ATA GGA TCC TGT ATT CGT AAA GTT TTT C (3’-PheAT-BamHI).

用琼脂糖凝胶电泳证实片段的正确大小。

用1单位的酶BamHI消化所述片段，并在30℃下培养4小时。然后添加1单位的酶BstEII，并在60℃下再培养4小时。

用相同方法消化质粒pasp-leu-His₆，然后用1单位的碱性磷酸酶培养1小时。通过琼脂糖凝胶电泳将载体部分(大约6，5kb)同其他DNA片段分离，并再次纯化。按上述方法用线性化的pasp-leu-His₆证实完全消化。用1单位的T4-连接酶在16℃下连接等摩尔比例的以上两种片段5小时。用1微升连接混合物对大肠杆菌XL1 blue感受态细胞进行电穿孔。在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)的2×YT琼脂上筛选转化体。对转化体进行的分析发现，在90个克隆中有一个插入了大约2000bp的片段。通过限制酶消化分析和对插入片段进行末端侧序证实正确的插入。

正确的克隆被命名为pasp-phe-His₆。与质粒pasp-leu-His₆上的肽合成酶编码基因相反，质粒pasp-phe-His₆上的肽合成酶编码基因是一种杂合基因，它是通过将第二种(Leu)最小组件的DNA片段(A-和T-结构域)交换成编码Phe最小组件的DNA片段而获得的。构建质粒pasp-phe-TE-His₆

用质粒pasp-phe-His₆构建质粒pasp-phe-TE-His₆。

用以下引物扩增(PCR)来自枯草芽孢杆菌ATCC 21332 DNA的910bp的染色体片段：

5’ATA ATC GAT AAT CGC ACA AAT ATG GTC(5’TE-srfCl-ClaI)和

3’ATA AGA TCT AAC AAC CGT TAC GGT TTG TGT(3’intTE-srfCl-BglII).

通过琼脂糖凝胶电泳证实所述片段的正确大小。

在37℃用1单位的酶ClaI消化所述片段4小时，然后调整缓冲条件，并用1单位的酶BglII消化(4小时，37℃)。

用酶ClaI消化质粒pasp-phe-His₆(4小时，37℃)，然后用BamHI消化(4小时，37℃)，然后将线性化的质粒用1单位的碱性磷酸酶一起培养1小时。通过琼脂糖电泳将载体部分(大约8kb)同其他DNA片段分离，并再次纯化。

完全消化、连接、电穿孔的控制和转化体的筛选是按上述方法进行的。

证实有两种分析过的转化体含有需要的DNA片段。通过限制酶分析和插入片段的末端侧序证实了900bp片段的正确插入。

正确的克隆被命名为pasp-phe-TE-His₆，与质粒pasp-phe-His₆上的肽合成酶编码基因相反，质粒pasp-phe-TE-His₆上的肽合成酶编码基因含有位于编码腺苷酸化结构域的DNA和第二个(Phe)最小组件的硫醇化结构域之间的第二个融合位点。C-末端T-TE结构域类似于枯草菌脂肽合成酶srfC的天然的C-末端。肽合成酶asp-leu-His₆、asp-phe-His₆和asp-phe-TE-His₆的表达

将1微升每一种构建的质粒转入大肠杆菌BL21/pgsp感受态细胞。菌株BL21 1DE3是从Stratagene，D-Heidelberg获得的。基于质粒pREP4(从Qiagen，D-Hilden获得)的质粒pgsp含有受T7启动子控制的gsp基因(来自短芽孢杆菌ATCC9999的短杆菌肽S-生物合成操纵子的4’-PP转移酶基因)。

在含有氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(25μg/mL)的2×YT琼脂平板上筛选转化体。用若干克隆接种4毫升的2×YT液体培养基(额外含有10mM MgCl₂)，并在37℃下培养16小时。然后用这4毫升的培养物接种400毫升的相同的培养基。让细胞在30℃下在水浴摇床上生长(250rpm)。3-4小时之后，细胞的光密度达到0.7(OD₆₀₀nm)，并通过添加200μM IPTGYB诱导。在收获之前再培养细胞1.5小时。

通过比较在诱导开始时和诱导1.5小时之后采集的蛋白样品的SDS-PAGE证实重组蛋白的表达。

在来自BL21/pgsp/pasp-leu-His₆和BL21/pgsp/pasp-phe-His₆的粗制细胞提取物中证实了大约180kDa的诱导型蛋白的表达。从BL21/pgsp/pasp-phe-TE-His₆的粗制细胞提取物中可以证实大约200kDa的诱导型蛋白的表达。

用表达正确重组蛋白的培养物制备甘油母液，并在-80℃下保存。重组蛋白Asp-Leu-His₆，Asp-Phe-His₆和Asp-Phe-TE-His₆的纯化

以5000rpm的速度将按“肽合成酶表达...”中所述方法处理过的800mL BL21/pgsp/pasp-leu-His₆，BL21/pgsp/pasp-phe-His₆和BL21/pgsp/pasp-phe-TE-His₆的培养物离心5分钟，并重新悬浮在缓冲液A(50mM HEPES，300mM NaCl，pH 8，0)的30毫升/升培养物中。直接使用细胞培养物，或者在-20℃下保存待用。用弗氏压碎器处理2次将细胞裂解，工作压力为12000psi。

在紧接着细胞裂解之后，将PMSF以1mM的最终浓度添加进去。以10000rpm的速度离心细胞裂解液30分钟，将上清液与1％(v/v)缓冲液B(50mM HEPES，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8，0)缓冲。将蛋白溶液加样到预先用1％(v.v)缓冲液平衡过的Ni²⁺-NTA-琼脂糖柱(Qiagen，D-Hilden)上。流速为0.75mL/分钟。在非-His₆-标记的蛋白通过该柱之后，再用1％的缓冲液B洗涤10分钟。然后施加一个线性梯度(30分钟达到30％B，再用10分钟达到100％B)。所有三种蛋白都被大约5％的缓冲液B的浓度洗脱(15mM咪唑)，并以2mL的级份收集。

用Bradford试剂通过在595nm下的吸收检测含有重组蛋白的级份。合并所述级份，并用含有50mM HEPES，100mM NaCl，10mMMgCl₂和5mM DTE的缓冲液透析16小时。在透析之后再次测定蛋白浓度。

添加甘油到10％(v/v)的浓度之后，在-20℃下保存蛋白待用。

从1L培养物中大约可以获得5毫克每一种纯的重组蛋白。通过SDS-PAGE估算纯度等级为95％。酶促活性的分析ATP-PPi-交换反应：

通过在逆反应中通过将标记过的32Ppi结合到ATP中间接测定氨基酸活性的专一性(Lee，S.G.& Lipmann，F.；Tyrocidine synthetasesystem；Methods Enzymol.43，1975，p.585-602)。为此，将20p摩尔的每一种酶与1mM氨基酸，1mM ATP，0.1mM PPi，50mM HEPES，100mM NaCl和10mM MgCl2和2 mCi 32Ppi一起在37℃下在100μL的总体积中培养。在10分钟之后通过添加500微升含有100mM NaPPi，560mM高氯酸和1.2％(w/v)活性碳的溶液终止反应。在13000rpm下沉淀所述混合物1分钟。洗涤沉淀并用1毫升水再悬浮2次。

沉淀物的放射性检测标记过的ATP的结合(吸收到活性碳上)。

证实了Asp-Leu-His₆只能活化Asp和Leu。测定的Asp和ATP的Km值分别为3.5mM和0.9mM。测定的Leu和ATP的Km值分别为0.3mM和0.6mM。

证实了Asp-Phe-His₆和Asp-Phe-TE-His₆能活化Phe和Asp。测定的对Phe的Km值为大约50μM。

发现Asp-Phe-His₆和Asp-Phe-TE-His₆的氨基酸活化方式相同。与氨基酸与Asp-Phe二肽合成酶的共价结合：

通过测定有可能与1个当量的纯化蛋白Asp-Leu-His₆，Asp-Phe-His₆和Asp-Phe-TE-His₆共价结合到标记过的Asp、Leu和Phe的量确定所形成的完整酶的量(Lee，S.G.；见上文)。

用50皮摩尔的每一种酶与2mM ATP，50mM HEPES，100mMNaCl，10mM MgCl₂和100皮摩尔的¹⁴C标记过的氨基酸(分别为Asp和Leu或Asp和Phe)一起在37℃下培养，30分钟之后，通过添加1毫升的10％的TCA和5mg/mL BSA终止该反应，然后在0℃下再保存30分钟。通过离心收集蛋白沉淀(速度为13000rpm，30分钟)，并用10％ TCA洗涤2次。将洗涤过的沉淀物溶解在50％的过甲酸中，并用于测定标记过的氨基酸的掺入。

可以用Asp和Leu将Asp-Leu-His₆标记到大约20％-25％的程度。Asp-Phe-His₆和Asp-Phe-TE-His₆只能用Asp标记到10-15％的程度。Phe的掺入可以达到50％的水平。间接证实二肽Asp-Leu和Asp-Phe的形成：

通过用放射性标记过的Asp进行的动力学试验证实所述组成氨基酸与二肽合成酶的共价结合。在第一个试验中，将0.85μM Asp-Leu-His₆与2mM ATP，2.8μM Asp(¹⁴C，56 nCi)一起在缓冲液(50mM HEPES，10mM MgCl₂，100mM NaCl，pH 8，0)中在37℃下培养。以规定的时间间隔采集样品，并按上文所述方法进行处理；测定每一种样品(与所述酶共价结合的Asp)。4分钟之后，几分钟之后如果不再加入第二种氨基酸的话，掺入的标记过的Asp的量开始趋向于达到最大值。不过，如果在4分钟之后加入1.5μM的Leu，将会出现放射性的另一次强的、暂时的增强，大约5分钟之后，如果不加入第二种氨基酸的话，该放射性急剧降低到低于所观察到的最大值的水平。

在另一个实验中，以培养Asp-Phe-His₆相同的方法培养0.5μM的Asp-Leu-His₆。在这种情况下，在大约5分钟之后添加0.1mM Phe会导致上文所述的共价结合的放射性Asp，的类似地暂时增强。不过，添加Leu而不是Phe而不会导致暂时增强。

这清楚地表明，肽键的形成发生在每一种所述肽合成酶上。另外，以上结果表明，在所述肽合成酶上形成的肽被从合成酶上释放下来。二肽Asp-Phe形成的直接证据：

用不同的分析技术通过一系列的实验证实二肽Asp-Phe的形成，即通过放射性检测的薄层层析(TLC)、高效液相层析和质谱法。

在第一种实验中(测定从二肽合成酶上释放的Asp-Phe的方法)，将100皮摩尔的Asp-Phe-His₆与1mM of ATP，1mM Phe和1.25μM ¹⁴C-标记过的Asp一起与200μl的总体积在缓冲液(50mM HEPES，20mMMgCl₂，pH 8)中，在37℃下培养6小时。进行对照实验，省略ATP、Phe或酶中的一种。

在另一个类似地实验中，在相同条件下将相同量的所述酶与1mMAsp和1.25μM ¹⁴C-标记过的Phe一起培养(而不用Phe和14C-标记过Asp)。同样进行适当的空白实验。

为了终止该反应，加入100μl of n-丁醇，并使所述酶沉淀，然后将沉淀的酶除去。对剩余的透明溶液进行蒸发，并用溶解在水中的10vol％的甲醇将其再补充到20μl体积。将合适体积的上述每一种样品加样到硅TLC平板上，然后用丁醇乙酸乙酸乙酯/水1∶1∶1∶1(v/v/v/v)的溶液作为洗脱剂展开该平板。在洗脱之后，让该平板干燥，并将X-光胶片放在它上面暴光2-5天。最后，对胶片进行处理，以便显示放射性标记过的化合物的斑点。

只有在反应混合物中存在Asp、Phe、ATP和酶的情况下才能检测到斑点，它具有Asp-Phe相同的保留因素(Rf)。

在第二种实验中(测定结合Asp-Phe的二肽合成酶的方法)，将1nmol Asp-Phe-His₆与1mM of ATP，1mM Asp和1μM ¹⁴C-标记过的Phe一起以600μl的总体积在缓冲液(50mM HEPES，20mM MgCl₂，pH 8)中在37℃下培养。

分别在10、20和30分钟之后通过添加300μl 20％(重量)含水三氯乙酸(TCA)终止反应，并将该混合物冷却到4℃。所有其他步骤都是在4℃下进行。

通过离心收集沉淀的蛋白，用500μl 10％的TCA洗涤1次，然后用1ml的3∶1(v/v)乙醚和乙醇的混合物洗涤，最后用1ml的乙醚洗涤。接着在37℃下干燥沉淀15分钟，然后在剧烈振动条件下将其重新悬浮在200μl 100mM的氢氧化钾的水溶液中。然后在70℃下处理该混合物0.5小时，并从所述酶上释放出所有结合二肽的硫酯。为了分离释放的形成所述蛋白的二肽，用甲醇将该溶液再补充到1毫升。在4℃下将该溶液离心30分钟，然后在室温下将上清液真空干燥3小时。最后所获得的沉淀重新悬浮在25μl 10％含水甲醇中。

然后通过在上文所述实验中所披露的方法通过放射性检测进行TLC分析。在三种样品的每一种中都可以观察到明显的二肽Asp-Phe的斑点。对于在分别在10、20和30分钟所采集的样品来说，这些斑点的强度明显增强。这表明二肽Asp-Phe的形成确实是在所述二肽合成酶上进行的。

在最后一种实验中，通过比较HPLC保留时间和所形成的二肽的质谱也证实了Asp-Phe的形成。在200μl的总体积中将50pmol的Asp-Phe-TE-His₆与1mM的Asp和0.5mM的Phe一起在缓冲液(50mMHEPES，20mM MgCl₂，pH 8)中在37℃下培养6小时。为了终止该反应，添加100μl的n-丁醇，使所述酶沉淀，然后除去沉淀的酶。对残余的透明溶液进行3小时的真空蒸发，并用溶解在水中的10vol％甲醇再补充到20毫升体积。

为了进行进一步的分析，将该体积稀释10倍(同样用溶解在水中的10vol％的甲醇)，并用其一部分进行HPLC，然后进行光度检测(如下文所述)和电喷射离子化LC-MS分析。用化学合成的Asp-Phe的参考样品进行比较。

对于用光度检测进行的HPLC来说，将50μl一份的上述10倍稀释样品注入Chromsep Inertsil 5 ODS-3柱(250×3mm；粒度5μ)中。使用洗脱剂A(0.05 M aq.H3BO3缓冲液，pH＝3.0)和B(乙腈；Merck，HPLC-级)，其梯度为(t＝0分钟；98％A，2％B；t＝35min：10％A，90％B)，流速为1.2ml/分钟，在40℃下进行。

进行光学检测(在210nm和257nm，在210nm下定量)。

在所得到的所述实验样品的HPLC层析谱上，在6.59分钟处出现一个高峰，它与Asp-Phe参考化合物的保留时间完全相同。另外，所记录到的所述样品的Asp-Phe峰值的UV-光谱与所记录到的Asp-Phe的参考化合物的相同(消光对波长在200到380nm范围内)。计算出的该样品中Asp-Phe的量16.1毫克/升。

对于电离子喷射化LC-MS分析来说，将4μl一份的所述10x稀释实验样品(见上文)注入所述柱上。使用Nucleosil 120-3 C18反相柱(Macherey & Nagel，250×4mm)。洗脱剂A(含有0.05％甲酸脱矿质水)和B(含有0.05％甲酸的HPLC级甲醇)。所使用的梯度洗脱剂A和B如下：t＝0：10％B；t＝25分钟：60％B；t＝30分钟：100％B；t＝34分钟：100％B，流速为0.4ml/分钟，在环境温度下进行。通过全离子流(TIC)进行检测，用正离子模式的电喷射离子化作为离子化技术。扫描范围为120-300，驻留时间为1毫秒。Asp-Phe的保留时间为23.7分钟(对于所述样品和参考化合物来说都是如此)。质谱分析证实来自所述样品和参考化合物的Asp-Phe具有相同的分子量(280克/摩尔)，并且还观察到了相同的断裂形式。根据该技术，计算出在所述样品中的Asp-Phe的量大约为20毫克/升。

序列表<110>荷兰加甜剂公司(Holland Sweetener Company V.O.F.)<120>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的微生物学生产方法<130>4024ep<140>99203518.8<141>1999-10-27<160>47<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>1Leu Thr Tyr Xaa Glu Leu1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>2Leu Ser Tyr Xaa Glu Leu1 5<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>3Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Val Pro Leu Asp1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>4Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Leu Pro Leu Asp1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>5Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Val Pro Ile Asp1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>6Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Leu Pro Ile Asp1 5 10<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>7Leu Ala Tyr Xaa Xaa Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Xaa Pro Lys Gly1 5 10 15<210>8<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>8Leu Ala Tyr Xaa Xaa Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Xaa Pro Lys Gly1 5 10 15<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>9Phe Asp Xaa Ser1<210>10<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>10Asn Xaa Tyr Gly Pro Thr Glu1 5<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>11Gly Glu Leu Xaa Ile Xaa Gly Xaa Gly Val Ala Arg Gly Tyr Leu1 5 10 15<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>12Gly Glu Leu Xaa Ile Xaa Gly Xaa Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu1 5 10 15<210>13<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>13Tyr Arg Thr Gly Asp Leu1 5<210>14<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>14Tyr Lys Thr Gly Asp Leu1 5<210>15<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>15Gly Arg Xaa Asp Xaa Gln Val Lys Ile Arg Gly Xaa Arg Ile Glu Leu1 5 10 15Gly Glu Ile Glu

20<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>16Leu Pro Xaa Tyr Met Ile Pro 1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>17Leu Pro Xaa Tyr Met Val Pro1 5<210>18<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>18Asn Gly Lys Val Asp Arg1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>19Asn Gly Lys Leu Asp Arg1 5<210>20<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>20Asp Xaa Phe Phe Xaa Xaa Leu Gly Gly His Ser Leu1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>21Asp Xaa Phe Phe Xaa Xaa Leu Gly Gly Asp Ser Leu1 5 10<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>22Asp Xaa Phe Phe Xaa Xaa Leu Gly Gly His Ser Ile1 5 10<210>23<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>23Asp Xaa Phe Phe Xaa Xaa Leu Gly Gly Asp Ser Ile1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>24Ser Xaa Ala Gln Xaa Arg Leu Trp Xaa Leu1 5 10<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>25Ser Xaa Ala Gln Xaa Arg Met Trp Xaa Leu1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>26Ser Xaa Ala Gln Xaa Arg Leu Tyr Xaa Leu1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>27Ser Xaa Ala Gln Xaa Arg Met Tyr Xaa Leu1 5 10<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>28Arg His Glu Xaa Leu Arg Thr Xaa Phe1 5<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>29Met His His Xaa Ile Ser Asp Gly Trp Ser1 5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>30Met His His Xaa Ile Ser Asp Gly Val Ser1 5 10<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>31Tyr Xaa Asp Phe Ala Val Trp1 5<210>32<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>32Tyr Xaa Asp Tyr Ala Val Trp1 5<210>33<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>33Ile Gly Xaa Phe Val Asn Thr Gln Cys Xaa Arg1 5 10<210>34<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>34Val Gly Xaa Phe Val Asn Thr Gln Cys Xaa Arg1 5 10<210>35<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>35Ile Gly Xaa Phe Val Asn Thr Leu Cys Xaa Arg1 5 10<210>36<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>36Val Gly Xaa Phe Val Asn Thr Leu Cys Xaa Arg1 5 10<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>37Ile Gly Xaa Phe Val Asn Thr Gln Ala Xaa Arg1 5 10<210>38<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>38Val Gly Xaa Phe Val Asn Thr Gln Ala Xaa Arg1 5 10<210>39<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>39Ile Gly Xaa Phe Val Asn Thr Leu Ala Xaa Arg1 5 10<210>40<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>40Val Gly Xaa Phe Val Asn Thr Leu Ala Xaa Arg1 5 10<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>41His Gln Asp Tyr Pro Phe Glu1 5<210>42<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>42Asn Gln Asp Tyr Pro Phe Glu1 5<210>43<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>43His Gln Asp Val Pro Phe Glu1 5<210>44<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>44Asn Gln Asp Val Pro Phe Glu1 5<210>45<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>45Arg Asp Xaa Ser Arg Asn Pro Leu1 5<210>46<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列<400>46Gly His Ser Xaa Gly1 5<210>47<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：共有序列

Sequence<400>47Gly Tyr Ser Xaa Gly1 5

Claims

1.用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的微生物学方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的条件下，让所述底物与包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件的非核糖体二肽合成酶接触，其中，所述组件的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且，其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成，并回收所形成的Asp-Phe。

2.如权利要求1的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个最小组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

3.如权利要求1或2的生产Asp-Phe的方法，其特征在于还存在一种用于释放在所述二肽合成酶上所形成的Asp-Phe的释放因子。

4.如权利要求1-3中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述释放因子是一种蛋白，该蛋白具有硫酯酶样功能，并且在其C-末端构成所述二肽合成酶的整合的结构域。

5.如权利要求1-4中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于在生产Asp-Phe之前，所述二肽合成酶业已用一种或多种翻译后修饰活性对其功能进行了优化。

6.如权利要求5的生产Asp-Phe的方法，其特征在于使用4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)转移酶作为翻译后修饰活性。

7.如权利要求1-6中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于还有一种具有II型硫酯酶样活性的非整合蛋白与所述二肽合成酶同时存在。

8.如权利要求1-7中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶存在于微生物的活的细胞材料中，将葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe添加到所述发酵罐中，并且回收所形成的Asp-Phe。

9.如权利要求8的生产Asp-Phe的方法，其特征在于在Asp-Phe二肽合成酶开始表达之前，首先让所述微生物在一种发酵罐中生长到预定的细胞密度，并添加葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe以便启动Asp-Phe二肽的合成。

10.如权利要求9的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是能产生L-苯丙氨酸的微生物，并且仅添加葡萄糖和L-Asp。

11.如权利要求10的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是埃希氏菌或芽孢杆菌。

12.如权利要求8-11中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物是具有针对Asp-Phe的减弱了的蛋白酶活性的或者缺乏针对Asp-Phe的活性的菌株。

13.如权利要求8-12中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物还含有一种用于输出所形成的Asp-Phe的合适的输出系统和/或一种或多种用于吸收葡萄糖和/或L-Asp和/或L-Phe的合适的吸收系统。

14.如权利要求1-7中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于Asp-Phe的生产是在酶反应器中体外进行的，同时补充ATP并添加L-Asp和/或L-Phe，并回收所形成的Asp-Phe。

15.如权利要求14的生产Asp-Phe的方法，其特征在于ATP的补充其一部分是由原位ATP-再生系统提供的。

16.如权利要求15的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述ATP再生系统存在于透化微生物中。

17.一种编码非核糖体Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段或DNA片段的组合，所述合成酶包括两个通过一个缩合结构域连接的最小组件，其中，所述组件中N-末端组件能识别L-天冬氨酸，而所述组件中的C-末端组件能识别L-苯丙氨酸，并且其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述最小组件中的每一个包括一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子。

18.如权利要求17的编码Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段，其特征在于所述编码的二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

19.如权利要求17或18的DNA片段或权利要求17的DNA片段的组合，其特征在于所述编码所述二肽合成酶的DNA片段或DNA片段的组合还编码一种用于释放在所述二肽合成酶上形成的Asp-Phe的释放因子。

20.如权利要求17-19中任一项的DNA片段或DNA片段的组合，其特征在于它还能编码一种蛋白，该蛋白具有硫酯样功能，并且在其C-末端形成所述二肽合成酶的整合的结构域。

21.如权利要求17-20中任一项的DNA片段或DNA片段的组合，其特征在于它还能表达一种翻译后修饰活性，以便在所述合成酶上进行有效的Asp-Phe的非核糖体合成。

22.如权利要求21的DNA片段或DNA片段的组合，其特征在于所表达的翻译后修饰活性是4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)转移酶活性。

23.如权利要求17-22中任一项的DNA片段或DNA片段的组合，其特征在于它还能编码一种具有II型硫酯酶样活性的非整合蛋白。

24.一种含有权利要求17-23中任一项的DNA片段或DNA片段的组合的微生物。

25.如权利要求24的微生物，其中，所述微生物能够产生L-Asp和/或L-Phe。

26.如权利要求25的微生物，其中，所述微生物是大肠杆菌或芽孢杆菌。

27.Asp-Phe二肽合成酶，其特征在于它包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件，其中，所述组件的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且，其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成。

28.如权利要求27的Asp-Phe二肽合成酶，其特征在于所述二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个最小组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

29.如权利要求27或28的Asp-Phe二肽合成酶，其特征在于还存在一种用于释放在所述二肽合成酶上所形成的Asp-Phe的释放因子。

30.如权利要求29的Asp-Phe二肽合成酶，其特征在于所述释放因子是一种蛋白，该蛋白具有硫酯酶样功能，并且在其C-末端构成所述二肽合成酶的整合的结构域。