KR101114937B1

KR101114937B1 - Ｌ체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 및 그것을코딩하는 ｄｎａ

Info

Publication number: KR101114937B1
Application number: KR1020077000465A
Authority: KR
Inventors: 야스히사 아사노; 아츠시 이노우에
Original assignee: 미츠비시 가스 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2005-05-23
Publication date: 2012-03-06
Also published as: CN1989246B; KR20070034575A; JPWO2006008872A1; EP1770166A4; JP4650421B2; EP1770166A1; WO2006008872A1; EP1770166B1; US20080057548A1; DE602005023466D1; US7776570B2; CN1989246A; US7432086B2; US20100009415A1

Abstract

본 발명은 L체의 아미노산 아미드, 특히 L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 재조합 미생물을 제조하여, 얻어진 미생물의 균체 또는 균체 처리물을 사용하여, L체의 아미노산 아미드로부터 L체의 아미노산을 제조한다.

L체의 아미노산 아미드, 2-알킬시스테인아미드, 재조합 미생물

Description

Ｌ체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 및 그것을 코딩하는 ＤＮＡ{L-AMINO ACID AMIDE ASYMMETRIC HYDROLASE AND DNA ENCODING THE SAME}

본 발명은 신규한 L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 및 그것을 코딩하는 DNA, 및 그들의 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, L체의 아미노산 아미드, 특히 L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 활성을 적어도 갖는 신규한 효소, 및 그 효소 단백질을 코딩하는 DNA, 및 그 DNA를 도입한 재조합 미생물, 및 그 재조합 미생물을 사용함으로써, 효소의 배양 생산성을 대폭적으로 향상시킴과 동시에, 그와 같이 하여 얻어진 효소를 사용함으로써, L체의 아미노산 아미드를 효율적으로 L체의 아미노산으로 변환하는 방법에 관한 것이다. 광학활성 아미노산이나 아미노산 아미드, 특히 광학활성 2-알킬시스테인이나 2-알킬시스테인아미드는 각종 공업 약품, 의약 및 농약의 제조 중간체로서 중요한 물질이다.

아미노산 아미드로부터 광학활성 아미노산을 제조하는 방법으로는, 예를 들면, 라세미체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 비대칭 가수분해 하는 효소를 함유한 미생물이나 미생물의 균체 처리물을 작용시키는 방법이, 공업적으로 뛰어난 방법으로서 알려져 있다(예를 들면, 특허문헌 1,2 참조). 그러나, 이러한 생체 유래의 촉매인 효소는, 온화한 반응 조건에서, 또한 매우 높은 반응 특이성으로 목적 산물을 생성시킨다는 뛰어난 특징을 가진 반면, 촉매 가능한 기질의 종류가 한정되거나, 균체의 효소 생산량 자체가 적기 때문에, 반응을 행함에 있어서 다량의 균체를 필요로 하고, 결과적으로, 경제적으로 불리하게 되어 채용할 수 없게 된다는 기술적인 문제점을 안고 있었다.

그래서, 이러한 작용을 하는 효소의 생산량을 높일 목적으로, 아미노산 아미드를 입체선택적으로 가수분해하는 효소의 효소 단백질을 코딩하는 DNA를, 유전자 재조합 방법으로 클론화하여 형질전환체로 하고, 그 형질전환체를 이용하여 라세미체의 아미노산 아미드로부터 광학활성 아미노산을 제조한다는 시도가 이루어졌다(예를 들면, 특허문헌 3～8, 비특허문헌 1 참조).

예를 들면, 특허문헌 3에는, Variovorax 유래의 D-아미다제, 그것을 코딩하는 DNA, 그러한 핵산을 함유하는 플라스미드, 벡터 및 미생물, 혼성화(hybridize)하는 핵산, 핵산을 제조하기 위한 프라이머 등이, 또한 특허문헌 4에는 개변형 아미노산 아미다제(modified amino acid amidase)와 그것을 사용한 D체 아미노산의 제조 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이들 방법은 D체의 아미노산 아미드에만 작용하는 것으로서, L체의 아미노산 아미드를 가수분해할 수 없다.

한편, L체의 아미노산 아미드에 작용하는 예로는, 예를 들면, 특허문헌 5에는, 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans) 유래의 L체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소와 그것을 코딩하는 DNA가 개시되어 있다. 그러나, 이 효소는 L-프롤린아미드에 대한 활성은 높지만, 그 외의 L체의 아미노산 아미드에 대한 활성은 낮다.

그 외, 특허문헌 6에는 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) 유래의 효소 단백질과 이것을 코딩하는 DNA 및 이 효소 단백질을 사용한 광학활성 유기산의 제조 방법이 개시되어 있으며, 그 중에서 아미노산 아미드의 비대칭 가수분해도 개시되어 있지만, 류신 아미드 또는 페닐알라닌 아미드를 기질로 한 경우뿐이다. 또한, 특허문헌 7에는, α-아미노산 아미드 및 α-히드록시산 아미드를 입체선택적으로 가수분해하는 아미다제 활성을 가진 단백질과 이것을 코딩하는 DNA가 개시되어 있지만, 바람직한 아미노산 아미드로서 개시되어 있는 것은 t-류신 아미드를 기질로 한 경우뿐이다. 또한, 특허문헌 8에는, 펩티드 아미다제를 함유하는 미생물의 획득 방법, 그것에 의해 얻어진 미생물, 그 속에 함유되는 펩티드 아미다제 및 그 사용 방법이 개시되어 있지만, 이 효소는 디펩티드 아미드나 N-아세틸 아미노산 아미드 또는 보호된 아미노산 아미드에 대하여 높은 활성을 갖지만, 미보호 아미노산 아미드를 가수분해하는 활성을 갖지 않는다. 또한, 예를 들면, 비특허문헌 1에는, α-위치에 알킬기를 가진 아미노산 아미드를 입체선택적으로 가수분해 하는 효소가 개시되어 있지만, 여기에 개시되어 있는 예는 메틸발린, 메틸류신 및 메틸페닐알라닌 등의 탄화수소형의 측쇄를 가진 아미노산에 한정되어 있고, 측쇄에 머캅토기와 알킬기를 가진 2-알킬시스테인에 관한 기재는 전혀 확인되지 않는다.

통상의 천연형 아미노산 이외의 특수 아미노산인 알킬시스테인의 유도체인 2-알킬시스테인은 α-위치의 탄소 원자에 알킬기를 가진 것 외에, 머캅토기, 아미노기 및 카르복시기라고 한 반응성이 풍부한 복수의 치환기를 분자내에 가지고 있 고, 특히, 그 광학활성체는 각종 공업 약품, 의약, 농약 등의 제조 원료, 범용 키랄 빌딩 블록으로서 광범한 활용이 기대되는 화합물이며, 산업상 매우 유용한 화합물이기 때문에, 공업적으로 유리한, 저렴한 제조 방법의 개발이 기대되고 있다.

그러나, 상술한 바와 같이, L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 활성을 가진 효소는 알려져 있지 않고, 따라서, 이러한 방법으로 광학활성 2-알킬시스테인, 또는 광학활성 2-알킬시스테인아미드를 제조하는 방법도 알려져 있지 않다. 또한, 그 외의 L체의 아미노산 아미드에 대한 기질 스펙트럼이 넓어, 공업 원료로서 유용한 각종 아미노산 아미드류에 대응할 수 있는 고활성 또한 고입체선택적인 L체의 아미노산 아미드 가수분해효소, 및 상기 효소의 효율적인 생산 방법과 이용 방법이 요구되고 있다.

특허문헌 1: 일본 특개소 61-293394호 공보

특허문헌 2: 일본 특개소 62-55097호 공보

특허문헌 3: 일본 특개 2003-225094호 공보

특허문헌 4: 일본 특개 2002-253256호 공보

특허문헌 5: 일본 특개 2003-250558호 공보

특허문헌 6: 일본 특개평 8-256771호 공보

특허문헌 7: 국제공개 제00/63354호 공보

특허문헌 8: 일본 특허 제3112090호 명세서

비특허문헌 1: H.F.M. Hermes 외, Applied and Environmental microbiology, Vol.60, No1, p.153-159, 1994

[발명의 개시]

본 발명의 목적은 각종 공업 약품, 의약 및 농약의 제조 중간체로서 광범위한 활용이 기대되고, 산업상, 매우 유용한 화합물인 광학활성 아미노산, 특히 광학활성 2-알킬시스테인을 제조하기 위해서 적합하게 사용할 수 있는, L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 및 그것을 코딩하는 DNA, 그 DNA를 함유하는 재조합 DNA를 도입한 재조합 미생물, 및 이들을 사용한 광학활성 아미노산, 특히 광학활성 2-알킬시스테인의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, L체의 아미노산 아미드, 특히 L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 높은 효소 활성을 가진 미생물을 신규로 알아내고, 이 미생물로부터 그 촉매활성을 나타내는 효소를 처음으로 단리?정제하였다. 또한, 이 효소를 코딩하는 DNA를 처음으로 분리 취득하고, 그 DNA를 포함하는 재조합 DNA(recombinant DNA), 및 상기 재조합 DNA를 도입한 재조합 미생물을 제조하여, 발현시킴에 성공하였다. 또한, 이와 같이 하여 얻어진 재조합 미생물을 배양 함으로써, DNA 공여체로서 사용한 야생주의 경우와 비교하여, 현저하게 높은 비활성(specific activity)을 가진 균체 또는 효소 용액을 제조할 수 있게 되고, L체의 아미노산 아미드, 특히 L체의 2-알킬시스테인아미드를 매우 효율좋게 대응 L체의 2-알킬시스테인으로 변환할 수 있게 되었다.

또한, 본 발명의 L체의 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소는, L체의 2-알킬시스테인아미드의 비대칭 가수분해활성을 가질 뿐만 아니라, 기질 스펙트럼이 매 우 넓어, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌 등으로 대표되는 천연형의 통상 아미노산, 또는, L-2-아미노부틸산, L-t-류신, L-페닐글리신, L-p-클로로페닐글리신, L-알리신에틸렌아세탈, L-페니실아민, (4R)-5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘-4-카르복시산 등의 소위 특수 아미노산에 대응하는 각종 L체의 아미노산 아미드를 비대칭 가수분해할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 효소는, L체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 선택적으로 가수분해한다고 하는 엄격한 입체특이성과, 폭넓은 종류의 L체의 아미노산 아미드에 반응한다고 하는 성질을 함께 가진, 종래 공지되어 있는 효소와 다른 산업적 이용성이 뛰어난 신규한 효소이다.

즉, 본 발명은, 이하의 (1)에 나타내는 L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소, (2)～(3)에 나타내는 L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소를 코딩하는 DNA, (4)～(5)에 나타내는 재조합 미생물, (6)에 나타내는 그 효소를 사용한 L체 아미노산 아미드로부터 L체 아미노산을 제조하는 방법, (7)～(9)에 나타내는 L체의 2-알킬시스테인아미드로부터 L체의 2-알킬시스테인을 제조하는 방법에 관한 것이다.

(1) 서열번호 8에 나타내는 아미노산 번호 1～355로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진, L체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소.

(2) (1) 기재의 효소의 효소 단백질을 코딩하는 DNA.

(3) 서열번호 7에 나타내는 염기서열 내의 염기번호 868～1932로 표시되는 염기서열, 또는 그 염기서열과 엄격한(stringent) 조건 하에서 혼성화하는 염기서열을 가진, (2) 기재의 DNA.

(4) (2) 또는 (3) 기재의 DNA가 도입된 재조합 미생물.

(5) 재조합 미생물이 대장균(Escherichia coli )인, (4) 기재의 재조합 미생물.

(6) (1) 기재의 효소를 L체의 아미노산 아미드에 작용시켜 L체의 아미노산으로 변환시키는, L체의 아미노산의 제조 방법.

(7) L체의 아미노산 아미드가 식(1)으로 표시되는 화합물인, (6) 기재의 제조 방법.

식 중의 R₁은 수소, 저급 알킬기, 치환 저급 알킬기, 페닐기, 치환 페닐기, 복소환기, 치환 복소환기, 또는 R₁이 결합하고 있는 탄소 원자 및 그 탄소 원자에 결합하고 있는 아미노기와 일체로 되어 질소함유 복소환을 형성할 수 있는 기이다. 여기서, 저급 알킬기로는 탄소수 1～4의 알킬기 등을 들 수 있고, 치환 저급 알킬기로는 그 중의 하나 또는 복수의 수소가, 예를 들면, 히드록시기, 메톡시기, 머캅토기, 메틸 머캅토기, 아미노기, 구아닐기, 카르복시기, 카르복사미드기, 할로겐기, 페닐기, 히드록시페닐기, 이미다졸릴기 등으로 치환된 탄소수 1～4의 알킬기 등을 들 수 있다. 치환 페닐기로는 임의의 수소가 히드록시기, 메톡시기, 머캅토 기, 메틸머캅토기, 아미노기, 구아닐기, 카르복시기, 카르복사미드기, 할로겐기 등으로 치환된 페닐기 등을 들 수 있다. 또한 복소환기로는, 인돌릴기, 이미다졸릴기 등을 들 수 있고, 치환 복소환기로는, 임의의 수소가 히드록시기, 메톡시기, 머캅토기, 메틸머캅토기, 아미노기, 구아닐기, 카르복시기, 카르복사미드기, 할로겐 기 등으로 치환된 상기의 인돌릴기, 이미다졸릴기 등의 복소환기를 들 수 있다. 또한, R₁이 결합하고 있는 탄소 원자 및 그 탄소 원자에 결합하고 있는 아미노기와 일체로 되어 질소함유 복소환을 형성할 수 있는 기로는 피롤리딘 환, 피롤 환, 티아졸리딘 환, 옥사졸리딘 환 등을 들 수 있다.

R₂는 수소, 또는 탄소수 1～4의 저급 알킬기이다.

또한, R₁과 R₂가 동시에 수소인 경우는 화합물(1)에서 제외된다.

(8) L체의 아미노산 아미드가 식(2)으로 표시되는 화합물인, (6) 기재의 제조 방법.

[화학식 2]

(식(2) 중의 R는 탄소수 1～4의 저급 알킬기를 나타낸다.)

(9) 식(2) 중의 R이 메틸기인, (8) 기재의 제조 방법.

또한, 본 발명의 효소는, 그 활성이 소실되지 않는 한, 서열번호 8에 나타내 는 아미노산 번호 1～355로 표시되는 아미노산 서열에서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 것이어도 좋다. 복수개의 아미노산의 수로는 바람직하게는 2～20개, 더 바람직하게는 2～10개, 특히 바람직하게는 2～5개이다. 또한, 본 발명의 효소는, 서열번호 8의 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖고, 또한 L체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소작용을 가진 것이어도 좋다.

또한, 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA는 서열번호 7의 염기서열의 염기번호 868～1932를 가진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 L체의 아미노산 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소를 코딩하는 DNA여도 좋다. 엄격한 조건으로는, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95%이상의 상동성을 가진 DNA가 서로 혼성화하는 조건, 구체적으로는, 예를 들면, 혼성화 반응을 행하고, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 특히 바람직하게는 65℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세정하는 조건을 들 수 있다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하, 본 발명의 실시 형태를 상세히 설명한다. 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA의 공여체가 될 수 있는 미생물은 L체의 아미노산 아미드, 특히 L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소 활성을 가진 미생물이면 좋다. 그러한 미생물을 찾아내는 방법으로는, 기준배양(type culture) 등의 보존 균주 중에서 선택하는 방법, 또는 자연계로부터 분리하는 방법이 있다. 본 발명자들은, 우선 보존 균주에 대해서 검토를 행하고, 그러한 효소 활성을 가진 미생물로서, 예를 들면, 플로타미노박터(Protamnobacter)속, 마이코플라나(Mycoplana)속 , 및 크산토박터(Xnathobacter)속에 속하는 미생물, 더 구체적으로는 플로타미노박터 알보플라버스(Protaminobacter alboflavus), 마이코플라나 라모사(Mycoplana ramose), 마이코플라나 디모르파(Mycoplana dimorpha), 크산토박터 오토트로피커스(Xanthobacter autotrophicus), 크산토박터 플라버스(Xanthobacter f1avus) 등의 미생물이 해당함을 알아내었다.

다음에, 보다 적합한 균주를 구하고자 자연계로부터의 분리를 예의 행한 결과, 크산토박터 플라버스(X. flavus)로 동정되는 새로운 균주를 분리함에 성공하였다. 본 균주는 하기의 균학적 성질(표 1)에 나타내는 바와 같이, 그람 염색 음성의 비운동성 간균(桿菌)이며, 다형능(多形能), 카탈라제 반응 양성, 옥시다제 반응 양성인 것으로부터 크산토박터속에 속하는 미생물로 판단되고, 또한 16SrDNA(16SrRNA 유전자)의 부분염기서열 약 500bp를 사용하여 귀속 분류군을 추정한 결과, 부분 염기서열이 상동율 100%로 크산토박터 플라버스(X. flavus)와 일치하고, 분자계통수 상에서도 크산토박터 플라버스(X. flavus)와 같은 장소에 위치하므로, 크산토박터 플라버스(X. flavus)로 동정하고, NR303주라 명명하였다.

표 1. 균학적 성질

세포형태 간균

크기 (0.5-0.6×2.0㎛)

다형태 있음

운동성 없음

포자의 유무 없음

그람 염색 -

콜로니 형태 (영양한천, 30℃, 24시간)

원형

가장자리가 매끄러움

볼록형상

광택있음

크림색

생육온도

37℃ +

40℃ -

카탈라제 +

옥시다제 +

산(酸)/가스생산(글루코스) -/-

O/F 테스트(글루코스) -/-

질산염 환원 +

인돌 생산 -

글루코스 산성화 -

아르기닌디히드롤라제 -

우레아제 +

에스크린 가수분해 -

젤라틴 가수분해 -

β-갈락토시다제 -

시토크롬 옥시다제 +

자화성

글루코스 -

L-아라비노스 -

D-만노스 -

D-만니톨 -

N-아세틸-D-글루코사민 -

말토스 -

글루콘산칼륨 +

n-카프린산 -

아디핀산 -

dl-말산 +

시트르산나트륨 +

아세트산페닐 -

혐기적 생육성 +

일례로서, 본 발명자들이 새롭게 분리한 상기 크산토박터 플라버스(X. navus) NR303주의 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 유전자의 단리 방법, 및 그 유전자의 대장균(E. coli) JM109주로의 도입 방법을, 이하에 나타낸다.

DNA 공여체 미생물의 배양은, 통상 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 각 미생물에 필수적인 무기염, 영양소 등을 함유시킨 배지를 사용하여 행해진다. 배양 시의 pH는 4～10의 범위가 바람직하고, 온도는 20～39℃가 바람직하다. 배양은 1일～1주일 정도 호기적으로 행해진다.

효소의 정제는 통상의 효소정제법을 사용할 수 있다. 즉, 배양 종료 후의 배양액으로부터 원심분리나 막분리 등의 통상의 방법에 의해 균체를 모으고, 초음파 처리 등의 기계적 방법 등에 의해 균체를 파쇄한다. 그 후, 원심분리 등에 의해 잔사를 제거하여 조(粗)효소액을 얻는다. 다음에 이 조효소액을 염석, 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 결정화 등에 의해 정제할 수 있다.

정제한 효소의 N말단 아미노산 서열을, 자동 에드만(Edman) 분해 아미노산 시퀀서(sequencer) HPG1005A protein sequencing system(Hewlett-Packard Development Company사제)을 사용하여 결정하고, 결정한 N말단 서열을 바탕으로, PCR에 의해 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드(프라이머)를 설계한다. 크산토박터 플라버스(X. flavus)로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 DNA를 증폭시키고, 표지(label)하여 프로브로 한다.

크산토박터 플라버스(X. flavus)로부터 추출한 DNA를 적당한 제한 효소(예를 들면, EcoRI 등)로 부분 분해한다. 이 DNA 단편과 표지한 DNA 프로브를 이용하여, 서든 혼성화(southern hybridization)를 행한다. 여기서 특정된 DNA를 추출 정제하고, 적당한 플라스미드 벡터에 결합하여, 대장균을 형질전환시킨다.

표지화한 DNA 프로브를 사용하여 콜로니 혼성화를 행하여, 목적 DNA 단편을 포함하는 클론의 플라스미드를 취득한다. 이 플라스미드를 사용하여, 벡터에 도입한, 크산토박터 플라버스(X. flavus) 유래의 DNA의 염기서열을 결정한다. 결정된 DNA 염기서열 중에 L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 유전자의 아미노산 서열의 판독 틀(reading flame)을 찾아내어, 상기 공정에서 얻어진 DNA 단편 중에, L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 유전자의 전(全)코딩 영역이 존재함을 확인한다.

얻어진 L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 유전자의 DNA 염기서열을 바탕으로, 프라이머를 설계한다. 크산토박터 플라버스(X. flavus)로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 DNA를 증폭하여, 플라스미드 벡터(pUC19)와 결합시킨다. 이것을 pMCA1이라고 명명한다. pMCA1을 대장균(E. coli)(JM109)에 형질전환하고, L체 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소 유전자를 보유하는 재조합 균을 pMCA1/JM109라고 명명한다.

또한, 여기서 얻어진 형질전환체 pMCA1/JM109는 2004년 5월 21일에 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호305-5466 일본 이바라키켄 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 쯔꾸바 센터랄 6)에 FERM AP-20056로서 기탁하고, 그 후, 부다페스트 조약에 의거하여 국제기탁에 이관되어, FERM BP-10334의 수탁 번호 로 기탁되어 있다. 따라서, 이 형질전환체에 유지되는 플라스미드 pMCA1로부터 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA를 취득할 수도 있다. 예를 들면, 플라스미드 pMCA1을, pUC19의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 서열을 인식하는 제한 효소로 잘라서 그 DNA를 취득해도 좋고, 플라스미드 pMCA1을 주형으로 하여, 서열번호 7의 염기서열 에 의거하여 설계한 프라이머를 사용한 PCR법에 의해 그 DNA를 취득해도 좋다.

또한, 크산토박터 플라버스의 기타 주, 또는 크산토박터 플라버스 이외의 미생물의 염색체로부터, 본 발명의 DNA를 취득할 수도 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 염기서열에 의거하여 설계된 프로브를 사용하여, 혼성화 반응에 의해, 상기 미생물 유래의 상기 효소를 코딩하는 DNA를 그 미생물의 염색체 DNA로부터 단리할 수도 있다.

본 발명의 DNA를 숙주 미생물에 도입하기 위한 벡터로는, 플라스미드 벡터 (예를 들면, pUC18, pUC19, pUC118 등), 파지(phage) 벡터(예를 들면, λgt11 등)의 어느 것이라도 좋다. 또한, 벡터를 사용하지 않고 숙주 미생물의 염색체에 직접 도입하는 것도 가능하다. 또한, 형질전환에 사용되는 숙주 미생물로는 대장균속 세균, 예를 들면, 대장균(E. coli) JM105주 또는 JM109주 등을 들 수 있지만, 특히, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, DNA, 재조합체 숙주로서의 대장균(E.coli)의 취급 등에 필요한 조작은 당업자간에 통상 행해지는 것이며, 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(ed. Sambrook J. and Russell D.W.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001(이하, 몰레큘러 클로닝 제 3판으로 기재)에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 사용하는 효소, 시약류도 모두 시판의 제품을 사용할 수 있고, 특히 한정하지 않는 한 제품에서 지정하고 있는 사용 조건에 따르면 완전히 그것들의 목적을 달성할 수 있다. 그 균으로부터의 전(全)DNA 추출은, 예를 들면, Saito 등(Biochim. Biophys. Acta., 72, 619-629, 1963)의 방법에 따라 행할 수 있다. 또한, DNA의 표지화는 종래부터 범용되어 있는 방사성 동위원소 또는 디곡시게닌(digoxigenin), 비오틴, 플루오레세인(fluoresceine) 등의 비방사성 화합물의 어느 것이라도 사용할 수 있고, Rediprime^TM II Random Prime Labelling System(Amersham Pharmacia Biothech사제)나, AlkPhos^TM Direct Labelling and Detection System(Amersham Pharmacia Biothech사제) 등을 사용하면 용이하게 실시할 수 있다. DNA 염기서열의 결정도 몰레큘러 클로닝 제3판 등에 기재된 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, Li-Cor DNA Sequencer model 4000L 등의 기기를 부속 매뉴얼 지침서에 따라서 사용하면 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 혼성화는 몰레큘러 클로닝 제3판 등에 기재되어 있는 방법에 따라서 행할 수 있다.

본 발명의 형질전환 미생물의 배양은 통상 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 미생물에 필수적인 무기염, 영양소 등을 함유시킨 배지를 사용하여 행해진다. 배양시의 pH는 4～10의 범위가 바람직하고, 온도는 20～50℃가 바람직하다. 배양은 1일～1주일 정도 호기적으로 행해진다. 이와 같이 하여 배양한 형질전환 미생물로부터 통상의 정제법에 의해 본 발명의 효소를 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어 진 효소는 입체선택적으로 식(I)으로 표시되는 화합물 등의 L체의 아미노산 아미드로부터 L체의 아미노산을 제조하는 반응에 사용할 수 있다. 라세미체 등의 DL체의 아미노산 아미드의 혼합물이 기질인 경우에는, L체의 아미노산과 D체의 아미노산 아미드의 혼합물이 얻어진다. 이 경우 이들을 분리함으로써, L체의 아미노산과 D체의 아미노산 아미드가 각각 얻어지고, 분리된 D체의 아미노산 아미드를 별도가수분해함으로써 D체의 아미노산이 얻어진다. 또한, 효소반응의 기질이 L체의 아미노산 아미드만으로 이루어질 경우에는 대응한 L체의 아미노산이 얻어진다. 또한, 형질전환체의 균체, 또는 그 균체의 처리물을 상기 반응에 사용할 수도 있다. 예를 들면, 상기 균체를 포함하는 배양액, 분리 균체, 균체 파쇄물 등을 상기 반응에 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라서 균체 또는 효소를 고정화하여 사용할 수도 있다.

반응 조건은 반응액에 함유되는 L체 아미노산 아미드의 종류 및 양에 따라서도 다르지만, 반응액 중의 원료 아미노산 아미드의 농도로는 0.1～40wt%, 효소량은, 그 효소를 포함하는 재조합 미생물의 건조 균체 기준으로, 원료 아미노산 아미드 중량의 0.00001～3배, 통상은 0.00005～0.001배가 바람직하다. 반응 온도는 10～70℃, 바람직하게는 20～60℃, pH는 4～13, 바람직하게는 5～10, 보다 바람직하게는 6～9이다. 또한, 2-알킬시스테인아미드 및 2-알킬시스테인은 산화되기 쉬워, 산소 존재 하에 방치하면 2량화한 디설피드(disulfide)로 된다. 이것을 방지하기 위해서, 생화학적 비대칭 가수분해반응은 질소 등의 불활성 가스 분위기하에서 행하는 것이 바람직하지만, 계내에 2-머캅토에탄올 등의 환원성 물질을 공존시키는 방법도 가능하다. 또한, 반응에 사용하는 모든 용매를 반응 실시 전에 탈기하면, 부생성물을 생성하지 않고 적합하게 반응이 진행한다. 또한, 본 반응을 행할 때에, Mg, Cu, Zn, Fe, Mn, Ni, Co 등의 금속 이온을 반응계에 첨가함으로써 반응 속도를 보다 높일 수 있다. 첨가하는 양은 금속 이온의 종류에 따라 다르며 한마디로 말할 수 없지만, 바람직하게는 1～50ppm, 더 바람직하게는 5～20ppm으로 되는 농도의 금속 이온을 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 2가의 Mn 이온을 5～20ppm 첨가한 경우, 반응 속도는 무첨가의 경우와 비교하여 2～5배로 대폭으로 향상한다. 또한, 비대칭 가수분해 반응에 사용한 균체 또는 균체 처리물은 원심분리 또는 여과조작 등에 의해 회수하여, 비대칭 가수분해 반응용의 효소 촉매로서 재이용할 수 있다. 또한, 원료의 아미노산 아미드의 반응액 중에서의 농도가 높은 경우에는, 상기의 아미노산 아미드에 대한 효소량은 사용량비가 바람직한 범위의 상한인 3배 이하로서, 반응이 적합하게 실시할 수 있는 비율을 적당히 선택하면 좋다.

DL체의 아미노산 아미드의 비대칭 가수분해 반응에서 생성한 L체 아미노산과 미반응의 D체 아미노산 아미드의 분리는 반응 종료액으로부터, 예를 들면, 원심분리나 여과막 등의 통상의 고액분리 수단에 의해 미생물 균체를 제거한 후, 감압 농축하고나서 유기 용매를 첨가하여 아미노산을 석출시키는 방법, 재결정이나 칼럼 크로마토그래피 등의 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 특히 제한은 없지만, 이온 교환 전기투석법이나, 이온교환 수지에 의한 흡탈착을 이용한 분리 방법도 유효하다.

본 발명의 L체의 아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소는 L체의 2-알킬시스테인아미드의 아미드 결합을 효율적으로 가수분해하는 특징을 갖는 것 외에, 기질 스펙트럼이 매우 넓어, 본 효소를 사용함으로써 다종류의 L체의 아미노산 아미드로부터 대응 L체의 아미노산을 제조할 수 있다. 구체적으로는, 2-메틸-L-시스테인에 더하여, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌 등으로 대표되는 단백질성 아미노산, 또 L-2-아미노부틸산, L-t-류신, L-페닐글리신, L-p-클로로페닐글리신, L-알리신에틸렌아세탈, L-페니실아민, (4R)-5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘-4-카르복시산 등의 소위 비단백질성 아미노산을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

아미노산 아미드 비대칭 가수분해효소의 단리

크산토박터 플라버스(Xanthobacter flavus) NR303주를, 하기 표 2의 조성을 가진 배지 3L에 접종하고, 30℃에서 170시간 배양하고, 원심분리에 의해 균체를 취득하였다. 균체 습중량(wet weight) 240g을 초음파 파쇄하고, 원심분리에 의해 무세포 추출액을 제조하였다.

표 2. 배지 조성

(NH₄)₂SO₄ 3g

KH₂PO₄ 1.4g

Na₂HPO₄ 3g

NaHCO₃ 0.3g

MgSO₄?7H₂O 0.2g

2% CaCl₂ 1g

효모 추출물 0.2g

비타민 혼합액 1g

요소 1g

글리세린 1Og

미량 미네랄 3.5g

1L (pH7.0)

이것에 30% 포화로 되도록 황산암모늄을 첨가하고, 원심분리하여 침전을 제거한 후, 상청액에 60% 포화로 되도록 황산암모늄을 추가 첨가하였다. 생성한 침전을 원심분리하여 모으고, 100mM 인산칼륨 완충액에 용해하여, 10mM 인산칼륨 완충액으로 투석하였다. 이것을 10mM 인산칼륨 완충액으로 평형화한 DEAE-Toyopearl 수지(Tosoh Corporation 제)에 흡착시켜 이온교환 크로마토그래피를 행하고, 그 아미노산 아미드 비대칭 가수분해 활성을 가진 획분을 순차적으로 황산암모늄을 사용한 Butyl-Toyopearl 칼럼(Tosoh Corporation 제), Gigapite 칼럼(Seikagaku Corporation 제)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 얻어진 정제 효소를 SDS-PAGE에 의해 분리한 결과 단일 밴드이며, 분자량은 40,000이었다.

[실시예 2]

N말단 아미노산 서열 분석

실시예 1에 의해 정제한 폴리펩티드의 N말단 아미노산 서열을, 자동 에드만 분해 아미노산 시퀀서 HP G1005A Protein Sequencing System(Hewlett-Packard Development Company 제)을 사용하여 분석하였다. 이 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타낸다.

[실시예 3]

본 발명의 DNA 단편의 취득

크산토박터 플라버스(X. flavus)를 상기 표 1의 배지 5.0mL에 접종하고, 30℃에서 48시간 배양하였다. 원심분리에 의해 미생물 균체를 취득하고, 페놀클로로포름법을 이용하여 그 미생물의 염색체 DNA를 취득하였다. 실시예 2에서 밝혀진 아미노산 서열로부터, 서열번호 2(AF), 3(BF), 4(AR), 5(BR)의 프라이머를 설계하고, 내열형 DNA 폴리머라제 존재 하에 이들 4종의 프라이머 중, 임의의 2종을 첨가하여 PCR를 행하였다. 본 PCR의 산물을 아가로스 겔 전기영동한 결과 서열번호 3의 프라이머 BF와 서열번호 4의 AR을 사용한 반응액에 87bp의 DNA가 특이적으로 증폭되었으므로, 이것을 아가로스 전기영동 겔로부터 추출 정제하였다. 그의 DNA의 일부를 pT7BlueT-Vector(Novagen사제)에 클로닝하여 Li-CorDNA Sequencer model 4000L을 사용하여(사용 방법은 부속의 메뉴얼 지침서에 따름) 염기서열을 결정하였다(서열번호 6). 상기 DegenerPCR에 의해 증폭한 87bp의 정제 DNA의 나머지를 Rediprime^TMII Random Prime Labelling System(Amersham Pharmacia Biotech 제)에 의해 표지하였다.

[실시예 4]

크산토박터 플라버스 ( X. flavus ) 염색체 DNA 라이브러리의 서든 혼성화

실시예 3 기재의 방법에 의해 크산토박터 플라버스(X. flavus)의 염색체 DNA를 취득하였다. 본 DNA를 Eco RI으로 자른 후, 실시예 3에서 제작한 87bp의 표지 DNA를 프로브로서 사용하여 서든 혼성화를 행하였다. 방법은 몰레큘러 클로닝 제3판에 따랐다. 그 결과, 약 5kb의 DNA 밴드가 검출되어, 본 DNA를 아가로스 겔로부터 추출 정제하고, pBluescriptII SK(-)(Stratagene사제)의 Eco RI 부위에 삽입하여, 염화칼슘을 사용한 형질전환 방법에 의해 E.coli(JM 109)에 도입하였다.

[실시예 5]

콜로니 혼성화 및 서브클로닝

실시예 4에서 얻어진 대장균(E. coli)(JM 109)의 형질전환주를 50μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천배지(1L의 수용액 중에 Bacto Trypton 10.0g, Bacto Yeast Extract 5.0g, 염화나트륨 10.0g, 한천 15.0g을 포함함)에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 생성된 콜로니를 니트로셀룰로오스 막 CELLULOSE NITRATE (Advantec Toyo Kaisha Ltd.제)에 리프팅(lifting) 하고, 실시예 3에서 취득한 DNA 프로브를 사용하여, 혼성화하였다. 혼성화 결과, 양성의 클론으로부터 플라스미드를 취득하여, Li-Cor DNA Sequencer model 4000L을 사용하여, 염기서열을 결정하였다(서열번호 7).

[실시예 6]

발현용 플라스미드의 구축 및 E. coli 의 형질전환

크산토박터 플라버스(X. flavus)로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 MCA-F와 MCA-R(서열번호 9 및 서열번호 10)을 사용하여 PCR를 행하였다. 얻어진 PCR 반응 생성물을 정제하여, 제한 효소 HindIII 및 XbaI로 자르고, 동일한 효소로 자른 pUC19(TAKARA BIO INC.제)에 연결하여 pMCA1을 제작한 후, 대장균(E. coli)(JM109)에 염화칼슘법으로 형질전환시켰다. 50μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 형질전환주를 도포하고, 생육한 클론을 취득하여 형질전환주 pMCA1/JM109를 얻었다.

[실시예 7]

형질전환체를 사용한 2- 메틸시스테인아미드 라세미 혼합물의 비대칭 가수분해 : 염화망간 첨가

하기 표 3의 조성의 배지를 제조하고, 이 배지 200mL을 1L의 삼각 플라스크에 넣고, 멸균한 후, 암피실린 50μg/mL를 첨가하고나서 형질전환주 pMCA1/JM109을 접종하여, 37℃에서 15시간 진탕 배양하였다. 그 다음에, 배양액으로부터 원심분리에 의해 건조 균체 0.1g에 상당하는 생균체를 얻었다.

표 3. 배지 조성

pH 7.0

트립톤 1%

효모 추출물 0.5%

염화나트륨 0.5%

2-메틸시스테인아미드 염산염의 라세미 혼합물 10.0g(58.6mmol)을 50mM 인산완충액(pH7.0) 300mL에 녹인 후, 500mL 플라스크에 넣고, 2가의 Mn 이온의 농도가 1Oppm으로 되도록 염화망간 수용액을 첨가하고, 또한 건조 균체 O.O1g에 상당하는 생균체를 첨가하여, 질소기류 하, 30℃에서 24시간 교반하여 가수분해반응을 행하였다.

반응 후, 반응액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하여 상청을 얻었다. 이 상청액에 활성탄 1g을 첨가하여 1시간 교반한 후, 활성탄을 여과하여 분별하고 나서 에바포레이터(evaporator)로 감압 하에 물을 증류하여 제거하였다. 여기에 2-프로판올 20mL를 첨가하여 가열 교반한 후, 5℃로 냉각하여 석출한 결정을 여과하여 모았다. 여과하여 모은 결정을 에탄올에 의해 재결정하여 2-메틸-L-시스테인 3.04g (22.5mmol)을 얻었다. 반응에 주입한 라세미 혼합물 중의 2-메틸-L-시스테 인 아미드로부터의 단리 수율은 76.8mol%, 2-메틸시스테인아미드의 라세미 혼합물로부터의 단리 수율은 38.4%였다. 또한, 이 고체를 하기 표 4의 HPLC 조건A로 분석한 결과, 광학 순도는 98% e.e.이상이었다.

표 4. HPLC 조건A

칼럼: Sumichiral OA-5000(Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.제)

칼럼 온도: 60℃

용리액: 3mM CuSO₄ 수용액

유속: 1.0mL/분

검출: CD-2095 plus(JASCO corporation 제)

시료: 0.1% 수용액을 포르말린 처리 후, 50μL 주입

[실시예 8]

형질전환체를 사용한 2- 메틸시스테인아미드 라세미 혼합물의 비대칭 가수분해 : 염화망간 비첨가

실시예 7에서, 염화망간 수용액을 첨가하지 않고 생화학적 비대칭 가수분해반응을 행하였다. 30℃에서 24시간 반응을 행하고, 실시예 7과 동일한 후처리를 실시하여, 1.50g(11.1mmol)의 2-메틸-L-시스테인을 얻었다. 2-메틸-L-시스테인아미드로부터의 단리 수율은 37.9mol%, 2-메틸시스테인아미드로부터의 단리 수율은 18.9mol%, 광학 순도는 98% e.e.이상이었다.

[비교예 1]

야생형 미생물(균체 0.01g)을 사용한 2- 메틸시스테인아미드 라세미 혼합물의 비대칭 가수분해

하기 표 5의 조성을 갖는 배지를 제조하고, 이 배지 20OmL를 1L의 삼각플라스크에 넣고, 멸균한 후, 크산토박터 플라버스(X. fLavus)를 접종하여, 30℃에서 170시간 진탕 배양하였다. 그 다음에, 배양액으로부터 원심분리에 의해 건조 균체O.1g에 상당하는 생균체를 얻었다.

표 5. 배지 조성

(NH₄)₂SO₄ 3g

KH₂PO₄ 1.4g

Na₂HPO₄ 3g

NaHCO₃ 0.3g

MgSO₄?7H₂O 0.2g

2% CaCl₂ 1g

효모 추출물 0.2g

비타민 혼합액 1g

요소 1g

글리세린 1Og

미량 미네랄 3.5g

1L (pH7.0)

2-메틸시스테인아미드 염산염의 라세미 혼합물 10.0g(58.6mmol)을 50mM 인산완충액(pH7.0) 300mL에 용해한 후, 500mL 플라스크에 넣고, 2가의 Mn 이온의 농도가 1Oppm으로 되도록 염화망간 수용액을 첨가하고, 건조 균체 O.O1g에 상당하는 생균체를 더 첨가하여, 질소 기류 하, 30℃에서 24시간 교반하여 가수분해 반응을 행하였다. 반응 후, 반응액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 상청액을 하기 표 6의 HPLC 조건B 하에서 분석한 결과, 생성물인 2-메틸시스테인은 확인되지 않았다.

표 6. HPLC 조건B

칼럼: LiChrosorb 100 RP-18(KANTO CHEMICAL CO. INC. 제)

칼럼 온도: 40℃

용리액: 50mM HClO₄ 수용액

유속: 0.5mL/분

검출: RI

시료: 0.1% 수용액을 5μL 주입

[비교예 2]

야생형 미생물(균체 5g)을 사용한 2- 메틸시스테인아미드 라세미 혼합물의 비대칭 가수분해

비교예 1의 배지 조성으로 배양한 10L의 배양액으로부터 원심분리에 의해 크산토박터 플라버스(X. flavus)의 건조 균체 5g에 상당하는 생균체를 얻었다. 2-메틸시스테인아미드 염산염의 라세미 혼합물 10.0g(58.6mmol)을 50mM 인산 완충액(pH7.0) 300mL에 용해한 후, 500mL 플라스크에 넣고, 2가의 Mn 이온의 농도가 10ppm으로 되도록 염화망간 수용액을 첨가하고, 건조 균체 5g에 상당하는 생균체를 더 첨가하여, 질소 기류 하에, 30℃에서 24시간 교반하여 가수분해반응을 행하였다. 반응 후, 반응액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 상청액을 HPLC 조건B로 분석한 결과, 2-메틸시스테인이 28.2mmol이 생성되었음이 확인되었다. 또한, HPLC 조건A로 분석한 결과, L체 아미노산의 광학 순도가 98% e.e.이상이었다.

[비교예 3]

야생형 미생물을 사용한 2- 메틸시스테인아미드 라세미 혼합물의 비대칭 가수분해 : 염화망간 비첨가

비교예 2에서, 염화망간 수용액을 첨가하지 않고 생화학적 비대칭 가수분해 반응을 행하였다. 30℃에서 24시간 반응을 행한 후, 반응액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하여, 상청액을 HPLC 조건B로 분석한 결과, 2-메틸시스테인이 13.9mmol 생성되었음이 확인되었다. 또한, HPLC 조건A로 분석한 결과, L체 아미노산의 광학 순도가 98% e.e.이상이었다.

[실시예 9]

형질전화체를 사용한 각종 아미노산 아미드의 라세미 화합물의 비대칭 가수분해

실시예 7과 동일하게 배양한 형질전환주 pMCA1/JM109의 배양액을 사용하고, 각종 아미노산 아미드의 라세미 혼합물을 기질로 하여 효소반응을 행하였다. 기질 화합물을 50mM 인산완충액(pH7.0)에 용해하여, 기질 농도를 0.1%로 제조하고, 균체를 첨가하여 30℃에서 효소반응을 행하고, 반응 후, 반응액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 입체선택성과 반응률(반응률=반응후의 아미노산 mol량/(반응 후의 아미노산 아미드 mol량 + 반응 후의 아미노산 mol 량)×100)을 HPLC 조건A 및 HPLC 조건B에 의해 분석하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 어느 반응도, 가수분해의 선택성은 L체 선택적이며, 생성된 L체의 아미노산의 광학 순도는 모두 98% e.e.이상이었다.

표 7. 각종 아미노산 아미드의 반응 결과

기질	기질중량/건조균체중량	반응시간	반응률
발린아미드 2-아미노부틸산아미드 t-류신아미드 알리신아미드에틸렌아세탈 페닐글리신아미드 p-클로로페닐글리신아미드 페닐알라닌아미드 페니실라민아미드 5,5-디메틸티아졸리딘-4카르복시산아미드	0.01 0.1 0.1 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.1	24시간 5시간 24시간 24시간 5시간 5시간 5시간 5시간 24시간	44.3% 49.2% 44.4% 44.3% 48.8% 49.6% 47.8% 44.9% 47.0%

본 발명에 의해, 각종 공업 약품, 의약 및 농약의 제조 중간체로서 광범위한 활용이 기대되며, 산업상, 매우 유용한 화합물인 광학활성 아미노산, 특히 광학활성 2-알킬시스테인을 제조하는 적합한 방법을 제공할 수 있다.

<110> Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. <120> L-AMINO ACID AMIDE ASYMMETRIC HYDROLASE AND DNA ENCODING THE SAME <130> 200544-C5111 <150> JP2004-214241 <151> 2004-07-22 <160> 10 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Xanthobacter flavus <400> 1 Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala Trp 1 5 10 15 Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala Gly 20 25 30 Glu Arg Tyr Glu Ile Thr 35 40 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 2 cgsccsctsa csccsccscc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 3 ccsccsgayc csgcstggctsg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 sgtgatytcr tascgytcgcc 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 5 sgcscggccc ttsgcytcgcc 21 <210> 6 <211> 87 <212> DNA <213> Xanthobacter flavus <220> <400> 6 cctcccgatc cggcctggct cgaaggctcc atcatggctg cccgcggcga agccaaaggg 60 cgcgccggcg aacgctacga gatcacc 87 <210> 7 <211> 4840 <212> DNA <213> Xanthobacter flavus <220> <221> CDS <222> (868)..(1932) <400> 7 gaattcgata ttatccgcga ggagccggcg cccatccggc cggatcccta tctggtgcgc 60 tccgcgccca ccgacagctg gttcgcatcc gcgccgcgct gcggtcgcca agtaaggagc 120 gggcgagcca tgtcccgcaa cctgctccag aacttccgcg gcgcccgggc gctcatcgtc 180 gcctccggcg agggcggcat cgacacgctg gagagcgtgc tcggcaagct cggcctcttg 240 gtcgcccgct cggaggcgcc ggaggcgggc cgccatctcg acctcgcctc ggtggaggag 300 cgcgcggacc tgctcttcat cgacggcgac ctcgacagcg tgctgccctg cgacctcggc 360 gcggcccgca ccccgccggt gccggtgatc gggctggtcg gcatcgaggc gccgggccgg 420 ctgaaggcgt tgatgaacca gggggccacg gccttcctgc gcaagccggt ctatgccggc 480 gccgtctaca ccacgctgtt cctcggcgtg aaccagtatc tgctgcgcaa ggagatggcg 540 agcgagctga acgcccagca ggatcgccgc cgccgccgca aggcggtcat caagaccatc 600 ctgctgctga tggaagagca ccaggtggat gacgacgagg cctatgtcat gctccgccgc 660 gacagcatgc gccggcgcca gagcctcgag gattattgcg aggactacat ctccggccgg 720 tcgaagctga ccgcgtcctc gcccgaagcc gagccgcgca ccgcggcccg gcgctgacct 780 taccgaccca catcacgacg gagccgcccg gctccgccgc acgtggcagc tgccagcgac 840 gccagcccgc ccgcaaggag aaggccc atg tcc cgg cat ccc atg tcc cgg cag 894 Met Ser Arg His Pro Met Ser Arg Gln 1 5 cac gca tca cgg cct ctg acg ccg ccc ccc tat tcc cct ccc gat ccg gcc 945 His Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala 10 15 20 25 tgg ctc gaa ggc tcc atc atg gct gcc cgc ggc gaa gcc aaa ggg cgc gcc 996 Trp Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala 30 35 40 ggc gaa cgc tac gag atc acc gag gcg agc caa ggc aag tat cac tac gtc 1047 Gly Glu Arg Tyr Glu Ile Thr Glu Ala Ser Gln Gly Lys Tyr His Tyr Val 45 50 55 60 tac ggc ccg tat gcc acg ccc gtg ctg cgc gtg gat ccg ggc gcg gtg gtg 1098 Tyr Gly Pro Tyr Ala Thr Pro Val Leu Arg Val Asp Pro Gly Ala Val Val 61 65 70 75 agc gcc gag acc cac gac gcc atg gaa ggg cag atc aaa agc gag agc gac 1149 Ser Ala Glu Thr His Asp Ala Met Glu Gly Gln Ile Lys Ser Glu Ser Asp 80 85 90 aag ccg tcg gaa atc ctc aac ttt ccc ttc ctc aac ccg cag aat ggg ccg 1200 Lys Pro Ser Glu Ile Leu Asn Phe Pro Phe Leu Asn Pro Gln Asn Gly Pro 95 100 105 110 atc ttc gtc aac ggc gcg gag aag ggc gac tgc ctc gcc gtc tat atc cac 1251 Ile Phe Val Asn Gly Ala Glu Lys Gly Asp Cys Leu Ala Val Tyr Ile His 115 120 125 gac atc gtg ccg cgc ggg ccg cag ccc atc ggc acc acc tgc atc atg ccg 1302 Asp Ile Val Pro Arg Gly Pro Gln Pro Ile Gly Thr Thr Cys Ile Met Pro 130 135 140 145 gag ttc ggc ggc ctc gtc ggc aca ggc gac acc gcg atc ctc aac gcg cct 1353 Glu Phe Gly Gly Leu Val Gly Thr Gly Asp Thr Ala Ile Leu Asn Ala Pro 150 155 160 ttg ccg gag atc gtg aag aag ctg cac gtg gat ccg gcg act ggc gtg cgc 1404 Leu Pro Glu Ile Val Lys Lys Leu His Val Asp Pro Ala Thr Gly Val Arg 165 170 175 tgg aac gag cga atc agc ctg ccc tac cag ccc ttc atc ggc acc atc ggc 1455 Trp Asn Glu Arg Ile Ser Leu Pro Tyr Gln Pro Phe Ile Gly Thr Ile Gly 180 185 190 195 acc gcg ccg gag atc gag gcc att tcc tcc ctc gtc ccc gac tat tac ggc 1506 Thr Ala Pro Glu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Asp Tyr Tyr Gly 200 205 210 ggc aac atg gac ctg ccg gac gtg gct ccc ggc gcc gtc atc tac ctg ccg 1557 Gly Asn Met Asp Leu Pro Asp Val Ala Pro Gly Ala Val Ile Tyr Leu Pro 215 220 225 230 gtc cat gcg ccc ggc gcc ctg ctc tat ctc ggc gat tgc cac gcc gcg cag 1608 Val His Ala Pro Gly Ala Leu Leu Tyr Leu Gly Asp Cys His Ala Ala Gln 235 240 245 ggc gat ggg gag ctg tgt gga ttc gcc atc gag cat ccc acc gtg acc acg 1659 Gly Asp Gly Glu Leu Cys Gly Phe Ala Ile Glu His Pro Thr Val Thr Thr 250 255 260 gtg cag atc gac ctc atc aag ggg tgg aac ttc cgc tgg ccg cgg ctg gag 1710 Val Gln Ile Asp Leu Ile Lys Gly Trp Asn Phe Arg Trp Pro Arg Leu Glu 265 270 275 280 acc cac gac cgc atc atg acc atc ggc tcc ggc cgc ccc atg gag gac gcc 1761 Thr His Asp Arg Ile Met Thr Ile Gly Ser Gly Arg Pro Met Glu Asp Ala 285 290 295 gcc cgc atc gcc tat cga gaa ctg gtg cgc tgg atg gcc gcc gac tac ggg 1812 Ala Arg Ile Ala Tyr Arg Glu Leu Val Arg Trp Met Ala Ala Asp Tyr Gly 300 305 310 315 tat gac gag ctg gaa gcc tac atg ctg ctg acg cag gcc ggg cac ctc agg 1863 Tyr Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Met Leu Leu Thr Gln Ala Gly His Leu Arg 320 325 330 gtc ggc aac atg gtg gac ccg aag tac acg ctc ggc gcc tcc gtc gac aag 1914 Val Gly Asn Met Val Asp Pro Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Ser Val Asp Lys 335 340 345 acg ctt ctc ggc gcg gcc tgagctacgc acgcctggca atggctccgg cgatcgcacg 1972 Thr Leu Leu Gly Ala Ala 350 355 atggcgccag cctccggtcg agccacctac gcccgcagat cctgccactc gggatggcgg 2032 cggaactgcg tggcaacgta tgaacacagc ggggtgatct tgaagccctc cgcgcgggca 2092 tcggcgatga gggcatccac cagacgcgca gcgatgccgc gcccttcgaa ggccggcggc 2152 acgccgtatg ggtgacgacg aacgggccgt cgccgcggcg ctggtagctc agttccgctt 2212 ccgcaccccc gccgaggcga atgacataac ggcctccgcc cggcccctcc tcgcgctgaa 2272 tctcttggcg agcatcttgg ctggcgtcgt tcatcatgcc tccgtcggtg gtggtgcccc 2332 caccataacg gcgatgctat cccatcagtt catttcgcgc gcctcaagcc cgcgagcgtg 2392 cggaaggcat ctgcgagccc ctccttggac agcggctgca cgaagttgcg aatatagggc 2452 gctgtctccc aggacacgga aacgatgccg tccaccacgg cctcggtctc gacgccgaaa 2512 tcctccagcg cgcgcggcag gccgaggcgg gcgtagaagg ccagcatgtc cgccatgaaa 2572 tcggcgtccc ggccttccgc cagcaattgc accagaagcc cgagggccac ctgttcgcca 2632 tgcagcgccc gcgccacctc cggcaccgtg gagaagccgc gcgtgagaga atgggcgatg 2692 gacaggcccc cgctttcgaa ggcgaggccg gagaggagga tggtcgcctc caccacgcgc 2752 tccaccgcct cgtccgccgt cttgcgggcg acggcggcca ccgccgcctc gccatccgcg 2812 cggatggcac ggtagcaggc atcggcgata gtgacggcga gcgtggtggg gcgacccttg 2872 aagaaattca gcccgccggc ggcggcgcac tgctctactt caaacttctt ggacagcgca 2932 tcgccgatgc ccgccacgaa gaagcgcgcc ggcgcctgga cgatgacgga tgtatccacc 2992 agcaccgcat cggggttggc atccatcagc cgcacttcgc tcagcacgtg ctcggcggtg 3052 tagaccacca cgaggcggga ggtggggctg tcgttggagg cgatggtcgg cacgatcacg 3112 agcggcgtgc gcagcgcgat gcgcacgccc ttggcggtgt cgatggcctt gccgccgccg 3172 acaccgatca ccacgtcagc gcccgccgcc cgcgccgccg cggccagctt gtccatctcc 3232 gccgccgtgc attccccgcc gaaggtggcg aaggtgaccg cctcggcctc cgccagctca 3292 gccttcaggc gcgccccgag cagatccatc acgatggcgt cggccaccac gaagggccgg 3352 cggcgtgcag gcgcacgagc gcgcccagct caccaagtgc ctcggggccc tggatgtagc 3412 gggccggaga cccgaacgcg cgcacgctca tgcgtcaccc cagtggaaat cgcgcttgcc 3472 gccatccatg cagatcaagg cgccgttgat gaaagccgcc tgcgtggagc agaggaaggc 3532 gacgagcgcc cccacctcct ccggctggca gaagcggccg acgggattct gtccggtgat 3592 caccgcccgc ttctccggcg agaaggtcga tgaaatcggt ggccacatag ccgggcgatg 3652 gcgttcacgg tgatgccgtc cgcccccacc tccttcgcca ccgtgcgggt gaagccgagc 3712 acgccggcct tggccgccga ataattcgcg acgcctggcc ggccgccgcc ggtgacgttc 3772 atggacgagg tgttgacgat gcggccgaag ccatttgcgc gcatcagtgg aatggcgtgc 3832 ttgctgcaca ggaaggtgct gcgcaggtgg gtggagacga tgatgtcgaa gtcgtcgatc 3892 tccatctccg ccacacgccg cccgagatgg cgcccacccg ccccggcatt gttcacgaga 3952 atgtcgaggc gcccgaaggc gtccgcagca gcactcacga cgccagccgc gcccgcctcg 4012 tcggccacgt cgcccgcgtg ccgccgcctc gtacccagcc tgccgcagct ccttggcgca 4072 gtggcggcgc cctccgcgtc gatgtcgttg atgacgatgc gcgcgccctc ggcggcgagc 4132 cccaacgcct ccgcccggcc gatgccggcg ccgcgccggt gacaagggcg acccgccctt 4192 tcaatcccag atccatcttg gtctccgatc agcccttcac cgcgcccgcg ccgagcccct 4252 gaatgaagta ttggctcagc aaggcgaagg cgccgaacag cggcaaagcg atgagggtgg 4312 agccggccat gatctccccc cagcgcagat cgaacgaacc gaccatggag gccagcccca 4372 ccggcacggt cttgttggca tcggagccga tcatgatcag cgcataggtg tagtccgtcc 4432 acgacaggag gaaggagaag atggccaccg tgatgagccc cggcagcgac agcggcagca 4492 ccacccgcag gaaggcgccg agccgtgtgc agccatccac catcgccgcc tcttccagct 4552 cgaacggcat gctcttgaag aagccccaca ggaaccacac gccgagcggc agcgtgaggg 4612 tgagatggga gacgatgacg ctcgccagcg tgtcgcccaa ccccagcttg gcgaagatgg 4672 agaacatggg aatggcgatg agcagcggcg ggaacatgta ggcgtagagc atcgccccca 4732 cgatgagccc cttgccgcgg atgcggtggc gcgtgaccgc ataggcgatc atgatcgaga 4792 acaccatggt caccgccacc gtcaccgccg cagacgatga gggaattc 4840 <210> 8 <211> 355 <212> PRT <213> Xanthobacter flavus <220> <400> 8 Met Ser Arg His Pro Met Ser Arg Gln His Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro 1 5 10 15 Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala Trp Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg 20 25 30 35 Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala Gly Glu Arg Tyr Glu Ile Thr Glu Ala Ser Gln 40 45 50 Gly Lys Tyr His Tyr Val Tyr Gly Pro Tyr Ala Thr Pro Val Leu Arg Val Asp 55 60 65 70 Pro Gly Ala Val Val Ser Ala Glu Thr His Asp Ala Met Glu Gly Gln Ile Lys 75 80 85 90 Ser Glu Ser Asp Lys Pro Ser Glu Ile Leu Asn Phe Pro Phe Leu Asn Pro Gln 95 100 105 Asn Gly Pro Ile Phe Val Asn Gly Ala Glu Lys Gly Asp Cys Leu Ala Val Tyr 110 115 120 125 Ile His Asp Ile Val Pro Arg Gly Pro Gln Pro Ile Gly Thr Thr Cys Ile Met 130 135 140 Pro Glu Phe Gly Gly Leu Val Gly Thr Gly Asp Thr Ala Ile Leu Asn Ala Pro 145 150 155 160 Leu Pro Glu Ile Val Lys Lys Leu His Val Asp Pro Ala Thr Gly Val Arg Trp 165 170 175 180 Asn Glu Arg Ile Ser Leu Pro Tyr Gln Pro Phe Ile Gly Thr Ile Gly Thr Ala 185 190 195 Pro Glu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Asp Tyr Tyr Gly Gly Asn Met 200 205 210 215 Asp Leu Pro Asp Val Ala Pro Gly Ala Val Ile Tyr Leu Pro Val His Ala Pro 220 225 230 Gly Ala Leu Leu Tyr Leu Gly Asp Cys His Ala Ala Gln Gly Asp Gly Glu Leu 235 240 245 250 Cys Gly Phe Ala Ile Glu His Pro Thr Val Thr Thr Val Gln Ile Asp Leu Ile 255 260 265 270 Lys Gly Trp Asn Phe Arg Trp Pro Arg Leu Glu Thr His Asp Arg Ile Met Thr 275 280 285 Ile Gly Ser Gly Arg Pro Met Glu Asp Ala Ala Arg Ile Ala Tyr Arg Glu Leu 290 295 300 305 Val Arg Trp Met Ala Ala Asp Tyr Gly Tyr Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Met Leu 310 315 320 Leu Thr Gln Ala Gly His Leu Arg Val Gly Asn Met Val Asp Pro Lys Tyr Thr 325 330 335 340 Leu Gly Ala Ser Val Asp Lys Thr Leu Leu Gly Ala Ala 345 350 355 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 9 cgccagaagc tttaaggagg aatagcccat gtcccggcat cccatgtccc ggcagc 56 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 10 taggtgtcta gaccggaggc tgcc 24

Claims

서열번호 8에 나타내는 아미노산 번호 1～355로 표시되는 아미노산 서열을 가진, L체의 아미노산 아미드의 아미드 결합을 입체선택적으로 가수분해하는 효소.
제1항 기재의 효소의 효소 단백질을 코딩하는 DNA.
제2항에 있어서,

서열번호 7에 나타내는 염기서열 내의 염기번호 868～1932로 표시되는 염기서열을 가진 DNA.
제2항 또는 제3항 기재의 DNA가 도입된 재조합 미생물.
제4항에 있어서,

재조합 미생물이 대장균(Escherichia coli)인 재조합 미생물.
제1항 기재의 효소를 L체의 아미노산 아미드에 작용시켜 L체의 아미노산으로 변환시키는, L체의 아미노산의 제조 방법.
제6항에 있어서,

L체의 아미노산 아미드가 식(1)으로 표시되는 화합물인 제조 방법.

[화학식 1]

(식 1 중의 R₁은 수소, 탄소수 1～4의 알킬기, 탄소수 1～4의 알킬기로서 그 중의 하나 또는 복수의 수소가, 히드록시기, 메톡시기, 머캅토기, 메틸 머캅토기, 아미노기, 구아닐기, 카르복시기, 카르복사미드기, 할로겐기, 페닐기, 히드록시페닐기, 또는 이미다졸릴기로 치환된 알킬기, 페닐기, 치환 페닐기, 복소환기, 치환 복소환기, 또는 R₁이 결합하고 있는 탄소 원자 및 그 탄소 원자에 결합하고 있는 아미노기와 일체로 되어 질소함유 복소환을 형성할 수 있는 기이고, R₂는 수소, 또는 탄소수 1～4의 알킬기를 나타낸다. 단, R₁과 R₂가 동시에 수소인 경우는 제외함)
제6항에 있어서,

L체의 아미노산 아미드가 식(2)으로 표시되는 화합물인 제조 방법.

[화학식 2]

(식(2) 중의 R은 탄소수 1～4의 저급 알킬기를 나타냄.)
제8항에 있어서,

식(2) 중의 R이 메틸기인 제조 방법.