JP5261709B2 - アミノ酸、ペプチド、蛋白質に脂肪酸を付加する方法 - Google Patents
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Description
(Streptomyces mobaraensis由来のアシル基転移酵素の精製)
Streptomyces mobaraensis NBRC 13819を寒天プレート(水1L中に酵母抽出物4g、麦芽抽出物10g、グルコース4g、寒天20gを含み、pHを7.3に調整)に無菌的に移し、30℃で7日間静止培養した。1ループ相当の寒天培養物を、30mLの前培養培地(水1L中にグルコース10g、デキストリン10g、NZアミン(A型)5g、酵母抽出物5g、CaCO3 1gを含み、pHを6.5に調整)を含んでいる300mLの振盪フラスコ中でインキュベートし、120ストローク/分で往復振盪をしながら30℃でインキュベートした。前培養物の1.8mLを50mLの培地(水1L中にビーフ抽出物40g、可溶性澱粉40g、ポリペプトン20g、K2HPO4 2g、MgSO4 20gを含み、pHを7.0に調整)を含んでいる500mLフラスコに添加した。見出された限りにおいては、これが最適の培地であった。120ストローク/分で往復振盪をしながら30℃で8日間、細胞をインキュベートした。培養した後に、培養液を4℃で20,000g、30分間遠心分離により回収した。
(Streptomyces mobaraensis由来のアシル基転移酵素を用いたアミノ酸、ペプチドへの脂肪酸付加反応)
以下で述べるアミノ酸誘導体や、ペプチドへ脂肪酸を付加させる反応は全て、0.1Mトリス緩衝液(pH7.0)の中で撹拌しながら30℃で行った。YMCパックC8 A-202カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより、反応生成物、加水分解副生成物、および基質の測定をした。フェニル化合物は260nmで、脂肪酸メチルエステル、カプサイン誘導体、N-脂肪酸-アミノ酸/N-脂肪酸-アシルペプチドメチルエステル、および脂肪酸は210nmで検出した。高速液体クロマトグラフィーの溶出液として、ヘキサノイルおよびオクタノイル化合物の解析には0.05%リン酸を含む50%メタノール溶液、フェニル化合物の解析には0.05%リン酸を含む65%メタノール溶液、ラウロイル化合物の解析には0.05%リン酸を含む80%メタノール溶液、ミリストイル化合物の解析には0.05%リン酸を含む90%メタノール溶液を使用した。これらを移動相として用いて、室温において流速0.5mL/分で溶出させた。
(Streptomyces mobaraensis由来のアシル基転移酵素を用いたタンパク質への脂肪酸付加反応)
基質のラウリン酸メチルエステル (終濃度 20 mM) およびタンパク質リゾチーム (終濃度5 mg/mL) を、0.5 mM コバルトイオンを含む100 mMトリス塩酸バッファーに溶解後、酵素溶液を 2 U/mL となるように添加し、反応溶液とした。反応は、37℃で緩やかに攪拌しながら行った。また、コントロールとして、基質のみを加えた溶液(コントロール1)およびリゾチームと酵素を加えた溶液(コントロール2)についても、同様に反応を行った。反応 72 時間後、コントロール1および2には、変化が見られなかったが、反応溶液は白濁し、析出物が見られた。反応溶液を回収し、15,000 rpmで10 分間遠心分離し、上清を除去した後、残った沈殿物をイオン交換水で洗浄した。
Claims (18)
- ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)またはストレプトマイセス・ルテイレティクリー(Streptomyces luteireticuli)に由来するアシル基転移酵素の存在下で、脂肪酸エステルを、アミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体、またはタンパク質とエステル交換反応をさせることを特徴とする、脂肪酸付加アミノ酸誘導体、脂肪酸付加ペプチドもしくは脂肪酸付加ペプチド誘導体、または脂肪酸付加タンパク質を作製する方法。
- ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)またはストレプトマイセス・ルテイレティクリー(Streptomyces luteireticuli)に由来するアシル基転移酵素の存在下で、脂肪酸エステルを、β-ラクタム系抗生物質の前駆体もしくはβ-ラクタム系抗生物質の誘導体の前駆体、またはカプサイシンの前駆体もしくはカプサイシンの誘導体の前駆体とエステル交換反応をさせることを特徴とする、β-ラクタム系抗生物質もしくはβ-ラクタム系抗生物質の誘導体、またはカプサイシンもしくはカプサイシンの誘導体を作製する方法。
- 前記エステル交換反応が水系で行われることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)に由来するアシル基転移酵素が、ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)NBRC 13819に由来するアシル基転移酵素である請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ストレプトマイセス・ルテイレティクリー(Streptomyces luteireticuli)に由来するアシル基転移酵素が、ストレプトマイセス・ルテイレティクリー(Streptomyces luteireticuli)NBRC 13422に由来するアシル基転移酵素である請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪酸エステルが脂肪酸メチルエステルである特徴とする請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪酸メチルエステルが、ラウリン酸メチルエステル、ミリスチン酸メチルエステル、n−ヘキサン酸メチルエステル、およびn−オクタン酸メチルエステルからなる群から選択されたことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記脂肪酸メチルエステルがラウリン酸メチルエステルであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記芳香族エステルがフェノキシ酢酸メチルエステル、またはフェノキシ酢酸エチルエステルである特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチドまたはペプチド誘導体が、ジペプチド、およびジペプチドエステルからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記ジペプチドエステルがジペプチドメチルエステルである請求項10に記載の方法。
- 前記アミノ酸誘導体がアミノ酸のエステルである請求項1に記載の方法。
- 前記アミノ酸のエステルがL−アミノ酸またはD−アミノ酸のメチルエステルである請求項12に記載の方法。
- 前記タンパク質がリジン残基を有するタンパク質である請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がC末端またはN末端にリジン残基を有するタンパク質である請求項14に記載の方法。
- 前記タンパク質がリゾチームである請求項15に記載の方法。
- 前記β−ラクタム系抗生物質の前駆体または前記β−ラクタム系抗生物質の誘導体の前駆体が6−アミノペニシラン酸または7−アミノデアセトキシセファロスポラン酸であり、前記β−ラクタム系抗生物質または前記β−ラクタム系抗生物質の誘導体がペニシリンV、ジヒドロペニシリンF、ペニシリンK、またはデアセトキシセファロスポリンVである請求項2に記載の方法。
- 前記カプサイシンの前駆体または前記カプサイシンの誘導体の前駆体がバニリルアミンであり、前記カプサイシンまたは前記カプサイシンの誘導体がオクタノイルバニリルアミド、ラウロイルバニリルアミド、またはミリストイルバニリルアミドである請求項2に記載の方法。
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