JP4501689B2 - ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できる新規酵素に関する。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する新規酵素、この酵素を生産する微生物、およびこの酵素もしくは微生物を使用するジペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、L−アラニル−L−グルタミンはL−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。
【0003】
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、N−ベンジルオキシカルボニルアラニン(以下Z−アラニンと称する)と保護L−グルタミンを用いる方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.,34,739(1961)、Bull.Chem.Soc.Jpn.,35,1966(1962))、Z−アラニンと保護L−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.,37,200(1964))、Z−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法(特開平1−96194号公報)、2−置換−プロピオニルハロイドを原料として、N−(2−置換)−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として生成する方法(特開平6−234715号公報)等が知られている。
【0004】
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは光学活性中間体の使用が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
【0005】
一方、酵素を用いたペプチドの代表的製造法としては、N保護、C無保護のカルボキシ成分とN無保護、C保護のアミノ成分を用いる縮合反応(反応1)、および、N保護、C保護のカルボキシ成分とN無保護、C保護のアミン成分を用いる置換反応(反応2)が広く知られている。反応1の例としては、Z−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのZ-アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法(特開昭53−92729号公報)、反応2の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法( Biochemical J., 163, 531 (1977))が挙げられる。N無保護、C保護のカルボキシ成分を用いる方法の報告研究例は極めて少なく、N無保護、C保護のカルボキシ成分とN無保護、C保護のアミン成分を用いる置換反応(反応3)の例としては特許WO 90/01555があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。N無保護、C保護のカルボキシ成分とN無保護、C無保護のアミン成分を用いる置換反応(反応4)の例としては、特許EP 278787A1とEP 359399B1があり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の反応1から反応4の方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応4の範疇に入る反応である。
【0007】
しかしながら、反応4の先行例(特許EP 278787A1)には以下の大きな問題点があった。(1)ペプチド生成速度が極めて遅い、(2)ペプチド生成収率が低い、(3)生産できるペプチドが比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものに限られる、(4)添加酵素量が極めて大量、(5)カビ、酵母、植物に由来する比較的高価なカルボキシペプチダーゼ標品が必要である。反応4において、細菌およびサッカロミセス(Saccharomyces)属以外の酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミン等のペプチドの製造方法についても全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
【0008】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できる新規酵素を提供することを課題とする。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する新規酵素、この酵素を生産する微生物、およびこの酵素もしくは微生物を使用する安価なペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、新たに見出したエンペドバクター(Empedobacter)属などに属する細菌などからペプチドを効率良く生成する新規酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕 カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属由来の酵素。
〔2〕 カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有し、下記(i)〜(iv)の条件下におけるジペプチド生成反応で、L−アラニル−L−グルタミンの生成速度が0.03mM/分以上となる能力を有する酵素。
(i)前記カルボキシ成分が、L−アラニンメチルエステル塩酸塩(100mM)
(ii)前記アミン成分が、L−グルタミン(200mM)
(iii)pHが、9.0
(iv)均一に精製された酵素の添加量が、タンパク量として0.61mg/ml未満
〔3〕 前記カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、上記〔1〕あるいは〔2〕に記載の酵素。
〔4〕 前記アミン成分として、アミノ酸、C保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔5〕 pHが6.5〜10.5の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、上記〔1〕から〔4〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔6〕 温度条件が0〜60℃の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、上記〔1〕から〔5〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔7〕 セリン酵素阻害剤のフェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されず、p-ニトロフェニル-p'-グアニジノベンゾエートで阻害される、上記〔1〕から〔6〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔8〕 SDS−ゲル電気泳動による分子量が約75kDa、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が約150kDaである、上記〔1〕から〔7〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔9〕 上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載の酵素を生産する微生物。
〔10〕 エンペドバクター ブレビス(Empedobacter brevis) FERM BP−8113株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託移管日;2002年7月8日)、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)である、上記〔9〕に記載の微生物。
〔11〕 上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載の酵素または当該酵素の含有物を用いて、カルボキシ成分とアミン成分とからジペプチドを生成する、ジペプチドの製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
以下、本発明の実施の形態について、(1)本発明の酵素を生産する微生物、(2)微生物の培養、(3)酵素の精製、(4)酵素の性質、(5)ジペプチドの製造方法、の順に詳細に説明する。
【0013】
(1)本発明の酵素を生産する微生物
本発明の酵素は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するものであればよく、このような酵素を生産する微生物は特に限定されるものではない。本明細書において、カルボキシ成分とは、ペプチド結合(−CONH−)におけるカルボニル部位(CO)を供給する成分のことをいい、アミン成分とは、ペプチド結合におけるアミノ部位(NH)を供給する成分のことをいう。また、本明細書において、単に「ペプチド」というときは、特に断らない限り、少なくとも1つ以上のペプチド結合を有するポリマーのことをいう。また、本明細書において「ジペプチド」とは、1つのペプチド結合を有するペプチドのことをいう。
【0014】
本発明の酵素を生産する微生物としては、例えばエンペドバクター属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはエンペドバクター ブレビス(Empedobacter brevis)ATCC 14234株(FERM P−18545株)、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー(Sphingobacterium sp.)FERM BP−8124株が挙げられる。エンペドバクター ブレビスATCC 14234株(FERM P−18545株、FERM BP−8113株)、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー(Sphingobacterium sp.)FERM BP−8124株は、本発明者らが、カルボキシ成分とアミン成分からペプチドを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。エンペドバクター ブレビス(Empedobacter brevis)ATCC 14234株(FERM P−18545株)、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー(Sphingobacterium sp.)FERM BP−8124株と同じ菌学的性質を有する微生物も、本発明の酵素を生産する微生物である。
【0015】
エンペドバクター ブレビス ATCC 14234株(FERM P−18545株)は、2001年10月1日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地 中央第6)に寄託され、FERM P−18545の受託番号が付与され、さらに平成14年7月8日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、FERM BP−8113が付与された微生物である(微生物の表示:Empedobacter brevis AJ 13933株)。
【0016】
スフィンゴバクテリウム エスピー AJ 110003株は、2002年7月22日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、FERM BP−8124株の受託番号が付与されている。尚、AJ 110003株(FERM BP−8124株)は、以下の分類実験により、上述のスフィンゴバクテリウム エスピーであることが同定された。FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)は、桿菌(0.7〜0.8×1.5〜2.0μm)、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色、30℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、OFテスト(グルコース)陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの酸生成陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β―ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、L−アラビノース資化陰性、D−マンノース資化陽性、D−マンニトール資化陰性、N−アセチル−D−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、n−カプリン酸資化陰性、アジピン酸資化陰性、dl−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム マルチボラムあるいはスフィンゴバクテリウム スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。更に16SrRNA遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム マルチボラムと最も高いホモロジー(98.8%)を示したが、完全に一致する株はなかったことより、本菌株をスフィンゴバクテリウム エスピー(Sphingobacterium sp.)と同定した。
【0017】
本発明の酵素は、上記のようにエンペドバクター ブレビス、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピーなどの菌体から単離・精製することによって得ることができる。また、単離された酵素をもとに遺伝子工学的な手法を用いて、本発明の酵素および当該酵素を生産する微生物を得ることもできる。すなわち、単離・精製した酵素をもとに本発明の酵素をコードするDNAを単離し、これを適当な宿主に導入し、発現させることによっても、本発明の酵素および微生物を作製することができる。また、エンペドバクター ブレビスから得られた本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドなどをもとにプローブを作製し、他の微生物から、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素を得てもよい。種々の遺伝子組換え技法は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)などに記載されている。
【0018】
(2)微生物の培養
本発明の酵素を生産する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【0019】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【0020】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【0021】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【0022】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてpH5〜8、温度15〜40℃の範囲でpHおよび温度を適当に制限しつつ12〜48時間程度培養を行えばよい。
【0023】
(3)酵素の精製
本発明の酵素を精製する例として、エンペドバクター ブレビスからペプチド生成酵素を単離・精製する方法を説明する。まずエンペドバクター ブレビス、例えばFERM BP−8113株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託移管日;2002年7月8日)などの菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。
【0024】
上記のようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Q-Sepharose HP(アマシャム社製)などが挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させてると当該酵素はpH8.5の条件下で非吸着画分に回収される。
【0025】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、MonoS HR(アマシャム社製)などが挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、MonoS HRを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、0.2〜0.5M程度のNaClで溶出される。
【0026】
上記のようにして精製された酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Sephadex 200pg(アマシャム社製)などが挙げられる。
【0027】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する方法等により各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。
【0028】
(4)本発明の酵素の性質
本発明の酵素は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素であるが、以下、本発明の酵素の好ましい形態について、その性質面から説明する。
【0029】
本発明の酵素の好ましい一形態として、ジペプチドの生成速度を1つの指標とした、下記のような能力を有する酵素が挙げられる。すなわち、本発明の酵素の好ましい一形態として、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有し、下記(i)〜(iv)の条件下におけるジペプチド生成反応において、L−アラニル−L−グルタミンの生成速度が、好ましくは0.03mM/分以上、より好ましくは0.3mM/分以上、特に好ましくは1.0mM/分以上となる能力を有する酵素が挙げられる。ジペプチド生成反応の条件は次のとおりである。
【0030】
(i)前記カルボキシ成分が、L−アラニンメチルエステル塩酸塩(100mM)
(ii)前記アミン成分が、L−グルタミン(200mM)
(iii)pHが、9.0
(iv)均一に精製された酵素の添加量が、タンパク量として0.61mg/ml未満
【0031】
上記酵素添加量とは、反応系に添加する酵素の終末添加量を示し、タンパク量として0.01mg/ml以上、好ましくは0.02mg/ml以上の添加が望ましい。「タンパク量として」とは、プロテインアッセイCBB溶液(ナカライ製)を用い、牛血清アルブミンを標準物質としたクマシーブリリアントブルーによる発色法で示した値を用いた。
【0032】
上記のような生成速度は、酵素を用いたペプチド生成のこれまでの常識を遙かに上回るものであり、本発明の酵素は極めて高速にペプチド生成を触媒する能力を有するものである。
【0033】
酵素活性の測定についてより具体的な例を挙げると、アミノ酸エステルとアミンを基質として含むホウ酸緩衝液中で反応させ、生成したペプチドを定量することにより測定できる。さらに具体的な例としては、L−アラニンメチルエステル
100mM、L−グルタミン 200mMを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)を用いて、25℃で数分反応させる方法が挙げられる。
【0034】
本発明に用いられる酵素の活性単位については、L−アラニンメチルエステル 100mM、L−グルタミン 200mMを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)を用いて、25℃で反応させた条件で、1分間に1μmoleのペプチドを生成する酵素量を1単位(U)と定義した。
【0035】
また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸エステルの少なくとも1種以上、アミノ酸アミドの少なくとも1種以上を基質とし得ることを意味する。また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、アミン成分として、アミノ酸、C保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸、C保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸の少なくとも1種以上、C保護アミノ酸の少なくとも1種以上、および、アミンの少なくとも1種以上を基質とし得ることを意味する。カルボキシ成分またはアミノ成分について幅広い基質特異性を有することは、工業生産の場におけるコスト、生産設備などの点で都合のよい原料の選択性が広がるという点で好ましい。
【0036】
カルボキシ成分の具体例を挙げると、例えば、L−アミノ酸エステル、D−アミノ酸エステル、L−アミノ酸アミド、D−アミノ酸アミドなどが挙げられる。また、アミノ酸エステルには、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルもある。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、または、ω−等のアミノ酸のエステルもある。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、n-プロピルエステル、iso-プロピルエステル、n-ブチルエステル、iso-ブチルエステル、または、tert-ブチルエステルなどが挙げられる。
【0037】
アミン成分の具体例を挙げると、例えば、L−アミノ酸、C保護L−アミノ酸、D−アミノ酸、C保護D−アミノ酸、または、アミン等が例示される。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体なども例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
【0038】
また、更に別の側面として、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、ペプチド生成反応における触媒可能なpHの範囲が6.5〜10.5の範囲である酵素が挙げられる。このように広いpH範囲で触媒可能であることは、様々な制約が生じ得る工業的生産において柔軟な対応が可能であるという点で好ましい。ただし、実際にペプチドを生産するにあたっては、酵素の触媒性能を最大限に引き出すように、取得された酵素に応じてさらに至適pHに調整して用いることが好ましい。
【0039】
また、更に別の側面として、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、ペプチド生成反応における触媒可能な温度条件が0〜60℃の範囲である酵素が挙げられる。このように広い温度範囲で触媒可能であることは、様々な制約が生じ得る工業的生産において柔軟な対応が可能であるという点で好ましい。ただし、実際にペプチドを生産するにあたっては、酵素の触媒性能を最大限に引き出すように、取得された酵素に応じてさらに至適温度に調整して用いることが好ましい。
【0040】
(5)ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素または当該酵素を含む含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用させ、ジペプチドを合成せしめるものである。
【0041】
本発明に使用する酵素または酵素含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、酵素または酵素含有物をカルボキシ成分とアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【0042】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【0043】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いてもよいし、本酵素を発現する遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【0044】
なお、培養物、培養菌体、または菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、0.1mMから300mMの範囲で、好ましくは1mMから100mMである。
【0045】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量(有効量)であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、0.01から100ユニット(U)程度、洗浄菌体を用いる場合は1〜500g/L程度である。
【0046】
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、L−アミノ酸エステル、D−アミノ酸エステル、L−アミノ酸アミド、D−アミノ酸アミド等が挙げられる。また、アミノ酸エステルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、n-プロピルエステル、iso-プロピルエステル、n−ブチルエステル、iso-ブチルエステル、tert-ブチルエステル等が例示される。
【0047】
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としては、例えば、L−アミノ酸、C保護L−アミノ酸、D−アミノ酸、C保護D−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
【0048】
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々1mM〜10M、好ましくは0.05M〜2Mであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【0049】
反応温度は0〜60℃でペプチド生成可能であり、好ましくは5〜40℃である。また反応pHはpH6.5〜10.5でペプチド生成可能であり、好ましくはpH7.0〜10.0である。
【実施例】
【0050】
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムのニンヒドリン発色での確認(定性)に加え、定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム:InertsiL ODS−2(GLサイエンス社製)、溶離液:5.0mM 1−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液(pH2.1):メタノール=100:15〜50、流量:1.0mL/min、検出 210nm。
【0051】
(実施例1)微生物の培養(Empedobacter brevis FERM BP-8113)
1L中にグルコース 5g、硫酸アンモニウム 5g、リン酸一カリウム 1g、リン酸二カリウム 3g、硫酸マグネシウム 0.5g、酵母エキス 10g、ペプトン 10gを含む培地(pH6.2)50mLを500mL坂口フラスコに分注し、115℃で15分殺菌した。これに同培地で30℃、16時間培養したエンペドバクター ブレビス FERM BP−8113株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託移管日;2002年7月8日)を1白金耳接種し、30℃、120往復/分で16時間振盪培養を行った。
【0052】
(実施例2)微生物菌体を用いるペプチドの生産
実施例1で得られた培養液を遠心分離(10,000rpm, 15分)し菌体を集め、10mM EDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)に100g/Lになるように懸濁した。懸濁液1mLを、EDTA10mMと下記のカルボキシ成分 200mMと、下記のアミノ酸400mMを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)1mLにそれぞれ添加し、全量を2mLとした後、18℃にて2時間反応をおこなった。この結果、生成したペプチドを表1に示した。
【0053】
【表1】
【0054】
(実施例3)酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは4℃にて行った。実施例1と同様に、Empedobacter brevis FERM BP-8113株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託移管日;2002年7月8日)を培養し、遠心分離(10,000rpm, 15分)によって菌体を集めた。菌体16gを50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)にて洗浄後、同緩衝液40mlに懸濁し、195Wにて45分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離(10,000rpm, 30分)し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に対して一夜透析し、超遠心分離(50,000rpm, 30分)にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)にて予め平衡化したQ−Sepharose HPカラム(アマシャム社製)に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を50mM酢酸緩衝液(pH4.5)に対して一夜透析し、遠心分離(10,000rpm, 30分)にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を50mM酢酸緩衝液(pH4.5)で予め平衡化したMono Sカラム(アマシャム社製)に供し、0〜1M NaClを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を1M NaClを含む50mM酢酸緩衝液(pH4.5)で予め平衡化したSuperdex 200pg カラム(アマシャム社製)に供し、1M NaClを含む同緩衝液(pH4.5)を流すことによりゲル濾過を行い、活性画分溶液を得た。これらの操作により、本発明に使用されるペプチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は12.2%、精製度は707倍であった。
【0055】
(実施例4)酵素の分子量測定
(SDS−ゲル電気泳動)
実施例3の方法により得られた精製酵素画分0.3μg相当をポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動緩衝液には0.3%(w/v)トリス、1.44%(w/v)グリシン、0.1%(w/v)ラウリル硫酸ナトリウムを、ポリアクリルアミドゲルはゲル濃度10〜20%の濃度勾配ゲル(マルチゲル10−20、第一化学薬品製)、分子量マーカーはファルマシア製分子量マーカーを用いた。電気泳動終了後、クーマシーブリリアントブルーR−250によってゲルを染色し、分子量約75kDa位置に均一なバンドが検出された。
【0056】
(ゲル濾過)
実施例3の方法により得られた精製酵素画分を1M NaClを含む50mM酢酸緩衝液(pH4.5)で予め平衡化したSuperdex 200pg カラム(アマシャム社製)に供し、1M NaClを含む同緩衝液(pH4.5)を流すことによりゲル濾過を行い、分子量を測定した。検量線を作成するための分子量既知の標準タンパクとしてはファルマシア製分子量マーカーを用いた。この結果、得られた酵素の分子量は約150kDaであった。
【0057】
SDS−ゲル電気泳動とゲル濾過の結果より、本酵素は分子量約75kDaのホモダイマーであることが示唆された。
【0058】
(実施例5)酵素の至適pH
L−アラニンメチルエステル塩酸塩とL−グルタミンからL−アラニル−L−グルタミンを生成する反応におけるpHの影響を検討した。緩衝液としては、酢酸緩衝液(pH3.9〜5.4)、MES緩衝液(pH5.4〜6.4)、リン酸緩衝液(pH6.0〜7.9)、ホウ酸緩衝液(pH7.8〜9.3)、CAPS緩衝液(pH9.3〜10.7)、およびK2HPO4−NaOH緩衝液(pH10.8〜11.6)を用いた。100mM L−アラニンメチルエステル、200mM L−グルタミン、10mMのEDTAを含む100mMのそれぞれの緩衝液100μlに実施例3で得られたMonoS画分酵素(約180U/ml)を1μl加え、18℃、5分間反応させ、反応に対するpHの影響を測定した。ホウ酸緩衝液(pH9.3)を用いた場合の活性を100%とした結果を第1図に示した。この結果、本酵素の至適pHは8〜9.5であった。
【0059】
(実施例6)酵素の至適温度
L−アラニンメチルエステル塩酸塩とL−グルタミンからL−アラニル−L−グルタミンを生成する反応における温度の影響を検討した。100mM L−アラニンメチルエステル、200mM L−グルタミン、10mM EDTAを含む100mMのホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに実施例5で用いたものと同じ酵素画分を1μl加え、各温度にて5分間反応させ、反応に対する温度の影響を測定した。34℃での活性を100%とした結果を第2図に示した。この結果、本酵素の至適温度は30〜40℃であった。
【0060】
(実施例7)酵素の阻害剤
L−アラニンメチルエステル塩酸塩とL−グルタミンを基質に用い、L−アラニル−L−グルタミン生成に与える阻害剤の影響を検討した。表2に示す10mMの各種酵素阻害剤を含む100mMのホウ酸緩衝液(pH9.0)50μlに実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを加え、25℃にて5分間反応させた。尚、o−フェナンスロリン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、p−ニトロフェニル−p'−グアニジノベンゾエートについては50mMになるようにメタノールに溶解したものを使用した。各条件での酵素活性は酵素阻害剤を加えない条件でのL−アラニル−L−グルタミン生成を100とした場合の相対活性で示した。結果を表2に示す。この結果、本酵素は、セリン酵素阻害剤の内、フェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されないが、p−ニトロフェニル−p'−グアニジノベンゾエートで阻害される性質を示した。
【0061】
【表2】
【0062】
(実施例8)L−アラニンメチルエステルとL−グルタミンからのL−アラニル−L−グルタミンの生産
実施例5で用いたものと同じ酵素画分3μlを、100mMのL−アラニンメチルエステル塩酸塩、200mMのL−グルタミン、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、18℃にて反応した。この結果、第3図に示すように、酵素添加区では、反応60分で83mMのL−アラニル−L−グルタミン(L-Ala-L-Gln)が生成し、副成するL-Ala-L-Ala-L-Glnは1.3mMであった。一方、酵素無添加区でのL-Ala-L-Gln生成はほとんど認められず、反応120分で0.07mM程度であった。
【0063】
(実施例9)L−アラニル−L−グルタミンの生産に与えるL−グルタミン濃度の影響
実施例5で用いたものと同じ酵素画分1μlを、100mMのL−アラニンメチルエステル塩酸塩、表3に示す濃度のL−グルタミン、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、18℃にて2時間反応した。この結果を表3に示した。
【0064】
【表3】
【0065】
(実施例10)酵素の基質特異性(1)
カルボキシ成分としてL−アミノ酸エステルを用いた場合のエステル特異性を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表4に示す100mMのカルボキシ成分、200mM L−グルタミン、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて2時間反応した。この反応で生成したL-Ala-L-Gln量を表4に示した(表4中、HClは塩酸塩を示す)。
【0066】
【表4】
【0067】
(実施例11)酵素の基質特異性(2)
カルボキシ成分にL−アラニンメチルエステル、アミン成分に各種のL−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、100mMのL−アラニンメチルエステル塩酸塩、150mMの表5に示すL−アミノ酸、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表5に示した(+印は、ペプチドの生成は確認されているが、標準品がなく定量できなかったもの、trは微量を示す)。
【0068】
【表5】
【0069】
(実施例12)酵素の基質特異性(3)
カルボキシ成分に各種のL−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にL−グルタミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表6に示す100mMのL−アミノ酸メチルエステル塩酸塩(AA-OMe・HCl)、150mMのL−グルタミン、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表6に示した(+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、trは微量を示す)。尚、L-Trp-OMe、L-Tyr-OMeを用いた場合には、反応系にTween-80を終末0.1%になるように添加した。
【0070】
【表6】
【0071】
(実施例13)酵素の基質特異性(4)
カルボキシ成分に各種のL−アミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のL−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表7に示す100mMのL−アミノ酸メチルエステル塩酸塩(AA-OMe・HCl)、表7に示す150mMの各種L−アミノ酸、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表7に示した(trは微量を示す)。尚、L-Trp-OMeを用いた場合には、反応系にTween-80を終末0.1%になるように添加した(+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成が確認されているものを示す)。
【0072】
【表7】
【0073】
(実施例14)酵素の基質特異性(5)
カルボキシ成分に各種のL−またはD−体のアミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のL−またはD−体のアミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表8に示す100mMのアミノ酸メチルエステル塩酸塩(AA-OMe・HCl)、表8に示す150mMの各種アミノ酸、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表8に示した(trは微量を示す)。
【0074】
【表8】
【0075】
(実施例15)酵素の基質特異性(6)
カルボキシ成分に各種のL−アミノ酸アミド、アミン成分に各種のL−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表9に示す100mMのL−アミノ酸アミド塩酸塩(AA-NH2・HCl)、表9に示す150mMのL−アミノ酸、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表9に示した。
【0076】
【表9】
【0077】
(実施例16)酵素の基質特異性(7)
カルボキシ成分に各種のL−アラニンメチルエステル、アミン成分にC保護L−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表10に示す100mMのL−アラニンメチルエステル塩酸塩(Ala-OMe・HCl)、表10に示す150mMのL−アミノ酸アミド、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表10に示した。
【0078】
【表10】
【0079】
(実施例17)酵素の基質特異性(8)
カルボキシ成分に各種のアミノ酸メチルエステル、アミン成分にメチルアミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表11に示す100mMのアミノ酸メチルエステル(AA-OMe・HCl)、表11に示す150mMのメチルアミン、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表11に示した。
【0080】
【表11】
【0081】
(実施例18)酵素の基質特異性(9)
カルボキシ成分としてβ-アミノ酸エステル、あるいはアミン成分としてβ-アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表12に示す100mMのカルボキシ成分、表12に示す150mMのアミン成分、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表12に示した(trは微量を示す)。
【0082】
【表12】
【0083】
(実施例19)酵素の基質特異性(10)
カルボキシ成分としてL−アミノ酸エステル、アミン成分としてペプチドを用いた場合のオリゴペプチド生産を検討した。実施例5で用いたものと同じ酵素画分2μlを、表13に示す100mMのカルボキシ成分、表13に示す150mMのアミン成分、10mMのEDTAを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlに加え、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表13に示した。この結果、本酵素はジペプチド生産のみならず、アミン成分としてペプチドを用いることにより、鎖長の長いペプチドも生産できることが明らかとなった。
【0084】
以上実施例9〜19に示されるように、エンペドバクター ブレビス FERMP BP−8113株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託移管日;2002年7月8日)から得られた本酵素が、極めて基質特異性の広い酵素であることが判明した。
【0085】
【表13】
【0086】
(実施例20)既存酵素とのペプチド生成触媒能力の比較
本酵素のペプチド生成能力を既存酵素と比較した。既存酵素としては、EP 278787A1記載のカルボキシペプチダ−ゼY、EP 359399B1記載のチオールエンドペプチダーゼ(フィシン、パパイン、ブロメライン、キモパパイン)を用い、これらについては、シグマ社製の精製酵素を使用した。本酵素源としては実施例3で均一に精製した酵素を使用した。これら酵素は、タンパク量として表14に示す量を反応系に添加した。反応は、100mM L−アラニンメチルエステルと200mM L−グルタミンを含む100μlのホウ酸緩衝液(pH9.0)に加え、25℃にて反応した。尚、カルボキシペプチダーゼは、1mMのEDTAを含む10mM酢酸緩衝液(pH5.0)で溶解した酵素、チオールエンドペプチダーゼは、2mM EDTA、0.1M KCl、5mM ジチオスレイトールを含む10mM酢酸緩衝液(pH5.0)で溶解した酵素を用いた。これら酵素によるL−アラニル−L−グルタミンの生成速度比を表14に示した。
【0087】
この結果、酵素無添加でも、ごく微量のL−アラニル−L−グルタミン生成が観察され、カルボキシペプチダーゼあるいはチオールエンドペプチダーゼ添加区では、酵素無添加区に比し若干生成速度速まることが観察された。これに対して、本酵素の添加区では圧倒的に速いL−アラニル−L−グルタミン生成速度が観察され、その速度は、カルボキシペプチダーゼY、チオールエンドペプチダーゼに対して、約5,000倍〜100,000倍であった。以上のように、本酵素は、今までに例のない極めて速いペプチド生成速度を有していることが判明した。尚、本酵素の分子量は75000のダイマーであるのに対し、カルボキシペプチダーゼYの分子量は約61000、上記チオールエンドペプチダーゼの分子量は約23000〜36000と報告されているので、分子量当たりのL−アラニル−L−グルタミン生成速度は、実施例に示した単位重量当たりよりも更に本酵素の方が速くなる。
【0088】
【表14】
【0089】
(実施例21)スフィンゴバクテリウム エスピー の菌体を用いるL−アラニル−L−グルタミンの生産
スフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)の培養には、1L中にグルコース 5g、硫酸アンモニウム 5g、リン酸一カリウム 1g、リン酸二カリウム 3g、硫酸マグネシウム 0.5g、酵母エキス 10g、ペプトン 10gを含む培地(pH7.0)50mLを500mL坂口フラスコに分注し、115℃で15分殺菌したものを用いた。これに1L中にグルコース 5g、酵母エキス 10g、ペプトン 10g、NaCl 5gを含む斜面寒天培地(寒天 20g/L、pH7.0)にて30℃、24時間培養したスフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)を1白金耳接種し、30℃、120往復/分、で20時間振とう培養を行った。この培養液1mlを上記培地(50ml/500mL坂口フラスコ)に添加し、30℃、18時間培養した。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として100g/Lになるように10mMのEDTAを含む0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)にて懸濁した。この菌体懸濁液0.1mLに、EDTA10mM、L−アラニンメチルエステル塩酸塩200mM、及びL−グルタミン400mMを含む100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)0.1mLを添加し、全量を0.2mLとした後、25℃にて120分反応をおこなった。このときのL―アラニル−L−グルタミン)の生成量は62mMであった。
【0090】
(実施例22)スフィンゴバクテリウム エスピーからの酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは4℃にて行った。実施例21と同様に、スフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)を培養し、遠心分離(10,000rpm, 15分)によって菌体を集めた。菌体2gを20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)にて洗浄後、同緩衝液8mlに懸濁し、195Wにて45分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離(10,000rpm, 30分)し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)に対して一夜透析し、超遠心分離(50,000rpm, 30分)にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)にて予め平衡化したQ−Sepharose HPカラム(アマシャム社製)に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を20mM酢酸緩衝液(pH5.0)に対して一夜透析し、遠心分離(10,000rpm,30分)にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を20mM酢酸緩衝液(pH5.0)で予め平衡化したSP-Sepharose HPカラム(アマシャム社製)に供し、0〜1M NaClを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
【0091】
(実施例23)酵素画分を用いたL−アラニル−L−グルタミンの生産
実施例22で精製したSP-Sepharose HP画分(約27U/ml)10μlを、111mMのL−アラニンメチルエステル塩酸塩、222mMのL−グルタミン、11mMのEDTAを含む111mMホウ酸緩衝液(pH9.0)90μlに加え、25℃にて120分反応した。はこの結果、酵素添加区では、73mMのL−アラニル−L−グルタミンが生成した。一方、酵素無添加区でのL-Ala-L-Gln生成はほとんど認められず、反応120分で0.07mM程度であった。
【0092】
(実施例24)酵素の基質特異性(11)
スフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)由来酵素の基質特異性を検討した。表15−1から表15−4に示した終末100mMの各種カルボキシ成分と150mMの各種アミン成分、実施例22で精製したSP-Sepharose HP画分酵素(反応液中0.33ユニット添加)を含む10mMのEDTA含有100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlの反応液を用い、25℃にて1.5時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表15に示した。(+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、trは微量を示す)。尚、L-Tyr-OMeを用いた場合には、反応系にTween-80を終末0.1%になるように添加した。また、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
【0093】
【表15−1】
【0094】
【表15−2】
【0095】
【表15−3】
【0096】
【表15−4】
【0097】
(実施例25)酵素の基質特異性(12)
スフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株(寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所;日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、国際寄託日;2002年7月22日)由来酵素のオリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表16に示した、終末100mMの各種カルボキシ成分と150mMの各種アミン成分、実施例22で精製したSP-Sepharose HP画分酵素(反応液中0.33ユニット添加)を含む10mMのEDTA含有100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlの反応液を用い、25℃にて1.5時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表16に示した。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
【0098】
【表16】
【0099】
(実施例26)酵素の基質特異性(13)
実施例5で用いたものと同じ酵素画分を用いて、さらにその基質特異性を検討した。
【0100】
【表17】
【0101】
表17に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素(反応液中0.1ユニット添加)を含む10mMのEDTA含有100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlの反応液を用い、25℃にて表17に示した反応時間で反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表17に示した(+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、trは微量を示す)。
【0102】
(略号)
H-Ala-OMe: L−アラニンメチルエステル塩酸塩
H-p-F-Phe-OMe: p−フルオロ−L−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
H-Cl-F-Phe-OMe: p−クロロ−L−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
H-p-NO2-Phe-OMe: p−ニトロ−L−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
H-t-Leu-OMe: tert−L−ロイシンメチルエステル塩酸塩
H-2-Nal-OMe: 3-(2-ナフチル)−Lアラニンメチルエステル塩酸塩
H-Aib-OMe: α-アミノイソブチリックアシッドメチルエステル塩酸塩
H-N-Me-Ala-OMe: N-メチル−L−アラニンメチルエステル塩酸塩
H-CHA-OMe: β-シクロヘキシル−L−アラニンメチルエステル塩酸塩
H-Ser(tBu)-OMe:O-tert- ブチル−L−セリンメチルエステル塩酸塩
H-Asp(OtBu)-OMe: L−アスパルチックアシッド β-tert-ブチルエステル α-メチルエステル塩酸塩
H-Lys(Boc)-OMe: N-ε-tert-ブトキシカルボニル−L−リジンメチルエステル塩酸塩
H-p-F-Phe-OH: p−フルオロ−L−フェニルアラニン
H-Cl-F-Phe-OH: p−クロロ−L−フェニルアラニン
H-p-NO2-Phe-OH: p−ニトロ−L−フェニルアラニン
H-t-Leu-OH: tert−L−ロイシン
H-2-Nal-OH: 3-(2-ナフチル)−Lアラニン
H-Gln-OH: L−グルタミン
H-Phe-OH: L−フェニルアラニン
H-Ser(tBu)-OH:O-tert- ブチル−L−セリン
H-Asp(OtBu)-OH: L−アスパルチックアシッド β-tert-ブチルエステル
H-Lys(Boc)-OH: N-ε-tert-ブトキシカルボニル−L−リジン
【0103】
(実施例27)酵素の基質特異性(14)
実施例26と同じ酵素画分を用い,オリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表18に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素(反応液中に添加したユニット数は表18に記載)を含む10mMのEDTA含有100mMホウ酸緩衝液(pH9.0)100μlの反応液を用い、25℃にて3時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表18に示した(+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、trは微量を示す)。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
【0104】
【表18】
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法を軽減し、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造することができる新規酵素が提供される。本発明の酵素を用いることにより、効率的なペプチドの工業生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】 図1は、本発明の酵素の至適pHを示す図である。
【図2】 図2は、本発明の酵素の至適温度を示す図である。
【図3】 図3は、L−アラニンメチルエステルとL−グルタミンからのL−アラニル−L−グルタミン生成の経時変化を示す図である。
Claims (4)
- 以下(A)〜(I)の特徴を有する、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するエンペドバクターブレビス由来の酵素。
(A)前記カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とする
(B)前記アミン成分として、アミノ酸、C保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とする
(C)SDS−ゲル電気泳動による分子量が約75kDa、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が約150kDaである
(D)セリン酵素阻害剤のフェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されず、p−ニトロフェニルp’−グアニジノベンゾエートで阻害される
(E)至適pHがpH8.0〜9.5である
(F)至適温度が30〜40℃である
(G)pHが6.5〜10.5の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する
(H)温度条件が0〜60℃の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する
(I)下記(i)〜(iv)の条件下におけるジペプチド生成反応で、L−アラニル−L−グルタミンの生成速度が0.03mM/分以上となる能力を有する
(i)前記カルボキシ成分が、L−アラニンメチルエステル塩酸塩(100mM)
(ii)前記アミン成分が、L−グルタミン(200mM)
(iii)pHが、9.0
(iv)均一に精製された酵素の添加量が、タンパク量として0.61mg/ml未満 - エンペドバクターブレビス(Empedobacter brevis) FERM BP−8113株。
- スフィンゴバクテリウム エスピー FERM BP−8124株。
- 請求項1に記載の酵素または当該酵素の含有物を用いて、カルボキシ成分とアミン成分とからジペプチドを生成する、ジペプチドの製造方法。
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