JPWO2004022733A1 - ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できる新規酵素に関する。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する新規酵素、この酵素を生産する微生物、およびこの酵素もしくは微生物を使用する安価なペプチドの製造方法を提供することである。新たに見出したエンペドバクター属に属する細菌からペプチドを効率良く生成する新規酵素を見出し、安価かつ簡便にペプチドを製造する方法を見出した。

Description

本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できる新規酵素に関する。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する新規酵素、この酵素を生産する微生物、およびこの酵素もしくは微生物を使用するジペプチドの製造方法に関する。

ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンはＬ−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Ｂｕｌｌ，Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として生成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは光学活性中間体の使用が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
一方、酵素を用いたペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミノ成分を用いる縮合反応（反応１）、および、Ｎ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が広く知られている。反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、反応２の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，１６３，５３１（１９７７））が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の報告研究例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許ＷＯ ９０／０１５５５があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１とＥＰ ３５９３９９Ｂ１があり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。

上記の反応１から反応４の方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範鴎に入る反応である。
しかしながら、反応４の先行例（特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１）には以下の大きな問題点があった。（１）ペプチド生成速度が極めて遅い、（２）ペプチド生成収率が低い、（３）生産できるペプチドが比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものに限られる、（４）添加酵素量が極めて大量、（５）カビ、酵母、植物に由来する比較的高価なカルボキシペプチダーゼ標品が必要である。反応４において、細菌およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属以外の酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミン等のペプチドの製造方法についても全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できる新規酵素を提供することを課題とする。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する新規酵素、この酵素を生産する微生物、およびこの酵素もしくは徽生物を使用する安価なペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、新たに見出したエンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属などに属する細菌からペプチドを効率良く生成する新規酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属由来の酵素。
〔２〕 カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有し、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の条件下におけるジペプチド生成反応で、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度が０．０３ｍＭ／分以上となる能力を有する酵素。
（ｉ）前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭ）
（ｉｉ）前記アミン成分が、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）
（ｉｉｉ）ｐＨが、９．０
（ｉｖ）酵素添加景が、タンパク量として０．６１ｍｇ／ｍｌ未満
〔３〕 前記カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕あるいは〔２〕に記載の酵素。
〔４〕 前記アミン成分として、アミノ酸、Ｃ保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔５〕 ｐＨが６．５〜１０．５の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、上記〔１〕から〔４〕のいずれか〜項に記載の酵素。
〔６〕 温度条件が０〜６０℃の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔７〕 セリン酵素阻害剤のフェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されず、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートで阻害される、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔８〕 ＳＤＳ−ゲル電気泳動による分子量が約７５ｋＤａ、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が約１５０ｋＤａである、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載の酵素。
〔９〕 上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の酵素を生産する微生物。
〔１０〕 エンペドバクターブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ） ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）である、上記〔９〕に記載の微生物。
〔１１〕 上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の酵素または当該酵素の含有物を用いて、カルボキシ成分とアミン成分とからジペプチドを生成する、ジペプチドの製造方法。

第１図は、本発明の酵素の至適ｐＨを示す図である。
第２図は、本発明の酵素の至適温度を示す図である。
第３図は、Ｌ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成の経時変化を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、（１）本発明の酵素を生産する微生物、（２）微生物の培養、（３）酵素の精製、（４）酵素の性質、（５）ジペプチドの製造方法、の順に詳細に説明する。
（１）本発明の酵素を生産する微生物
本発明の酵素は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するものであればよく、このような酵素を生産する微生物は特に限定されるものではない。本明細書において、カルボキシ成分とは、ペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）におけるカルボニル部位（ＣＯ）を供給する成分のことをいい、アミン成分とは、ペプチド結合におけるアミノ部位（ＮＨ）を供給する成分のことをいう。また、本明細書において、単に「ペプチド」というときは、特に断らない限り、少なくとも１つ以上のペプチド結合を有するポリマーのことをいう。また、本明細書において「ジペプチド」とは、１つのペプチド結合を有するペプチドのことをいう。
本発明の酵素を生産する微生物としては、例えばエンペドバクター属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはエンペドバクター ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株）、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株が挙げられる。エンペドバクター ブレビスＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株は、本発明者らが、カルボキシ成分とアミン成分からペプチドを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。エンペドパクター ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株）、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株と同じ菌学的性質を有する微生物も、本発明の酵素を生産する微生物である。
エンペドバクター ブレビス ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株）は、２００１年１０月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５の受託番号が付与され、さらに平成１４年７月８日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３が付与された微生物である（微生物の表示：Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＡＪ １３９３３株）。
スフィンゴバクテリウム エスピー ＡＪ １１０００３株は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株の受託番号が付与されている。尚、ＡＪ １１０００３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株）は、以下の分類実験により、上述のスフィンゴバクテリウム エスピーであることが同定された。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの産生陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陰性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陰性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、ｎ−カプリン酸陰性、アジピン酸資化陰性、ｄ１−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム マルチボラムあるいはスフィンゴバクテリウム スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。更に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム マルチボラムと最も高いホモロジー（９８．８％）を示したが、完全に一致する株はなかったことより、本菌株をスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
本発明の酵素は、上記のようにエンペドバクター ブレビス、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピーなどの菌体から単離・精製することによって得ることができる。また、単離された酵素をもとに遺伝子工学的な手法を用いて、本発明の酵素および当該酵素を生産する微生物を得ることもできる。すなわち、単離・精製した酵素をもとに本発明の酵素をコードするＤＮＡを単離し、これを適当な宿主に導入し、発現させることによっても、本発明の酵素および微生物を作製することができる。また、エンペドバクター ブレビスから得られた本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドなどをもとにプローブを作製し、他の微生物から、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素を得てもよい。種々の遺伝子組換え技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｊｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）などに記載されている。
（２）微生物の培養
本発明の酵素を生産する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
（３）酵素の精製
本発明の酵素を精製する例として、エンペドバクター ブレビスからペプチド生成酵素を単離・精製する方法を説明する。まずエンペドバクター ブレビス、例えばＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）などの菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。
上記のようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャム社製）などが挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させてると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ ＨＲ（アマシャム社製）などが挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
上記のようにして精製された酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャム社製）などが挙げられる。
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する方法等により各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。
（４）本発明の酵素の性質
本発明の酵素は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素であるが、以下、本発明の酵素の好ましい形態について、その性質面から説明する。
本発明の酵素の好ましい一形態として、ジペプチドの生成速度を１つの指標とした、下記のような能力を有する酵素が挙げられる。すなわち、本発明の酵素の好ましい一形態として、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有し、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の条件下におけるジペプチド生成反応において、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度が、好ましくは０．０３ｍＭ／分以上、より好ましくは０．３ｍＭ／分以上、特に好ましくは１．０ｍＭ／分以上となる能力を有する酵素が挙げられる。ジペプチド生成反応の条件は次のとおりである。
（ｉ）前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンメチルエヌテル塩酸塩（１００ｍＭ）
（ｉｉ）前記アミン成分が、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）
（ｉｉｉ）ｐＨが、９．０
（ｉｖ）酵素添加量が、タンパク量として０．６１ｍｇ／ｍｌ未満
上記酵素添加量とは、反応系に添加する酵素の終末添加量を示し、タンパク量として０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍｌ以上の添加が望ましい。「タンパク量として」とは、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライ製）を用い、牛血清アルブミンを標準物質としたクマシーブリリアントブルーによる発色法で示した値を用いた。
上記のような生成速度は、酵素を用いたペプチド生成のこれまでの常識を遙かに上回るものであり、本発明の酵素は極めて高速にペプチド生成を触媒する能力を有するものである。
酵素活性の測定についてより具体的な例を挙げると、アミノ酸エステルとアミンを基質として含むホウ酸緩衝液中で反応させ、生成したペプチドを定量することにより測定できる。さらに具体的な例としては、Ｌ−アラニンメチルエステル１００ｍＭ、Ｌ−グルタミン２００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、２５℃で数分反応させる方法が挙げられる。
本発明に用いられる酵素の活性単位については、Ｌ−アラニンメチルエステル１００ｍＭ、Ｌ−グルタミン２００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、２５℃で反応させた条件で、１分間に１μｍｏｌｅのペプチドを生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。
また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸エステルの少なくとも１種以上、アミノ酸アミドの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、アミン成分として、アミノ酸、Ｃ保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸、Ｃ保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸の少なくとも１種以上、Ｃ保護アミノ酸の少なくとも１種以上、および、アミンの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。カルボキシ成分またはアミノ成分について幅広い基質特異性を有することは、工業生産の場におけるコスト、生産設備などの点で都合のよい原料の選択性が広がるという点で好ましい。
カルボキシ成分の具体例を挙げると、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミドなどが挙げられる。また、アミノ酸エステルには、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルもある。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、または、ω−等のアミノ酸のエステルもある。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、または、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどが挙げられる。
アミン成分の具体例を挙げると、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、または、アミン等が例示される。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体なども例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
また、更に別の側面として、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、ペプチド生成反応における触媒可能なｐＨめ範囲が６．５〜１０．５の範囲である酵素が挙げられる。このように広いｐＨ範囲で触媒可能であることは、様々な制約が生じ得る工業的生産において柔軟な対応が可能であるという点で好ましい。ただし、実際にペプチドを生産するにあたっては、酵素の触媒性能を最大限に引き出すように、取得された酵素に応じてさらに至適ｐＨに調整して用いることが好ましい。
また、更に別の側面として、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、ペプチド生成反応における触媒可能な温度条件が０〜６０℃の範囲である酵素が挙げられる。このように広い温度範囲で触媒可能であることは、様々な制約が生じ得る工業的生産において柔軟な対応が可能であるという点で好ましい。ただし、実際にペプチドを生産するにあたっては、酵素の触媒性能を最大限に引き出すように、取得された酵素に応じてさらに至適温度に調整して用いることが好ましい。
（５）ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有する酵素または当該酵素を含む含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用させ、ジペプチドを合成せしめるものである。
本発明に使用する酵素または酵素含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、酵素または酵素含有物をカルボキシ成分とアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を精製・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いてもよいし、本酵素を発現する遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
なお、培養物、培養菌体、または菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は１〜５００ｇ／Ｌ程度である。
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド等が挙げられる。また、アミノ酸エステルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が例示される。
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−ナミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
反応温度は０〜６０℃でペプチド生成可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５でペプチド生成可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。

以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムのニンヒドリン発色での確認（定性）に加え、定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ−２（ＧＬサイエンス社製）、溶離液：５．０ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：メタノール＝１００：１５〜５０、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出 ２１０ｎｍ。
（実施例１）微生物の培養（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３）
１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した。これに同培地で３０℃、１６時間培養したエンペドバクター ブレビスＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
（実施例２）微生物菌体を用いるペプチドの生産
実施例１で得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し菌体を集め、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に１００ｇ／Ｌになるように懸濁した。懸濁液１ｍＬを、ＥＤＴＡ１０ｍＭと下記のカルボキシ成分２００ｍＭと、下記のアミノ酸４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、１８℃にて２時間反応をおこなった。この結果、生成したペプチドを表１に示した。

（実施例３）酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例１と同様に、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。
この超音波破砕液上清を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＭｏｎｏ Ｓカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、活性画分溶液を得た。これらの操作により、本発明に使用されるペプチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は１２．２％、精製度は７０７倍であった。
（実施例４）酵素の分子量測定
（ＳＤＳ−グル電気泳動）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分０．３μｇ相当をポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動緩衝液には０．３％（ｗ／ｖ）トリス、１．４４％（ｗ／ｖ）グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを、ポリアクリルアミドゲルはゲル濃度１０〜２０％の濃度勾配ゲル（マルチゲル１０−２０、第一化学薬品製）、分子量マーカーはファルマシア製分子量マーカーを用いた。電気泳動終了後、クーマシーブリリアントブル−Ｒ−２５０によってゲルを染色し、分子量約７５ｋＤａ位置に均一なバンドが検出された。
（ゲル濾過）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、分子量を測定した。検量線を作成するための分子量既知の標準タンパクとしてはファルマシア製分子量マーカーを用いた。この結果、得られた酵素の分子量は約１５０ｋＤａであった。
ＳＤＳ−ゲル電気泳動とゲル濾過の結果より、本酵素は分子量約７５ｋＤａのホモダイマーであることが示唆された。
（実施例５）酵素の至適ｐＨ
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応におけるｐＨの影響を検討した。緩衝液としては、酢酸緩衝液（ｐＨ３．９〜５．４）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．４〜６．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．８〜９．３）、ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３〜１０．７）、およびＫ_２ＨＰＯ_４−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．８〜１１．６）を用いた。１００ｍＭＬ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのそれぞれの緩衝液１００μｌに実施例３で得られたＭｏｎｏＳ画分酵素（約１８０Ｕ／ｍｌ）を１μｉ加え、１８℃、５分間反応させ、反応に対するｐＨの影響を測定した。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）を用いた場合の活性を１００％とした結果を第１図に示した。この結果、本酵素の至適ｐＨは８〜９．５であった。
（実施例６）酵素の至適温度
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応における温度の影響を検討した。１００ｍＭＬ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭＥＤＴＡを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分を１μｌ加え、各温度にて５分間反応させ、反応に対する温度の影響を測定した。３４℃での活性を１００％とした結果を第２図に示した。この結果、本酵素の至適温度は３０〜４０℃であった。
（実施例７）酵素の阻害剤
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質に用い、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成に与える阻害剤の影響を検討した。表２に示す１０ｍＭの各種酵素阻害剤を含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを加え、２５℃にて５分間反応させた。尚、ｏ−フェナンスロリン、フェニルメチルスルフォオニルフルオリド、ｐ−ニトロフェニルーｐ゛−グアニジノベンゾエートについては５０ｍＭになるようにメタノールに溶解したものを使用した。各条件での酵素活性は酵素阻害剤を加えない条件でのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成を１００とした場合の相対活性で示した。結果を表２に示す。この結果、本酵素は、セリン酵素阻害剤の内、フェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されないが、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートで阻害される性質を示した。

（実施例８）Ｌ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例５で用いたものと同じ酵素画分３μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて反応した。この結果、第３図に示すように、酵素添加区では、反応６０分で８３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成し、副成するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎは１．３ｍＭであった。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例９）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産に与えるＬ−グルタミン濃度の影響
実施例５で用いたものと同じ酵素画分１μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、表３に示す濃度のＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて２時間反応した。この結果を表３に示した。

（実施例１０）酵素の基質特異性（１）
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステルを用いた場合のエステル特異性を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表４に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、２００ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて２時間反応した。この反応で生成したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量を表４に示した（表４中、ＨＣｌは塩酸塩を示す）。

（実施例１１）酵素の基質特異性（２）
カルボキシ成分にＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭの表５に示すＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表５に示した（＋印は、ペプチドの生成は確認されているが、標準品がなく定量できなかったもの、ｔｒは微量を示す）。

（実施例１２）酵素の基質特異性（３）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にＬ−グルタミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表６に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１５０ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表６に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。

（実施例１３）酵素の基質特異性（４）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表７に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表７に示す１５０ｍＭの各種Ｌ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表７に示した（ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成が確認されているものを示す）。

（実施例１４）酵素の基質特異性（５）
カルボキシ成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表８に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表８に示す１５０ｍＭの各種アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表８に示した（ｔｒは微量を示す）。

（実施例１５）酵素の基質特異性（６）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸アミド、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表９に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸アミド（ＡＡ−ＮＨ_２・ＨＣｌ）、表９に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表９に示した。

（実施例１６）酵素の基質特異性（７）
カルボキシ成分に各種のＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分にＣ保護Ｌ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１０に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１０に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸アミド、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１０に示した。

（実施例１７）酵素の基質特異性（８）
カルボキシ成分に各種のアミノ酸メチルエステル、アミン成分にメチルアミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μ１を、表１１に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１１に示す１５０ｍＭのメチルアミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１１に示した。

（実施例１８）酵素の基質特異性（９）
カルボキシ成分としてβ−アミノ酸エステル、あるいはアミン成分としてβ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１２に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１２に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１２に示した（ｔｒは微景を示す）。

（実施例１９）酵素の基質特異性（１０）
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステル、アミン成分としてペプチドを用いた場合のオリゴペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１３に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１３に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１３に示した。この結果、本酵素はジペプチド生産のみならず、アミン成分としてペプチドを用いることにより、鎖長の長いペプチドも生産できることが明らかとなった。
以上実施例９〜１９に示されるように、エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭＰ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から得られた本酵素が、極めて基質特異性の広い酵素であることが判明した。

（実施例２０）既存酵素とのペプチド生成触媒能力の比較
本酵素のペプチド生成能力を既存酵素と比較した。既存酵素としては、ＥＰ ２７８７８７Ａ１記載のカルボキシペプチダーゼＹ、ＥＰ ３５９３９９Ｂ１記載のチオールエンドペプチダーゼ（フィシン、パパイン、ブロメライン、キモパパイン）を用い、これらについては、シグマ社製の精製酵素を使用した。本酵素源としては実施例３で均一に精製した酵素を使用した。これら酵素は、タンパク量として表１４に示す量を反応系に添加した。反応は、１００ｍＭＬ−アラニンメチルエステルと２００ｍＭＬ−グルタミンを含む１００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２５℃にて反応した。尚、カルボキシペプチダーゼは、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素、チオールエンドペプチダーゼは、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素を用いた。これら酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度比を表１４に示した。
この結果、酵素無添加でも、ごく微量のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成が観察され、カルボキシペプチダーゼあるいはチオールエンドペプチダーゼ添加区では、酵素無添加区に比し若千生成速度速まることが観察された。これに対して、本酵素の添加区では圧倒的に速いＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度が観察され、その速度は、カルボキシペプチダーゼＹ、チオールエンドペプチダーゼに対して、約５，０００倍〜１００，０００倍であった。以上のように、本酵素は、今までに例のない極めて速いペプチド生成速度を有していることが判明した。尚、本酵素の分子量は７５０００のダイマーであるのに対し、カルボキシペプチダーゼＹの分子量は約６１０００、上記チオールエンドペプチダーゼの分子量は約２３０００〜３６０００と報告されているので、分子量当たりのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度は、実施例に示した単位重量当たりよりも更に本酵素の方が速くなる。

（実施例２１）スフィンゴバクテリウム エスピーの菌体を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養したスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２０時間振とう培養を行った。この培養液１ｍｌを上記培地（５０ｍｌ／５００ｍＬ坂口フラスコ）に添加し、３０℃、１８時間培養した。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。この菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡＴＯｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬを添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて１２０分反応をおこなった。このときのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）の生成量は６２ｍＭであった。
（実施例２２）スフィンゴバクテリウム エスピーからの酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例２１と同様に、スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体２ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて洗浄後、同緩衝液８ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
（実施例２３）酵素画分を用いたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例２２で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分（約２７Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、１１１ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２２２ｍＭのＬ−グルタミン、１１ｍＭのＥＤＴＡを含む１１１ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９０μｌに加え、２５℃にて１２０分反応した。はこの結果、酵素添加区では、７３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが生成した。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例２４）酵素の基質特異性（１１）
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素の基質特異性を検討した。表１５−１から表１５−４に示した終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２２で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１５に示した。（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。また、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。

（実施例２５）酵素の基質特異性（１２）
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素のオリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１６に示した、終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２２で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１６に示した。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。

（実施例２６）酵素の基質特異性（１３）
実施例５で用いたものと同じ酵素画分を用いて、さらにその基質特異性を検討した。

表１７に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中０．１ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて表１７に示した反応時間で反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１７に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。

（実施例２７）酵素の基質特異性（１４）
実施例２６と同じ酵素画分を用い，オリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１８に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中に添加したユニット数は表１８に記載）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１８に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。

産業上の利用の可能性

本発明により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法を軽減し、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造することができる新規酵素が提供される。本発明の酵素を用いることにより、効率的なペプチドの工業生産が可能である。

Claims (11)

1. カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有するエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属由来の酵素。
2. カルボキシ成分とアミン成分とからペプチドを生成する能力を有し、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の条件下におけるジペプチド生成反応で、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度が０．０３ｍＭ／分以上となる能力を有する酵素。
   （ｉ）前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭ）
   （ｉｉ）前記アミン成分が、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）
   （ｉｉｉ）ｐＨが、９．０
   （ｉｖ）酵素添加量が、タンパク量として０．６１ｍｇ／ｍｌ未満
3. 前記カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第１項あるいは第２項に記載の酵素。
4. 前記アミン成分として、アミノ酸、Ｃ保護アミノ酸、アミンのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の酵素。
5. ｐＨが６．５〜１０．５の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の酵素。
6. 温度条件が０〜６０℃の範囲で、ペプチドを生成する能力を有する、特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の酵素。
7. セリン酵素阻害剤のフェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されず、ｐ−ニトロフェニルｐ’−グアニジノベンゾエートで阻害される、特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の酵素。
8. ＳＤＳ−ゲル電気泳動による分子量が約７５ｋＤａ、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が約１５０ｋＤａである、特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の酵素。
9. 特許請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の酵素を生産する微生物。
10. エンペドバクターブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ） ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株、あるいはスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株である、特許請求の範囲第９項に記載の微生物。
11. 特許請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の酵素または当該酵素の含有物を用いて、カルボキシ成分とアミン成分とからジペプチドを生成する、ジペプチドの製造方法。

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