KR100760974B1 - 디펩티드의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 저가로 구입할 수 있는 출발 물질로부터, 공업적으로 유리하고 간편한 경로를 통하여 디펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 디펩티드는, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체 또는 당해 미생물 균체 처리물을 사용하여, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 제조된다.

디펩티드, 아미노산 에스테르, 아미노산, 미생물, L-알라닌 에스테르, L-글루타민

Description

디펩티드의 제조 방법{Method for producing dipeptides}

본 발명은 디펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 아미노산 에스테르와 아미노산으로 부터 간편하고도 저렴하게 디펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

디펩티드는 다양한 분야에서 용도가 밝혀졌다. 예를 들면, 디펩티드는 의약품 소재 및 기능성 식품으로서 사용된다. 구체적으로, L-알라닐-L-글루타민은 무혈청 배지의 성분으로서 사용된다. 또한, L-알라닐-L-글루타민은, L-글루타민 보다 안정하고 수용성이 높기 때문에, 수액(輸液)(infusion solution)의 성분으로서 사용된다.

디펩티드는 일반적으로 화학 합성법에 의해 제조된다. 그러나, 이러한 방법은 종종 복잡한 단계를 요구한다. 이러한 방법은, 예를 들면 N-벤질옥시카보닐알라닌 (이후, "Z-알라닌"으로서 지칭함) 및 보호된 L-글루타민을 사용하는 경우 [참조 문헌: Bull. Chem. Soc. Jpn. , 34,739 (1961) and Bull. Chem. Soc. Jpn. , 35,1966 (1962)]; Z-알라닌 및 보호된 L-글루탐산-γ-메틸 에스테르를 사용하는 경 우 [참조 문헌: Bull. Chem. Soc. Jpn. , 37,200 (1964)]; Z-알라닌 에스테르 및 비보호된 글루타민을 사용하는 경우 [참조 문헌: JP-1-96194A]; 및 원료로서 2-치환된 프로피오닐 할라이드를 사용하여 중간체 N-(2-치환된)-프로피오닐글루타민 유도체를 경유하는 합성 [참조 문헌: JP-6-234715A]을 포함한다.

그러나, 이들 방법은 모두 보호 그룹의 도입 및 제거 또는 중간체의 합성을 요구하므로, 이들 방법 중 어느 것도 공업적으로 유리하지 않고 충분히 만족스럽지 못하다.

효소를 사용하여 디펩티드를 제조하는 대표적인 제조 방법으로서, N-보호된-C-비보호된 카복실 성분 및 N-비보호된-C-보호된 아민 성분을 사용하는 축합 방법(이후, "반응 1"로 지칭함), 및 N-보호된-C-보호된 카복실 성분 및 N-비보호된-C-보호된 아민 성분을 사용하는 치환 반응 (이후, "반응 2"로 지칭함)이 알려져 있다. 반응 1의 예로서, Z-아스파르트산 및 페닐알라닌 메틸 에스테르로 부터 Z-아스파르틸페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법을 들 수 있다 [참조 문헌: JP-53-92729A]. 반응 2의 예로는 아세틸페닐알라닌 에틸 에스테르 및 루이신아미드로 부터 아세틸페닐알라닐루이신아미드를 제조하는 방법을 들 수 있다 [참조 문헌: Biochemical J. , 163,531 (1977)]. N-비보호된-C-보호된 카복실 성분의 사용에 관한 보고는 극히 드물다.

N-비보호된-C-보호된 카복실 성분 및 N-비보호된-C-보호된 아민 성분을 사용하는 치환 반응 (이후, "반응 3"으로서 지칭됨)의 예로는, 문헌[W090/01555]에 기재된 바와 같이, 아르기닌 에틸 에스테르 및 루이신아미드로 부터 아르기닐루이신 아미드를 제조하는 방법을 들 수 있다. N-비보호된-C-보호된 카복실 성분 및 N-비보호된-C-비보호된 아민 성분을 사용하는 치환 반응 (이후, "반응 4"로 지칭함)의 예로는, 문헌[EP-278787A]에 기재된 바와 같이, 티로신 에틸 에스테르 및 알라닌으로부터 티로실알라닌을 제조하는 방법을 들 수 있다. 이들 제조 방법 중에서 가장 저렴한 제조 방법은, 사용된 성분들 중의 보호 그룹의 수가 가장 적은 반응 4의 범주에 속하는 반응을 사용하는 방법이다.

그러나, 반응 4의 선행예 (EP-278787A)에서 사용된 효소로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 효모 또는 진균 또는 식물로부터 유래된 비교적 고가의 카복시펩티다제 제제의 시약이 포함된다. 생산된 디펩티드는 비교적 소수성 정도가 높은 아미노산을 함유한다. 문헌[EP-278787A]은, 세균 또는 사카로마이세스 속에 속하는 것 외의 효모로부터 유래된 효소를 사용하는 방법이 기재되어 있다. 추가로, 친수성이 높은 알라닐글루타민 또는 알라닐아스파라긴을 제조하는 방법은 전혀 공지되지 않았다. 따라서, 이러한 펩티드를 비용을 절감하며 공업적 규모로 제조하는 방법의 개발이 요망되고 있다.

발명의 개요

본 발명의 목적은, 절감된 비용으로 구입할 수 있는 출발 물질 및 절감된 비용으로 공급되는 효소원 (미생물의 배양물, 미생물 균체, 또는 균체 처리물)을 사용하여 공업적으로 유리하고 간편한 경로를 통하여 디펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상세히 연구한 결과로서, 본 발명의 발명자들은, 세균 및 효모에 속하고 저비용으로 배양될 수 있는 미생물이 저비용으로 구입할 수 있는 L-아미노산 에스테르 및 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 이하를 제공한다:

[1] 셀루로파가(Cellulophaga), 웩셀라(Weeksella), 페도박터(Pedobacter), 페르시코박터(Persicobacter), 플렉시트릭스(Flexithrix), 키티노파가(Chitinophaga), 사이클로박테리움(Cyclobacterium), 루넬라(Runella), 써모네마(Thermonema), 사이크로세르펜스(Psychroserpens), 겔리디박터(Gelidibacter), 디아도박터(Dyadobacter), 플라메오비르가(Flammeovirga), 스피로소마(Spirosoma), 플렉토바실러스(Flectobacillus), 테나시바쿨룸(Tenacibaculum), 로도써무스(Rhodothermus), 조벨리아(Zobellia), 무리카우다(Muricauda), 살레겐티박터(Salegentibacter), 탁세오박터(Taxeobacter), 사이토파가(Cytophaga), 마리닐라빌리아(Marinilabilia), 루위넬라(Lewinella), 사프로스피라(Saprospira) 및 할리스코메노박터(Haliscomenobacter)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에 속하고 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것 중 하나 이상의 존재하에 아미노산 에스테르를 아미노산과 반응시켜 디펩티드를 생성시킴을 포함하여, 디펩티드를 제조하는 방법.

[2] 상기 [1] 항목에 있어서, 당해 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것 중 하나 이상의 존재하에 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드가 생성되는 때에 반응 혼합물에 금속 효소 억제제를 첨가함을 추가로 포함하는 방법.

[3] 상기 [1] 또는 [2] 항목에 있어서, 아미노산 에스테르가 L-알라닌 에스테르인 방법.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 아미노산이 L-글루타민인 방법.

본 발명은 저비용으로 디펩티드를 제조하는 간편한 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 디펩티드가 복잡한 합성 경로를 거치지 않고 저비용으로 구입할 수 있는 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 제조될 수 있으므로, 의약품 소재 및 기능성 식폼으로서 유용한 디펩티드를 제조하는 비용이 절감될 수 있다. 더우기, 다양한 유형의 디펩티드가 각종 아미노산 에스테르와 아미노산 원료로 부터 생성될 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 태양

본 발명에 따라 디펩티드를 제조하는 방법은, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 사용한다. 본 발명에 따른 디펩티드 제조 방법에 관련된 반응은 아래의 반응식으로 나타낼 수 있다. 아래의 반응식에서 제시된 바와 같이, 본원에 사용된 "디펩티드"는 하나의 펩티드 결합을 가진 펩티드 중합체를 말한다.

R₁-CH(NH₂)-COOR + H₂N-CH(COOH)-R₂

→ R₁CH(NH₂)-CONH-CH(COOH)-R₂ + ROH

(상기식에서, R은 치환되거나 비치환된 탄화수소 쇄를 나타내고; R₁은 아미노산 에스테르의 측쇄를 나타내고; R₂는 아미노산의 측쇄를 나타낸다).

아미노산 에스테르는 저비용으로 구입가능하다. 본 발명의 방법은, 출발 물질인 아미노산 에스테르 및 비보호된 아미노산을 수용액 중에서 효소원으로서 세균 또는 효모를 사용하여 반응시키는 방법으로서, 디펩티드를 제조하는 신규 방법이다. 따라서, 이 방법은 의약품 소재 및 기능성 식품으로서 유용한 디펩티드를 저비용으로 제공할 수 있다.

디펩티드를 제조하는 본 방법은 아래의 순서로 상세히 설명될 것이다:

[I] 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물,

[II] 디펩티드를 제조하는 방법, 및

[III] 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA의 단리 등.

[I] 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물.

본 발명에 사용될 수 있는 미생물은 특히 제한되지 않으며, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 모든 미생물이 사용될 수 있다. 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물로는, 셀루로파가(Cellulophaga), 웩셀라(Weeksella), 페도박터(Pedobacter), 페르시코박터(Persicobacter), 플렉시트릭스(Flexithrix), 키티노파가(Chitinophaga), 사이클로박테리움(Cyclobacterium), 루넬라(Runella), 써모네마(Thermonema), 사이크로세르펜스(Psychroserpens), 겔리디박터(Gelidibacter), 디아도박터(Dyadobacter), 플라메오비르가(Flammeovirga), 스피로소마(Spirosoma), 플렉토바실러스(Flectobacillus), 테나시바쿨룸(Tenacibaculum), 로도써무스(Rhodothermus), 조벨리아(Zobellia), 무리카우다(Muricauda), 살레겐티박터(Salegentibacter), 탁세오박터(Taxeobacter), 사이토파가(Cytophaga), 마리닐라빌리아(Marinilabilia), 루위넬라(Lewinella), 사프로스피라(Saprospira) 또는 할리스코메노박터(Haliscomenobacter) 속에 속하는 미생물들이 포함될 수 있다. 구체적으로, 아래의 미생물들이 예시된다:

셀룰로파가 리티카(Cellulophaga lytica) NBRC 14961

웩셀라 비로사(Weeksella virosa) NBRC 16016

페도박터 헤파리누스(Pedobacter heparinus) NBRC 12017

페르시코박터 디플루엔스(Persicobacter diffluens) NBRC 15940

플렉시트릭스 도로테애(Flexithrix dorotheae) NBRC 15987

키티노파가 피넨시스(Chitinophaga pinensis) NBRC 15968

사이클로박테리움 마리눔(Cyclobacterium marinum) ATCC 25205

루넬라 슬리티포르미스(Runella slithyformis) ATCC 29530

써모네마 랍숨(Thermonema lapsum) ATCC 43542

사이크로세르펜스 부르토넨시스(Psychroserpens burtonensis) ATCC 700359

겔리디박터 알겐스(Gelidibacter algens) ATCC 700364

디아도박터 페르멘탄스(Dyadobacter fermentans) ATCC 700827

플라메오비르가 압리카(Flammeovirga aprica) NBRC 15941

스피로소마 린구알레(Spirosoma linguale) DSMZ 74

플렉토바실러스 메이저(Flectobacillus major) DSMZ 103

테나시바쿠룸 마리티뭄(Tenacibaculum maritimum) ATCC 43398

로도테르무스 마리누스(Rhodothermus marinus) DSMZ 4252

조벨리아 갈락타니비로란스(Zobellia galactanivorans) DSMZ 12802

무리카우다 뤼스트린겐시스(Muricauda ruestringensis) DSMZ 13258

살레겐티박터 살레겐스(Salegentibacter salegens) DSMZ 5424

탁세오박터 겔루푸르푸라스센스(Taxeobacter gelupurpurascens) DSMZ 11116

사이토파가 후킨소니(Cytophaga hutchinsonii) NBRC 15051

마리니라빌리아 살모니콜로르(Marinilabilia salmonicolor) NBRC 15948

루위넬가 코해렌스(Lewinella cohaerens) ATCC 23123

사프로스피라 그란디스(Saprospira grandis) ATCC 23119

할리스코메노박터 히드로씨스(Haliscomenobacter hydrossis) ATCC 27775.

상기 균주 중에서, ATCC 번호를 가진 것들은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(P.O. Box 1549, Manassas VA 20110, U.S.A.)에 기탁되었으며, 각 번호를 참조하여 분양받을 수 있다. 상기 균주 중에서, NBRC 번호를 가진 것들은 독립행정법인 제품평가기구 생물유전자원부문(NITE Biological Resource Center, Department of Biotechnology, National Institute of Technology and Evaluation)(5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken,292-0818 Japan)에 기탁되었으며, 각 번호를 참조하여 분양받을 수 있다. 상기 균주 중에서, DSMZ 번호를 가진 것들은 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (DeutcheSammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures))(Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)에 기탁되었으며, 각 번호를 참조하여 분양받을 수 있다.

야생 균주 또는 돌연변이 균주가 미생물로서 사용될 수 있다. 세포 융합 또는 유전자 조작 등과 같은 유전공학 기법에 의해 유도되는 재조합 균주가 또한 미생물로서 사용될 수 있다.

이러한 미생물의 균체는, 증식시키기에 적당한 배지에서 미생물을 배양함으로써 수득될 수 있다. 당해 배지는 미생물의 증식을 허용하는 임의의 배지일 수 있다. 예를 들면, 당해 배지는 탄소원, 질소원, 인(phosphorus)원, 유황원 및 무기 이온을 함유하는 통상의 배지일 수 있다. 필요에 따라, 당배 배지는 통상적으로 사용되는 유기 영양원을 추가로 함유할 수 있다.

예를 들면, 탄소원으로는, 상기 미생물이 이용가능한 것이면 어떠한 탄소원도 사용될 수 있다. 구체적으로, 글루코스, 프럭토스, 말토스 및 아밀로스와 같은 당류; 소르비톨, 에탄올 및 글리세롤과 같은 알코올; 푸마르산, 시트르산, 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산 및 이의 염; 파라핀과 같은 탄화수소; 또는 이의 혼합물들이 사용될 수 있다.

질소원으로는, 황산암모늄 및 염화암모늄과 같은 무기산의 암모늄염; 암모늄 푸마레이트 및 암모늄 시트레이트와 같은 유기산의 암모늄염; 질산나트륨 및 질산칼륨과 같은 질산염; 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물 및 옥수수 침지액과 같은 유기 질소 화합물; 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

필요에 따라, 당해 배지는 통상의 배지에서 사용되는 영양원, 예를 들어 무기 염, 미량 금속염 및 비타민을 또한 함유할 수 있다.

배양 조건은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 배양은 pH 및 온도가 pH 5 내지 8 및 5℃ 내지 65℃의 범위 내로 적당히 조절된 호기성 조건하에서 약 12 시간 내지 약 100시간 동안 수행될 수 있다.

[II] 디펩티드를 제조하는 방법

본 발명에 따른 디펩티드의 제조 방법은, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물, 당해 배양물로 부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소로 이루어진 그룹으로부터 것 중 하나 이상의 존재하에서 아미노산 에스테르를 아미노산과 반응시켜 디펩티드를 생성시키는 단계를 포함한다. 당해 미생물에 의해 생성된 펩티드-생성 효소는 아미노산 에스테르와 아미노산을 기질로 사용하여 디펩티드를 생성할 수 있는 활성을 가진다.

당해 미생물에 의해 생성된 펩티드-생성 효소는, 상기 미생물이 배양되어지는 배양액에 기질인 아미노산 에스테르와 아미노산을 직접 첨가하여, 아미노산 에스테르와 아미노산과의 반응을 일으킬 수 있다. 달리, 균체들은 배양 종료 후에 배양액 또는 배양된 미생물로 부터 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 분리된 균체 그대로, 또는 분리된 균체를 세정한 후에, 완충액 중에 재현탁시킬 수 있고, 아미노산 에스테르와 아미노산을 이에 가하여 반응을 수행할 수 있다. 달리, 통상의 방법, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 방법, 카라기난(carrageenan) 방법 또는 알기네이트 겔 방법에 의해 고정된 균체가 사용될 수 있다.

균체 파쇄물, 아세톤-처리된 미생물 균체, 또는 동결-건조된 미생물 균체를 미생물 균체 처리물로서 사용할 수 있다. 파쇄는 초음파 파쇄, 프렌치 프레스(French press) 파쇄, 글라스 비드(glass bead) 파쇄 등에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 용균(lysis)이 요구되는 경우에, 난백 리소자임을 사용하는 방법, 펩티다제 처리를 사용하는 방법 또는 이들을 적절히 조합한 방법이 사용될 수 있다. 추가로, 펩티드-생성 효소를 미생물 균체 처리물로부터 회수하여, 조(粗) 효소 용액을 수득하여, 사용할 수 있다. 필요한 경우, 조 효소를 사용 전에 정제할 수 있다. 배양물로부터 효소를 정제하는 방법으로서, 통상의 효소 정제 방법이 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 펩티드-생성 효소는 아래의 단계를 통하여 정제될 수 있다: 원심분리 등에 의해 균체를 회수하고, 당해 균체를 기계적 방법, 예컨대 초음파 처리, 글라스 비드 처리 또는 디노 밀(dyno mill) 처리에 의해 파쇄하고, 세포 단편 등의 고형물을 원심분리로 제거하여 조 효소를 수득한 다음, 초원심분리 분별, 염석, 유기 용매 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피, 겔 여과 또는 소수성 크로마토그래피 등을 수행한다.

"미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소"는 미생물 균체 처리물로부터의 상기 정제 단계에 의해 수득된 효소 뿐만 아니라, 이종 또는 동종 숙주에서 효소의 유전자를 발현시켜 생성된, 즉 소위 유전공학 기법에 의해 생성된 효소를 포함하는 것임에 유의한다.

즉, 효소 및 모든 이들 효소-함유물은, 이들이 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 활성을 가진 분획이라면, 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "효소-함유물"은 효소를 함유하는 임의의 물(物)일 수 있다. 이의 구체적 태양은, 당해 효소를 생성하는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 미생물 균체 처리물 등 일 수 있다. 미생물의 배양물은 미생물을 배양함으로써 수득될 수 있는 모든 물(物)을 말한다. 구체적으로, 미생물의 배양물은 미생물 균체의 혼합물, 미생물을 배양하는데 사용된 배지, 및 배양된 미생물에 의해 생성된 물질일 수 있다. 추가로, 미생물 균체를 세정하여 세정된 미생물 균체를 수득하고, 이를 사용한다. 게다가, 균체 처리물에는 파쇄된 미생물 균체, 용균된 미생물 균체, 동결-건조된 미생물 균체 등이 포함될 수 있다. 균체 처리물은 또한, 미생물 균체를 처리하여 회수한 조 효소 및 당해 조 효소를 추가로 정제하여 수득한 정제된 효소를 포함할 수 있다. 정제된 효소로는, 각종 정제 방법에 의해 수득된 부분적으로 정제된 효소가 사용될 수 있다. 당해 효소를 공유 결합법, 흡착법 및 봉입(inclusion)법과 같은 추가의 방법에 의해 고정시켜, 고정된 효소를 수득하여, 이를 사용할 수 있다. 일부 미생물이 배양 동안에 부분적으로 용균되는 경우에, 배양 상청액이 또한 효소-함유물로서 사용될 수 있다.

배양물, 배양된 미생물 균체, 세정된 미생물 균체, 및 미생물 균체를 파쇄하고 용균시켜 수득된 미생물 균체 처리물은 펩티드의 생성에는 관여하지 않으나, 생성된 펩티드를 분해하는 효소를 종종 함유한다. 따라서, 이들을 사용하는 경우에, 때로는 금속 효소 억제제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 같은 금속 프로테아제 억제제를 첨가하는 것이 바람직하다. 이의 첨가량은 0.1 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 50 mM 일 수 있다.

효소 또는 효소-함유물의 사용량은 유효량, 즉 목적하는 효과가 수득될 수 있는 양일 수 있다. 유효량은 당업자가 간단한 예비 실험을 수행하여 쉽게 구할 수 있다. 예를 들면, 세정된 미생물 균체가 사용되는 경우에, 세정된 미생물 균체의 바람직한 사용량은 반응 혼합물의 리터 당 0.1g 내지 500g 일 수 있다.

사용되는 아미노산 에스테르로는, 펩티드-생성 효소가 디펩티드를 생성하는데 아미노산과 함께 당해 아미노산 에스테르를 특이적으로 이용할 수 있는 한, 어떠한 아미노산 에스테르도 가능하다. 이의 예로는 L-아미노산의 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, n-프로필 에스테르, 이소프로필 에스테르, n-부틸 에스테르, 이소부틸 에스테르, 3급-부틸 에스테르 등이 포함될 수 있다. 천연형 아미노산에 상응하는 L-아미노산 에스테르 뿐만 아니라, 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체에 상응하는 L-아미노산 에스테르 또는 D-아미노산 에스테르가 또한 사용될 수 있다. 본 발명에서, L-알라닌 에스테르가 아미노산 에스테르로서 사용되는 것이 바람직할 수 있다.

아미노산은 특별히 제한되지 않으며, 펩티드-생성 효소가 디펩티드를 생성하는데 아미노산 에스테르와 함께 당해 아미노산을 특이적으로 이용할 수 있다면 어떠한 공지된 아미노산도 사용될 수 있다. L-아미노산 및 D-아미노산이 모두 사용될 수 있다. 이의 보다 구체적인 예로는 C-비보호된 L-아미노산, C-보호된 L-아미노산, C-비보호된 D-아미노산, C-보호된 D-아미노산, 아민 등을 들 수 있다. 또한, 아민으로는, 천연형 아민 뿐만 아니라, 비천연형 아민 또는 이의 유도체가 예시될 수 있다. 또한, 아미노산으로는, 천연형 아미노산 뿐만 아니라, 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체가 예시될 수 있다. α-아미노산 외에, β-, γ-, ω- 등의 아미노산이 예시될 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 L-글루타민이 아미노산으로 사용될 수 있다.

출발 물질, 즉 아미노산 에스테르와 아미노산의 농도는 각각 1 mM 내지 10 M, 바람직하게는 0.05 M 내지 2 M이다. 어떤 경우에는, 아미노산을 아미노산 에스테르에 비하여 등몰량 또는 과몰량으로 첨가하는 것이 바람직하다. 필요하다면, 기질이 반응계에 점차적으로 첨가될 수 있다. 예를 들면, 특정 기질이 고농도에서 반응을 억제할 수 있다면, 이러한 기질은 이러한 억제 수준 이하에서 이의 농도를 유지하면서 점차적으로 첨가할 수 있다.

반응 온도는 3℃ 내지 70℃, 바람직하게는 5℃ 내지 50℃ 일 수 있다. 반응 pH는 2 내지 12, 바람직하게는 3 내지 11이다. 2 내지 100 시간 동안 반응을 수행함으로써, 디펩티드가 반응 혼합물 중에 생성되어 축적될 수 있다. 생성된 디펩티드는 통상의 방법에 의해 회수될 수 있으며, 필요에 따라, 정제될 수 있다.

[III] 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA의 단리 등

[III-1] DNA의 단리

본 발명에 사용된 미생물은 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진다. 이러한 미생물로부터, 유전공학적 기법으로 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 단백질을 암호화하는 DNA를 단리할 수 있다. 추가로, 단리된 DNA는, 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 단백질 (펩티드-생성 효소)를 생산하는 형질전환체를 작제하는데 사용될 수 있다. L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 단백질을 암호화하는 DNA를 미생물로부터 단리하고, 형질전환체를 제조하는 방법의 양태가 후술될 것이다.

먼저, 펩티드-생성 효소를 상기 항목 [II]에 기재된 바와 같은 상기 미생물로부터 수득한다. 이어서, 정제된 펩티드-생성 효소의 아미노산 서열을 결정한다. 이러한 결정은 에드만(Edman) 방법[참조 문헌: Edman, P., Acta Chem., Scand., 4,227 (1950)] 또는 제조원[Applied Biosynstems, Inc.]에 의해 제작된 서열분석기를 사용하여 수행할 수 있다. 정제된 펩티드-생성 효소에 관하여는, N-말단으로부터 30개 아미노산 잔기의 서열이 결정되었다. 결정된 아미노산 서열을 토대로, 펩티드-생성 효소를 암호화하는 DNA의 염기 서열을 연역할 수 있다. DNA의 염기 서열을 연역하는데 만능(universal) 코돈을 채용한다.

연역된 염기 서열을 토대로 하여, 약 30개 염기 쌍의 DNA 분자를 합성한다. DNA 분자를 합성하는 방법은 문헌[Tetrahedron Letters, 22,1859 (1981)]에 기재되어 있다. 달리, DNA 분자를 제조원[Applied Biosystems, Inc.]에 의해 제작된 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 당해 DNA 분자는, 미생물의 염색체 유전자 라이브러리로부터 펩티드-생성 효소를 암호화하는 전장 DNA를 단리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 달리, 당해 DNA 분자는, 펩티드-생성 효소를 암호화하는 DNA를 PCR 방법에 의해 증폭시킬 때, 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러나, PCR 방법을 사용하여 증폭시킨 DNA는 펩티드-생성 효소를 암호화하는 전장 DNA를 함유하지 않으므로, 펩티드-생성 효소를 암호화하는 전장 DNA는 PCR 방법에 의해 증폭된 DNA를 프로브로써 사용하여 미생물의 염색체 유전자 라이브러리로부터 단리시킨다.

PCR 방법의 조작은 문헌[White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)] 등에 기재되어 있다. 염색체 DNA를 제조하는 방법 및 유전자 라이브러리로부터 표적 DNA 분자를 단리하는 방법은 문헌["Molecular Cloning", 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)] 등에 기재되어 있다.

단리된 펩티드-생성 효소를 암호화하는 DNA의 염기 서열을 결정하는 방법은 문헌["A Practical Guide to Molecular Cloning', John Wiley & Sons, Inc. (1985)]에 기재되어 있다. 또한, 염기 서열은 제조원[Applied Biosystems, Inc.]에 의해 제작된 서열분석기를 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 DNA는 상기한 바와 같이 수득된 DNA로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 DNA로는, 특정 미생물의 염색체 DNA로부터 단리되어진 펩티드-생성 효소를 암호화하는 DNA를 돌연변이시켜 수득된 인공적으로 돌연변이된 DNA일지라도, 그것이 펩티드-생성 효소를 암호화하는 한 어떠한 DNA도 포함될 수 있다. 이러한 인공적 돌연변이 방법에 종종 사용되는 방법은 문헌[Method. in Enzymol., 154 (1987)]에 기재된 부위-특이적 돌연변이유발법일 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 DNA로는 또한, 상기한 바와 같이 염색체 DNA와 같은 DNA로부터 단리되어진 DNA의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)와 엄격한 조건하에서 하이브리드화되는 염기 서열을 가지며, 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA가 포함될 수 있다.

본원에서 사용된 "엄격한 조한하에서"란 용어는 소위 특이적 하이브리드는 형성되지만, 비-특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 말한다. 비록 이러한 조건을 수치로 정확하게 표현하는 것은 곤란할지라도, 이러한 조건의 예로는 높은 상동성, 예를 들어 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가진 DNA들은 서로 하이브리드화되지만, 이들 보다 낮은 상동성을 가진 DNA는 서로 하이브리드화되지 않는 조건, 또는 서던(Southern) 하이브리드화, 즉 60℃, 1 x SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 x SSC, 및 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 65℃, 0.1 x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도에서의 하이브리드화에서 세정하기 위한 통상의 조건을 들 수 있다. 펩티드-생성 효소의 활성은 이미 앞서 설명되어졌다. 그러나, 엄격한 조건하에서 상보적 염기 서열과 하이브리드화되는 염기 서열에 관하여, 이에 의해 암호화된 단백질이, 50℃ 및 pH 8의 조건하에서, 원래의 아미노산 서열을 가진 단백질의 효소 활성의 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 효소 활성을 보유하는 것이 요망된다.

또한, 단리된 DNA에 의해 암호화된 단백질과 실질적으로 동일한 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 DNA로는, 단리된 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열 중의 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 함유하고, 펩티드-생성 활성, 즉 L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 반응을 촉매화할 수 있는 능력을 가진 단백질을 암호화하는 DNA가 포함될 수 있다. 본원에서 "수 개"란 용어는 단백질의 삼차원 구조 또는 펩티드-생성 효소의 활성에 현저한 손상을 일으키지 않는 범위의 아미노산의 개수를 의미한다. 구체적으로, "수 개"는 통상적으로 2 내지 50, 바람직하게는 2 내지 30, 보다 바람직하게는 2 내지 10을 의미한다. 펩티드-생성 효소의 활성은 이미 앞서 설명된 바와 같다. 그러나, 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 함유하는 아미노산 서열에 관하여는, 이러한 아미노산 서열이, 50℃ 및 pH 8의 조건하에서 원래의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성의 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 효소 활성을 보유할 것이 요망된다.

상기한 바와 같이, DNA가 미생물로부터 단리되는 경우에, 아래의 DNA들이 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있다. 아래의 예에서, 단리된 DNA의 구체화된 염기 서열은 염기 서열 y로서 지칭되고, 당해 염기 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 아미노산 서열 Y로 지칭된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 DNA로는 다음의 것이 포함된다:

(i) 염기 서열 y로 이루어진 DNA,

(ii) 염기 서열 y와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화되고, L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 반응을 촉매화하는 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA,

(iii) 아미노산 서열 Y를 가진 단백질을 암호화하는 DNA, 및

(iv) 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 함유하는 아미노산 서열 Y에 상응하는 아미노산 서열을 가지며, L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 반응을 촉매화하는 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA,

[III-2] 형질전환체의 제조

이후에는, 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 발현하는 형질전환체의 작제가 설명될 것이다. 재조합 DNA 기술을 이용하여, 효소 및 생리학적 활성 물질과 같은 유용한 단백질을 수득하는 제조예가 다수 공지되어 있다. 재조합 DNA 기술을 이용함으로써, 천연에는 미량으로 존재하는 유용한 단백질을 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 형질전환체의 바람직한 예로는, 아래의 (A), (B) 또는 (C)에 기술된 것들과 같은 단백질을 발현할 수 있는 형질전환체를 들 수 있다:

(A) 아미노산 서열 Y를 갖는 단백질,

(B) 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 함유하는 아미노산 서열 Y에 상응하는 아미노산 서열을 가지며, L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 반응을 촉매화하는 펩티드-생성 활성을 가진 단백질, 및

(C) 염기 서열 y와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화되고, L-아미노산 에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩티드를 생성하는 반응을 촉매화하는 펩티드-생성 활성을 가진 단백질을 암호화하는 DNA에 의해 암호화된 단백질.

펩티드-생성 활성을 가진 단백질 (A) 내지 (C)를 발현하는 형질전환체는 상기 항목 [III-1]에 기재된 DNA (i), (ii), (iii) 및 (iv) 중의 어느 하나를 도입함으로써 작제할 수 있다. 즉, (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 DNA를 숙주 세포에서 발현될 수 있는 발현 벡터 속에 삽입하고, 숙주 세포에 도입할 수 있다.

상기 (B)에 언급된 돌연변이는, 예를 들면 암호화된 아미노산이 본 효소의 유전자의 특정 부위에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 본 효소의 유전자의 염기 서열을 변형시키는 부위-특이적 돌연변이유발법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 상기한 바와 같은 변형된 DNA는 종래부터 공지된 돌연변이처리에 의해 수득될 수 있다. 이러한 돌연변이처리의 예로는, 예컨대 본 효소를 암호화하는 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 것, 및 본 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 에스체리키아(Escherichia) 속의 세균을 인공 돌연변이에 통상적으로 사용되는 돌연변이제, 예를 들어 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG), 또는 아질산으로 처리하는 것을 들 수 있다.

재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 대량 생산하는 바람직한 일 태양에서, 단백질 분자는, 당해 단백질을 생성하는 형질전환체 내에서, 회합하여 단백질의 봉입체(inclusion body)를 형성할 수 있다. 이러한 발현 및 생산 방법의 이점은, 미생물 균체 내에 존재하는 프로테아제로 인한 분해로부터 목적 단백질을 보호하고, 미생물 균체의 파쇄 및 후속적인 원심분리 작업에 의해 목적 단백질을 간단히 정제하는데 있다.

이와 같이 수득된 단백질의 봉입체는 단백질 변성제를 사용하여 가용화시킬 수 있다. 이어서, 가용화된 단백질은, 예를 들어 변성제를 제거함으로써 재생을 활성화하여, 적당히 폴딩된 생리학적 활성 단백질로 전환시킬 수 있다. 이의 예로는 사람 인터루킨-2의 재활성화 (JP-61-257931A)와 같은 다수의 예가 있다.

단백질의 봉입체로부터 활성형 단백질을 복구하는 것은, 가용화 및 활성 재생과 같은 일련의 작업을 요구할 수 있으며, 이로 인해 활성형 단백질을 직접 제조하는 것 보다 작업을 더욱 복잡하게 만들 수 있다. 그러나, 미생물 균체 내에서 생성되는 단백질이 균체의 성장에 영향을 미칠 수 있다면, 당해 단백질이 이러한 불활성 봉입체의 형태로 균체 내에 축적됨으로써, 이러한 단백질이 균체에 미치는 영향을 억제할 수 있을 것이다.

목적 단백질을 봉입체로서 대규모로 생산하는 것은, 목적 단백질을 강력한 프로모터의 제어하에 단독으로 발현시키거나, 목적 단백질 및 다량으로 발현되는 것으로 공지된 또 다른 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현시킴으로써 수행될 수 있다.

추가로, 제한 프로테아제에 의해 인식될 수 있는 서열을, 융합 단백질의 발현 후 목적 단백질을 잘라내고자 하는 적당한 위치에 삽입하는 것이 유용할 수 있다.

단백질이 재조합 DNA 기술에 의해 대량 생산되는 경우에, 형질전환될 숙주 세포는 세균 세포, 방선균 세포, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포 등일 수 있다. 이들 중에서, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 장내 세균을 사용한 단백질의 대량 생산 기법이 다수 발견되었기 때문에, 장내 세균, 바람직하게는 에스체리키아 콜라이가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 형질전환된 에스체리키아 콜라이 세균을 사용한 펩티드-생성 효소의 생산에 관한 태양은 본원에서 후술될 것이다.

펩티드-생성 효소를 암호화하는 DNA를 발현시키는데 사용될 수 있는 프로모터로는, 에스체리키아 콜라이 내에서 이종 단백질을 생산하는데 통상적으로 사용되는 프로모터가 포함될 수 있다. 이러한 프로모터의 예로는 T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 및 람다 파아지의 P_R 및 P_L 프로모터와 같은 강력한 프로모터가 포함될 수 있다.

펩티드-생성 효소를 융합 단백질의 봉입체로서 제조하기 위하여, 또 다른 단백질, 바람직하게는 친수성 펩티드를 암호화하는 유전자를 펩티드-생성 효소 유전자의 상류 또는 하류에 연결하여 융합 단백질 유전자를 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 다른 단백질을 암호화하는 유전자는, 융합 단백질의 축적량을 증가시키고 변성 및 재생 단계 후 융합 단백질의 가용성을 증가시키는 임의의 유전자일 수 있다. 이를 위한 후보로는 예를 들어 T7 유전자 10, β-갈락토시다제 유전자, 데하이드로폴산 리덕타제 유전자, 인터페론-γ유전자, 인터루킨-2 유전자, 및 프로키모신 유전자가 포함될 수 있다.

이들 유전자를 펩티드-생성 효소를 암호화하는 유전자에 연결하기 위하여는, 이의 코돈의 판독 프레임은 서로 일치하여야 한다. 이러한 일치는 적당한 제한 효소 부위에 연결시키거나, 또는 이용될 적당한 서열을 가진 합성 DNA를 활용함으로써 이루어질 수 있다.

펩티드-생성 효소의 생산량을 증가시키기 위하여, 일부 경우에는, 전사 종결 서열인 터미네이터를 융합 단백질 유전자의 하류에 연결시키는 것이 바람직하다. 터미네이터에는, 예를 들어 T7 터미네이터, fd 파아지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자 터미네이터, 및 에스체리키아 콜라이 trpA 유전자 터미네이터가 포함될 수 있다.

펩티드-생성 효소, 또는 펩티드-생성 효소와 또 다른 단백질로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 에스체리키아 콜라이 속에 도입하기 위한 벡터로서, 소위 다중-복사(multi-copy)형 벡터가 바람직하다. 이의 예로는 ColE1 유래의 복제개시점을 가진 플라스미드, 예를 들어 pUC-계 플라스미드 및 pBR322-계 플라스미드 또는 이의 유도체가 포함될 수 있다. 본원에서 사용된 "유도체"는 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위에 의해 변형된 이들 플라스미드를 말한다. 본원에서 사용된 변형은 돌연변이제 또는 UV 조사를 이용한 돌연변이처리에 의한 변형 또는 자연적 돌연변이에 의한 변형을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 사용될 수 있는 벡터로는 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW 119, pMW 118, pMW219, pMW218 등이 포함될 수 있다. 그 외에, 파아지 DNA 및 트랜스포손(transposon) DNA와 같은 벡터가 또한 사용될 수 있다.

형질전환체의 선별을 용이하게 하기 위하여, 벡터가 앰피실린 내성 유전자와 같은 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드는 강력한 프로모터를 가진 발현 벡터 (a pUC-계 벡터 (제조원: Takara Shuzo, Co., Ltd.), pRROK-계 벡터 (제조원: Clonetech Laboratories,Inc.), pKK233-2 (제조원: Clonetech Laboratories,Inc.) 등)로서 시판되고 있다.

재조합 DNA는 프로모터, 펩티드-생성 효소 또는 펩티드-생성 효소와 또 다른 단백질의 융합 단백질을 암호화하는 유전자, 및 터미네이터를 상기 순서대로 연결하여 DNA 단편을 생성시키고, 이를 벡터 DNA에 연결함으로써 수득될 수 있다.

상기 재조합 DNA를 사용하여 에스체리키아 콜라이를 형질전환시키고, 당해 세균을 배양함으로써, 펩티드-생성 효소 또는 펩티드-생성 효소와 또 다른 단백질의 융합 단백질이 발현되어 생성된다. 형질전환될 숙주는 이종 유전자를 발현시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 균주일 수 있다. 예를 들면, 에스체리키아 콜라이 JM109 균주가 바람직하다. 형질전환을 수행하는 방법 및 형질전환체를 선별하는 방법은 예를 들면 문헌[Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]에 기재되어 있다.

펩티드-생성 효소가 융합 단백질로서 발현되는 경우에, 혈액응고인자 Xa 또는 칼리크레인(kallikrein)과 같이 펩티드-생성 효소에 존재하지 않는 서열을 인식 서열로서 인식하는 제한 프로테아제에 의해 펩티드-생성 효소가 융합 단백질로부터 잘라내어 지도록, 융합 단백질이 설계될 수 있다.

사용될 수 있는 생산 배지는 에스체리키아 콜라이를 배양하는데 통상적으로 사용될 수 있는 임의의 배지, 예를 들면 M9-카스아미노산 배지 및 LB 배지일 수 있다. 또한, 배양 조건 및 생산 유도 조건은 사용된 벡터의 마커 및 프로모터, 및 숙주 미생물의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다.

펩티드-생성 효소 또는 펩티드-생성 효소와 또 다른 단백질의 융합 단백질은, 예를 들어 아래의 방법에 의해 회수될 수 있다: 펩티드-생성 효소 또는 이의 융합 단백질이 미생물 균체 내에서 가용화되는 경우에, 사용할 조 효소 용액은 미생물 균체를 회수한 다음, 이를 파쇄 또는 용균시킴으로써 수득될 수 있다. 필요에 따라, 상기 조 용액을 예를 들어 통상의 침전, 여과 및 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 정제된 펩티드-생성 효소 또는 이의 융합 단백질을 수득하여 사용할 수 있다. 이 경우에, 펩티드-생성 효소 또는 이의 융합 단백질을 이용하는 정제 방법이 또한 사용될 수 있다.

당해 단백질의 봉입체가 생성되는 경우에, 단백질의 봉입체는 변성제에 의해 가용화될 수 있다. 펩티드-생성 효소는 미생물 균체 단백질과 함께 가용화될 수 있다. 그러나, 후속적 정제 작업을 고려할 때, 봉입체를 미생물 균체로부터 취한 다음, 봉입체를 가용화시키는 것이 바람직하다. 미생물 균체로부터 봉입체의 회수는 통상의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 미생물 균체를 파쇄할 수 있고, 봉입체를 원심분리 등에 의해 회수할 수 있다. 단백질의 봉입체를 가용화시키는 변성제로는, 예를 들어 구아니딘 하이드로클로라이드 (예를 들면, 6M, pH 5 내지 8) 또는 우레아 (예를 들면, 8 M)가 포함될 수 있다.

투석과 같은 작업에 의해 변성제를 제거함으로써, 당해 단백질은 활성형으로 재생될 수 있다. 투석용 용액의 예로는 예컨대 Tris-HCl 완충액 및 포스페이트 완충액이 포함될 수 있다. 이의 농도 및 pH는 각각 20 mM 내지 0.5 M 및 pH 5 내지 8 일 수 있다.

재생 단계에서 단백질의 농도는 바람직하게는 약 500μM/ml 이하로 유지된다. 재생된 펩티드-생성 효소의 자가-가교를 피하기 위하여, 5℃ 이하의 온도에서 투석을 유지하는 것이 바람직하다. 투석 방법 이외에 변성제를 제거하기 위한 방법으로는 희석 방법, 한외여과 방법 등이 포함될 수 있다. 이들 방법 중의 어느 하나를 사용함으로써 활성이 재생될 수 있다.

유전공학 기법은 예를 들어 문헌[Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]에 기재된 기법에 의거하여 실시될 수 있다.

본 발명은 이하에서 실시예를 참조하여 보다 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다. 이들 실시예에서, L-알라닌 및 L-알라닐-L-글루타민을 고성능 액체 크로마토그래피 (칼럼: InertsiL ODS-2 (제조원: GL Science, Inc.); 용리액: 인산 수용액 (pH 2.2, 5.0 mM 나트륨 1-옥탄설포네이트/메탄올 = 100/15, 유속: 1.0ml/분, 검출: 210 nm))에 의해 정량하였다.

실시예 1: L- 알라닐 -L- 글라타민을 생성하는 미생물

셀룰로파가 리티카(Cellulophaga lytica) NBRC 14961 및 플렉시트릭스 도로테애(Flexithrix dorotheae) NBRC 15987의 배양을, 1 L의 DAIGO 인공 해수 SP (제조원: Nihon Pharmaceutical Co.,Ltd) 중에 1 g의 트립톤, 1 g의 효모 추출물 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 셀룰로파가 리티카 NBRC 14961 또는 플렉시트릭스 도로테애 NBRC 15987의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량(mass) 배양하였다.

웩셀라 비로사(Weeksella virosa) NBRC 16016의 배양을 양(羊) 혈액 아가 배 지 (Nissui Plate, 제조원: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)를 사용하여 수행하였다. 웩셀라 비로사 NBRC 16016의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

페도박터 헤파리누스(Pedobacter heparinus) NBRC 12017의 배양을, 1 L의 증류수 중에 10 g의 펩톤, 2 g의 효모 추출물, 1g의 MgS0₄ㆍ7H₂0 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지 (pH 7.0, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 페도박터 헤파리누스 NBRC 12017를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

페르시코박터 디플루엔스(Persicobacter diffluens) NBRC 15940의 배양을, 1 L의 DAIGO 인공 해수 SP 중에 0.5 g의 KN0₃, 0.1 g의 나트륨글르세로포스페이트, 1 g의 트리스하이드록시메틸아미노메난, 5 g의 트립톤, 5 g의 효모 추출물, 15 g의 아가 및 1 ml의 미량원소 용액을 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 상기 미량원소 용액은 1 L의 증류수 중에 2.85 g의 H₃BO₄, 1.8 g의 MnCl₂ㆍ4H₂0, 1.36 g의 FeSO₄ㆍ7H₂O, 26.9 mg의 CuCl₂ㆍ2H₂0, 20.8 mg의 ZnCl₂, 40.4 mg의 CoCl₂ㆍ6H₂O, 25.2 mg의 Na₂MoO₄ㆍ2H₂O, 및 1.77 g의 나트륨 타르트레이트를 함유한다. 페르시코박터 디플루엔스 NBRC 15940의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

키티노파가 피넨시스(Chitinophaga pinensis) NBRC 15968의 배양을, 1 L의 증류수 중에 3 g의 박토-카시톤(bacto-casitone), 1 g의 효모 추출물, 1.36 g의 CaCl₂ㆍ2H₂0 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 키티노파가 피넨시스 NBRC 15968의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

사이클로박테리움 마리눔(Cyclobacterium marinum) ATCC 25205의 배양을, 1 L의 DAIGO 인공 해수 SP 중에 5 g의 펩톤, 1 g의 효모 추출물, 0.2 g의 FeSO₄ㆍ 7H₂0 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

루넬라 슬리티포르미스(Runella slithyformis) ATCC 29530의 배양을, 1 L의 증류수 중에 1 g의 펩톤, 1 g의 효모 추출물, 1 g의 글루코스 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 루넬라 슬리티포르미스 ATCC 29530의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

써모네마 랍숨(Thermonema lapsum) ATCC 43542의 배양을, 1 L의 증류수 중에 0.2 g의 니트릴로트리아세트산, 2 ml의 0.03% FeCl₃ 용액, 0.12 g의 CaSO₄ㆍ2H₂0, 0.2 g의 MgSO₄ㆍ7H₂0, 0.016 g의 NaCl, 0.21 g의 KNO₃, 1.4 g의 NaN0₃, 0.22 g의 Na₂HPO₄, 2 ml의 미량원소 용액 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 8.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 상기 미량원소 용액은 1 L의 증류수 중에 0.5 ml의 H₂SO₄, 2.2 g의 MnS0₄, 0.5 g의 ZnS0₄, 0.5 g의 H₃BO₃, 0.016 g의 CuS0₄, 0.025g의 Na₂Mo0₄, 및 0.046 g의 CoCl₂를 함유한다. 써모네마 랍숨 ATCC 43542의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 60℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 60℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

겔리디박터 알겐스(Gelidibacter algens) ATCC 700364, 루위넬가 코해렌스(Lewinella cohaerens) ATCC 23123, 사이크로세르펜스 부르토넨시스(Psychroserpens burtonensis) ATCC 700359 및 살레겐티박터 살레겐스(Salegentibacter salegens) DSMZ 5424의 배양을 Marine Agar 2216 (제조원: Difco)을 사용하여 수행하였다. 겔리디박터 알겐스 ATCC 700364 또는 사이크로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359의 균체를 상기 배지에서 72 시간 동안 10℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 10℃에서 72 시간 동안 대량 배양하였다. 루위넬가 코해렌스 ATCC 23123의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다. 살레겐티박터 살레겐스 DSMZ 5424의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

디아도박터 페르멘탄스(Dyadobacter fermentans) ATCC 700827의 배양을, 1 L의 증류수 중에 0.8 g의 NH₄Cl, 0.25 g의 KH₂PO₄, 0.4 g의 K₂HPO₄, 0.505 g의 KNO₃, 15m g의 CaCl₂ㆍ2H₂0, 20 mg의 MgCl₂ㆍ6H₂0, 7mg의 FeS0₄ㆍ7H₂O, 5 mg의 Na₂SO₄, 5 mg의 MnCl₂ㆍ4H₂O, 0.5 mg의 H₃BO₃, 0.5 mg의 ZnCl₂, 0.5 mg의 CoCl₂ㆍ6H₂0, 0.5 mg의 NiSO₄ㆍ6H₂0, 0.3 mg의 CuCl₂ㆍ2H₂0, 10 mg의 Na₂MoO₄ㆍ2H₂0, 0.5 g의 효모 추출물, 0.5 g의 펩톤, 0.5 g의 카스아미노산, 0.5 g의 덱스트로스, 0.5 g의 가용성 전분, 0.5 g의 나트륨 피루베이트 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 디아도박터 페르멘탄스 ATCC 700827의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

플라메오비르가 압리카(Flammeovirga aprica) NBRC 15941의 배양을, 1 L의 DAIGO 인공 해수 SP 중에 2 g의 트립톤, 0.5 g의 육우 추출물, 0.5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 나트륨 아세테이트, 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 플라메오비르가 압리카 NBRC 15941의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

스피로소마 린구알레(Spirosoma linguale) DSMZ 74 및 플렉토바실러스 메이 저(Flectobacillus major) DSMZ 103의 배양을, 1 L의 증류수 중에 1 g의 글루코스, 1 g의 펩톤, 1 g의 효모 추출물 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 배양하였다. 스피로소마 린구알레 DSMZ 74 또는 플렉토바실러스 메이저 DSMZ 103의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

테나시바쿠룸 마리티뭄(Tenacibaculum maritimum) ATCC 43398의 배양을, 700 ml의 DAIGO 인공 해수 SP 중에 0.5 g의 트립톤, 0.5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 육우 추출물, 0.2 g의 나트륨 아세테이트 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.0, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 테나시바쿠룸 마리티뭄 ATCC 43398의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

로도테르무스 마리누스(Rhodothermus marinus) DSMZ 4252의 배양을, 1 L의 당해 배지 중에 2.5 g의 효모 추출물, 2.5 g의 트립톤, 100 mg의 니트릴로트리아세트산, 40 mg의 CaSO₄ㆍ2H₂0, 200 mg의 MgCl₂ㆍ6H₂0, 0.5 ml의 0.01M Fe 시트레이트, 0.5 ml의 미량원소 용액, 100 ml의 포스페이트 완충액, 900 ml의 증류슈, 및 28 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 상기 미량원소 용액은 1 L의 증류수 중에 12.8 g의 니트릴로트리아세트산, 1 g의 FeCl₂ㆍ4H₂0, 0.5 g의 MnCl₂ㆍ4H₂O, 0.3g의 CoCl₂ㆍ4H₂O, 50 mg의 CuCl₂ ㆍ2H₂0, 50 mg의 Na₂MoO₄ㆍ2H₂O, 20 mg의 H₃BO₃, 및 20 mg의 NiCl₂ㆍ6H₂O를 함유한다. 포스페이트 완충액은 1 L의 증류수 중에 5.44 g의 KH₂PO₄ 및 43 g의 K₂HPO₄를 함유한다. 로도테르무스 마리누스 DSMZ 4252의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 60℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 60℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

조벨리아 갈락타니비로란스(Zobellia galactanivorans) DSMZ 12802의 배양을, BACTO MARINE BROTH (DIFCO 2216)를 함유하는 고체 아가 배지 (1.5% 아가, pH 7.6, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 조벨리아 갈락타니비로란스 DSMZ12802의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

무리카우다 뤼스트린겐시스(Muricauda ruestringensis) DSMZ 13258의 배양을, 1 L의 증류수 중에 1.5 g의 효모 추출물, 2.5 g의 펩톤, 2 g의 헥사데칸, 17.7 g의 NaCl, 0.48 g의 KCl, 3.4 g의 MgCl₂ㆍ6H₂0, 4.46g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.98 g의 CaCl₂ 및 15g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 무리카우다 뤼스트린겐시스 DSMZ 13258의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

탁세오박터 겔루푸르푸라스센스(Taxeobacter gelupurpurascens) DSMZ 11116의 배양을, 1 L의 증류수 중에 3 g의 카시톤, 1 g의 효모 추출물, 1.36 g의 CaCl₂ㆍ 2H₂0 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 탁세오박터 겔루푸르푸라스센스 DSMZ 11116의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

사이토파가 후킨소니(Cytophaga hutchinsonii) NBRC 15051의 배양을, 1 L의 증류수 중에 3 g의 카시톤, 1 g의 효모 추출물, 1.36 g의 CaCl₂ㆍ2H₂O, 5 g의 셀룰로비오스 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지 (pH 7.2, 120℃에서 15 분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 사이토파가 후킨소니 NBRC 15051의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

마리니라빌리아 살모니콜로르(Marinilabilia salmonicolor) NBRC 15948의 배양을, 250 ml의 증류수와 750 ml의 DAIGO 인공 해수 SP의 혼합물 중에 10 g의 펩톤, 2 g의 효모 추출물, 0.5 g의 MgSO₄ㆍ7H₂0, 및 15 g의 아가를 함유하는 고체 아가 배지(pH 7.2, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 마리니라빌리아 살모니콜로르 NBRC 15948의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

사프로스피라 그란디스(Saprospira grandis) ATCC 23119의 배양을, 1L의 DAIGO 인공 해수 SP 중에 0.5 g의 KN0₃, 0.1 g의 나트륨 글리세로포스페이트, 1 g의 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 2 g의 트립톤, 2 g의 효모 추출물, 15 g의 아가 및 1 ml의 미량원소 용액을 함유하는 고체 아가 배지(pH 7. 0, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 상기 미량원소 용액은 1 L의 증류수 중에 2.85 g의 H₃BO₄, 1.8 g의 MnCl₂ㆍ4H₂0, 1.36 g의 FeS0₄ㆍ7H₂O, 26.9 mg의 CuCl₂ㆍ2H₂O, 20.8 mg의 ZnCl₂, 40.4 mg의 CoCl₂ㆍ6H₂O, 25.2 mg의 Na₂MnO₄ㆍ2H₂O 및 1.77 g의 나트륨 타르트레이트를 함유한다. 사프로스피라 그란디스 ATCC 23119의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 30℃에서 예비-배양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 30℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

할리스코메노박터 히드로씨스(Haliscomenobacter hydrossis) ATCC 27775의 배양을, 1 L의 증류수 중에 27 mg의 KH₂PO₄, 40 mg의 K₂HPO₄, 40 mg의 Na₂HPO₄ㆍ2H₂O, 50 mg의 CaCl₂ㆍ2H₂O, 75 mg의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 5 mg의 FeCl₃ㆍ6H₂O, 3 mg의 MnSO₄ㆍH₂O, 1.31 g의 글루탐산, 2.5 mg의 트립티카제 쏘이 브로쓰(Tripticase Soy Broth)(글루코스 부재), 0.4 mg의 티아민, 0.01 mg의 비타민 B12, 2 g의 글루코스, 및 1 ml의 미량원소 용액을 함유하는 고체 아가 배지(pH 7. 0, 120℃에서 15분간 멸균)를 사용하여 수행하였다. 상기 미량원소 용액은 1 L의 증류수 중에 0.1 g의 ZnSO₄ㆍ7H₂0, 0.03 g의 MnCl₂ㆍ4H₂0, 0.3 g의 H₃BO₃, 0.2 g의 CoCl₂ㆍ6H₂O, 0.01g의 CuCl₂ㆍ2H₂0, 0.02 g의 NiCl₂ㆍ6H₂O 및 0.03 g의 Na₂MoO₄ㆍH₂O를 함유한다. 할리스코메노박터 히드로씨스 ATCC 27775의 균체를 상기 배지에서 48 시간 동안 25℃에서 예비-배 양한 다음, 배양된 균체를 동일 배지에 도포하여 25℃에서 48 시간 동안 대량 배양하였다.

상기와 같이 수득된 각각의 미생물 균주를 아가 배지로부터 회수하여, 10 mM EDTA를 함유하는 0.1 M 보레이트 완충액 (pH 9.0)에 현탁시켜, 100 g/l의 습윤 미생물 균체를 함유하는 현탁액을 수득하였다. 각각의 미생물 균체 현탁액 0.1 ml를 10 mM EDTA, 200 mM L-알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 및 400 mM L-글루타민을 함유하는 100 mM 보레이트 완충액 (pH 9.0) 0.1 ml와 혼합하여, 총량이 0.2 ml인 반응 혼합물을 수득한 후, 이를 표 1에 제시된 기간 동안 20℃에서 반응시켰다. 각 반응에 의해 생성된 L-알라닐-L-글루타민(Ala-Gln)의 양(mM)은 표 1에 제시되었다.

실시예 2: 다양한 L-알라닌 에스테르를 기질로서 사용한 L- 알라닐 -L-글루타민의 제조

페도박터 헤파리누스(Pedobacter heparinus) NBRC 12017의 미생물 균체를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양하고, 아가 배지로부터 회수하였다. 회수된 미생물 균체를 10 mM EDTA를 함유하는 0.1 M 보레이트 완충액 (pH 9.0) 중에 현탁시켜, 100 g/l의 습윤 미생물 균체를 함유하는 현탁액을 수득하였다. 미생물 균체 현탁액 0.1 ml를, 10 mM EDTA, 200 mM L-알라닌 에스테르 하이드로클로라이드 (표 2에 기재됨) 및 400 mM L-글루타민을 함유하는 100 mM 완충액 (pH 9.0) 0.1 ml와 혼합하여, 총량이 0.2 ml인 반응 혼합물을 수득한 후, 이를 1 시간 동안 20℃에서 반응시켰다. 각 반응에 의해 생성된 L-알라닐-L-글루타민(Ala-Gln)의 양(mM)은 표 2에 제시되었다.

알라닌 에스테르	Ala-Gln (mM)
L-알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드	29.52
L-알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드	27.13
L-알라닌 이소프로필 에스테르 하이드로클로라이드	20.83
L-알라닌-t-부틸 에스테르 하이드로클로라이드	2.65

본 발명은 디펩티드를 제조하는데 유용하다.

참조 문헌:

JP-1-96194A

JP-6-234715A

JP-53-92729A

WO90/01555

EP 278787A

Bull. Chem. Soc.Jpn.,34, 739 (1961)

Bull. Chem. Soc.Jpn., 35, 1966 (1962)

Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)

Biochemical J., 163, 531 (1977)

Claims (4)

1. 셀루로파가(Cellulophaga), 웩셀라(Weeksella), 페도박터(Pedobacter), 페르시코박터(Persicobacter), 플렉시트릭스(Flexithrix), 키티노파가(Chitinophaga), 사이클로박테리움(Cyclobacterium), 루넬라(Runella), 써모네마(Thermonema), 사이크로세르펜스(Psychroserpens), 겔리디박터(Gelidibacter), 디아도박터(Dyadobacter), 플라메오비르가(Flammeovirga), 스피로소마(Spirosoma), 플렉토바실러스(Flectobacillus), 테나시바쿨룸(Tenacibaculum), 로도써무스(Rhodothermus), 조벨리아(Zobellia), 무리카우다(Muricauda), 살레겐티박터(Salegentibacter), 탁세오박터(Taxeobacter), 사이토파가(Cytophaga), 마리닐라빌리아(Marinilabilia), 루위넬라(Lewinella), 사프로스피라(Saprospira) 및 할리스코메노박터(Haliscomenobacter)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에 속하고 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드를 생성할 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것 중 하나 이상의 존재하에 아미노산 에스테르를 아미노산과 반응시켜 알라닐-글루타민(Ala-Gln)인 디펩티드를 생성시킴을 포함하여, 알라닐-글루타민인 디펩티드를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 당해 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물, 및 당해 미생물로부터 유래된 펩티드-생성 효소 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것 중 하나 이상의 존재하에 아미노산 에스테르와 아미노산으로부터 디펩티드가 생성되는 때에 반응 혼합물에 금속 효소 억제제를 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
3. 청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

   제1항에 있어서, 아미노산 에스테르가 L-알라닌 에스테르인 방법.
4. 청구항 4은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

   제1항에 있어서, 아미노산이 L-글루타민인 방법.