KR100762730B1 - 신규 펩타이드 신타제 유전자 - Google Patents

신규 펩타이드 신타제 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩타이드를 제조할 수 있는 신규 효소에 관한 것이다. 보다 상세하게는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드 합성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 저렴한 디펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다. 신규하게 밝혀낸 엠페도박터(Empedobacter)속에 속하는 세균으로부터 펩타이드를 효율적으로 합성하는 신규 효소를 밝혀내고, 저렴하면서 간편하게 디펩타이드를 제조하는 방법을 밝혀냈다.
펩타이드 합성반응, 엠페도박터 브레비스, 펩타이드 생성효소

Description

신규 펩타이드 신타제 유전자{Novel peptide synthase gene}
본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩타이드를 생성할 수 있는 신규 효소에 관한 것이다. 보다 상세하게는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드 생성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 디펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
펩타이드는 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다. 예를 들면, L-알라닐-L-글루타민은 L-글루타민과 비교하여 안정적이면서 또한 수용성도 높다는 점에서 수액(輸液)이나 무혈청 배지의 성분으로서 널리 사용되고 있다.
펩타이드의 제조법으로서는 종래부터 화학합성법이 공지되어 있지만, 이의 제조법은 반드시 용이한 것은 아니다. 예를 들면, N-벤질옥시카보닐알라닌(이하, Z-알라닌이라고 칭한다)과 보호 L-글루타민을 사용하는 방법[Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739(1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966(1962)], Z-알라닌과 보호 L-글루탐산-γ-메틸에스테르를 사용하는 방법[Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200(1964)], Z-알라닌에스테르와 무보호 글루탐산을 사용하는 방법(특허 문헌1), 2-치환-프로피오닐할라이드를 원료로 하여 N-(2-치환)-프로피오닐글루타민 유도체를 중간체로 하여 합성하는 방법(특허 문헌2) 등이 공지되어 있다.
그러나 모든 이들 방법에서는 보호기의 도입, 제거 또는 광학활성 중간체의 사용이 필요하며, 공업적으로 유리하고 충분하게 만족할 수 있는 제조방법이 아니다.
한편, 효소를 사용하는 펩타이드의 대표적 제조법으로서는 N 보호, C 무보호의 카복시 성분과 N 무보호, C 보호의 아민 성분을 사용하는 축합반응(반응 1) 및 N 보호, C 보호의 카복시 성분과 N 무보호, C 보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 2)이 널리 공지되어 있다. 반응 1의 예로서는 Z-아스파르트산과 페닐알라닌메틸에스테르로부터의 Z-아스파르틸페닐알라닌메틸에스테르의 제조방법(특허 문헌 3), 반응 2의 예로서는 아세틸페닐알라닌에틸에스테르와 로이신아미드에서의 아세틸페닐알라닐로이신아미드의 제조방법(문헌참조: Biochemical J., 163, 531(1977), 비특허 문헌 1)을 들 수 있다. N 무보호, C 보호의 카복시 성분을 사용하는 방법의 보고 연구예는 매우 적으며 N 무보호, C 보호의 카복시 성분과 N 무보호, C 보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 3)의 예는 특허공개공보 WO 90/01555(특허 문헌 4)에 기재되어 있으며 예를 들면, 아르기닌에틸에스테르와 로이신아미드에서의 아르기닐로이신아미드의 제조방법을 들 수 있다. N 무보호, C 보호의 카복시 성분과 N 무보호, C 무보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 4)의 예로서는 EP 278787A1(특허 문헌 5)과 EP 359399B1(특허 문헌 6)이 있으며 예를 들면, 티로신에틸에스테르와 알라닌으로부터 티로실알라닌의 제조방법을 들 수 있다.
특허 문헌 1; 일본 공개특허공보 제(평) 1-96194호,
특허 문헌 2; 일본 공개특허공보 제(평)6-234715호,
특허 문헌 3; 일본 공개특허공보 제(소) 53-92729호,
특허 문헌 4; WO 90/01555,
특허 문헌 5; EP 278787A1,
특허 문헌 6; EP 359399B1 및
비특허 문헌 1; Biochemical J., 163, 531(1977).
발명의 개시
상기한 반응 1 내지 반응 4의 방법 중에서 가장 저렴한 제조방법으로 될 수 있는 것은 당연히 보호기의 수가 가장 적은 반응 4의 범주에 들어 가는 반응이다.
그러나 반응 4의 선행 기술(EP 278787Al)에는 하기의 큰 문제점이 있다. (1)펩타이드 생성속도가 매우 느리고, (2)펩타이드 생성 수율이 낮고, (3)생산될 수 있는 펩타이드가 비교적 소수성이 높은 아미노산을 함유하는 펩타이드로 한정되고, (4)첨가 효소량이 매우 대량이고, (5)곰팡이 효모, 식물에서 유래하는 비교적 비싼 카복시펩티다제 제제가 필요하다. (반응 4)에서 세균 및 사카로마이세스(Saccharomyces)속 이외의 효모 유래의 효소를 사용하는 방법은 전혀 공지되어 있지 않으며, 또한 친수성이 높은 알라닐글루타민 등의 펩타이드의 제조방법에 대해서도 전혀 공지되어 있지 않다. 이러한 배경하에 이들 펩타이드의 공업적으로 저렴한 제조법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩타이드를 생성할 수 있는 신규 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드 생성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 저렴한 펩타이드의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자등은 신규하게 밝혀낸 엠페도박터(Empedobacter)속에 속하는 세균으로부터 펩타이드를 효율적으로 합성하는 신규 효소를 밝혀내고, 이러한 효소 유전자의 서열을 결정함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 하기(A) 또는 (B)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(A) 서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(B) 서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질.
[2] 하기 (C) 또는 (D)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(C) 서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 21 내지 619의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(D)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 21 내지 619의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질.
[3] 하기(E) 또는 (F)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(E)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 23 내지 625의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(F)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 645의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질.
[4] 하기(G) 또는 (H)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(G)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 23 내지 645의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(H)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 645의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질.
[5] 하기(I) 또는 (J)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(I)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 26 내지 620의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(J)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 26 내지 620의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질
[6] 하기(K) 또는 (L)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(K)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 18 내지 644의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(L)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 18 내지 644의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질.
[7] 하기(M) 또는 (N)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(M)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(N)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[8] 하기(O) 또는 (P)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(O)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(P)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[9] 하기(Q) 또는 (R)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(Q)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(R)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[10] 하기(S) 또는 (T)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(S)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(T)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[11] 하기(U) 또는 (V)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(U)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(V)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[12] 하기(W) 또는 (X)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA:
(W)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(X)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
[13] 하기(a) 또는 (b)에 기재된 DNA:
(a)서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1908의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(b)서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1908의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[14] 하기(c) 또는 (d)에 기재된 DNA:
(c)서열목록의 서열번호 11에 기재된 염기서열 중의 염기번호 121 내지 1917의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(d)서열목록의 서열번호 11에 기재된 염기서열 중의 염기번호 121 내지 1917의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[15] 하기(e) 또는 (f)에 기재된 DNA:
(e)서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1935의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(f)서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1935의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[16] 하기(g) 또는 (h)에 기재된 DNA:
(g)서열목록의 서열번호 22에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1995의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(h)서열목록의 서열번호 22에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1995의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[17] 하기(i) 또는 (j)에 기재된 DNA:
(i)서열목록의 서열번호 24에 기재된 염기서열 중의 염기번호 104 내지 1888의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(j)서열목록의 서열번호 24에 기재된 염기서열 중의 염기번호 104 내지 1888의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[18] 하기(k) 또는 (l)에 기재된 DNA:
(k)서열목록의 서열번호 26에 기재된 염기서열 중의 염기번호 112 내지 1992의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(l)서열목록의 서열번호 26에 기재된 염기서열 중의 염기번호 112 내지 1992의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[19] 하기(m) 또는 (n)에 기재된 DNA:
(m)서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1908의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(n)서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1908의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[20] 하기(o) 또는 (p)에 기재된 DNA:
(o)서열목록의 서열번호 11에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1917의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(p)서열목록의 서열번호 11에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1917의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[21] 하기(q) 또는 (r)에 기재된 DNA:
(q)서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1935의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(r)서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1935의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[22] 하기(s) 또는 (t)에 기재된 DNA:
(s)서열목록의 서열번호 22에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1995의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(t)서열목록의 서열번호 22에 기재된 염기서열 중의 염기번호 127 내지 1995의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[23] 하기(u) 또는 (v)에 기재된 DNA:
(u)서열목록의 서열번호 24에 기재된 염기서열 중의 염기번호 29 내지 1888의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(v)서열목록의 서열번호 24에 기재된 염기서열 중의 염기번호 29 내지 1888의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[24] 하기(w) 또는 (x)에 기재된 DNA:
(w)서열목록의 서열번호 26에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1992의 염기서열로 이루어진 DNA 또는
(x)서열목록의 서열번호 26에 기재된 염기서열 중의 염기번호 61 내지 1992의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA.
[25] 엄중 조건이 1×SSC 및 0.1% SDS에 상당하는 염농도로 60℃에서 세정이 실시되는 조건인 항목 [13] 내지 [24]의 어느 한 항목에 기재된 DNA.
[26] 항목 [1] 내지 [25]의 어느 한 항목에 기재된 DNA를 갖는 재조합 DNA.
[27] 항목 [26]에 기재된 재조합 DNA가 도입된 형질전환 세포.
[28] 항목 [27]에 기재된 형질전환 세포를 배지 중에서 배양하며, 배지중 및/또는 형질전환 세포중에 펩타이드 생성효소를 축적시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드 생성효소의 제조방법.
[29] 항목 [28]에 기재된 형질전환 세포를 배지 중에서 배양하여 배양물을 수득하고 당해 배양물과 카복시 성분과 아민 성분을 혼합하여, 디펩타이드를 합성하는 디펩타이드의 제조방법.
[30]스핀고박테리움속에 속하며, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리한 미생물 균체, 당해 미생물의 처리된 균체 생성물 또는 당해 미생물로부터 유래하는 펩타이드 생성효소를 사용하여, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 디펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
또한, 서열목록의 서열번호 5에 기재된 DNA에 의해 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열이 특정된다. 서열번호 11에 기재된 DNA에 의해 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열이 특정된다. 서열번호 17에 기재된 DNA에 의해 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열이 특정된다. 서열번호 22에 기재된 DNA에 의해 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열이 특정된다.서열번호 24에 기재된 DNA에 의해 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열이 특정된다. 서열번호 26에 기재된 DNA에 의해 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열이 특정된다.
제1도는 본 발명의 엠페도박터 효소의 최적 pH를 도시하는 도면이다.
제2도는 본 발명의 엠페도박터 효소의 최적온도를 도시하는 도면이다.
제3도는 L-알라닌메틸에스테르와 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민 생성의 경시 변화를 도시하는 도면이다.
제4도는 세포질 분획(Cy)과 세포질주변공간(periplasm) 분획(Pe)에 존재하는 효소량을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 신규 디펩타이드 생성효소 유전자와 이의 유전자 산물인 디펩타이드 생성효소에 관해서 상세하게 설명한다.
(1)본 발명의 DNA를 갖는 미생물
본 발명의 DNA는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 단백질을 암호화하는 것이다. 본 명세서에서 카복시 성분이란 펩타이드 결합(-CONH-)에서 카보닐 부위(CO)를 제공하는 성분을 말하며 아민 성분이란 펩타이드 결합에서 아미노 부위(NH)를 제공하는 성분을 말한다. 또한, 본 명세서에서 단순히 「펩타이드」라고 할 때에는 특별히 단정하지 않는 한, 1개 이상의 펩타이드 결합을 갖는 중합체를 말한다. 또한, 본 명세서에서 「디펩타이드」란 1개의 펩타이드 결합을 갖는 펩타이드를 말한다.
본 발명의 DNA를 갖는 미생물로서는 예를 들면, 엠페도박터속에 속하는 세균, 스핀고박테리움(Sphingobacterium)속, 페도박터속, 탁세오박터(Taxeobacter)속, 사이클로박테리움(Cyclobacterium)속 또는 사이클로세르펜스(Psycloserpens)속에 속하는 세균 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) ATCC 14234주(FERM P-18545주, FERM BP-8113주), 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.) FERM BP-8124주, 페도박터 헤파리누스(Pedobacter heparinus) IFO 12017주, 탁세오박터 겔루푸르푸라센스(Taxeobacter gelupurpurascens) DSMZ 11116주, 사이클로박테리움 마리눔(Cyclobacterium marinum) ATCC 25205주, 사이클로세르펜스 부르토넨시스(Psycloserpens burtonensis) ATCC 700359주 등을 들 수 있다. 엠페도박터 브레비스 ATCC 14234주(FERM P-18545주, FERM BP-8113주), 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.) FERM BP-8124주, 페도박터 헤파리누스(Pedobacter heparinus) IFO 12017주, 탁세오박터 겔루푸르푸라센스(Taxeobacter gelupurpurascens) DSMZ 11116주, 사이클로박테리움 마리눔(Cyclobacterium marinum) ATCC 25205주, 사이클로세르펜스 부르토넨시스(Psycloserpens burtonensis) ATCC 700359주는 본 발명자등이 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드를 고수율로 생성시키는 효소의 생산균을 검색한 결과로 선별된 미생물이다.
상기 균주 중에서 FERM 번호가 기재되어 있는 것은 독립행정법인 산업기술종 합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
상기 균주 중에서 ATCC 번호가 기재되어 있는 것은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(P.O. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
상기 균주 중에서 IFO 번호가 기재되어 있는 것은 재단법인 발효연구소(일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
상기 균주 중에서 NBRC 번호가 기재되어 있는 것은 독립행정법인 제품평가기구 생물유전자원부문(일본국 치바켄 기사라즈시 가즈사 가마아시 2-5-8)에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
상기 균주 중에서 DSMZ 번호가 기재되어 있는 것은 기탁기관[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Germany)]에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
엠페도박터 브레비스 ATCC 14234주(FERM P-18545주, FERM BP-8113주)는 2001년 10월 1일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 츄오 제6)에 기탁되어 있으며, FERM P-18545의 수탁번호가 부여되어 있으며, 또한 2002년 7월 8일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 부다페스트 조약에 근거하는 기탁으로 이관되어 있으며, FERM BP-8113이 부여된 미생물이다(미생물의 표시: 엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) AJ-13933주).
스핀고박테리움 종 AJ 110003주는 2002년 7월 22일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어 있으며, FERM BP-8124의 수탁번호가 부여되어 있다. 또한, AJ 110003(FERM BP-8124)은 하기의 동정실험에 의해 상기한 스핀고박테리움 종인 것으로 동정되었다. FERM BP-8124주는 간균(0.7 내지 0.8×1.5 내지 2.0μm), 그램 음성, 포자 형성 없음, 운동성 없음, 콜로니 형태는 원형, 전체 테두리 매끄러운 모양, 저볼록형, 광택있음, 담황색, 30℃에서 생육, 카탈라제 양성, 옥시다제 양성, OF 테스트(글루코스) 음성의 성질을 기초로 스핀고박테리움에 속하는 세균으로 동정되었다. 또한, 질산염 환원 음성, 인돌 생성 음성, 글루코스로부터의 산 생성 음성, 아르기닌디하이드롤라제 음성, 우레아제 양성, 에스쿨린 가수분해 양성, 젤라틴 가수분해 음성, β-갈락토시다제 양성, 글루코스 자화 양성, L-아라비노스 자화 음성, D-만노스 자화 양성, D-만니톨 자화 음성, N-아세틸-D-글루코사민 자화 양성, 말토스 자화 양성, 글루콘산칼륨 자화 음성, n-카프르산 음성, 아디프산 자화 음성, dl-말산 자화 음성, 시트르산나트륨 자화 음성, 아세트산페닐 자화 음성, 시토크롬 옥시다제 양성의 성질로부터 스핀고박테리움 멀티보룸(Sphingobacterium multivorum) 또는 스핀고박테리움 스피리티보룸(Sphingobacterium spriritivorum)의 성질과 유사한 것으로 판명됐다. 또한 16S rRNA 유전자의 염기서열의 상동성 분석의 결과, 스핀고박테리움 멀티보룸과 가장 높은 상동성(98.8%)을 나타내지만, 완전하게 일치하는 주는 없는 점으로부터 본 균주를 스핀고박테리움 종으로 동정하였다.
(2) 미생물의 배양
본 발명의 DNA를 갖는 미생물의 배양 균체를 수득하기 위해 당해 미생물을 적당한 배지에서 배양 증식시킨다. 이를 위한 배지는 이러한 미생물을 증식할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으며 통상적인 탄소원, 질소원, 인원, 황원, 무기 이온, 또한 필요에 따라 유기 영양원을 함유하는 통상적인 배지일 수 있다.
예를 들면, 탄소원으로서는 상기 미생물이 이용할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며 구체적으로는 글루코스, 프럭토스, 말토스, 아밀로스 등의 당류, 소르비톨, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이들의 염류, 파라핀 등의 탄화수소 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
질소원으로서는 황산암모늄, 염화암모늄 등의 무기산의 암모늄염, 푸마르산암모늄, 시트르산암모늄 등의 유기산의 암모늄염, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 옥수수 침지액 등의 유기 질소 화합물 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
기타 무기염류, 미량 금속염, 비타민류 등의 통상적인 배지에 사용되는 영양원을 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다.
배양조건에도 특별한 제한은 없으며 예를 들면, 호기적 조건하에 pH 5 내지 8, 온도 15 내지 40℃의 범위에서 pH 및 온도를 적당히 조절하면서 약 12 내지 약 48시간 정도 배양할 수 있다.
(3) 효소의 정제
본 발명의 DNA는 펩타이드 생성효소를 암호화하는 DNA이다. 이러한 펩타이드 생성효소는 예를 들면, 엠페도박터속에 속하는 세균으로부터 정제할 수 있다. 당해 효소를 정제하는 예로서 엠페도박터 브레비스로부터 펩타이드 생성효소를 분리 및 정제하는 방법을 설명한다.
우선, 엠페도박터 브레비스, 예를 들면, FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)의 균체로부터 초음파 파쇄 등의 물리적 방법 또는 세포벽 용해효소 등을 사용하는 효소법 등에 의해 균체를 파괴하며, 원심분리 등에 의해 불용성 분획을 제거하여 균체 추출물을 조제한다. 이와 같이 수득되는 균체 추출액을 통상적인 단백질의 정제법, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 조합하여 분획함으로써 펩타이드 생성효소를 정제할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피용의 담체로서는 Q-세파로스 HP(아마샴사제) 등을 들 수 있다. 본 효소를 함유하는 추출액을 이들의 담체가 충전된 칼럼에 통과시키면 당해 효소는 pH 8.5의 조건하에 비흡착 분획으로 회수된다.
양이온 크로마토그래피용 담체로서는 Mono S HR(아마샴사제) 등을 들 수 있다. 본 효소를 함유하는 추출액을 이들의 담체가 충전된 칼럼에 통과시켜 본 효소를 칼럼에 흡착시키고 칼럼을 세정한 후에 고염농도의 완충액을 사용하여 효소를 용출시킨다. 이때에 단계적으로 염농도를 높일 수 있으며 농도 구배를 적용할 수 도 있다. 예를 들면, Mono S HR을 사용하는 경우에는 칼럼에 흡착된 본 효소는 0.2 내지 0.5M 정도의 NaCl로 용출된다.
상기와 같이 하여 정제된 효소는 다시 겔 여과 크로마토그래피 등에 의해 균일하게 정제할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피용 담체로서는 세파덱스 200pg(아마샴사제) 등을 들 수 있다.
상기 정제과정에서 본 효소를 함유하는 분획은 하기 방법 등에 따라 각 분획의 펩타이드 생성활성을 분석함으로써 확인할 수 있다. 상기한 바와 같이 정제된 본 효소의 내부 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재한다.
(4)본 발명의 DNA 및 형질전환체
(4-1)본 발명의 DNA
본 발명의 DNA인 서열번호 5에 기재된 염기번호 61 내지 1908의 염기서열로 이루어진 DNA는 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)에서 분리된 것이다. 서열번호 5에 기재된 염기번호 61 내지 1908의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 61 내지 1908의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 61 내지 126의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 127 내지 1908의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의 펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 5에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 리더 서열이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내에서 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 127 내지 1908에 의해 암호화되는 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성활성을 나타낸다고 추정된다.
본 발명의 DNA인 서열번호 11에 기재된 염기번호 61 내지 1917의 염기서열로 이루어진 DNA는 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)에서 분리된 것이다. 서열번호 11에 기재된 염기번호 61 내지 1917의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 61 내지 1917의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 61 내지 120의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 121 내지 1917의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 11에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 당해 리더 서열영역이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내에서 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 121 내지 1917이 암호화하는 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성활성을 나타낸다고 추정된다.
본 발명의 DNA인 서열번호 17에 기재된 염기번호 61 내지 1935의 염기서열로 이루어진 DNA는 페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)에서 분리된 것이다. 서열번호 17에 기재된 염기번호 61 내지 1935의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 61 내지 1935의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 61 내지 126의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 127 내지 1935의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의 펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 17에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 당해 리더 서열영역이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내로부터 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 127 내지 1935이 암호화하는 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성활성을 나타낸다고 추정된다.
본 발명의 DNA인 서열번호 22에 기재된 염기번호 61 내지 1995의 염기서열로 이루어진 DNA는 탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Germany)에서 분리된 것이다. 서열번호 22에 기재된 염기번호 61 내지 1995의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 61 내지 1995의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 61 내지 126의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 127 내지 1995의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의 펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 22에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 당해 리더 서열영역이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내로부터 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 127 내지 1995에 의해 암호화되는 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성활성을 나타낸다고 추정된다.
본 발명의 DNA인 서열번호 24에 기재된 염기번호 29 내지 1888의 염기서열로 이루어진 DNA는 사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA20110, the United States of America)에서 분리된 것이다. 서열번호 24에 기재된 염기번호 29 내지 1888의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 29 내지 1888의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 29 내지 103의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 104 내지 1888의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의 펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 24에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 당해 리더 서열영역이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내로부터 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 104 내지 1888이 암호화하는 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성활성을 나타낸다고 추정된다.
본 발명의 DNA인 서열번호 26에 기재된 염기번호 61 내지 1992의 염기서열로 이루어진 DNA는 사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소 P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)에서 분리된 것이다. 서열번호 26에 기재된 염기번호 61 내지 1992의 염기서열로 이루어진 DNA는 암호화 서열(CDS) 부분이다. 염기번호 61 내지 1992의 염기서열에는 시그널 서열영역과 성숙 단백질 영역이 포함되어 있다. 시그널 서열영역은 염기번호 61 내지 111의 영역이며, 성숙 단백질 영역은 염기번호 112 내지 1992의 영역이다. 즉, 본 발명은 시그널 서열을 함유하는 펩타이드 효소 단백질 유전자와, 성숙한 단백질 형태의 펩타이드 효소 단백질 유전자를 제공한다. 서열번호 26에 기재된 서열에 포함되는 시그널 서열은 일종의 리더 서열이며, 당해 리더 서열영역이 암호화하는 리더 펩타이드의 주된 기능은 세포막 내로부터 세포막 외로 분비시키는 것에 있다고 추정된다. 염기번호 112 내지 1992에 의해 암호화된 단백질, 즉 리더 펩타이드를 제외한 부위가 성숙 단백질이며, 높은 펩타이드 생성 활성을 나타낸다고 추정된다.
또한, 하기에 열거된 각종 유전자 재조합 기법에 관해서는 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]등의 기재에 준하여 실시할 수 있다.
본 발명의 DNA는 엠페도박터 브레비스, 스핀고박테리움 종, 페도박터 헤파리누스, 탁세오박터 겔루푸르푸라센스, 사이클로박테리움 마리눔 또는 사이클로세르펜스 부르토넨시스의 염색체 DNA 또는 DNA 라이브러리에서 폴리머라제 연쇄 반응(이후부터 "PCR"[polymerase chain reacion, White, T.J. et al; Trend S Genet., 5, 185(l989) 참조] 또는 하이브리드화에 의해서 취득할 수 있다. PCR에 사용하는 프라이머는 상기(3)의 란에서 설명한 바와 같이 하여 정제된 펩타이드 생성효소에 근거하여 결정된 내부 아미노산 서열에 근거하여 설계할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 펩타이드 생성효소 유전자(서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26)의 염기서열이 명백하게 됨으로써 이들 염기서열에 근거하여 프라이머 또는 하이브리드화용의 프로브를 설계할 수 있으며 프로브를 사용하여 유전자를 분리할 수 있다. PCR용의 프라이머로서 5' 비해독 영역 및 3' 비해독 영역에 상응하는 서열을 갖는 프라이머를 사용하면 본 효소의 암호화 영역 전체 길이를 증폭시킬 수 있다. 서열번호 5에 기재된 리더 서열 및 성숙 단백질 암호화 영역 둘다를 포함하는 영역을 증폭하는 경우를 예로 들면 구체적으로는 5'측 프라이머로서는 서열번호 5에서 염기번호 61보다 상류의 영역의 염기서열을 갖는 프라이머를 들 수 있는 반면 3'측 프라이머로서는 염기번호 1908보다 하류의 영역의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 들 수 있다.
프라이머의 합성은 예를 들면, 제조원(Applied Bio Systems)의 DNA 합성기 모델 380B를 사용하고, 포스포아미다이트법을 사용하여[문헌참조: Tetrahedron Letters(1981), 22, 1859] 통상적인 방법에 따라서 합성할 수 있다. PCR 반응은 예를 들면, 유전자 증폭 PCR 시스템(Gene Amp PCR System) 9600(PERKIN ELMER사제) 및 TaKaRa LA PCR 시험관내 클로닝 키트(다카라슈조사제)를 사용하여, 각 제조자 등의 공급자가 명시한 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 5에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 함유하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 5에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 11에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이것을 유지하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 11에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 17에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 유지하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 17에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 22에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 유지하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 22에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 24에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 유지하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 24에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
본 발명의 DNA에 리더 서열이 함유되는 경우 및 함유되지 않는 경우와는 상관없이 서열목록의 서열번호 26에 기재된 CDS로 이루어진 DNA와 실질적으로 동일한 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 즉, 변이를 갖는 본 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 유지하는 세포 등으로부터 서열목록의 서열번호 26에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA 또는 동 염기서열로부터 조제되는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다.
프로브는 예를 들면, 서열목록의 서열번호 5에 기재된 염기서열에 근거하여 확립된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 프로브를 사용하여 이것과 하이브리드화하는 DNA를 모색하여, 목적하는 DNA를 분리하는 방법도 확립된 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, DNA 프로브는 플라스미드나 파지 벡터에 클로닝된 염기서열을 증폭하여, 프로브로서 사용하고자 하는 염기서열을 제한효소에 의해 절단 인출하며 추출하여 조제할 수 있다. 절단 인출되는 부분은 목적하는 DNA에 따라 조절할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 「엄중 조건」이란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만, 한가지 예를 기재하면 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면, 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리드화하며, 이보다 상동성이 낮은 DNA끼리 하이브리드화하지 않는 조건 또는 통상적인 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. 이러한 조건하에 하이브리드화하는 유전자 중에는 이의 서열을 따라 특정 위치에 종료 코돈이 존재하거나 활성 중심의 변이에 의해 활성을 잃은 유전자들을 포함하지만, 이들에 관해서는 시판하는 발현 벡터에 연결하며, 적당한 숙주에서 발현시켜 발현 산물의 효소활성을 하기 방법으로 측정함으 로써 용이하게 제거할 수 있다.
그러나, 상기한 바와 같이 엄중 조건하에 하이브리드화하는 염기서열의 경우에는 50℃, pH 8의 조건하에 본래의 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 반정도 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 효소활성을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 서열번호 5에 기재된 염기서열 중에서 염기번호 127 내지 1908에서의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 엄중 조건하에 하이브리드화하는 염기서열의 경우에 관해서 설명하면 50℃, pH 8의 조건하에 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 반정도 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 효소활성을 유지하는 것이 바람직하다.
서열목록의 서열번호 5에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 6에 기재된다. 서열목록의 서열번호 11에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 12에 기재된다. 서열목록의 서열번호 17에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 18에 기재된다. 서열목록의 서열번호 22에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 23에 기재된다. 서열목록의 서열번호 24에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25에 기재된다. 또한, 서열목록의 서열번호26에 기재된 CDS에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27에 기재된다.
서열번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체에는 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 22까지가 리더 펩타이드에 해당되며 23 내지 616까지가 성숙 단백질 영역이다. 또한, 서열번호 11에 기재된 전체 아미노산 서열은 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 20까지가 리더 펩타이드에 해당되며, 21 내지 619까지가 성숙 단백질 영역이다.
서열번호 18에 기재된 전체 아미노산 서열은 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 22까지가 리더 펩타이드에 해당되며, 23 내지 625까지가 성숙 단백질 영역이다.
서열번호 23에 기재된 전체 아미노산 서열은 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 22까지가 리더 펩타이드에 해당되며, 23 내지 645까지가 성숙 단백질 영역이다.
서열번호 25에 기재된 전체 아미노산 서열은 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 25까지가 리더 펩타이드에 해당되며, 26 내지 620까지가 성숙 단백질 영역이다.
서열번호 27에 기재된 전체 아미노산 서열은 리더 펩타이드와 성숙 단백질 영역이 포함되며, 아미노산 잔기번호 1 내지 17까지가 리더 펩타이드에 해당되며, 18 내지 644까지가 성숙 단백질 영역이다.
본 발명의 DNA에 의해 암호화되는 단백질은 이의 성숙 단백질이 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질이다. 리더 펩타이드를 함유하거나 함유하지 않는가에 관계없이 서열목록의 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 서열번호 23, 서열번호 25 또는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다(또한, 범용 코돈의 코드에 따라서 아미노산 서열로부터 염기서열이 특정됨을 주지한다). 즉, 본 발명에 따라 하기의 (A) 내지 (X)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA가 제공된다.
(A)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(B)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(C)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 21 내지 619의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(D)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 21 내지 619의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(E)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 625의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(F)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 625의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(G)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 23 내지 645의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(H)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 23 내지 645의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(I)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 26 내지 620의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(J)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 26 내지 620의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(K)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열중에 아미노산 잔기번호 18 내지 644의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(L)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열중의 아미노산 잔기번호 18 내지 644의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 단백질,
(M)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(N)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질,
(O)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(P)서열목록의 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질,
(Q)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(R)서열목록의 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질,
(S)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(T)서열목록의 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질,
(U)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(V)서열목록의 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질,
(W)서열목록의 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(X)서열목록의 서열번호 27에 기재의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 펩타이드 생성활성을 갖는 성숙 단백질 영역을 포함하는 단백질.
여기서, 「수개」란 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조나 활성을 크게 손상하지 않는 범위의 것이며, 구체적으로는 2 내지 50개, 바람직하게는 2 내지 30개, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개이다. 단, (B), (D), (F), (H), (J), (L), (N), (P), (R), (T), (V), (X)의 단백질의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열의 경우에는 50℃, pH 8의 조건하에 변이를 포함하지 않는 상태에서 단백질의 반정도 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 효소활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, (B)의 경우에 관하여 설명하면 (B)서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열의 경우에는 50℃, pH 8의 조건하에 서열목록의 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 반정도 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 효소활성을 유지하는 것이 바람직하다.
상기(B) 등에 기재된 바와 같은 아미노산의 변이는 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해 본 효소 유전자의 특정한 부위의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 부가되도록 염기서열을 변형시킴으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 변형된 DNA는 종래부터 공지되어 있는 돌연변이유발 처리에 의해서도 취득될 수 있다. 돌연변이 유발 처리로서는 본 효소를 암호화하는 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법 및 본 효소를 암호화하는 DNA를 함유하는 에스케리치아속 세균을 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상적인 인공 돌연변이 유발에 사용되는 변이제에 의해 처리하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기와 같은 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위 등에는 미생물의 종 또는 균주에 의한 차등의 천연에 생기는 돌연변이도 포함된다. 상기와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 적당한 세포에서 발현시켜 발현 산물의 본 효소활성을 조사함으로써 서열목록의 서열번호 6 또는 12에 기재된 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA가 수득된다.
(4-2)형질전환체의 작제 및 펩타이드 생성효소의 생산
본 발명의 DNA를 적당한 숙주에 도입하며, 당해 DNA를 발현시킴으로써 펩타이드 생성효소를 생산할 수 있다.
본 발명의 DNA에 의해 특정되는 단백질을 발현시키기 위한 숙주로서는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 등의 에스케리치아속 세균, 엠페도박터속 세균, 스핀고박테리움속 세균, 플라보박테리움속 세균 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실루스 속을 비롯하여 각종 원핵세포, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 아스퍼질러스·오리제(Aspergillus oryzae)를 위시해서 각종 진핵세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA를 숙주에 도입하는 데 사용하는 재조합 DNA는 DNA가 발현되는 숙주의 종류에 상응하는 벡터에 본 발명의 DNA를 당해 DNA가 암호화하는 단백질을 발현할 수 있는 형태로 삽입하는 것으로 조제할 수 있다. 본 발명의 DNA를 발현시키기 위한 프로모터로서는 엠페도박터 브레비스 등의 펩타이드 생성효소 유전자 고유의 프로모터가 숙주세포에서 기능하는 경우에는 당해 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 숙주세포에서 작용하는 다른 프로모터를 본 발명의 DNA에 연결하여, 당해 프로모터 제어하에 발현되도록 할 수 있다.
재조합 DNA를 숙주세포에 도입하기 위한 형질전환법으로서는 모리슨 디 엠(D.M. Morrison)의 방법[Methods in Enzymology 68, 326(1979)] 또는 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[문헌참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)] 등을 들 수 있다.
단백질을 재조합 DNA 기술을 사용하여 대량생산하는 경우, 당해 단백질을 생산하는 형질전환체 내로 당해 단백질은 단백질의 봉입체(inclusion body)로서 형성되도록 하는 형태도 바람직한 한가지 실시형태로서 들 수 있다. 이러한 발현 생산방법의 이점은 목적하는 단백질을 균체내에 존재하는 프로테아제에 의한 분해로부터 보호하는 점 및 목적하는 단백질을 균체 파쇄에 계속되는 원심분리 조작에 의해 간단하게 정제할 수 있는 점 등이다.
이와 같이 하여 수득되는 단백질 봉입체는 단백질 변성제에 의해 가용화되어, 주로 당해 변성제를 제거하는 것에 의한 활성 재생조작을 경유한 다음, 정확하게 접힌 생리적으로 활성인 단백질로 변환된다. 예를 들면, 사람 인터류킨 2의 활성 재생[일본 공개특허공보 제(소)61-257931호] 등의 많은 예가 있다.
단백질 봉입체로부터 활성형 단백질을 수득하기 위해서는 가용화·활성 재생 등의 일련의 조작이 필요하며, 직접활성형 단백질을 생산하는 경우보다 조작이 복잡해진다. 그러나 균체의 생육에 치명적인 효과를 갖는 단백질을 균체내에서 대량으로 생산시키는 경우에는 불활성인 단백질 봉입체로서 균체내에 축적시킴으로써 이의 영향을 억제할 수 있다.
목적하는 단백질을 봉입체로서 대량생산시키는 방법으로서 강력한 프로모터의 제어하에 목적하는 단백질을 단독으로 발현시키는 방법 이외에 대량 발현하는 것이 공지되어 있는 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 방법이 있다.
이하, 형질전환된 이. 콜리를 작제하며, 이것을 사용하여 펩타이드 생성효소를 제조하는 방법을 예로서 보다 구체적으로 설명한다. 또한, 이. 콜리 등의 미생물에서 펩타이드 생성효소를 생산하는 경우 단백질의 암호화 서열로서 리더 서열을 포함하는 전구 단백질을 암호화하는 DNA를 혼입하거나 리더 서열을 포함하지 않는 성숙 단백질 영역의 DNA만을 혼입할 수 있으며, 작제하고자 하는 효소의 제조조건, 형태, 사용조건 등에 따라 DNA를 적절하게 선택할 수 있다.
펩타이드 생성효소를 암호화하는 DNA를 발현시키는 프로모터로서는 통상적으로 이. 콜리에서 이종 단백질 생산에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있으며 예를 들면, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의 PR 프로모터, PL 프로모터 등의 강력한 프로모터를 들 수 있다. 또한, 벡터로서는 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RS F1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등을 사용할 수 있다. 이외에도 파지 DNA의 벡터도 이용할 수 있다. 또한, 프로모터를 포함하여, 삽입 DNA 서열을 발현시 킬 수 있는 발현 벡터를 사용할 수 있다.
펩타이드 생성효소를 융합 단백질 봉입체로서 생산시키기 위해서는 펩타이드 생성효소 유전자의 상류 또는 하류에 다른 단백질, 바람직하게는 친수성인 펩타이드를 암호화하는 유전자를 연결하여, 융합 단백질 유전자를 수득한다. 이러한 다른 단백질을 암호화하는 유전자는 융합 단백질의 축적량을 증가시켜 변성·재생공정 후에 융합 단백질의 용해성을 증가시키는 임의의 유전자이며 예를 들면, T7 유전자 10, β-갈락토시다제 유전자, 데하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, γ-인터페론 유전자, 인터류킨 2 유전자, 프로키모신 유전자 등을 후보로서 들 수 있다.
이들의 유전자와 펩타이드 생성효소를 암호화하는 유전자를 연결할 때에는 코돈의 판독 프레임이 일치하도록 한다. 당해 유전자들은 적당한 제한효소 부위에서 연결될 수 있거나 적당한 서열의 합성 DNA가 사용될 수 있다.
또한, 펩타이드 생성효소의 생산량을 증대시키기 위해서는 융합 단백질 유전자의 하류에 전사 종결서열인 터미네이터를 연결하는 것이 바람직한 경우가 있다. 이러한 터미네이터로서는 T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터, 이. 콜리 trpA 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다.
펩타이드 생성효소 또는 펩타이드 생성효소와 기타 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 이. 콜리에 도입하기 위한 벡터로서는 소위 다중복제형의 벡터가 바람직하며 ColE1 유래의 복제 오리진을 갖는 플라스미드, 예를 들면, pUC계의 플라스미드나 pBR322계의 플라스미드 또는 이의 유도체를 들 수 있다. 여기 서, 「유도체」란 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위 등에 의해서 플라스미드를 변형시킨 것을 의미한다. 또한, 여기서 말하는 변형이란 변이제나 UV 조사 등에 의한 변이처리 또는 자연변이 등에 의한 개변을 포함한다.
또한, 형질전환체를 선별하기 위해 당해 벡터는 암피실린 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드로서 강력한 프로모터를 가지는 발현 벡터가 시판되고 있다. [pUC계 벡터(다카라슈조(주)제), pPROK계 벡터(클론텍제), pKK233-2(클론텍제) 등).
프로모터, 펩타이드 생성효소 또는 펩타이드 생성효소와 기타 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자, 경우에 따라서는 터미네이터의 순서로 연결한 DNA 단편과, 벡터 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다.
당해 재조합 DNA를 사용하여 이. 콜리를 형질전환하며, 이러한 이. 콜리를 배양하면 펩타이드 생성효소 또는 펩타이드 생성효소와 기타 단백질과의 융합 단백질이 발현 생산된다. 형질전환되는 숙주는 이종 유전자의 발현에 통상적으로 사용되는 주를 사용할 수 있지만, 에스케리치아 콜리 JM109주가 바람직하다. 형질전환을 실시하는 방법 및 형질전환체를 선별하는 방법은 [문헌참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]등에 기재되어 있다.
융합 단백질로서 펩타이드 생성효소를 발현시킨 경우, 혈액 응고인자 Xa, 칼리크레인 등의 펩타이드 생성효소 내에 존재하지 않는 서열을 인식서열로 하는 제한 프로테아제를 사용하여 펩타이드 생성효소를 절단 인출시키도록 할 수 있다.
생산 배지에서는 M9-카사미노산 배지, LB 배지 등의 이. 콜리를 배양하기 위해 통상적으로 사용하는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 배양조건, 생산 유도조건은 사용하는 벡터의 마커, 프로모터, 숙주균 등의 종류에 따라서 적절하게 선택한다.
펩타이드 생성효소 또는 펩타이드 생성효소와 기타 단백질과의 융합 단백질을 회수하기 위해서는 하기의 방법 등이 있다. 펩타이드 생성효소 또는 이의 융합 단백질이 균체내에 가용화되어 있으면, 균체를 회수한 다음, 균체를 파쇄 또는 용균시키고, 조효소액으로서 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 통상적인 침전, 여과, 칼럼 크로마토그래피 등의 수법에 따라 펩타이드 생성효소 또는 이의 융합 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이 경우, 펩타이드 생성효소 또는 융합 단백질의 항체를 이용한 정제법도 이용할 수 있다.
단백질 봉입체가 형성되는 경우에는 변성제로 이것을 가용화한다. 균체 단백질과 동시에 가용화할 수 있지만, 이후의 정제조작을 고려하면 봉입체을 인출하여 이것을 가용화하는 것이 바람직하다. 봉입체를 균체로부터 회수하는 데는 종래부터 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 균체를 파괴하여 원심분리 조작 등에 의해 봉입체를 회수한다. 단백질 봉입체를 가용화시키는 변성제로서는 구아니딘하이드로클로라이드(예: 6M, pH 5 내지 8)이나 요소(예: 8M) 등을 들 수 있다.
이들 변성제를 투석 등에 의해 제거하면 활성을 갖는 단백질로서 재생된다. 투석에 사용하는 투석 용액으로서는 트리스-HCl 완충액이나 포스페이트 완충액 등을 사용하면 양호하며 농도로서는 20mM 내지 0.5M, pH로서는 5 내지 8을 들 수 있다.
재생 단계시의 단백질 농도는 500μg/ml 정도 이하로 억제하는 것이 바람직하다. 재생한 펩타이드 생성효소가 자가가교 결합하는 것을 억제하기 위해 투석온도는 5℃ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 변성제 제거방법으로서 이러한 투석법 이외에 희석법, 한외여과법 등이 있으며 어떤 것을 사용해도 활성의 재생을 기대할 수 있다.
(5)본 발명의 DNA로 암호화되는 효소의 성질
본 발명의 DNA가 암호화하는 효소의 활성은 예를 들면, 아미노산에스테르와 아민을 기질로서 함유하는 보레이트 완충액 속에서 반응시켜 생성된 펩타이드를 정량함으로써 측정할 수 있다. 보다 구체적인 예로서는 L-알라닌메틸에스테르 100mM, L-글루타민 200mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0)을 사용하여, 25℃에서 수분 동안 반응시키는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 효소의 활성단위에 관해서는 L-알라닌메틸에스테르 100mM, L-글루타민 200mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0)을 사용하여, 25℃에서의 반응 조건으로 1분 동안에 1μmole의 펩타이드를 생성하는 효소량을 1유니트(U) 라고 정의한다.
본 발명의 DNA로 암호화되는 단백질은 펩타이드 생성효소 단백질이다. 펩타이드 생성활성이란 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드를 생성하는 활성을 언급한다. 이하, 본 발명의 DNA가 암호화하는 효소의 바람직한 형태에 관해서, 이의 성질면에서 설명한다.
본 발명의 DNA가 암호화하는 효소의 바람직한 한가지 형태로서 디펩타이드의 생성속도를 1개의 지표로 하는 하기와 같은 능력을 갖는 효소를 들 수 있다. 즉, 본 발명의 효소의 바람직한 한가지 형태로서 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드를 생성하는 능력을 가지며 하기(i) 내지 (iv)의 조건하에 디펩타이드 합성반응에서 L-알라닐-L-글루타민의 생성속도가 바람직하게는 0.03mM/분 이상, 보다 바람직하게는 0.3mM/분 이상, 특히 바람직하게는 1.0mM/분 이상으로 되는 능력을 갖는 효소를 들 수 있다. 디펩타이드 합성반응의 조건은 다음과 같다:
(i)카복시 성분이 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드(100mM),
(ii)아민 성분이 L-글루타민(200mM),
(iii)pH가 9.0 및
(iv) 균일하게 정제된 효소의 첨가량이 단백질량으로서 0.61mg/ml 미만.
상기와 같은 생성속도는 효소를 사용하는 펩타이드 합성의 지금까지의 상식을 훨씬 상회하는 것이며 본 발명의 효소는 매우 고속으로 펩타이드 합성을 촉매하는 능력을 갖는 것이다.
효소 첨가량이란 반응계에 첨가하는 효소의 최종 첨가량을 나타내며 단백질량으로서 0.01mg/ml 이상, 바람직하게는 0.02mg/ml 이상의 첨가가 바람직하다. 「단백질량으로서」란 단백질 분석 CBB 용액(나카라이제)를 사용하며, 소 혈청 알부민을 표준물질로 하는 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 발색법으로 나타내는 값을 언급한다.
효소활성의 측정에 관해서 보다 구체적인 예를 들면, 아미노산에스테르와 아민을 기질로서 함유하는 보레이트 완충액 속에서 반응시켜 생성된 펩타이드를 정량 함으로써 측정할 수 있다. 보다 구체적인 예로서는 L-알라닌메틸에스테르 100mM, L-글루타민 200mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0)을 사용하여, 25℃에서 수분 동안 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA로 암호화되는 효소로서 바람직한 한가지 형태에는 카복시 성분으로서 아미노산에스테르, 아미노산아미드의 어느 하나를 기질로 할 수 있는 성질을 갖는 효소를 들 수 있다. 「아미노산에스테르, 아미노산아미드의 어느 하나를 기질로 할 수 있다」라는 것은 아미노산에스테르의 하나 이상 및 아미노산아미드의 하나 이상을 기질로 할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 효소로서 바람직한 한가지 형태에는 아민 성분으로서 아미노산, C 보호 아미노산, 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있는 성질을 갖는 효소를 들 수 있다. 「아미노산, C 보호 아미노산, 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있다」라는 것은 아미노산의 하나 이상, C 보호 아미노산의 하나 이상 및 아민의 하나 이상을 기질로 할 수 있는 것을 의미한다. 카복시 성분 또는 아민 성분에 관해서 폭넓은 기질 특이성을 갖는 것은 공업 생산의 장소에서 소비, 생산 설비 등의 점에서 상황이 좋은 원료의 선택성이 넓어진다는 점에서 바람직하다.
카복시 성분의 구체예를 예로 들면, L-아미노산에스테르, D-아미노산에스테르, L-아미노산 아미드, D-아미노산아미드 등을 들 수 있다. 또한, 아미노산에스테르에는 천연형의 아미노산에 상응하는 아미노산에스테르 뿐만 아니라, 비천연형의 아미노산 또는 이의 유도체에 상응하는 아미노산에스테르도 있다. 또한, 아미노산에스테르로서는 α-아미노산에스테르 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ- 또는 ω- 등의 아미노산의 에스테르도 있다. 아미노산에스테르의 대표예로서는 아미노산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, n-프로필에스테르, 이소프로필에스테르, n-부틸에스테르, 이소부틸에스테르 또는 3급-부틸에스테르 등을 들 수 있다.
아민 성분의 구체예를 예로 들면, L-아미노산, C 보호 L-아미노산, D-아미노산, C 보호 D-아미노산 또는 아민 등이 예시된다. 또한, 아민으로서는 천연형 아민 뿐만 아니라, 비천연형의 아민 또는 이의 유도체 등도 예시된다. 또한, 아미노산으로서는 천연형 아미노산 뿐만 아니라 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체도 예시된다. α-아미노산 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산 등도 예시된다.
또한, 더욱 별도의 측면으로서 본 발명의 DNA로 암호화되는 효소로서 바람직한 한가지 형태에는 펩타이드 생성반응에서 촉매할 수 있는 pH의 범위가 6.5 내지 10.5의 범위인 효소를 들 수 있다. 이와 같이 넓은 pH 범위로 촉매할 수 있는 것은 다양한 제약이 생길 수 있는 공업적 생산에서 유연한 대응을 할 수 있다는 점에서 바람직하다. 단, 실제로 펩타이드를 생산하는 데 있어서는 효소의 촉매 성능을 최대화하기 위해 취득된 효소에 따라 다시 최적 pH로 조정하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 다시 별도의 측면으로서 본 발명의 DNA로 암호화되는 효소로서 바람직한 한가지 형태에는 펩타이드 생성반응에서 촉매할 수 있는 온도범위가 0 내지 60℃인 효소를 들 수 있다. 이와 같이 넓은 온도범위로 촉매할 수 있는 것은 다양한 제약이 생길 수 있는 공업적 생산에서 유연한 대응이 할 수 있다는 점에서 바람직하다. 단, 실제로 펩타이드를 생산하는 데 있어서는 효소의 촉매 성능을 최대화하기 위해 취득된 효소에 따라 다시 최적온도로 조정하여 사용하는 것이 바람직하다.
(6)디펩타이드의 제조방법
본 발명의 디펩타이드를 제조하는 방법으로서는 소정의 효소의 존재하에 카복시 성분과 아민 성분을 반응시킨다. 즉, 본 발명의 디펩타이드의 제조방법은 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 효소 또는 당해 효소를 포함하는 함유물을 카복시 성분과 아민 성분에 작용시켜 디펩타이드를 합성시키는 것이다.
본 발명에 사용하는 효소 또는 효소 함유물을 카복시 성분과 아민 성분에 작용시키는 방법으로서는 당해 효소 또는 효소 함유물, 카복시 성분 및 아민 성분을 혼합하면 양호하다. 보다 구체적으로는 효소 또는 효소 함유물을 카복시 성분과 아민 성분을 함유하는 용액중에 첨가하여 반응시키는 방법을 사용할 수 있으며 당해 효소를 생산하는 미생물을 사용하는 경우에는 당해 효소를 생산하는 미생물을 배양하며, 미생물 중 또는 미생물의 배양액 중에 당해 효소를 정제 및 축적시키며, 배양액 중에 카복시 성분과 아민 성분을 첨가하는 방법 등을 사용할 수 있다. 생성된 디펩타이드는 확립된 방법에 따라 회수하여, 필요에 따라 정제할 수 있다.
「효소 함유물」란 당해 효소를 함유하는 것이면 양호하며 구체적 형태로서는 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 처리된 균체 생성물 등이 포함된다. 미생물의 배양물이란 미생물을 배양하여 수득되는 물질이며, 보다 구체적으로는 미생물 균체, 당해 미생물의 배양에 사용하는 배지 및 배양된 미생물에 의해 생성된 물질의 혼합물 등을 말한다. 또한, 미생물 균체는 세정하며, 세정 균체로서 사용할 수 있다. 또한, 처리된 균체 생성물에는 균체를 파쇄, 용균, 동결 건조한 것 등이 포함되며, 또한 균체 등을 처리하여 회수하는 조 효소(crude enzyme), 다시 정제한 정제 효소 등도 포함된다. 정제처리된 효소로서는 각종 정제법에 따라 수득되는 부분 정제 효소 등을 사용할 수 있으며, 이들을 공유결합법, 흡착법, 포집법 등에 의해 고정화한 고정화 효소를 사용할 수 있다. 또한, 사용되는 미생물에 따라서는 배양중에 일부, 용균하는 것도 있으므로 이 경우에는 배양액 상등액도 효소 함유물로서 이용할 수 있다.
또한, 당해 효소를 포함하는 미생물로서는 야생주를 사용할 수 있으며 본 효소를 발현한 유전자 재조합 주를 사용할 수 있다. 당해 미생물로서는 효소 미생물 균체에 한하지 않으며 아세톤 처리균체, 동결 건조균체 등의 처리된 균체 생성물을 사용할 수 있으며 이들을 공유결합법, 흡착법, 포집법 등에 의해 고정화한 고정화 균체, 고정화 처리된 균체 생성물을 사용할 수 있다.
또한 배양물, 배양 균체, 세정 균체, 균체를 파쇄 또는 용균시킨 처리된 균체 생성물을 사용하는 경우에는 펩타이드의 생성에 관여하지 않고 생성 펩타이드를 분해하는 효소가 존재하는 경우가 많으며 이 경우에는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)와 같은 금속 프로테아제 억제제를 첨가하는 편이 바람직한 경우가 있다. 첨가량은 O.1mM 내지 300mM의 범위이며 바람직하게는 1mM 내지 100mM이다.
본 발명의 디펩타이드 제조방법의 바람직한 형태로서는 상기(4-2)에 기재된 형질전환 세포를 배지 중에서 배양하며, 배지중 및/또는 형질전환 세포중에 펩타이드 생성효소를 축적시키는 방법을 들 수 있다. 형질전환체를 사용함으로써 펩타이드 생성효소를 간편하게 대량 생성할 수 있으므로 디펩타이드의 생성도 대량으로 신속하게 실시할 수 있다.
효소 또는 효소 함유물의 사용량은 목적하는 효과를 발휘하는 양(유효량)이면 양호하며 이러한 유효량은 당업자이면 간단한 예비실험에 의해 용이하게 결정되지만, 예를 들면, 효소를 사용하는 경우에는 O.01 내지 약 100유니트(U) 정도, 세정 균체를 사용하는 경우에는 약 1 내지 약 500g/L 정도이다.
카복시 성분으로서는 또 하나의 기질인 아민 성분과 축합하여 펩타이드를 생성할 수 있는 것이면 사용할 수 있다. 카복시 성분으로서는 예를 들면, L-아미노산에스테르, D-아미노산에스테르, L-아미노산아미드, D-아미노산아미드, 또한 아미노기를 갖지 않는 유기산 에스테르 등을 들 수 있다. 또한, 아미노산에스테르로서는 천연형의 아미노산에 상응하는 아미노산에스테르 뿐만 아니라, 비천연형의 아미노산 또는 이의 유도체에 상응하는 아미노산에스테르 등도 예시된다. 또한, 아미노산에스테르로서는 α-아미노산에스테르 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산의 에스테르 등도 예시된다. 아미노산에스테르의 대표예로서는 아미노산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, n-프로필에스테르, 이소프로필에스테르, n-부틸에스테르, 이소부틸에스테르, 3급-부틸에스테르 등이 예시된다.
아민 성분으로서는 또 하나의 기질인 카복시 성분과 축합하여 펩타이드를 생성할 수 있는 것이면 사용할 수 있다. 아민 성분으로서는 예를 들면, L-아미노산, C 보호 L-아미노산, D-아미노산, C 보호 D-아미노산, 아민 등을 들 수 있다. 또한, 아민으로서는 천연형 아민 뿐만 아니라, 비천연형의 아민 또는 이의 유도체 등이 예시된다. 또한, 아미노산으로서는 천연형 아미노산 뿐만 아니라 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체도 예시된다. α-아미노산 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산 등도 예시된다.
출발원료인 카복시 성분 및 아민 성분의 농도는 각각 1mM 내지 10M, 바람직하게는 0.05M 내지 2M이지만, 카복시 성분에 대하여 아민 성분을 등량 이상 첨가하는 편이 바람직한 경우가 있다. 또한, 기질이 고농도이면 반응을 억제할 것 같은 경우에는 반응중에 이들을 억제하지 않을 농도로 하여 순차적으로 첨가할 수 있다.
반응온도는 0 내지 60℃이며 펩타이드 합성할 수 있으며 바람직하게는 5 내지 40℃이다. 또한 반응 pH는 pH 6.5 내지 10.5이며 펩타이드를 합성할 수 있으며 바람직하게는 pH 7.0 내지 10.0이다.
이하, 실시예를 열거하여 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것이 아니다. 생성물의 측정에는 박층 크로마토그램의 닌하이드린 발색에서의 확인(정성)에 추가하여, 정량적으로는 하기에 기재된 고속 액체 크로마토그래피로써 정량한다. 칼럼: inertsiL ODS-2(GL 사이언스사제), 용리액: 5.0mM 1-옥탄, 설포네이트를 함유하는 인산 수용액(pH 2.1):메탄올= 100:15 내지 50, 유속: 1.0mL/분, 검출 210nm.
(실시예 1) 미생물의 배양(엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113)
1L 중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g을 함유하는 배지(pH 6.2) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 분주(分注)하여, 115℃에서 15분 동안 살균한다. 여기에 동 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)을 1백금이 접종하고, 30℃, 120왕복/분으로 16시간 동안 진탕 배양을 실시한다.
(실시예 2) 미생물 균체를 사용하는 펩타이드의 생산
실시예 1에서 수득된 배양액을 원심분리(10,000rpm, 15분)하여 균체를 수집하고 10mM EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0)에서 100g/L이 되도록 현탁한다. 현탁액 1mL를 EDTA 10mM과 하기의 카복시 성분 200mM과, 하기의 아미노산 400mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 1mL에 각각 첨가하여, 전량을 2mL로 한 다음, 18℃에서 2시간 동안 반응을 실시한다. 이 결과, 생성된 펩타이드를 표 1에 기재한다.
Figure 112005004766406-pct00001
(카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다)
(실시예 3) 효소의 정제(엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113)
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시한다. 실시예l와 동일하게 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)을 배양하여, 원심분리(10,000rpm, 15분)에 의해 균체를 수집한다. 균체 16g을 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 세정한 다음, 동 완충액 40ml에 현탁하여, 195W에서 45분 동안 초음파 파쇄처리를 실시한다. 이러한 초음파 파쇄액을 원심분리(10,000rpm, 30분)하여, 파쇄 균체편을 제거함으로써 초음파 파쇄액 상등액을 수득한다. 이러한 초음파 파쇄액 상등액을 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 대하여 하룻밤 투석하며, 초원심분리(50,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로 하여 가용성 분획을 수득한다. 수득된 가용성 분획을 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화한 Q-세파로스 HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 비흡착 분획으로부터 활성 분획을 수집한다. 이러한 활성 분획을 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 대하여 하룻밤 투석하며, 원심분리(10,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로서 투석 분획을 수득한다. 이러한 투석 분획을 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 Mono S 칼럼(아마샴사제)에 제공하며, O 내지 1M NaCl을 함유하는 동 완충액의 선형 농도 구배에서 효소를 용출시킨다. 활성 분획 내에 오염 단백질의 가장 적은 1분획을 1M NaCl을 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 슈퍼덱스(Superdex) 200pg 칼럼(아마샴사제)에 제공하며, 1M NaCl을 함유하는 동 완충액(pH 4.5)을 칼럼에 통과시켜 겔 여과를 실시하고, 활성 분획 용액을 수득한다. 이들 조작에 의해 본 발명에 사용되는 펩타이드 생성효소는 전기영동의 실험결과보다 균일하게 정제되는 것이 확인된다. 상기한 정제공정에서 활성의 회수율은 12.2%, 정제도는 707배이다.
(실시예 4) 효소의 분자량 측정
(SDS-겔 전기영동)
실시예 3의 방법에 따라 수득된 정제 효소분획 0.3μg 상당물을 폴리아크릴아미드 전기영동에 제공한다. 전기영동 완충액에는 0.3%(w/v) 트리스, 1.44%(w/v) 글리신, O.1%(w/v) 라우릴황산나트륨을 사용하고 폴리아크릴아미드 겔은 겔 농도 10 내지 20%의 농도 구배 겔(멀티겔 10-20, 다이이치가가쿠야쿠힝제)을 사용하며, 분자량 마커는 파마시아제 분자량 마커를 사용한다. 전기영동 종료후, 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250에 의해 겔을 염색하며, 분자량 약 75kDa 위치에 균일한 밴드가 검출된다.
(겔 여과)
실시예 3의 방법에 따라 수득된 정제 효소분획을 1M NaCl을 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 슈퍼덱스 200pg 칼럼(아마샴사제)에 제공하며, 1M NaCl을 함유하는 동 완충액(pH 4.5)을 칼럼에 통과시켜 겔 여과를 실시하여, 분자량을 측정한다. 검량선을 작성하기 위한 공지된 분자량의 표준 단백질로서는 파마시아제 분자량 마커를 사용한다. 이 결과, 수득된 효소의 분자량은 약 150kDa이다.
SDS-겔 전기영동과 겔 여과의 결과로부터 본 효소는 분자량 약 75kDa의 동종이량체인 것으로 시사된다.
(실시예 5) 효소반응의 최적 pH
L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드과 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 반응에서 pH의 영향을 검토한다. 완충액으로서는 아세트산 완충액(pH 3.9 내지 5.4) MES 완충액(pH 5.4 내지 6.4), 포스페이트 완충액(pH 6.0 내지 7.9), 보레이트 완충액(pH 7.8 내지 9.3), CAPS 완충액(pH 9.3 내지 10.7) 및 K2HPO4-NaOH 완충액(pH 10.8 내지 11.6)을 사용한다. 100mM L-알라닌메틸에스테르, 200mM L-글루타민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM의 각각의 완충액 100μl에 실시예 3에서 수득된 Mono S 분획 효소(약 180U/ml)를 1μl 가하며, 18℃, 5분 동안 반응시켜 반응에 대한 pH의 영향을 측정한다. 보레이트 완충액(pH 9.3)을 사용하는 경우의 활성을 100%로 한 결과를 제1도에 도시한다. 이 결과, 본 효소의 최적 pH는 8 내지 9.5이다.
(실시예 6) 효소반응의 최적온도
L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드과 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 반응에서 온도의 영향을 검토한다. 100mM L-알라닌메틸에스테르, 200mM L-글루타민, 10mM EDTA를 함유하는 100mM의 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획을 1μl 가하며, 각 온도에서 5분 동안 반응시켜 반응에 대한 온도의 영향을 측정한다. 34℃에서의 활성을 100%로 한 결과를 제2도에 도시한다. 이 결과, 본 효소의 최적온도는 30 내지 40℃이다.
(실시예 7) 효소의 억제제
L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드과 L-글루타민을 기질에 사용하여, L-알라닐-L-글루타민 생성에 주는 억제제의 영향을 검토한다. 표 2에 기재된 10mM의 각종 효소 억제제를 함유하는 100mM의 보레이트 완충액(pH 9.0) 50μl에 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 가하여, 25℃에서 5분 동안 반응시킨다. 또한, o-페난트롤린, 페닐메틸설포닐플루오라이드, p-니트로페닐-p'-구아니딘벤조에이트에 관해서는 50mM이 되도록 메탄올에 용해한 것을 사용한다. 각 조건에서의 효소활성은 효소 억제제를 가하지 않는 조건에서 L-알라닐-L-글루타민 생성을 100으로 하는 경우의 상대활성으로 나타낸다. 결과를 표 2에 기재한다. 이 결과, 본 효소는 세린 효소 억제제 중의 페닐메틸설포닐플루오라이드로는 억제되지 않지만, p-니트로페닐-p'-구아니딘벤조에이트로 억제되는 성질을 나타낸다.
Figure 112005004766406-pct00002
(실시예 8) L-알라닌메틸에스테르와 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민의 생산
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 3μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드, 200mM의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 18℃에서 반응시킨다. 이 결과, 제3도에 도시된 바와 같이 효소 첨가구에서는 반응 60분으로 83mM의 L-알라닐-L-글루타민(L-Ala-L-Gln)이 생성되며, 부산물인 L-Ala-L-Ala-L-Gln의 농도는 1.3mM이다. 한편, 효소 무첨가구에서 L-Ala-L-Gln 생성은 거의 확인되지 않으며 120분 동안 반응 후 0.07mM 정도이다.
(실시예 9) L-알라닐-L-글루타민의 생산에 주는 L-글루타민 농도의 영향
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 1μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드, 표 3에 기재된 농도의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 18℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 이 결과를 표 3에 기재한다.
Figure 112005004766406-pct00003
(실시예 10) 효소의 기질 특이성(1)
카복시 성분으로서 L-아미노산에스테르를 사용하는 경우에 에스테르 특이성을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 4에 기재된 100mM의 카복시 성분, 200mM L-글루타민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 25℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 L-A1a-L-Gln 양을 표 4에 기재한다(표 4 중에서 HCl은 하이드로클로라이드 염을 나타낸다).
Figure 112005044659883-pct00026
(실시예 11) 효소의 기질 특이성(2)
카복시 성분에 L-알라닌메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드, 150mM의 표 5에 기재된 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 5에 기재한다(+ 표시는 펩타이드의 생성은 확인되지만, 표준품이 없어 정량할 수 없는 펩타이드를 지적하며, tr은 미량을 나타낸다).
Figure 112005004766406-pct00005
(실시예 12) 효소의 기질 특이성(3)
카복시 성분에 각종 L-아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 L-글루타민을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 6에 기재된 100mM의 L-아미노산메틸에스테르 하이드로클로라이드(AA-0Me·HCl), 150mM의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표6에 기재한다(+ 표시는 표준품이 없어 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 펩타이드를 지적하며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, L-Trp-OMe, L-Tyr-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 최종농도가 O.1%가 되도록 첨가한다.
Figure 112005004766406-pct00006
(카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다)
(실시예 13) 효소의 기질 특이성(4)
카복시 성분에 각종 L-아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 7에 기재된 100mM의 L-아미노산메틸에스테르 하이드로클로라이드(AA-0Me·HCl), 표7에 기재된 150mM의 각종 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표7에 기재한다(tr는 미량을 나타낸다). 또한, L-Trp-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 최종농도가 O.1%가 되도록 첨가한다(+ 표시는 표준품이 없어 정량할 수 없지만, 생성이 확인되는 펩타이드를 나타낸다).
Figure 112005004766406-pct00007
(카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다)
(실시예 14) 효소의 기질 특이성(5)
카복시 성분에 각종 L- 또는 D-형의 아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L- 또는 D-형의 아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 8에 기재된 100mM의 아미노산메틸에스테르 하이드로클로라이드(AA-OMe·HCl), 표 8에 기재된 150mM의 각종 아미노산, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 8에 기재한다(tr는 미량을 나타낸다).
Figure 112005004766406-pct00008
(카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다)
(실시예 15) 효소의 기질 특이성(6)
카복시 성분에 각종 L-아미노산아미드, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 9에 기재된 100mM의 L-아미노산아미드 하이드로클로라이드(AA-NH2·HCl), 표 9에 기재된 150mM의 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 9에 기재한다.
Figure 112005004766406-pct00009
(실시예 16) 효소의 기질 특이성(7)
카복시 성분에 각종 L-알라닌메틸에스테르, 아민 성분에 C 보호 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 10에 기재된 100mM의 L-알라닌산메틸에스테르 하이드로클로라이드(Ala-0Me·HCl), 표 10에 기재된 150mM의 L-아미노산아미드 하이드로클로라이드, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 10에 기재한다.
Figure 112005004766406-pct00010
(실시예 17) 효소의 기질 특이성(8)
카복시 성분에 각종 아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 메틸 아민을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 11에 기재된 100mM의 아미노산메틸에스테르 하이드로클로라이드(AA-0Me·HCl), 표 11에 기재된 150mM의 메틸아민, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 11에 기재한다.
Figure 112005004766406-pct00011
(실시예 18) 효소의 기질 특이성(9)
카복시 성분으로서 β-아미노산에스테르 또는 아민 성분으로서 β-아미노산을 사용하는 경우에 펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 12에 기재된 100mM의 카복시 성분, 표 12에 기재된 150mM의 아민 성분, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하 고, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 12에 기재한다(tr는 미량을 나타낸다).
Figure 112005044659883-pct00012
(카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다)
(실시예 19) 효소의 기질 특이성(10)
카복시 성분으로서 L-아미노산에스테르, 아민 성분으로서 펩타이드를 사용하는 경우에 올리고펩타이드 생산을 검토한다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 13에 기재된 100mM의 카복시 성분, 표 13에 기재된 150mM의 아민 성분, 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 13에 기재한다. 이 결과, 본 효소는 디펩타이드 생산 뿐만 아니라, 아민 성분으로서 펩타이드를 사용함으로써 장쇄 펩타이드도 생산할 수 있는 것이 명백해 졌다.
이상, 실시예 9 내지 20에 기재된 바와 같이 엠페도박터 브레비스 FERM P-18545주로부터 수득된 본 효소는 기질 특이성이 매우 넓은 효소인 것으로 판명됐다.
Figure 112005004766406-pct00013
(* L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala의 용해도가 낮으므로 이러한 반응 시스템에서는 카복시 성분 10mM, 아민 성분 15mM의 농도를 사용한다. 다른 조건은 실시예의 설명과 동일하다. 카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다).
(실시예 20) 기존 효소와의 펩타이드 생성 촉매능력의 비교
본 효소의 펩타이드 생성능력을 기존 효소와 비교한다. 기존 효소로서는 EP 278787A1에 기재된 카복시펩티다제 Y, EP 359399B1에 기재된 티올 엔도펩티다제(피신, 파파인, 브로멜라인, 키모파파인)를 사용하며, 이들에 관해서는 시그마사제의 정제 효소를 사용한다. 본 효소원으로서는 실시예 3에서 균일하게 정제한 효소를 사용한다. 이들 효소는 단백질량으로서 표 14에 기재하는 양을 반응계에 첨가한다. 반응은 100mM L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드와 200mM L-글루타민을 함유하는 100μl의 보레이트 완충액(pH 9.0)에 가하고, 25℃에서 반응시킨다. 또한, 카복시펩티다제는 1mM의 EDTA를 함유하는 10mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 용해한 효소, 티올엔도펩티다제는 2mM EDTA, 0.1M KCl, 5mM 디티오스레이톨을 함유하는 10mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 용해한 효소를 사용한다. 이들 효소에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 생성 속도비를 표 14에 기재한다.
이 결과, 효소 무첨가에서도 극히 미량의 L-알라닐-L-글루타민 생성이 관찰되며, 카복시펩티다제 또는 티올엔도펩티다제 첨가구에서는 효소 무첨가구에 비하여 약간 생성속도가 빨라지는 것이 관찰된다. 이에 대해 본 효소의 첨가구에서는 압도적으로 빠른 L-알라닐-L-글루타민 생성속도가 관찰되며, 이의 속도는 카복시펩티다제 Y, 티올엔도펩티다제에 대해 약 5,000배 내지 100,000배이다. 이상과 같이 본 효소는 지금까지의 예가 없는 매우 빠른 펩타이드 생성속도를 갖고 있는 것이 판명됐다. 또한, 본 효소의 분자량은 75,000의 이량체인 데 대해 카복시펩티다제 Y의 분자량은 약 61,000이고, 티올 엔도펩티다제의 분자량은 약 23,000 내지 36,000으로 보고되어 있으므로 카복시펩티다제 Y 및 티올 엔도펩티다제의 생성 속도와 비교하여 본 효소의 C-알라닐-L-글루타민의 생성 속도가 실시예에 기재된 단위 중량당으로 표현될 때보다 분자량당으로 표현될때 심지어 보다 높다.
Figure 112005004766406-pct00014
(실시예 21) 스핀고박테리움 종 균체를 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)의 배양에는 1L 중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g을 함유하는 배지(pH 7.0) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 분주하고, 115℃에서 15분 동안 살균한 것을 사용한다. 여기에 1L 중에 글루코스 5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g을 함유하는 사면 한천 배지(한천 20g/L, pH 7.0)에서 30℃, 24시간 동안 배양한 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)을 1백금이 접종하여, 30℃, 120왕복/분으로 20시간 동안 진탕 배양을 실시한다. 이러한 배양액 1ml를 상기 배지(50ml/500mL 경사구 플라스크)에 첨가하여, 30℃, 18시간 동안 배양한다. 배양 종료후, 이들의 배양액으로부터 균체를 원심분리하여, 습균체로서 100g/L이 되도록 10mM의 EDTA를 함유하는 0.1M 보레이트 완충액(pH 9.0)으로 현탁한다. 이러한 균체 현탁액 0.1mL에 EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드 200mM 및 L-글루타민 400mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 0.1mL를 첨가하고, 전량을 O.2mL로 한 다음, 25℃에서 120분 동안 반응을 실시한다. 이때의 L-알라닐-L-글루타민의 생성 농도는 62mM이다.
(실시예 22) 스핀고박테리움 종으로부터의 효소의 정제
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시한다. 실시예 21과 동일하게 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)을 배양하여, 원심분리(10,000rpm, 15분)에 의해서 균체를 수집한다. 균체 2g을 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)으로 세정한 다음, 동 완충액 8ml에 현탁하여, 195W에서 45분 동안 초음파 파쇄처리를 실시한다. 이러한 초음파 파쇄액을 원심분리(10,000rpm, 30분)하여, 파쇄 균체편을 제거함으로써 초음파 파쇄액 상등액을 수득한다. 이러한 초음파 파쇄액 상등액을 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)에 대하여 하룻밤 투석하여, 초원심분리(50,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로서 가용성 분획을 수득한다. 수득된 가용성 분획을 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)으로 미리 평형화한 Q-세파로스 HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 비흡착 분획으로부터 활성 분획을 수집한다. 이러한 활성 분획을 20mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 대하여 하룻밤 투석하며, 원심분리(10,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로서 투석 분획을 수득한다. 이러한 투석 분획을 20mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 미리 평형화한 SP-세파로스 HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하며, O 내지 1M NaCl을 함유하는 동 완충액의 선형 농도 구배에서 효소를 용출시킨 활성 분획을 수득한다.
(실시예 23) 효소 분획을 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
실시예 22에서 정제한 SP-세파로스 HP 분획(약 27U/ml) 10μl를 111mM의 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드, 222mM의 L-글루타민, 11mM의 EDTA를 함유하는 111mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 90μl에 가하여, 25℃에서 120분 동안 반응시킨다. 그 결과, 효소 첨가구에서는 73mM의 L-알라닐-L-글루타민이 생성된다. 한편, 효소 무첨가구에서의 L-Ala-L-Gln 생성은 거의 확인되지 않으며 120분 동안 반응 후 0.07mM 정도이다.
(실시예 24) 효소의 기질 특이성(11)
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일) 유래 효소의 기질 특이성을 검토한다. 표 15-1 내지 표 15-4에 기재된 최종 농도 100mM의 각종 카복시 성분과 150mM의 각종 아민 성분, 실시예 22에서 정제한 SP-세파로스 HP 분획효소(반응액 중에 O.33유니트 첨가) 및 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하고, 25℃에서 1.5시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 15에 기재한다(+ 표시는 표준품이 없어 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 펩타이드를 나타내며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, L-Tyr-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 최종 농도 O.1%가 되도록 첨가한다. 또한, 카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다.
Figure 112005004766406-pct00015
Figure 112005004766406-pct00016
Figure 112005004766406-pct00017
Figure 112005044659883-pct00018
아미노산 아미드는 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다
(실시예 25) 효소의 기질 특이성(12)
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일) 유래 효소의 올리고펩타이드 생산에 대한 기질 특이성을 검토한다. 표 16에 기재된 최종농도 100mM의 각종 카복시 성분과 150mM의 각종 아민 성분, 실시예 22에서 정제한 SP-세파로스 HP 분획효소(반응액 중에 0.33유니트 첨가) 및 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하고, 25℃에서 1.5시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 올리고펩타이드의 생산량을 표 16에 기재한다. 또한, 카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다.
Figure 112005004766406-pct00019
(실시예 26) 효소의 기질 특이성(13)
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획을 사용하여 엠페도박터 브레비스에 유래하는 효소의 기질 특이성을 검토한다.
Figure 112005004766406-pct00020


표 17에 기재된 최종 농도의 각종 카복시 성분과 각종 아민 성분, 효소(반응액 중에 0.1유니트 첨가) 및 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하여, 25℃에서 표 17에 기재된 반응시간으로 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 펩타이드의 생산량을 표 17에 기재한다(+ 표시는 표준품이 없어 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다).
(약어)
H-Ala-OMe: L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-p-F-Phe-OMe: p-플루오로-L-페닐알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-Cl-F-Phe-0Me: p-클로로-L-페닐알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-p-NO2-Phe-OMe: p-니트로-L-페닐알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-t-Leu-OMe: 3급-L-로이신메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-2-Na1-0Me: 3-(2-나프틸)-L 알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-Aib-OMe: α-아미노이소부티르산메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-N-Me-Ala-OMe: N-메틸-L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-CHA-OMe: β-사이클로헥실-L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-Ser(tBu)-OMe: O-3급-부틸-L-세린메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-Asp(OtBu)-OMe: L-아스파르트산-β-3급-부틸에스테르-α-메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-Lys(Boc)-OMe: N-ε-3급-부톡시카보닐-L-라이신메틸에스테르 하이드로클로라이드,
H-p-F-Phe-OH: p-플루오로-L-페닐알라닌,
H-Cl-F-Phe-OH: p-클로로-L-페닐알라닌,
H-p-NO2-Phe-OH: p-니트로-L-페닐알라닌,
H-t-Leu-OH: 3급-L-로이신,
H-2-Nal-OH: 3-(2-나프틸)-L 알라닌,
H-Gln-OH: L-글루타민,
H-Phe-OH: L-페닐알라닌,
H-Ser(tBu)-OH: O-3급-부틸-L-세린,
H-Asp(OtBu)-OH: L-아스파르트산β-3급-부틸에스테르 및
H-Lys(Boc)-OH: N-ε-3급-부톡시카보닐-L-라이신
(실시예 27) 효소의 기질 특이성(14)
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획(엠페도박터 브레비스 유래)을 사용하여, 올리고펩타이드 생산에 대한 기질 특이성을 검토한다. 표 18에 기재된 최종 농도의 각종 카복시 성분과 각종 아민 성분, 효소(반응액 중에 첨가한 유니트 수는 표 18에 기재) 및 10mM의 EDTA를 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하며, 25℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 본 반응에서 생성된 각종 올리고펩타이드의 생산량을 표 18에 기재한다(+ 표시는 표준품이 없어 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, 카복시 성분은 모두 하이드로클로라이드 염 형태로 사용한다.
Figure 112005004766406-pct00021
(실시예 28) 엠페도박터 브레비스 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관해서 기재하지만, 미생물은 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)을 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 JM-109를 숙주로 사용하고, 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)결정 내부 아미노산 서열에 기초한 PCR 프라이머의 작제
상기한 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일) 유래의 펩타이드 생성효소의 라이실엔도펩티다제에 의한 분해물로부터 에드만 분해법에 의해 결정한 아미노산 서열(서열번호 1 및 2)을 바탕으로 서열번호 3 및 4에 각각 기재된 염기서열을 갖는 혼합 프라이머를 작성한다.
(2)균체의 취득
엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)을 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 30℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균(植菌)하여, 30℃에서 진탕 배양한다.
(3)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50ml를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Genomic-tip System)(Qiagen사)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(4)PCR법에 따른 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편의 취득
엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)로부터 취득한 염색체 DNA에 대해 서열번호 3 및 4에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다.
PCR 반응은 기계[Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(다카라슈조제)]를 사용하여 실시하며, 하기의 조건의 반응을 30사이클 실시한다.
94℃ 30초,
52℃ 1분 및
72℃ 1분.
반응후, 반응액 3μl를 0.8% 아가로스 전기영동에 적용한다. 그 결과, 약 1.5kb의 DNA 단편이 증폭되어 있는 것이 확인된다.
(5)유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
상기 PCR로 증폭된 약 1.5kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하여 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(High Prime)(베링거·만하임사제)을 사용하여 키트 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지시킨다.
본 실시예 28(3)에서 취득한 엠페도박터 브레비스의 염색체 DNA를 제한효소 HindIII으로 37℃, 16시간 동안 반응시키고 완전하게 분해한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 양전하 나일론 막 필터(Nylon memebranes filter)(로슈·다이아그노틱스사제)에 블로팅하여, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 50℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여, 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC에서 실온, 20분 동안 세정한다. 또한 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC에서 65℃, 15분 동안 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 키트의 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 약 4kb의 밴드를 검출할 수 있다.
본 실시예 28(3)에서 조제한 염색체 DNA를 HindIII으로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 4kb의 DNA를 분리한 후 진 클린(Gene Clean)II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하고, 10μl의 TE에 용해시킨다. 이러한 생성물 4μl와, pUC118 HindIII/BAP(다카라슈조제)를 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(도요보세키제) 100μl를 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환시킨다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하고, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다.
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터 [Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC에서 실온, 20분 동안 세정한다. 또한 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC에서 필터를 65℃, 15분 동안 2회 추가로 세정한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 키트 설명서에 근거하여 실시한다.
그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 2개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(6)엠페도박터 브레비스 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
표지 프로브와 하이브리드화한 것이 확인된 상기 2개의 콜로니로부터 에스케리치아 콜리 JM109가 보유하는 플라스미드를 위자르드 플러스 미니프렙 DNA 정제 시스템(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)(프로메가사제)를 사용하여 조제하며, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트(Quick Start) 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소의 내부 아미노산 서열(서열번호 1 및 2)을 함유하는 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하며, 펩타이드 생성효소를 암호화하는 유전자인 것을 확인한다. 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록 서열번호 5에 기재한다. 수득된 개방 판독 프레임을 BLASTP 프로그램으로 상동성에 대해 해석한 결과, 두개의 효소에 상동성이 발견되며, 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus)의 a-아미노산에스테르하이드롤라제[문헌참조: Appl. Environ. Microbiol., 68(1), 211-218(2002)]와 아미노산 서열로 34%, 브레비바실루스 라테로스포룸(Brevibacillus laterosporum)[문헌참조: J. Bacteriol., 173(24), 7848-7855(1991)]의 글루타릴-7ACA 아시라제와 아미노산 서열로 26%의 상동성을 나타낸다.
(실시예 29) 엠페도박터 브레비스 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 이. 콜리에서의 발현
에스케리치아 콜리 W3110 염색체 DNA 위의 trp 오페론의 프로모터 영역을 서열번호 7 및 8에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR에 의해 목적 유전자 영역을 증폭하여, 수득된 DNA 단편을 pGEM-Teasy 벡터(프로메가제)에 연결한다. 이러한 연결 용액으로 이. 콜리 JM109를 형질전환시키고, 암피실린 내성주 중에서 trp 프로모터의 방향이 lac 프로모터와 반대 방향으로 삽입되는 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택한다. 다음에 이러한 플라스미드를 Eco0109I/EcoRI로 처리하여 수득되는 trp 프로모터를 포함하는 DNA 단편과, pUC19(Takara제)의 Eco0109I/EcoRI 처리물과 연결한다. 이러한 연결 용액으로 에스케리치아 콜리 JM109를 형질전환시키며, 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택한다. 다음에 이러한 플라스미드를 HindIII/PvuII로 처리하여 수득되는 DNA 단편과, pKK223-3(Amersham Pharmacia제)를 HindIII/HincII로 처리하여, 수득된 rrnB 터미네이터를 함유하는 DNA 단편을 연결한다. 이러한 연결 용액으로 이. 콜리 JM109를 형질전환하여, 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택하고, 이러한 플라스미드를 pTrpT라고 명명한다.
엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 9 및 10에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR에 의해 목적 유전자를 증폭한다. 이러한 DNA 단편을 NdeI/PstI로 처리하여, 수득된 DNA 단편과 pTrpT의 NdeI/PstI 처리물을 연결한다. 이러한 연결 용액으로 에스케리치아 콜리 JM109를 형질전환하며, 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택하여, 이러한 플라스미드를 pTrpT_Gtg2라고 명명한다.
pTrpT_Gtg2를 갖는 에스케리치아 콜리 JM109를 100mg/l 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 30℃, 24시간 동안 전배양한다. 수득된 배양액 1ml를 50ml의 배지(2g/l D-글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 카사미노산, 5g/l 황산암모늄, 3g/l 인산2수소칼륨, 1g/l 인산수소2칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘 7수화물, 100mg/l 암피실린)을 채운 500ml 경사구 플라스크에 접종하며, 25℃, 24시간 동안의 본 배양을 실시한다. 배양액 1ml당 0.44U의 L-알라닐-L-글루타민 생성활성을 갖고 있으며 클로닝한 유전자가 이. 콜리에서 발현한 것을 확인한다. 또한, 대조군으로서 pTrpT만을 도입한 형질전환체에는 활성은 검출되지 않는다.
(시그널 서열 예측)
서열목록에 기재된 서열번호 6번의 아미노산 서열을 SignalP vl.1 프로그램(문헌참조: Protein Engineering, vol 12, no.1, pp.3-9, 1999)으로 해석한 바, 아미노산 서열의 1-22번째까지가 시그널로서 기능하여 세포질주변공간에 분비되는 것으로 예측되며, 성숙 단백질은 23번째 아미노산의 하류인 것으로 추정된다.
(분비의 확인)
pTrpT_Gtg2를 갖는 에스케리치아 콜리 JM109를 100mg/l 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 30℃, 24시간 동안 전배양한다. 수득된 배양액 1ml를 50ml의 배지(2g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 카사미노산, 5g/l 황산암모늄, 3g/l 인산2수소칼륨, 1g/l 인산수소2칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘 7수화물, 100mg/l 암피실린)을 채운 500ml 경사구 플라스크에 접종하며, 25℃, 24시간 동안의 본 배양을 실시하여 배양 균체를 수득한다.
배양 균체를 20g/dl의 슈크로스 용액을 사용하는 삼투압 쇼크법에 의해 세포를 파쇄한 후 세포질주변공간 분획과 세포질 분획으로 분획한다. 20g/dl의 슈크로스 용액에 침지한 파쇄된 균체를 5mM MgSO4 수용액에 침지하고, 이러한 원심 상등액을 세포질주변공간 분획(Pe)으로 한다. 또한, 이의 원심 침전물을 재현탁하여, 초음파 파쇄한 것을 세포질 분획(Cy)으로 한다. 세포질을 분리한 것을 확인하기 위해 세포질에 존재하는 것으로 공지되어 있는 글루코스 6-포스페이트데하이드로게나제의 활성을 지표로 한다. 측정법은 30℃에서 1mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4mM NADP, 10mM MgSO4, 50mM Tris-Cl(pH 8)를 함유하는 반응 용액 속에 적당량의 효소를 첨가하여, 340nm의 흡광도의 측정에 의해 NADPH의 생성을 측정함으로써 실시한다.
별도 조제한 무세포 추출액의 활성을 100%로 할 때에 세포질 분획, 세포질주변공간 분획의 효소량을 도 4에 도시한다. 글루코스-6-포스페이트데하이드로게나제 활성이 세포질주변공간 분획에 혼입되어 있지 않은 것은 세포질 분획에 세포질주변공간 분획이 혼입되어 있지 않음을 나타낸다. Ala-Gln 생성활성 중에서 약 60%가 세포질주변공간 분획에서 회수되고 SignalP vl.1 프로그램을 사용하여 아미노산 서열로부터 예측된 바와 같이 Ala-Gln 생성효소가 세포질주변공간에 분비되어 있는 것이 확인된다.
(실시예 30) 스핀고박테리움 종 균체를 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
스핀박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)의 배양에는 1L 중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g을 함유하는 배지(pH 7.0) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 분주하고 115℃에서 15분 동안 살균한것을 사용한다. 여기에 1L 중에 글루코스 5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g을 함유하는 경사면 한천 배지(한천 20g/L, pH 7.0)로써 30℃, 24시간 동안 배양한 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)을 1백금이 접종하며 30℃, 120왕복/분으로 20시간 동안 진탕 배양을 실시한다. 이러한 배양액 1ml를 상기 배지(50ml/500mL 경사구 플라스크)에 첨가하며 30℃, 18시간 동안 배양한다. 배양 종료후, 이들 배양액으로부터 균체를 원심분리하여, 습균체로서 100g/L로 되도록 10mM의 EDTA를 함유하는 0.1M 보레이트 완충액(pH 9.0)으로 현탁한다. 이러한 균체 현탁액 0.1mL에 EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드 200mM 및 L-글루타민 400mM을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH 9.0) 0.1mL를 첨가하고, 전량을 0.2mL로 한 다음, 25℃에서 120분 동안 반응을 실시한다. 이때 생성된 L-알라닐-L-글루타민의 농도는 62mM이다.
(실시예 31) 스핀고박테리움 종으로부터의 효소의 정제
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시한다. 실시예 21과 동일하게 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)을 배양하여, 원심분리(10,000rpm, 15분)에 의해서 균체를 수집한다. 균체 2g을 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)으로 세정한 다음, 동 완충액 8ml에 현탁하여, 195W에서 45분 동안 초음파 파쇄처리를 실시한다. 이러한 초음파 파쇄액을 원심분리(10,000rpm, 30분)하여, 파쇄 균체편을 제거함으로써 초음파 파쇄액 상등액을 수득한다. 이러한 초음파 파쇄액 상등액을 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)에 대하여 하룻밤 투석하여, 초원심분리(50,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로서 가용성 분획을 수득한다. 수득된 가용성 분획을 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)으로 미리 평형화한 Q-세파로스 HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 비흡착 분획으로부터 활성 분획을 수집한다. 이러한 활성 분획을 20mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 대하여 하룻밤 투석하며, 원심분리(10,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거함으로써 상등액으로서 투석 분획을 수득한다. 이러한 투석 분획을 20mM 아세테이트 완충액(pH 5.0)으로 미리 평형화한 SP-세파로스 HP 칼럼(아마샴사제)에 적용하며, O 내지 1M NaCl을 함유하는 동 완충액의 선형 농도 구배에서 효소를 용출시켜 활성 분획을 수득한다.
(실시예 32) 효소 활성 분획을 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
실시예 31에서 정제한 SP-세파로스 HP 분획(약 27U/ml) 10μl를 111mM의 L-알라닌메틸에스테르 하이드로클로라이드, 222mM의 L-글루타민 및 11mM의 EDTA를 함유하는 90μl의 보레이트 완충액(pH 9.0)에 가하여, 25℃에서 120분 동안 반응시킨다. 그 결과, 효소 첨가구에서는 73mM의 L-알라닐-L-글루타민이 생성된다. 한편, 효소 무첨가구에서의 L-Ala-L-Gln 생성은 거의 확인되지 않으며 120분동안 반응 후 0.07mM 정도이다.
(실시예 33) 스핀고박테리움 종 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관해서 기재하지만, 미생물은 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)을 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 DH5α를 숙주로 사용하며, 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)균체의 취득
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)을 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 25℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여, 25℃에서 진탕 배양한다.
(2)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50ml를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Qiagen사)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(3)PCR법에 따른 프로브용 DNA 단편의 취득
엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)로부터 취득한 염색체 DNA에 대해 서열번호 3 및 4에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다.
PCR 반응은 기계[Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(다카라슈조제)]를 사용하여 실시하며, 하기의 조건의 반응을 30사이클 실시한다.
94℃ 30초,
52℃ 1분 및
72℃ 1분.
반응후, 반응액 3μl를 0.8% 아가로스 전기영동에 적용한다. 그 결과, 약 1.5kb의 DNA 단편이 증폭되어 있는 것이 확인된다.
(4)유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조:Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
상기 PCR로 증폭된 약 1.5kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하며 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(베링거·만하임사제)을 사용하여 키트 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지를 실시한다.
본 실시예 33(2)에서 취득한 스핀고박테리움 종의 염색체 DNA를 제한효소 SacI로 37℃, 16시간 동안 반응시키고 완전하게 분해한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 양전하 나일론 막 필터 (로슈·다이아그노틱스사제)에 블로팅하여, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 키트 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 약 3kb의 밴드를 검출할 수 있다.
본 실시예 33(2)에서 조제한 염색체 DNA를 SacI로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 3kb의 DNA를 분리하여, 진 클린II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하고, 10μl의 TE에 용해한다. 이러한 생성물 4μl를 SacI와 37℃, 16시간 동안 반응시켜 완전하게 분해한 다음, 알칼린 포스파타제(이. 콜리 C75)로 37℃, 30분, 50℃, 30분 동안 처리한 pUC118과 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포(다카라슈조사제) 100μl를 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환시킨다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하여, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다.
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터 [Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 키트 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 6개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(5)스핀고박테리움 종 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
표지 프로브와 하이브리드화하는 것으로 확인된 상기 6개의 균주로부터 에스케리치아 콜리 DH5α가 보유하는 플라스미드를 위자르드 플러스 미니프렙 DNA 정제 시스템(프로메가사제)을 사용하여 조제하여 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 키트 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소의 내부 아미노산 서열을 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 스핀고박테리움 종 유래 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록 서열번호 11에 기재한다. 스핀고박테리움 종 유래 펩타이드 생성효소는 엠페도박터 브레비스 유래 펩타이드 생성효소와 아미노산 서열로 63.5%의 상동성을 나타낸다(BLASTP 프로그램을 사용).
(실시예 34) 스핀고박테리움속 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 이. 콜리에서의 발현
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 13, 14에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR에 의해 목적 유전자를 증폭한다. 이러한 DNA 단편을 NdeI/XbaI로 처리하여, 수득된 DNA 단편과 pTrpT의 NdeI/XbaI 처리물을 연결한다. 이러한 연결 용액에서 에스케리치아 콜리 JM109를 형질전환하여, 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하고, 이러한 플라스미드를 pTrpT_Sm_aet라고 명명한다.
pTrpT_Sm_aet를 갖는 에스케리치아 콜리 JM109를 3ml의 배지(2g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 카사미노산, 5g/l 황산암모늄, 3g/l 인산2수소칼륨, 1g/l 인산수소2칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘 7수화물, 100mg/l 암피실린)을 채운 보통 시험관에 1백금이 식균하며 25℃, 20시간 동안의 본 배양을 실시한다. 배양액 1ml당 2.1U의 L-알라닐-L-글루타민 생성활성을 갖고 있는 클로닝한 유전자가 에스케리치아 콜리에 의해 발현되는 것을 확인한다. 또한, 대조군으로서 pTrpT만을 도입한 형질전환체에는 활성이 검출되지 않는다.
(시그널 서열 예측)
서열목록에 기재된 서열번호 12의 아미노산 서열을 SignalP vl.1 프로그램(Protein Engineering, vol 12, no.1, pp.3-9, 1999)으로 해석한 바, 아미노산 서열의 1-20번째까지가 시그널로서 기능하여 세포질주변공간에 분비하는 것으로 예측되며, 성숙 단백질은 21번째의 아미노산의 하류에 위치한다고 추정된다.
(시그널 서열의 확인)
pTrpT_Sm_aet를 갖는 에스케리치아 콜리 JM109를 50ml의 배지(2g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 카사미노산, 5g/l 황산암모늄, 3g/l 인산2수소칼륨, 1g/l 인산수소2칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘 7수화물, 100mg/l 암피실린)을 채운 보통 시험관에 1백금이 식균하며 25℃, 20시간 동안의 본 배양을 실시한다.
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시한다. 배양 종료후, 이들의 배양액로부터 균체를 원심분리하여 분리하고, 100mM 포스페이트 완충액(pH 7)으로 세정한 다음, 동 완충액에 현탁한다. 195W에서 20분 동안 초음파 파쇄처리를 실시하여, 초음파 파쇄 처리액을 원심분리(12,000rpm, 30분)하며, 파쇄 균체편을 제거함으로써 가용성 분획을 수득한다. 수득된 가용성 분획을 100mM 포스페이트 완충액(pH 7)으로 미리 평형화한 CHT-II 칼럼(바이오래드제)에 적용하여, 500mM 포스페이트 완충액에 의한 선형 농도 구배에서 효소를 용출시킨다. 활성 분획과 5배 용적의 2M 황산암모늄 및 100mM 포스페이트 완충액을 혼합한 용액을 2M 황산암모늄, 100mM 포스페이트 완충액으로 미리 평형화한 리소스(Resource)-PHE 칼럼(아마샴사제)에 적용하여, 2 내지 0M 황산암모늄에 의한 선형 농도 구배에서 효소를 용출시키고, 활성 분획 용액을 수득한다. 이들 조작에 따라 펩타이드 생성효소는 전기영동적으로 단일하게 정제되는 것이 확인된다.
상기 펩타이드 생성효소를 에드만 분해법에 따라 아미노산 서열을 결정한 바, 서열번호 15의 아미노산 서열을 취득하고, SignalP vl.1 프로그램으로 예측된 바와 같이 성숙 단백질은 21번째의 아미노산의 하류에 위치하는 것으로 확인된다.
(실시예 35) 페도박터 헤파리누스 IFO 12017 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관해서 기재하지만, 미생물은 페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)를 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 JM109를 숙주에 사용하고, 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)균체의 취득
페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)를 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 25℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여, 25℃에서 진탕 배양한다.
(2)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50ml를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Qiagen사)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(3)PCR법에 따른 프로브용 DNA 단편의 취득
페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인 발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인 발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)로부터 취득한 염색체 DNA에 대하여, 서열번호 15 및 16에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다. PCR로 증폭된 약 1kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하며 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(베링거·만하임사제)를 사용하여 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지시킨다.
(4)유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 프로브로 하여 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조:Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)의 염색체 DNA를 제한효소 HindIII으로 37℃, 16시간 동안 반응시켜 완전하게 분해한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 양전하 나일론 막 필터(로슈·다이아그노틱스사제)에 블로팅하며, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 50℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여, 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 약 5kb의 밴드를 검출할 수 있다.
페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)의 염색체 DNA를 HindIII으로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 5kb의 DNA를 분리하며, 진 클린II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하고, 10μl의 TE에 용해한다. 이러한 생성물 4μl와, pUC118 HindIII/BAP(다카라슈조제)를 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(다카라슈조사제) 100μl를 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환시킨다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하여, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(l989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터 [Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 1개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(5)페도박터 헤파리누스 IFO 12017주 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
표지 프로브와, 하이브리드화한 것이 확인된 상기 1개의 균주로부터 에스케리치아 콜리 JM109가 보유하는 플라스미드를 조제하여, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소를 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85) 유래 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 17에 기재한다.
(실시예 36) 페도박터 헤파리누스 IFO 12017주 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 이. 콜리에서의 발현
페도박터 헤파리누스 IFO 12017주(기탁기관; 재단법인발효연구소, 기탁기관 주소; 일본국 오사카시 요도가와쿠 쥬소 혼마치 2초메 17-85)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 19 및 20에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 PCR에 의해 목적 유전자를 증폭시킨다. 이러한 DNA 단편을 NdeI/HindIII으로 처리하여, 수득된 DNA 단편과 pTrpT의 NdeI/HindIII 처리물을 연결한다. 이러한 연결 용액으로 에스케리치아 콜리 JM109를 형질전환시켜, 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하며, 이러한 플라스미드를 pTrpT_Ph_aet라고 명명한다.
pTrpT_Ph_aet를 갖는 에스케리치아 콜리 JM109를 3ml의 배지(2g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 카사미노산, 5g/l 황산암모늄, 3g/l 인산2수소칼륨, 1g/l 인산수소2칼륨, 0.5g/l 황산마그네슘 7수화물, 100mg/l 암피실린)를 채운 보통 시험관에 1백금이 식균하고, 25℃, 20시간 동안의 본 배양을 실시한다. 배양액 1ml당 0.3U의 L-알라닐-L-글루타민 생성활성을 갖고 있는 클로닝한 유전자가 에스케리치아 콜리에서 발현되는 것을 확인한다. 또한, 대조군으로서 pTrpT만을 도입한 형질전환체에는 활성은 검출되지 않는다.
(실시예 37) 탁세오박터 겔루푸르푸라센스(Taxeobacter gelupurpurascens)
DSMZ 11116주 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관하여 기재하지만, 미생물은 탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)를 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 JM109를 숙주에 사용하고 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)균체의 취득
탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)를 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 25℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여, 25℃에서 진탕 배양한다.
(2)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50mL를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Qiagen사)을 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(3)PCR법에 따른 프로브용 DNA 단편의 취득
탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)로부터 취득한 염색체 DNA에 대해 서열번호 21 및 16에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다. PCR로 증폭된 약 1kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하고, 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(베링거·만하임사제)을 사용하여, 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지시킨다.
(4)유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR에서 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)의 염색체 DNA를 제한효소 PstI로 37℃, 16시간 동안 반응시켜 완전하게 분해한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 양전하 나일론 막 필터 (로슈·다이아그노틱스사제)에 블로팅하여, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 50℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한, 디곡시니겐으로 표지된 프로브를 첨가하여, 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 약 5kb의 밴드가 검출될 수 있다.
탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)의 염색체 DNA를 HindIII으로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 5kb의 DNA를 분리한 후 진 클린II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하며, 10μl의 TE에 용해시킨다. 이러한 생성물 4μl와, pUC118 PstI/BAP(다카라슈조제)를 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(다카라슈조사제) 100μl를 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환한다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하여, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다.
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터[Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 l×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 1개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(5)탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
표지 프로브와 하이브리드화하는 것이 확인된 상기 1개의 균주로부터 에스케리치아 콜리 JM109가 보유하는 플라스미드를 조제하여, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소를 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 탁세오박터 겔루푸르푸라센스 DSMZ 11116주(기탁기관; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 기탁기관 주소; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) 유래 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록 서열번호 22에 기재한다.
(실시예 38) 사이클로박테리움 마리눔(Cyclobacterium marinum) ATCC 25205주 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관해서 기재하지만, 미생물은 사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)를 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 JM109를 숙주에 사용하며, 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)균체의 취득
사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)를 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 25℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여, 25℃에서 진탕 배양한다.
(2)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50mL를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Qiagen사)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(3)PCR법에 따른 프로브용 DNA 단편의 취득
사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)로부터 취득한 염색체 DNA에 대해 서열번호 15 및 16에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다. PCR로 증폭된 약 1kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하며 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(베링거·만하임사제)을 사용하여, 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지시킨다.
(4)유전자 라이브러리에서 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR에서 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조:Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)의 염색체 DNA를 제한효소 PstI 또는 HincII로 37℃, 16시간 동안 반응시켜 완전하게 분해한 다음, 각각 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 나일론 막 필터[Nylon Memebranes positively charged(로슈·다이아그노틱스사제)]에 블로팅하여, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 50℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 PstI 분해 산물에서는 7k 밴드, HincII 분해 산물에서는 2k의 밴드를 검출할 수 있다.
사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)의 염색체 DNA를 PstI 또는 HincII로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 각각 약 7kb 또는 2kb의 DNA를 분리하며, 진 클린II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하며, 10μl의 TE에 용해시킨다. 이러한 생성물 4μl와, 각각 pUC118 PstI/BAP(다카라슈조제) 또는 pUC118 HincII/BAP(다카라슈조제)를 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(다카라슈조사제) 100μl를 각각 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환한다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하여, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다.
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조:Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터[Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 각각 1개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(5)사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
상기, 표지 프로브와 하이브리드화한 것이 확인된 각각 1개의 균주로부터 에스케리치아 콜리 JM109가 보유하는 플라스미드를 조제하여, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소를 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 사이클로박테리움 마리눔 ATCC 25205주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America) 유래 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록 서열번호 24에 기재한다.
(실시예 39) 사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리
이하, 펩타이드 생성효소 유전자의 분리에 관해서 기재하지만, 미생물은 사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)를 사용한다. 유전자의 분리에는 에스케리치아 콜리 JM109를 숙주에 사용하며, 벡터는 pUC118을 사용한다.
(1)균체의 취득
사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)를 CM2G 한천 배지(50g/l 글루코스, 10g/l 효모 추출물, 10g/l 펩톤, 5g/l 염화나트륨, 20g/l 한천, pH 7.0) 위에서 10℃, 24시간 동안 배양한다. 이러한 균체를 50ml의 CM2G 액체 배지(상기 배지에서 한천을 제거한 배지)를 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여, 10℃에서 진탕 배양한다.
(2)균체로부터 염색체 DNA의 취득
배양액 50ml를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하고, 집균한다. QIAGEN 게놈-팁 시스템(Qiagen사)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 이러한 균체로부터 염색체 DNA를 취득한다.
(3)PCR법에 의한 프로브용 DNA 단편의 취득
사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America) 유래의 펩타이드 생성효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편을 LA-Taq(다카라슈조사제)를 사용하는 PCR법에 의해 취득한다. 사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)로부터 취득한 염색체 DNA에 대해 서열번호 15 및 16에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시한다. PCR로 증폭된 약 1kb DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 분리한다. 목적하는 밴드를 절단 인출하며 정제한다. 이러한 DNA 단편을 DIG 하이 프라임(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 프로브의 디곡시니겐으로 표지시킨다.
(4)유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성효소 유전자의 클로닝
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 우선, 상기 PCR에서 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 서던 하이브리드화를 실시한다. 서던 하이브리드화의 조작은 문헌[참조:Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)의 염색체 DNA를 제한효소 EcoRI로 37℃, 16시간 동안 반응시켜 완전하게 분해한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한다. 전기영동 후의 아가로스 겔로부터 나일론 막 필터[Nylon membranes positively charged(로슈·다이아그노틱스사제)]에 블로팅하여, 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 50℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 상기에서 작제한 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 50℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
프로브와 하이브리드화하는 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 프로브와 하이브리드화하는 약 7kb의 밴드가 검출된다.
사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)의 염색체 DNA를 EcoRI로 완전하게 분해한다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 7kb의 DNA를 분리하여, 진 클린II 키트(프나코시사제)를 사용하여 DNA를 정제하며, 10μl의 TE에 용해한다. 이러한 생성물 4μl와, pUC118 EcoRI/BAP(다카라슈조제)를 혼합하고, DNA 연결 키트 Ver.2(다카라슈조제)를 사용하여 연결반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액 5μl와 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(다카라슈조사제) 100μl를 혼합하여, 에스케리치아 콜리를 형질전환한다. 이것을 적당한 고형 배지에 도말하여, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다.
펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이를 취득하기 위해 상기 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리드화에 의한 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 실시한다. 콜로니 하이브리드화의 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 설명되어 있다.
염색체 DNA 라이브러리의 콜로니를 나일론 막 필터[Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(로슈·다이아그노틱스사제)]에 옮기고 알칼리 변성, 중화 및 고정화로 이루어진 처리를 실시한다. 하이브리드화는 EASY HYB(베링거·만하임사제)를 사용하여 실시한다. 필터를 37℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화를 실시한 다음, 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 첨가하여, 37℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시한다. 다음에 필터를 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 60℃에서 세정을 2회 실시한다.
표지 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출은 DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(베링거·만하임사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 그 결과, 표지 프로브와 하이브리드화하는 1개 균주의 콜로니를 확인할 수 있다.
(5)사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주 유래 펩타이드 생성효소 유전자의 염기서열
표지 프로브와 하이브리드화한 것이 확인된 상기 1개의 균주로부터 에스케리치아 콜리 JM109가 보유하는 플라스미드를 조제하여, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정한다. 서열 분석 반응은 CEQ DTCS-퀵 스타트 키트(베크만·콜터사제)를 사용하여, 설명서에 근거하여 실시한다. 또한, 전기영동은 CEQ 2000-XL(베크만·콜터사제)를 사용하여 실시한다.
그 결과, 펩타이드 생성효소를 암호화하는 개방 판독 프레임이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 사이클로세르펜스 부르토넨시스 ATCC 700359주(기탁기관; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 기탁기관 주소; P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America) 유래 펩타이드 생성효소 유전자 전체 길이의 염기서열과 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열목록 서열번호 26에 기재한다.
본 발명에 따라 보호기의 도입 및 제거 등의 복잡한 합성방법을 경감시켜, 간편하면서 또한 고수율로 염가에 펩타이드를 제조할 수 있는 신규 효소가 제공된다. 본 발명의 효소를 사용함으로써 효율적인 펩타이드의 산업 규모의 생산을 할 수 있다.
서열목록
서열번호 3; 합성 프라이머 1
서열번호 4; 합성 프라이머 2
서열번호 5; 펩타이드 합성효소를 암호화하는 유전자
서열번호 7; pTrpT의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 8; pTrpT의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 9; pTrpT_Gtg2의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 10; pTrpT_Gtg2의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 11; 펩타이드 합성효소를 암호화하는 유전자
서열번호 13; pTrpT_Sm_aet의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 14; pTrpT_Sm_aet의 조제를 위한 합성 프라이머
서열번호 15; Aet용 혼합 프라이머 1
서열번호 16; Aet용 혼합 프라이머 2
서열번호 19; 페도박터 유래 aet 발현 벡터 작제용 프라이머 1
서열번호 20; 페도박터 유래 aet 발현 벡터 작제용 프라이머 2
서열번호 21; Aet용 믹스 프라이머 3
서열목록 전자파일 첨부

Claims (38)

  1. 서열번호 6의 아미노산 잔기번호 23 내지 616의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  2. 제1항에 따른 DNA를 갖는 재조합 DNA.
  3. 제2항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 형질전환 세포.
  4. 제3항에 따른 형질전환 세포를, 펩타이드 생성효소를 생산하는데 적합한 시간 및 조건하에 배지 중에서 배양하는 단계 및 배지 또는 형질전환 세포 또는 이들 모두에 펩타이드 생성효소를 축적시키는 단계를 포함하는 펩타이드 생성효소의 제조방법.
  5. 제3항에 따른 형질전환 세포를, 배양에서 펩타이드 생성효소를 생산하는데 적합한 시간 및 조건하에 배지 중에서 배양하는 단계 및 당해 DNA에 의해 암호화된 펩타이드 생성효소에 의해 촉진되는 효소적 촉매작용에 의해 디펩타이드를 합성하기 위해 당해 배양물과 카복시 성분과 아민 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 디펩타이드의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포가 카복시 성분과 아민 성분으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 스핀고박테리움(Sphingobacterium)속에 속하는 미생물임을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 세포가 배양물로부터 분리됨을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 세포가 미생물의 처리된 균체 생성물임을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
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  18. 서열번호 5의 염기번호 127 내지 1908의 염기서열 또는 서열번호 5의 염기번호 61 내지 1908의 염기서열을 갖는 DNA.
  19. 제18항에 따른 DNA를 갖는 재조합 DNA.
  20. 제19항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 형질전환 세포.
  21. 제20항에 따른 형질전환 세포를, 펩타이드 생성효소를 생산하는데 적합한 시간 및 조건하에 배지 중에서 배양하는 단계 및 배지 형질전환 세포 또는 이둘 모두에 펩타이드 생성효소를 축적시키는 단계를 포함하는 펩타이드 생성효소의 제조방법.
  22. 제20항에 따른 형질전환 세포를, 배양에서 펩타이드 생성효소를 생산하는데 적합한 시간 및 조건하에 배지 중에서 배양하는 단계 및 당해 DNA에 의해 암호화된 펩타이드 생성효소에 의해 촉진되는 효소적 촉매작용에 의해 디펩타이드를 합성하기 위해 당해 배양물과 카복시 성분과 아민 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 디펩타이드의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포가 카복시 성분과 아민 성분으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 스핀고박테리움속에 속하는 미생물임을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 세포가 배양물로부터 분리됨을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 세포가 미생물의 처리된 균체 생성물임을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102650468B1 (ko) 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070034103A (ko) 2002-07-26 2007-03-27 아지노모토 가부시키가이샤 신규 펩타이드 신타제 유전자
EP2166109B1 (en) 2003-01-24 2012-02-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine-beta-ester and method for producing alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine-alpha-methyl ester
JP2005040037A (ja) * 2003-07-25 2005-02-17 Ajinomoto Co Inc ジペプチドの製造方法、それに用いるペプチド生成酵素、およびペプチド生成酵素の製造方法
DE602004024312D1 (de) * 2003-08-12 2010-01-07 Tigenix Nv Verwendung von cxcl6 chemokin bei der prävention oder reparatur von knorpeldefekten
US20050176150A1 (en) * 2004-02-05 2005-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Mutant microorganism and method for producing peptide using the same
WO2006009255A1 (ja) * 2004-07-22 2006-01-26 Ajinomoto Co., Inc. α－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－フェニルアラニン－α－エステルの製造方法
WO2006075486A1 (ja) * 2004-12-20 2006-07-20 Ajinomoto Co., Inc. ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質
WO2007055388A2 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Calcium receptor activator
JPWO2008001837A1 (ja) 2006-06-28 2009-11-26 協和発酵バイオ株式会社 オリゴペプチドの精製方法
US20090194263A1 (en) * 2008-02-05 2009-08-06 Bernardes Marco Aurelio Dos Santos Methods and mechanisms for thermal semi conduction
JPWO2009107660A1 (ja) 2008-02-25 2011-07-07 味の素株式会社 糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤
EP2275138A4 (en) 2008-03-24 2013-08-21 Ajinomoto Kk PROMOTER FOR SECRETION OF BICARBONATE IN THE GASTROINTESTINAL TRACT
WO2009128523A1 (ja) 2008-04-17 2009-10-22 味の素株式会社 免疫賦活剤
MY158503A (en) 2009-04-01 2016-10-14 Ajinomoto Kk Use of peptides for imparting kokumi
MY160825A (en) 2009-12-28 2017-03-31 Ajinomoto Kk Lanthionine derivatives
KR101410710B1 (ko) 2009-12-28 2014-06-24 아지노모토 가부시키가이샤 코쿠미 부여제
JP2011223896A (ja) * 2010-04-15 2011-11-10 Ajinomoto Co Inc ペプチドの製造方法
WO2013051685A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 味の素株式会社 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法
BR112014018793B1 (pt) 2012-02-06 2020-05-05 Ajinomoto Kk composição para conferir o sabor kokumi em um alimento ou bebida, método de produção de um alimento ou bebida, e, alimento ou bebida
EP2883960B1 (en) 2012-08-10 2020-05-13 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING gamma-GLUTAMYL-VALYL-GLYCINE CRYSTAL
CN103965326A (zh) * 2013-01-29 2014-08-06 苏州偲聚生物材料有限公司 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒
US10443376B2 (en) * 2013-06-20 2019-10-15 Halliburton Energy Services, Inc. Device and method for corrosion detection and formation evaluation using integrated computational elements
US9528346B2 (en) * 2013-11-18 2016-12-27 Weatherford Technology Holdings, Llc Telemetry operated ball release system
CA3049488C (en) * 2016-12-30 2020-07-28 Innobio Corporation Limited Gene encoding alanyl-glutamine dipeptide biosynthetic enzyme and application thereof
CN106754447B (zh) * 2016-12-30 2020-08-25 大连医诺生物股份有限公司 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
JPWO2022244696A1 (ko) 2021-05-17 2022-11-24
WO2022244697A1 (ja) 2021-05-17 2022-11-24 味の素株式会社 異臭抑制用組成物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000058478A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Holland Sweetener Company V.O.F. MICROBIOLOGICAL PRODUCTION METHOD FOR α-L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5392729A (en) 1977-01-27 1978-08-15 Toyo Soda Mfg Co Ltd Adduct of dipeptide derivatives and amino acid derivatives and process for their preparation
JPS59225152A (ja) * 1983-06-02 1984-12-18 Ajinomoto Co Inc α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル又はその塩酸塩の製法
JPH0640832B2 (ja) 1985-05-10 1994-06-01 味の素株式会社 インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法
DK72587D0 (da) 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
US4892820A (en) * 1987-06-10 1990-01-09 The Nutrasweet Company Solvent system for enzymatic coupling process
JPH0832717B2 (ja) 1987-10-07 1996-03-29 味の素株式会社 グルタミン誘導体の製造方法
DK163435C (da) 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
JP3473976B2 (ja) 1992-10-29 2003-12-08 協和醗酵工業株式会社 アラニルグルタミンの製造法
CA2333667A1 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Merck & Co., Inc. Murd protein and gene of pseudomonas aeruginosa
JP2000078971A (ja) * 1998-09-04 2000-03-21 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物
KR100365838B1 (ko) * 2000-03-24 2002-12-26 한국생명공학연구원 브레비바실러스 보스테렌시스 ｂｃｓ-1 에서 유래한 신규내열성 ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법
CZ292694B6 (cs) * 2001-06-22 2003-11-12 Bedřich Ing. Doležal Synchronizační zařízení ručně řazené převodovky
KR100635803B1 (ko) * 2001-07-26 2006-10-19 아지노모토 가부시키가이샤 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법
WO2004011652A1 (ja) * 2002-07-26 2004-02-05 Ajinomoto Co., Inc. トリペプチド以上のペプチドの製造方法
KR20070034103A (ko) * 2002-07-26 2007-03-27 아지노모토 가부시키가이샤 신규 펩타이드 신타제 유전자
EP2166109B1 (en) * 2003-01-24 2012-02-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine-beta-ester and method for producing alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine-alpha-methyl ester
US20040204577A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Ajinomoto Co., Inc. Novel peptide-forming enzyme gene
JP5392729B2 (ja) 2011-10-03 2014-01-22 公立大学法人高知工科大学 遠隔操作システム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000058478A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Holland Sweetener Company V.O.F. MICROBIOLOGICAL PRODUCTION METHOD FOR α-L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102650468B1 (ko) 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

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EP2298908A2 (en) 2011-03-23
US8753841B2 (en) 2014-06-17
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