JPH0640832B2 - インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 - Google Patents
インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法Info
- Publication number
- JPH0640832B2 JPH0640832B2 JP60099262A JP9926285A JPH0640832B2 JP H0640832 B2 JPH0640832 B2 JP H0640832B2 JP 60099262 A JP60099262 A JP 60099262A JP 9926285 A JP9926285 A JP 9926285A JP H0640832 B2 JPH0640832 B2 JP H0640832B2
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- interleukin
- guanidine
- solution
- cells
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、インターロイキン２（IL-２）の回収方法
に関し、詳しくは、微生物細胞内に顆粒状の蓄積されて
いるIL-２ポリペプチドを回収する方法に関する。
に関し、詳しくは、微生物細胞内に顆粒状の蓄積されて
いるIL-２ポリペプチドを回収する方法に関する。
IL-２は、Ｔ細胞増殖因子としての作用を有するリンホ
カインの一種であり、医薬としての用途が期待されてい
る。
カインの一種であり、医薬としての用途が期待されてい
る。
従来の技術 IL-２の製造法の一つとして、組換えDNA技術により造成
された微生物を用いる方法が知られている（欧州特許出
願公開第0091539号）。このような微生物を用いてIL-２
を製造しようとする場合、IL-２ポリペプチドは、微生
物細胞内に顆粒状に蓄積されることが多い。顆粒状に蓄
積されたIL-２ポリペプチドを可溶化し、IL-２活性を有
するポリペプチドとして回収するには、従来煩雑な工程
を必要とし、また得られたポリペプチドの比活性も低
く、更にポリペプチドの回収率も高いものではなかっ
た。
された微生物を用いる方法が知られている（欧州特許出
願公開第0091539号）。このような微生物を用いてIL-２
を製造しようとする場合、IL-２ポリペプチドは、微生
物細胞内に顆粒状に蓄積されることが多い。顆粒状に蓄
積されたIL-２ポリペプチドを可溶化し、IL-２活性を有
するポリペプチドとして回収するには、従来煩雑な工程
を必要とし、また得られたポリペプチドの比活性も低
く、更にポリペプチドの回収率も高いものではなかっ
た。
顆粒状に微生物細胞内に蓄積された蛋白質を採取するた
めに、微生物細胞を先ずリゾチームに接触させ、ついで
超音波により細胞を破砕し、破砕物より遠心分離により
蛋白顆粒を分離する方法が知られている（例えば、牛生
長ホルモンについて、バイオテノノロジー（Biotechnol
ogy），１５１−１５４，１９８５年２月を参照）。ま
た、得られた蛋白顆粒をグアニジン塩酸塩等により可溶
化することも知られている（例えば、インターフェロン
について、米国特許第4,476,049号参照）。更に、一般
の可溶性蛋白質分子中の２つのチオール残基をグルタチ
オン等で酸化してジスルフィド結合を形成せしめること
も知られている（例えば、バイオケミストリー（Bioche
mistry）９(1970)5015〜5022）。
めに、微生物細胞を先ずリゾチームに接触させ、ついで
超音波により細胞を破砕し、破砕物より遠心分離により
蛋白顆粒を分離する方法が知られている（例えば、牛生
長ホルモンについて、バイオテノノロジー（Biotechnol
ogy），１５１−１５４，１９８５年２月を参照）。ま
た、得られた蛋白顆粒をグアニジン塩酸塩等により可溶
化することも知られている（例えば、インターフェロン
について、米国特許第4,476,049号参照）。更に、一般
の可溶性蛋白質分子中の２つのチオール残基をグルタチ
オン等で酸化してジスルフィド結合を形成せしめること
も知られている（例えば、バイオケミストリー（Bioche
mistry）９(1970)5015〜5022）。
しかしながら、微生物細胞内に顆粒状に蓄積されたIL-
２ポリペプチドについては、より比活性が高いポリペプ
チドをより高い回収率で得るには、どのような回収方法
が適しているのか、知られていない。
２ポリペプチドについては、より比活性が高いポリペプ
チドをより高い回収率で得るには、どのような回収方法
が適しているのか、知られていない。
特にIL-２ポリペプチドは、他の蛋白質と比べると、水
に溶けにくい。加えて顆粒状ポリペプチドを可溶化した
ときは、分子中に３箇のチオール残基が生じ、このよう
なポリペプチドは、IL-２活性を有しない。従って、こ
れら３つのチオール残基よりジスルフィド結合を形成せ
しめる必要があると考えられるが、いずれか二つのチオ
ール残基より選択的にジスルフィド結合を形成せしめな
ければならない。これらの点から、従来の顆粒状に蓄積
された蛋白に比べ、IL-２ポリペプチドの回収について
は、より困難が予想される。
に溶けにくい。加えて顆粒状ポリペプチドを可溶化した
ときは、分子中に３箇のチオール残基が生じ、このよう
なポリペプチドは、IL-２活性を有しない。従って、こ
れら３つのチオール残基よりジスルフィド結合を形成せ
しめる必要があると考えられるが、いずれか二つのチオ
ール残基より選択的にジスルフィド結合を形成せしめな
ければならない。これらの点から、従来の顆粒状に蓄積
された蛋白に比べ、IL-２ポリペプチドの回収について
は、より困難が予想される。
発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の目的は、微生物細胞内に顆粒状に蓄積
されたIL-２ポリペプチドを、可溶性のIL-２活性を有す
るポリペプチドとして、より高い比活性であってより高
い回収率で、回収する方法を見い出すことにある。
されたIL-２ポリペプチドを、可溶性のIL-２活性を有す
るポリペプチドとして、より高い比活性であってより高
い回収率で、回収する方法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段 叙上のような状況下で本発明者らは、IL-２ポリペプチ
ドを顆粒状で細胞内に蓄積している微生物細胞を、リゾ
チームと接触せしめた後、超音波にて細胞を破砕し、つ
いで破砕物を重力場において沈降物を採取し、沈降物を
１Ｍから６Ｍグアニジン水溶液を入れ、これを弱い酸化
的条件下に置き、最後にグアニジン水溶液中に溶解され
ているIL-２ポリペプチドを採取することにより高い比
活性のポリペプチドが高い回収率で得られることを見い
出した。
ドを顆粒状で細胞内に蓄積している微生物細胞を、リゾ
チームと接触せしめた後、超音波にて細胞を破砕し、つ
いで破砕物を重力場において沈降物を採取し、沈降物を
１Ｍから６Ｍグアニジン水溶液を入れ、これを弱い酸化
的条件下に置き、最後にグアニジン水溶液中に溶解され
ているIL-２ポリペプチドを採取することにより高い比
活性のポリペプチドが高い回収率で得られることを見い
出した。
組換えDNA技術により造成されたIL-２生産能を有する微
生物及びその微生物を培養してIL-２ポリペプチドを生
成せしめる方法は、欧州特許出願公開第0091539号に記
載されている。
生物及びその微生物を培養してIL-２ポリペプチドを生
成せしめる方法は、欧州特許出願公開第0091539号に記
載されている。
IL-２ポリペプチドを顆粒状に蓄積している微生物細胞
をリゾチームに接触せしめる方法は、微生物菌体を好ま
しくは湿重量０．００５〜０．２ｇ／mlとなるようにpH
６から８の低張緩衝液あるいは培養液にけん濁し、リゾ
チームを２，５００から５０，０００単位／mlとなるよ
うに加え、好ましくは０から３０℃の範囲に、通常３０
分以上保てばよい。けん濁液中には０．１から１００ｍ
μのEDTAを添加すれば、好ましい結果が得られることが
ある。
をリゾチームに接触せしめる方法は、微生物菌体を好ま
しくは湿重量０．００５〜０．２ｇ／mlとなるようにpH
６から８の低張緩衝液あるいは培養液にけん濁し、リゾ
チームを２，５００から５０，０００単位／mlとなるよ
うに加え、好ましくは０から３０℃の範囲に、通常３０
分以上保てばよい。けん濁液中には０．１から１００ｍ
μのEDTAを添加すれば、好ましい結果が得られることが
ある。
リゾチームに接触させた細胞は、９から25kHzの超音波
により破砕される。装置は、通常、細胞や組織の破砕・
ホモジエナイジングに用いられる超音波発生装置を用い
ればよく、試料に超音波を伝達するホーンは投込式のも
の、カップ式のもの、いずれも使用できる。超音波出力
は、使用する超音波発生装置に適したものでよいが、通
常２０Ｗから１kWが用いられる。処理時間は、処理液
量，出力，使用するホーン等に応じ適宜選択すればよ
い。細胞の破砕状態は顕微鏡下に容易に観察することが
できる。適切な破砕が行なわれると、IL-２ポリペプチ
ドの顆粒以外の細胞構成物（細胞壁，細胞膜等）は、微
細な破片となり、もとの形をとどめない。また超音波処
理は発熱を伴うので、けん濁液の熱変性を防ぐため細胞
の破砕は通常４℃とできるだけ低い温度下で行なわれ
る。
により破砕される。装置は、通常、細胞や組織の破砕・
ホモジエナイジングに用いられる超音波発生装置を用い
ればよく、試料に超音波を伝達するホーンは投込式のも
の、カップ式のもの、いずれも使用できる。超音波出力
は、使用する超音波発生装置に適したものでよいが、通
常２０Ｗから１kWが用いられる。処理時間は、処理液
量，出力，使用するホーン等に応じ適宜選択すればよ
い。細胞の破砕状態は顕微鏡下に容易に観察することが
できる。適切な破砕が行なわれると、IL-２ポリペプチ
ドの顆粒以外の細胞構成物（細胞壁，細胞膜等）は、微
細な破片となり、もとの形をとどめない。また超音波処
理は発熱を伴うので、けん濁液の熱変性を防ぐため細胞
の破砕は通常４℃とできるだけ低い温度下で行なわれ
る。
破砕により得られたIL-２ポリペプチド顆粒は重力場に
おき、沈降物として採取される。遠心分離はIL-２ポリ
ペプチド顆粒が沈降する条件で行えばよいが、通常2,00
0〜30,000×ｇ、好ましくは10,000×ｇ、５分程度行な
われる。また、蔗糖等の密度勾配遠心分離を行ってもよ
い。このようにして得られる沈降物は、通常８０％以上
のIL-２ポリペプチドを含有する。
おき、沈降物として採取される。遠心分離はIL-２ポリ
ペプチド顆粒が沈降する条件で行えばよいが、通常2,00
0〜30,000×ｇ、好ましくは10,000×ｇ、５分程度行な
われる。また、蔗糖等の密度勾配遠心分離を行ってもよ
い。このようにして得られる沈降物は、通常８０％以上
のIL-２ポリペプチドを含有する。
得られた顆粒状IL-２ポリペプチドよりなる沈降物を１
Ｍから６Ｍの範囲のグアニジン溶液中に、好ましくは、
０．０１から０．２ｇ／の濃度となるようにけん濁又
は溶解する。グアニジン溶液が４から６Ｍの範囲である
ときは、顆粒が充分溶解して後、１．５から３Ｍになる
ように水または緩衝液で希釈する。グアニジン水溶液の
pHは、６から１０の範囲、より好ましくは７から９の範
囲である。また、顆粒状IL-２ポリペプチドがけん濁ま
たは溶解されているグアニジン水溶液は、温度５℃から
４５℃の範囲に置くのが好ましい。
Ｍから６Ｍの範囲のグアニジン溶液中に、好ましくは、
０．０１から０．２ｇ／の濃度となるようにけん濁又
は溶解する。グアニジン溶液が４から６Ｍの範囲である
ときは、顆粒が充分溶解して後、１．５から３Ｍになる
ように水または緩衝液で希釈する。グアニジン水溶液の
pHは、６から１０の範囲、より好ましくは７から９の範
囲である。また、顆粒状IL-２ポリペプチドがけん濁ま
たは溶解されているグアニジン水溶液は、温度５℃から
４５℃の範囲に置くのが好ましい。
グアニジンは、グアニジン塩酸塩が容易に入手できるの
で、塩酸塩が通常使用されるが、他の塩又は遊離形であ
ってもよい。
で、塩酸塩が通常使用されるが、他の塩又は遊離形であ
ってもよい。
顆粒状IL-２ポリペプチドがけん濁又は溶解されている
１から６Ｍグアニジン水溶液は、弱い酸化条件に置かれ
る。弱い酸化条件に置くには、グアニジン水溶液に空気
又は酸素を含む気体を通気してもよく、また、グルタチ
オン，システィン，メルカプトエタノール，ジチオスレ
イトール等のチオール化合物（及び酸素又は他の酸化
剤）及びこれらのジスルフィド体のような弱い酸化剤を
水溶液に添加してもよい。弱い酸化剤は、顆粒状IL-２
ポリペプチドと同時にグアニジン水溶液に添加しても良
いが、IL-２ポリペプチドがある程度溶解して後、特に
４から６Ｍグアニジンを水にて希釈した後に添加しても
よい。
１から６Ｍグアニジン水溶液は、弱い酸化条件に置かれ
る。弱い酸化条件に置くには、グアニジン水溶液に空気
又は酸素を含む気体を通気してもよく、また、グルタチ
オン，システィン，メルカプトエタノール，ジチオスレ
イトール等のチオール化合物（及び酸素又は他の酸化
剤）及びこれらのジスルフィド体のような弱い酸化剤を
水溶液に添加してもよい。弱い酸化剤は、顆粒状IL-２
ポリペプチドと同時にグアニジン水溶液に添加しても良
いが、IL-２ポリペプチドがある程度溶解して後、特に
４から６Ｍグアニジンを水にて希釈した後に添加しても
よい。
弱い酸化剤は大過剰量使用されるが、通常１から１００
mM好ましくは10から20mMの濃度範囲で用いられる。ジス
ルフィド化合物を酸化剤として用いる場合は、そのチオ
ール体と混用するのがよく、例えばグルタチオンを用い
る場合には、還元型グルタチオン（GSH）と酸化型グル
タチオン（GSSG）を好ましくは５：１〜２０：１の比混
用する。還元型のみを用いるときは、グアニジン水溶液
に空気を流すのがよい。
mM好ましくは10から20mMの濃度範囲で用いられる。ジス
ルフィド化合物を酸化剤として用いる場合は、そのチオ
ール体と混用するのがよく、例えばグルタチオンを用い
る場合には、還元型グルタチオン（GSH）と酸化型グル
タチオン（GSSG）を好ましくは５：１〜２０：１の比混
用する。還元型のみを用いるときは、グアニジン水溶液
に空気を流すのがよい。
酸化は、反応液を適当な時間間隔でサンプルをとりだ
し、逆相HPLCによる分析により、活性型IL-２のピーク
の増加が停止する迄続けられる。
し、逆相HPLCによる分析により、活性型IL-２のピーク
の増加が停止する迄続けられる。
かくして、グアニジン水溶液中に溶解されたIL-２ポリ
ペプチドを、通常の方法で回収する。例えば、グアニジ
ン水溶液をゲル過によって脱塩し、陽イオン交換樹脂
を用いるカラムクロマトグラフィーに供する。塩濃度を
上昇させることにより、吸着されたIL-２ポリペプチド
を溶離せしめ、溶離液を逆相HPLCに直接負荷することに
より精製する。このようにして、実質的に夾雑物を含ま
ないIL-２ポリペプチドを得ることが出来る。
ペプチドを、通常の方法で回収する。例えば、グアニジ
ン水溶液をゲル過によって脱塩し、陽イオン交換樹脂
を用いるカラムクロマトグラフィーに供する。塩濃度を
上昇させることにより、吸着されたIL-２ポリペプチド
を溶離せしめ、溶離液を逆相HPLCに直接負荷することに
より精製する。このようにして、実質的に夾雑物を含ま
ないIL-２ポリペプチドを得ることが出来る。
発明の作用、効果 この発明のIL-２の回収方法によれば、高い比活性のIL-
２ポリペプチドが、高い回収率で得られる。
２ポリペプチドが、高い回収率で得られる。
実施例１ IL-２産生微生物の取得 IL-２ポリペプチドを細胞内に顆粒状に蓄積できるエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）pT9-11／HB101を
次のようにして得た（第１図参照）。
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）pT9-11／HB101を
次のようにして得た（第１図参照）。
即ち、IL-２全cDNAを含むpIL2-50A（欧州特許出願公開9
1539号),（寄託エシェリヒア・コリ（Escherichiacol
i）χ1776/pIL2-50A,AJ11996,FERMBP-226)よりPstIで切
断しインターロイキン−２cDNA断片を得、さらにDraIで
消化してIL-２cDNA遺伝子の３′非構造遺伝子に存在す
るＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃホモポリマーを含む約３００塩酸対の
断片を除去したところの５３０塩基対断片を得た。そし
てこの断片とBamHIリンカーと、pBR322のPstI-EcoRIの
大きい方の断片（EcoRI部位はクレノウで平滑末端にし
た）とをT4DNAリガーゼで連結し、インターロイキン−
２構造遺伝子のおよそ５０塩基対下流の非構造遺伝子の
後にBamHI切断部位の入ったプラスミドを造成した。そ
してこのプラスミドを、HgiA1で消化しIL-２遺伝子を含
むHgiA1断片を得、これをDNAポリメラーゼＩ（クレノ
ウ）処理で３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチドを
削り取り平滑末端にした。そしてさらにこの断片をBamH
Iで切断して約４５０塩基対の断片を得た。
1539号),（寄託エシェリヒア・コリ（Escherichiacol
i）χ1776/pIL2-50A,AJ11996,FERMBP-226)よりPstIで切
断しインターロイキン−２cDNA断片を得、さらにDraIで
消化してIL-２cDNA遺伝子の３′非構造遺伝子に存在す
るＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃホモポリマーを含む約３００塩酸対の
断片を除去したところの５３０塩基対断片を得た。そし
てこの断片とBamHIリンカーと、pBR322のPstI-EcoRIの
大きい方の断片（EcoRI部位はクレノウで平滑末端にし
た）とをT4DNAリガーゼで連結し、インターロイキン−
２構造遺伝子のおよそ５０塩基対下流の非構造遺伝子の
後にBamHI切断部位の入ったプラスミドを造成した。そ
してこのプラスミドを、HgiA1で消化しIL-２遺伝子を含
むHgiA1断片を得、これをDNAポリメラーゼＩ（クレノ
ウ）処理で３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチドを
削り取り平滑末端にした。そしてさらにこの断片をBamH
Iで切断して約４５０塩基対の断片を得た。
また、trpプロモーターを搭載したプラスミドとしてpDR
720を使用した。pDR720はpKO-1（Russel,D.R. and Benn
ett,G.N., Gene, 20,231(1982)）のSma I 切断部位にtr
pプロモーター，オペレーター断片が組込まれたもので
ある。pDR720をHpaIとBamHIで消化し、大きいHpaI−Bam
HI断片を得、trpプロモーターの１部とAAGGなるSD配列
ならびに蛋白合成開始コドンATGと成熟IL-２ポリペプチ
ドのＮ末端のアラニンをコードするGCAを含む合成オリ
ゴマーとを第１図に示すように連結しpMI-9を選びだし
た。
720を使用した。pDR720はpKO-1（Russel,D.R. and Benn
ett,G.N., Gene, 20,231(1982)）のSma I 切断部位にtr
pプロモーター，オペレーター断片が組込まれたもので
ある。pDR720をHpaIとBamHIで消化し、大きいHpaI−Bam
HI断片を得、trpプロモーターの１部とAAGGなるSD配列
ならびに蛋白合成開始コドンATGと成熟IL-２ポリペプチ
ドのＮ末端のアラニンをコードするGCAを含む合成オリ
ゴマーとを第１図に示すように連結しpMI-9を選びだし
た。
一方、pBR322のPvuIIとSalI切断断片の大きい断片と、
合成したtrpAターミネーター配列を持つDNAとを連結さ
せpTrpAを得た。そしてpMI-9 とpTrpAをともにEcoRIとB
amHIで消化しpMI-9 はIL-２遺伝子を含む方の断片、pTr
pAはtrpAターミネータを含む方の断片をそれぞれ調製
し、この２者を連結して、pT9-11を得た。そこでpT9-11
をエシュリヒア・コリ HB101(Ｆ-，hsdS20（rB -，
mB -），recA13, ara-14, proA2, lacY1, gaLK2,rpsL20
(Smr), xy1-5, m+l-1, supE44，λ-）に導入してpT9-11
/HB101 を得た。
合成したtrpAターミネーター配列を持つDNAとを連結さ
せpTrpAを得た。そしてpMI-9 とpTrpAをともにEcoRIとB
amHIで消化しpMI-9 はIL-２遺伝子を含む方の断片、pTr
pAはtrpAターミネータを含む方の断片をそれぞれ調製
し、この２者を連結して、pT9-11を得た。そこでpT9-11
をエシュリヒア・コリ HB101(Ｆ-，hsdS20（rB -，
mB -），recA13, ara-14, proA2, lacY1, gaLK2,rpsL20
(Smr), xy1-5, m+l-1, supE44，λ-）に導入してpT9-11
/HB101 を得た。
IL-２ポリペプチド顆粒の調製 細胞は、（２％カザミノ酸、０．２％酵母エキス、０．
５％NH4Cl，２％グルコース，０．１％KH2PO4，０．０
５％MgSO4・７H2O，0.005％CaCl2・２H2O，０．８mg/ml
Ｌ−ロイシン，０．８mg/mlＬ−プロリン，８mg／サ
イアミン，１００μｇ／mlアンピリシン，２５μｇ／ml
ストレプトマイシン）の組成の培地３００ml中で、アン
モニアでpHを６．２に調節しながら３１℃で１３時間、
通気培養した。途中、６６０nmのO.D.がおよび５．０に
達した時点で、３−インドールアクリル酸２５μｇ／ml
を加えて、IL-２遺伝子を発現させた。
５％NH4Cl，２％グルコース，０．１％KH2PO4，０．０
５％MgSO4・７H2O，0.005％CaCl2・２H2O，０．８mg/ml
Ｌ−ロイシン，０．８mg/mlＬ−プロリン，８mg／サ
イアミン，１００μｇ／mlアンピリシン，２５μｇ／ml
ストレプトマイシン）の組成の培地３００ml中で、アン
モニアでpHを６．２に調節しながら３１℃で１３時間、
通気培養した。途中、６６０nmのO.D.がおよび５．０に
達した時点で、３−インドールアクリル酸２５μｇ／ml
を加えて、IL-２遺伝子を発現させた。
その後、細胞を集め、湿重量０．０２ｇ／mlになるよう
に、50mMのEDTAを加えて２０mMトリス塩酸緩衝液（pH
７．５）にけん濁し、１mg／mlとなるようにリゾチーム
（生化学工業製、卵白、比活性＞50,000U/mg）を加え、
１０℃に３０分保った。次いで、このうち２０mlを４
℃，５０Ｗ，１０分間超音波処理して（大岳製作所Soni
cator使用）細胞を破砕し、１２，０００×ｇ，５分間
遠心分離して、IL-２ポリペプチドの顆粒を採取した。
に、50mMのEDTAを加えて２０mMトリス塩酸緩衝液（pH
７．５）にけん濁し、１mg／mlとなるようにリゾチーム
（生化学工業製、卵白、比活性＞50,000U/mg）を加え、
１０℃に３０分保った。次いで、このうち２０mlを４
℃，５０Ｗ，１０分間超音波処理して（大岳製作所Soni
cator使用）細胞を破砕し、１２，０００×ｇ，５分間
遠心分離して、IL-２ポリペプチドの顆粒を採取した。
活性型IL-２ポリペプチドの回収 得られたIL-２ポリペプチド顆粒を、６Ｍグアニジン塩
酸塩（Gun・HCl）２０mlに溶解して、液体クロマトグラ
フィーによりIL-２ポリペプチド量を測定した。一方、
培養終了後の細胞をリゾチーム処理、超音波による細胞
破砕をせずに直接6M Gun・HClにより可溶化したものを
調製し、液体クロマトグラフィーによりIL-２ポリペプ
チド量を測定した。これらの結果を表１に示す。
酸塩（Gun・HCl）２０mlに溶解して、液体クロマトグラ
フィーによりIL-２ポリペプチド量を測定した。一方、
培養終了後の細胞をリゾチーム処理、超音波による細胞
破砕をせずに直接6M Gun・HClにより可溶化したものを
調製し、液体クロマトグラフィーによりIL-２ポリペプ
チド量を測定した。これらの結果を表１に示す。
得られたIL-２ポリペプチドを含むペレットを、６Ｍ塩
酸グアニジンを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
８．０，以下Ａと略す）に、IL-２濃度０．３mg/ml と
なるように溶解した。その後、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（pH８．０，以下、Ｂと略す）で、３倍に希釈し、
GSH及びGSSGをそれぞれ、最終濃度10mM及び１mMとなる
ように加えた後、希苛性ソーダを用いて、pHを８に調整
した。室温下、12時間静止した後反応液０．０５Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（pH５．０）で平衡化したセファデッ
クスG-25を用いるカラムクロマトグラフィーに供して低
分子を除去した。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH
５．０）で平衡化したCM-セファデックスC-25を充填し
たカラムに通液し、IL-２を吸着させた後に、０．５Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．０）で、IL-２を溶出し
た。
酸グアニジンを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
８．０，以下Ａと略す）に、IL-２濃度０．３mg/ml と
なるように溶解した。その後、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（pH８．０，以下、Ｂと略す）で、３倍に希釈し、
GSH及びGSSGをそれぞれ、最終濃度10mM及び１mMとなる
ように加えた後、希苛性ソーダを用いて、pHを８に調整
した。室温下、12時間静止した後反応液０．０５Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（pH５．０）で平衡化したセファデッ
クスG-25を用いるカラムクロマトグラフィーに供して低
分子を除去した。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH
５．０）で平衡化したCM-セファデックスC-25を充填し
たカラムに通液し、IL-２を吸着させた後に、０．５Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．０）で、IL-２を溶出し
た。
得られたIL-２ポリペプチド画分を逆相HPLC（特開昭59
−225195に記載されている方法を使用した）に供し、IL
-２画分を分取した。得られたIL-２ポリペプチドは、細
胞障害性Ｔ−リンパ球株を用いる活性検定法では4.8×1
07U／mgの比活性を示した。またペプチドマップ法によ
り、ジスルフィド結合の架橋位置を調べたところ、天然
型IL-２（ProNAS.81 (1984) 6486-6490）と同じくCys-5
8とCys-105間にあることが判った。また、ペレット中に
含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は８６％であ
った。
−225195に記載されている方法を使用した）に供し、IL
-２画分を分取した。得られたIL-２ポリペプチドは、細
胞障害性Ｔ−リンパ球株を用いる活性検定法では4.8×1
07U／mgの比活性を示した。またペプチドマップ法によ
り、ジスルフィド結合の架橋位置を調べたところ、天然
型IL-２（ProNAS.81 (1984) 6486-6490）と同じくCys-5
8とCys-105間にあることが判った。また、ペレット中に
含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は８６％であ
った。
実施例２ 実施例１に記した緩衝液Ａで可溶化したペレットを緩衝
液Ｂで希釈する際に、ペレット量に対するＡ，Ｂの容量
を変化させることによりIL-２ポリペプチド濃度及び塩
酸グアニジン濃度を表２に示した値になるように調節し
た溶液を作成した。これを、実施例１に記載した方法と
同様にして、GSHとGSSGで処理し、処理液を直接逆相HPL
Cで分析することによって、総IL-２ポリペプチドに対す
る活性型、すなわちCys-58 Cys-105間にジスルフィド結
合を持つIL-２の変換率を求めた。結果を表２に記し
た。
液Ｂで希釈する際に、ペレット量に対するＡ，Ｂの容量
を変化させることによりIL-２ポリペプチド濃度及び塩
酸グアニジン濃度を表２に示した値になるように調節し
た溶液を作成した。これを、実施例１に記載した方法と
同様にして、GSHとGSSGで処理し、処理液を直接逆相HPL
Cで分析することによって、総IL-２ポリペプチドに対す
る活性型、すなわちCys-58 Cys-105間にジスルフィド結
合を持つIL-２の変換率を求めた。結果を表２に記し
た。
実施例３ 実施例１に記載した方法によって得たIL-２ポリペプチ
ドを含むペレットを、緩衝液ＡにIL-２濃度０．３mg/ml
となるように溶解し、続いて緩衝液Ｂで３倍に希釈し
た。この溶液に空気をおだやかに通じながら１２時間撹
拌した。しかる後に、実施例２に記した方法により、脱
塩，イオン交換クロマトグラフィー，逆相HPLC工程を経
て、IL-２画分を得た。得られたIL-２は4.9×107Ｕ／mg
の比活性を示し、また、ジスルフィド結合位置は、Cys-
58-Cys-105間であることが確認された。なおペレット中
に含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は７２％で
あった。
ドを含むペレットを、緩衝液ＡにIL-２濃度０．３mg/ml
となるように溶解し、続いて緩衝液Ｂで３倍に希釈し
た。この溶液に空気をおだやかに通じながら１２時間撹
拌した。しかる後に、実施例２に記した方法により、脱
塩，イオン交換クロマトグラフィー，逆相HPLC工程を経
て、IL-２画分を得た。得られたIL-２は4.9×107Ｕ／mg
の比活性を示し、また、ジスルフィド結合位置は、Cys-
58-Cys-105間であることが確認された。なおペレット中
に含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は７２％で
あった。
実施例４ 実施例１に記載した方法によって得られたIL-２ポリペ
プチドを含むペレットを、３Ｍ塩酸グアニジン，１０mM
GSH，１mM GSSGを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
H８．０）に懸濁し、室温下、２４時間、緩かに撹拌し
た。遠心分離によって不溶性画分を除去した後実施例２
に記した方法によって脱塩，イオン交換クロマトグラフ
ィー，逆相HPLCを行ない、IL-２画分を得た。得られたI
L-２は、4.8×107Ｕ／mgの比活性を示し、ジスルフィド
結合をCys-58-105 間に有していた。また、ペレット中
に含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は６５％で
あった。
プチドを含むペレットを、３Ｍ塩酸グアニジン，１０mM
GSH，１mM GSSGを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
H８．０）に懸濁し、室温下、２４時間、緩かに撹拌し
た。遠心分離によって不溶性画分を除去した後実施例２
に記した方法によって脱塩，イオン交換クロマトグラフ
ィー，逆相HPLCを行ない、IL-２画分を得た。得られたI
L-２は、4.8×107Ｕ／mgの比活性を示し、ジスルフィド
結合をCys-58-105 間に有していた。また、ペレット中
に含まれるIL-２ポリペプチドからの回収率は６５％で
あった。
実施例５ 実施例１に記載した方法によって得られたIL-２ポリペ
プチドを含むペレットを３Ｍ塩酸グアニジンを含む０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁し、室温下
空気を通じながら、２４時間撹拌した。遠心分離によっ
て不溶性画分を除去した後、実施例２に記した方法によ
り脱塩，イオン交換クロマトグラフィー，逆相HPLCを行
ないIL-２画分を得た。得られたIL-２は、5.0×107Ｕ／
mgの比活性を示し、ジスルフィド結合をCys-58-105 間
に有していた。またペレット中に含まれるIL-２ポリペ
プチドからの回収率は、５２％であった。
プチドを含むペレットを３Ｍ塩酸グアニジンを含む０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁し、室温下
空気を通じながら、２４時間撹拌した。遠心分離によっ
て不溶性画分を除去した後、実施例２に記した方法によ
り脱塩，イオン交換クロマトグラフィー，逆相HPLCを行
ないIL-２画分を得た。得られたIL-２は、5.0×107Ｕ／
mgの比活性を示し、ジスルフィド結合をCys-58-105 間
に有していた。またペレット中に含まれるIL-２ポリペ
プチドからの回収率は、５２％であった。
第１図は、インターロイキン２産生微生物の取得経過説
明図である。
明図である。
Claims (1)
- 【請求項１】インターロイキン２ポリペプチドを細胞内
に顆粒状に蓄積している微生物細胞をリゾチームに接触
させる第１工程、リゾチームに接触された細胞を超音波
により破砕する第２工程、破砕物を重力場に置き沈降物
を採取する第３工程、沈降物を１５０μｇ／ｍｌ以下の
インターロイキン２ポリペプチド濃度とし、１．５から
３Ｍのグアニジン水溶液中にて弱い酸化条件に置く第４
工程、及びグアニジン水溶液中に溶解されているインタ
ーロイキン２ポリペプチドを採取する第５工程よりなる
インターロイキン２ポリペプチドの回収方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099262A JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099262A JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61257931A JPS61257931A (ja) | 1986-11-15 |
| JPH0640832B2 true JPH0640832B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=14242791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60099262A Expired - Lifetime JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640832B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| DE3855986T2 (de) * | 1987-05-11 | 1998-02-05 | Chiron Corp | Prozess zur gewinnung von gereinigtem, oxidiertem, renaturiertem, rekombinantem interleukin-2 aus mikroorganismen |
| EP0529086B1 (en) * | 1991-02-26 | 1999-05-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for purifying human bcdf |
| PT1124941E (pt) | 1998-10-28 | 2004-02-27 | Genentech Inc | Processo para recuperar polipeptidos heterologos a partir de celulas bacterianas |
| AU1223600A (en) | 1998-10-28 | 2000-05-15 | Genentech Inc. | Process |
| US6140128A (en) * | 1998-12-23 | 2000-10-31 | Genentech, Inc. | Preparation of calcium phosphate transfectacons |
| US7037673B2 (en) | 2001-07-26 | 2006-05-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Dipeptide production method, L-amino acid amide hydrolase used therein, and production method of L-amino acid amide hydrolase |
| DE60239072D1 (de) | 2001-12-27 | 2011-03-10 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung von glutaminsäurederivaten |
| JP4501688B2 (ja) | 2002-07-26 | 2010-07-14 | 味の素株式会社 | 新規ペプチド生成酵素遺伝子 |
| DE60332026D1 (de) | 2002-08-26 | 2010-05-20 | Ajinomoto Kk | Ubstituierter alpha-ketosäure |
| JPWO2009139392A1 (ja) | 2008-05-12 | 2011-09-22 | 味の素株式会社 | β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR79124B (ja) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| GB8303383D0 (en) * | 1983-02-08 | 1983-03-16 | Biogen Nv | Sequences recombinant dna molecules |
-
1985
- 1985-05-10 JP JP60099262A patent/JPH0640832B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61257931A (ja) | 1986-11-15 |
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