JP2537029B2 - 成長ホルモン放出因子の製造方法 - Google Patents

成長ホルモン放出因子の製造方法

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JP2537029B2
JP2537029B2 JP7143597A JP14359795A JP2537029B2 JP 2537029 B2 JP2537029 B2 JP 2537029B2 JP 7143597 A JP7143597 A JP 7143597A JP 14359795 A JP14359795 A JP 14359795A JP 2537029 B2 JP2537029 B2 JP 2537029B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野及び従来の技術】成長ホルモン放出
因子（ＧＲＦ）と称される一群の物質が最近先端肥大症
患者のすい臓腫瘍から単離されている。Ｇｕｉｌｌｅｍ
ｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１８，５８５，１９８２；
及びＥｓｃｈ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１
８０６，１９８３。
【０００２】幾つかの形のＧＲＦが精製され、そしてそ
れらのアミノ酸配列が決定された。ＧＲＦ−４４はＧＲ
Ｆ−４０の完全なアミノ酸配列を含有し、そしてそのカ
ルボキシ末端において４個のアミノ酸により延長されて
いる。今度はＧＲＦ−４０はＧＲＦ−３７の完全なアミ
ノ酸配列を含有し、そしてそのカルボキシル末端におい
て３個のアミノ酸により延長されている。ペプチドＧＲ
Ｆ２９（Ｊ．Ｒｉｖｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３００，２
７６−８，１９８２）もまた生物学的に活性であること
が示されている。
【０００３】ＧＲＦ−４４のカルボキシ末端（Ｌｅｕ）
のみがアミド化されている（ＧＲＦ−ＮＨ2 −４４）。
ＧＲＦ−ＮＨ2 −４４が成熟ホルモンであり、そしてＧ
ＲＦ−４０，ＧＲＦ−３７及びＧＲＦ−２９はその蛋白
質分解誘導体であると信じられている。但し、上記のす
べてのＧＲＦは生物学的に活性である。ＧＲＦ類は脳下
垂体による成長ホルモンの合成及び放出の両者に対して
作用すると報告されている。Ｓｃｉ．，７９，７９０
９，１９８２；及びＢａｒｉｎｇａ等、Ｎａｔｕｒｅ，
３０６，８４，１９８３。
【０００４】視床下部から単離されたＧＲＦ−４４ペプ
チド（ｈｈＧＲＦ）はすい臓腫瘍に由来するそれ（ｈｐ
ＧＲＦ）と同一であることが示唆されており、そして事
実、ｈｈＧＲＦと、ｈｐＧＲＦに対する抗体との間に免
疫反応性が検出された。さらに、両ペプチドは、ＨＰＬ
Ｃにより分析された場合同一のプロフィールをもたらす
（Ｂｏｈｌｅｍ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１４，９３０，１９８
３）。さらに最近になって、ｈｐＧＲＦ及びｈｈＧＲＦ
が同じアミノ酸配列を有することが証明された（Ｌｉｎ
ｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８
１，４３０２，１９８４）。
【０００５】ｈｐＧＲＦを生産するすい臓腫瘍から単離
されたメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なＤＮＡの
合成及び特徴付けにより、ＧＲＦ−４４は１０７〜１０
８個のアミノ酸を有するプレ−プロホルモンとして生産
され、そしてＧＲＦはアミノ酸残基３２からアミノ酸残
基７５にわたることが証明された（Ｇｕｂｌｅｒ等、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，４３１
１，１９８３；及びＭａｙｏ等、Ｎａｔｕｒｅ，３０
６，８６，１９８３）。
【０００６】ＧＲＦ−４４配列に続くＧｌｙ−Ａｒｇは
典型的なアミド化部位に類似する（Ｂｏｅｌ等、Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊ．，３，９０９，１９８４；Ｂｒａｄｂ
ｕｒｙ等、Ｎａｔｕｒｅ，２９８，６８６，１９８
２）。ＧＲＦは、成長ホルモンによる治療について現在
考えられているほとんどの分野において医療的に使用す
ることができる。このような医療的用途の例には脳下垂
体性小人症、異状な成長ホルモン生産による糖尿病、創
傷、重症の熱傷の治療が含まれる。
【０００７】幾つかの形態のＧＲＦの大きさは、常用の
ペプチド合成法によってその製造が可能なものである。
確かに、幾つかのＧＲＦ誘導体がこれらの手段によって
製造され、そして生物学的に活性であることが見出され
た（Ｍｕｒｐｈｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２，４６９，１９８
３；Ｔｈｏｒｎｅｒ等、Ｌａｎｃｅｔ，１月１／８，２
４，１９８３；Ａｄａｍｓ等、Ｌａｎｃｅｔ，５月１４
１１００，１９８３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ等、Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．，５７，６７７，１９
８３）。さらに端末アミノ酸にアミド化されたカルボキ
シを有するペプチドを合成することが可能である。しか
しながら、化学的手段によるＧＲＦ−４４の製造は非常
に高価であり、そして組換ＤＮＡ技法によるペプチドの
製造が一層便利であると考えられる。
【０００８】ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．・０１０８
３８７は、メチオニンのコドンにより先行される種々の
形態のＧＲＦをコードする合成ＤＮＡ分子の製造を記載
しており、このメチオニンのコドンは、該ＤＮＡ分子が
適当なベクターに挿入された後の適当な微生物によるメ
チオニン化ＧＲＦの直接合成を可能にする。適当な配列
で連結された場合にＧＲＦペプチドのそれぞれアミノ端
及びカルボキシ端をコードする２つの２本鎖ＤＮＡ分子
をもたらす２系列のオリゴデオキシリボヌクレオチド断
片の製造方法が記載されている。
【０００９】２個の２本鎖ＤＮＡ分子が一緒に連結され
て目的とするＧＲＦ構造遺伝子が得られる。好ましい発
現ベクターは、バクテリオファージλＤＮＡから単離さ
れそしてｔｅｔR 遺伝子及びａｍｐR 遺伝子の間に挿入
されたＰL プロモーターを含有するプラスミドｐＢＲ３
２２の誘導体である。ＧＲＦ分子のＮ末端における追加
のアミノ酸メチオニンの存在が、特に長い治療期間にお
ける不所望の免疫反応の可能性を生じさせる。
【００１０】
【発明の目的】この発明は、組換ＤＮＡ技法により得ら
れるハイブリドポリペプチドによるＧＲＦの製造、及び
そのために使用される材料に関する。このハイブリドポ
リペプチドは、アミノ酸Ｔｒｐを介してＧＲＦのアミノ
酸配列に連結されたＴｒｐＥのアミノ酸１−３２３を含
む。還元及びカルボキシアミドメチル化、Ｔｒｐ残基の
特異的開裂、並びにこれに続くゲル濾過及びＨＰＬＣに
よるＧＲＦの精製により非アミド化ＧＲＦが得られる。
【００１１】従って、この発明は、Ｅ．コリＴｒｐプロ
モーター／オペレーター、Ｔｒｐリーダー及びアテヌエ
ーター、ＴｒｐＥ遺伝子のリボゾーム結合部位、Ｔｒｐ
Ｅポリペプチドの最初の３分の２をコードするＤＮＡ、
Ｔｒｐコドン、並びにＧＲＦペプチドをコードする遺伝
子の使用に基いて、プラスミドによりコードされたハイ
ブリドポリペプチドとしてＧＲＦを製造するための方法
を提供することを目的とする。
【００１２】この発明の他の目的は、ＤＮＡ分子の合成
を提供することであり、このＤＮＡ分子は、ＧＲＦのコ
ード配列、並びにこれに先行するＴｒｐのためのＴＧＧ
コドン、及び正しいリーディングフレームを維持しなが
らＴｒｐＥ構造遺伝子を担持するプラスミド内に前記の
ＤＮＡ分子を挿入することを可能にするヌクレオチド配
列を含む。
【００１３】この発明の他の目的は、高品質のハイブリ
ドＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの合成を行うためにこ
の発明のプラスミドを含有する微生物を増殖せしめる方
法を提供することである。この発明の他の目的は、ハイ
ブリドポリペプチドの抽出のため及び一連の段階を通し
て目的とするＧＲＦペプチドを分離するための方法を提
供することである。
【００１４】この発明のこれらの及びその他の目的は、
以下の詳細な記載から明らかになるであろう。ＧＲＦ−
４４のＤＮＡ分子上には幾つかの制限酵素部位が存在す
るため、この発明の他の面を構成する他の３種類の分
子、すなわちＧＲＦ−４０，ＧＲＦ−３７、及びＧＲＦ
−２９ペプチドをコードするＤＮＡ分子を導くことがで
きる。
【００１５】事実、ＤＮＡ分子をＮａｒＩ制限酵素で分
解し、そして次のオリゴヌクレオチド：
【００１６】
【化１】
【００１７】により３′−末端断片を置き換えてＧＲＦ
−４０をコードするＤＮＡを生じさせることができる。
ＧＲＦ−３７をコードするＤＮＡ分子は次のようにして
得ることができる。 ａ）図１に示すＤＮＡをＢｓｔＸＩ制限酵素で分解し
て、次の３′−末端：
【００１８】
【化２】
【００１９】を生じさせ； ｂ）単鎖テイルをＳ１エキソヌクレアーゼにより除去
し；そして、 ｃ）次のオリゴヌクレオチド：
【００２０】
【化３】
【００２１】を３′−末端に付加して３７番目のコドン
を再生する。図１に示すＤＮＡ分子をＸｂａＩ制限酵素
で分解し、そして３′−末端を次のオリゴヌクレオチ
ド：
【００２２】
【化４】
【００２３】で置き換えることにより、ＧＲＦ−２９を
コードするＤＮＡ分子が得られる。プラスミドｐＳＰ１
９の造成、及びプラスミド由来ＴｒｐＥ−ＧＲＦ−４４
ハイブリドポリペプチドの製造は、次のようにして達成
される。
【００２４】（１）プラスミドｐＳＰ２の造成 ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２，９５−１１３，１９７７）及びλＥＤ１０ｆ（Ａｒ
ｍｓｔｒｏｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，１７２，
１９７７；及びＨｅｌｉｎｓｋｉ等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｔｅｎｔｈ Ｍｉｌｅｓ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９７７，１５１−１６５）
から出発してｐＳＰ２を造成した。λＥＤ１０ｆは、プ
ロモーターからＴｒｐＤ構造遺伝子に延びるＥ．コリＴ
ｒｐオペロンＤＮＡ源として使用した。
【００２５】ｐＢＲ３２２及びλＥＤ１０ｆをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIII 制限酵素により消化した。Ｔｒｐオ
ペロン制限機能部、完全ＴｒｐＥ構造遺伝子及びＴｒｐ
Ｄ構造遺伝子の５′−端を担持するλＥＤ１０ｆからの
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼにより、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ大
断片と連結した。この連結混合物を用いてＥ．コリＷ３
１１０ΔＴｒｐ Ｅ５／ｔｎａ２細胞（Ｎｉｃｈｏｌｓ
及びＹａｎｏｇｓｋｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１０１，１５５，１９８３）を形質転換し
た。
【００２６】形質転換処理された細胞をトリプトファン
を欠く最少培地プレート上にプレートした。１つのＴｒ
ｐ+ クローンをｐＳＰ２組換体ＤＮＡプラスミド源とし
て使用した。このクローンの細胞を、５０μｇ／mlのア
ンピシリン（Ａｐ）を添加した富培地中で増殖せしめ、
そして貯蔵した。ｐＳＰ２の制限地図を図２に示す。こ
こで、太い線で示されるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片
はＥ．コリＴｒｐ機能部を担持し、そしてλＥＤ１０ｆ
に由来するものであり、他方、他のＤＮＡはｐＢＲ３２
２に由来する。
【００２７】（２）プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌの造成 プラスミドｐＳＰ２のＤＮＡをＢｇｌIIエンドヌクレア
ーゼにより消化し、そして大断片をアガロースゲル電気
泳動により精製し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより
自己連結した。この連結混合物を用いてＷ３１１０ΔＴ
ｒｐ Ｅ５／ｔｎａ２細胞を形質転換した。ＡｐR 形質
転換体を５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するニュト
リエント・アガー（ディフコ）上で選択した。１個のＡ
ｐR クローンをｐＳＰ２ｄｅｌのＤＮＡの入手源として
使用した。この制限地図を図３に示す（詳しくは図２の
説明を参照のこと）。
【００２８】ＴｒｐＥ構造遺伝子からのＢｇｌII断片の
除去が、酵素活性を喪失した部分的ＴｒｐＥポリペプチ
ドの発現をもたらす。従って、ｐＳＰ２ｄｅｌを担持す
るＷ３１１０ΔＴｒｐＥ５ ｔｎａ２細胞はトリプトフ
ァンの存在下で増殖せしめなければならない。ｐＳＰ２
ｄｅｌ中のＢｇｌII部位の連結が蛋白質合成の新しい終
止コドンを形成する（Ｎｉｃｈｏｌｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｏｉｌ．１４６，４５−５４，１９８１）。
【００２９】こうして、ｐＳＰ２ｄｅｌ由来部分Ｔｒｐ
Ｅ（ΔＴｒｐＥ）は３４２個のアミノ酸を含有し、これ
に対してプラスミドｐＳＰ２によりコードされる全蛋白
質は５２０個のアミノ酸を含有する（図３を参照のこ
と）。
【００３０】（３）Ｔｒｐ−ＧＲＦ−４４遺伝子のクロ
ーニング ｐＳＰ２ｄｅｌをＢｇｌII及びＢａｍＨＩ制限酵素で分
解し、そして大断片をアガロースゲル電気泳動により精
製した。このＤＮＡを合成Ｔｒｐ−ＧＲＦ−４４コード
ＤＮＡ分子（図１を参照のこと）と混合し、そしてＴ４
ＤＮＡリガーゼと反応せしめた。
【００３１】図４は、プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌ中に合
成遺伝子を挿入することによるｐＳＰ１９プラスミドの
造成を示す。ＴｃS はテトラサイクリンに対する感受性
を示す。連結混合物を使用してＷ３１１０ΔＴｒｐＥ／
ｔｎａ２細胞を形質転換し、そして５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含有するプレート上でＡｐR クローンを選択
する。テトラサイクリンに対して感受性（ＴｃS ）であ
る１つのＡｐR クローンをｐＳＰ１６ ＤＮＡ源として
使用した。
【００３２】Ｔｒｐ ＧＲＦ ４４遺伝子のヌクレオチ
ド配列は、部分的ＴｒｐＥとＧＲＦ４４がトリプトファ
ン残基により分離されているハイブリドポリペプチドの
合成を可能にする。Ｔｒｐは、後で記載するようにヨー
ドソ安息香酸により分解され得る。ｐＳＰ１９プラスミ
ドＤＮＡによりコードされるハイブリドＤＮＡは図５に
示すアミノ酸配列を有し、そしてＴｒｐＥ−ＧＲＦとし
て示される。最初の３２３アミノ酸はＴｒｐＥの３分の
２を示し、これにＴｒｐ残基及びＧＲＦ ４４のアミノ
酸配列が続く。従ってＴｒｐＥ−ＧＲＦは３６８個のア
ミノ酸から成る。
【００３３】ＴｒｐＥ−ＧＲＦ−４４ハイブリド蛋白質
の製造 Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５ｔｎａ２（ｐＳＰ１９）株 、
３００mlのＳＭＭ（スピッツアー最少培地）中で一夜増
殖せしめた。この培地は１ｌ当り次の成分： (ＮＨ4)2 ＳＯ4 ２ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ６ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 １４ｇ Ｎａ．シトレート．２Ｈ2 Ｏ １ｇ ＭｇＳＯ4 ０．２ｇ を含有する水溶液である。オートクレーブにより殺菌し
た後、１０mlの４０％グルコース、及び３．５μｇ／ml
のインドールを加える。
【００３４】培養物（約４．３×１０8 細胞／ml）を１
０ｌの同じ培地中に希釈し、そして細胞を攪拌、及び１
分間当り１気圧の空気１ｌの吹込のもとで増殖せしめ
た。１０ｌの発酵槽中の培地の組成及び増殖条件は、Ｔ
ｒｐオペレーターを担持するｐＳＰ１９を抑制解除状態
に維持し（従って、ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの発
現を可能にし）そしてさらに細胞の増殖を可能にするの
に理想的であることが証明された。２２〜２５時間の増
殖の後、培養物は５９０nmにおける約３．０の０Ｄに達
した。遠心分離により集菌し、そして−８０℃にて貯蔵
した。この細胞のサンプルを使用したポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により蛋白質の分析を行い、目的とする
ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの存在が証明された。
【００３５】ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドの精製 凍結した細胞を、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
６），０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ ＣＨ3 ＣＯＯ
Ｍｇ，０．０１Ｍ β−メルカプトエタノール及び５％
グリセリンを含む緩衝液中で解凍した。アルミナの存在
下で細胞を破砕し、そして細胞破片を遠心除去した。水
相を水で４倍に希釈し、そして最終溶液１ｌ当り１４４
ｇの (ＮＨ4)2 ＳＯ4 を添加することによりハイブリド
蛋白質を沈澱せしめた。沈澱した蛋白質を遠心分離によ
りペレット化し、水に溶解し、そして１０mM ＮＨ4 Ｈ
ＣＯ3 に対して十分に透析した。次に透析物をＰＡＧＥ
で分析し、そして凍結乾燥した。
【００３６】ＴｒｐＥ−ＧＲＦハイブリドポリペプチド
からのＧＲＦ−４４の分離 ＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを下記の一連の化学反応
にかけＧＲＦペプチド成分を分離した。（１）Ｃｙｓ残基の還元及びカルボキシアミドメチル化 還元及びカルボキシアミドメチル化の条件はＧ．Ａｌｌ
ｅｎの報告、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｌｃｈｉｎｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Vol ９，２８頁、
Ｔ．Ｓ．Ｗｏｒｋ及びＲ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，１９８１から採用した。
【００３７】あらかじめ調製しそして凍結乾燥したＴｒ
ｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，０．１％ ＥＤＴＡ及び６Ｍグアニジン−ＨＣｌ
（pH８．５）を含む緩衝液中に溶解した。最終蛋白質濃
度は２％であった。次に、ＤＴＴを蛋白質中のＣｙｓ含
量より１５倍高い濃度に加えた。次に、混合物を５０℃
にて２時間インキュベートし、そして次にヨードアセタ
ミドをＤＴＴ濃度の２倍加えた。暗中室温にて３０分間
インキュベートした後、β−メルカプトエタノールを添
加することにより反応を停止した。次に反応混合物を水
に対して２時間、そして１０mM ＮＨ4 ＨＣＯ3 に対し
て一夜透析した。次に、カルボキシアミドメチル化され
たＴｒｐＥ−ＧＲＦポリペプチドを含有するこの材料を
凍結乾燥した。
【００３８】（２）ヨードソ安息香酸反応 使用した方法は、Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ等、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２０，６９９７，１９８１により記載さ
れたものと実質上同一である。５mgのヨードソ安息香酸
を３７５μｌの４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、８０％酢酸に
溶解した。この溶液に７．５μｌのｐ−クレゾール及び
次に５mgのカルボキシアミドメチル化ＴｒｐＥ−ＧＲＦ
を溶解した。室温にて暗中２０時間反応を行った。次に
７５０μｌの水を加え、そして１０分間の後、混合物を
１２，０００ｇにて５分間遠心分離した。水相はペプチ
ド、特にＧＲＦ−４４を含有する。
【００３９】（３）ＧＲＦ−４４の精製 前に得られた水溶液を、５％酢酸に対して平衡化した１
×５０cmセファデックスＧ−２５カラムを通してゲル濾
過することにより脱塩した。流速は約３ml／時であっ
た。排除された材料を回収し、そして蒸発によりその容
積を減少せしめた。こうして得られた濃縮液をＥｔ3 Ｎ
によりpH３．５にした１０mM Ｈ2 ＰＯ4で平衡化した
Ｃ１８カラムを用いてＨＰＬＣにより分析した。
【００４０】ペプチドをアセトニトリルで溶出し、そし
て画分に集め、次にこの画分をＲＩＡにより分析した。
この結果は主ピーク中に免疫活性が存在することを示し
た。ＴｒｐＥ−ＧＲＦ ４０，ＴｒｐＥ−ＧＲＦ３７及
びＴｒｐＥ−ＧＲＦ２９ハイブリドポリペプチド並びに
対応するＧＲＦ ４０，ＧＲＦ ３７及びＧＲＦ ２９
ペプチドは、ＴｒｐＥ−ＧＲＦ ４４及びＧＲＦ ４４
の製造について上に記載したのと同様の方法により得る
ことができる。
【００４１】記載されたプラスミドを含有するＷ３１１
０ΔＴｒｐＥ５ｔｎａ２細胞はＡＴＣＣに寄託された。 Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ２） Ａ
ＴＣＣ ５３０５６ Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ２−ｄｅ
ｌ）ＡＴＣＣ ５３０５８ Ｗ３１１０ΔＴｒｐ Ｅ５ ｔｎａ２（ｐＳＰ１９）Ａ
ＴＣＣ ５３０５４。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＧＲＦ−４４をコードする遺伝子のヌク
レオチド配列を示す。このＤＮＡ分子は構成ブロックと
してジヌクレオチドを使用しそして固体支持体としてポ
リスチレンを用いる固相ホスホトリエステル法により化
学的に合成されたものである。ＢｇｌII，ＸｂａＩ，Ｂ
ｓｔＸＩ、及びＢａｍＨＩはこれらの制限エンドヌクレ
アーゼにより認識される部位を示す。Ｓｔｏｐは蛋白質
合成の終止のためのコドンを示す。この図はさらにＧＲ
Ｆ−４４の全アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ｐＳＰ２プラスミドベクターの制限地
図であり、ここで細線はｐＢＲ３２２のＤＮＡを示し；
太線はＴｒｐプロモーター／オペレーター、Ｔｒｐリー
ダー配列（ＴｒｐＬ）、完全ＴｒｐＥ構造遺伝子及び部
分的ＴｒｐＤ構造遺伝子（ΔＴｒｐＤ）を担持するＥ．
コリ染色体ＤＮＡを示し；ＡｐR 及びＴｃR はそれぞれ
アンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性を付与
する遺伝子を示し；そして "Ｏｒｉ" はこのプラスミド
の複製開始点である。
【図３】図３は、プラスミドｐＳＰ２からのプラスミド
ｐＳＰ２ｄｅｌの造成を示すフローチャートであり、Δ
Ｅは不完全なＴｒｐＥ構造遺伝子を示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＳＰ２ｄｅｌからのプラ
スミドｐＳＰ１９の造成を示すフローチャートである。
【図５】図５は、ＴｒｐＥ部位の全アミノ酸配列及びＧ
ＲＦの最初の５個のアミノ酸を示すＴｒｐＥ−ＧＲＦハ
イブリドポリペプチドのアミノ酸配列の模式的構造を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ステファノ ビラ イタリア国，ローマ，ビア オスラビア 37 (72)発明者 シルビア ドニニ イタリア国，ローマ，エル．ゴ デクリ オルシ 22

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）のＮ−
    末端にトリプトファン（Ｔｒｐ）を介してＴｒｐＥペプ
    チドのＣ−末端が結合しているハイブリドポリペプチド
    のＣｙｓ残基を還元しそしてカルボキシアミドメチル化
    し、そして次に、ＴｒｐＥのアミノ酸配列及びＧＲＦの
    アミノ酸配列を連結しているＴｒｐ残基を開裂せしめる
    ことを含んで成るＧＲＦの製造方法。
  2. 【請求項２】 前記還元及びカルボキシアミドメチル化
    をグアニジンに溶解した前記ハイブリドポリペプチドに
    対して行い、そして前記開裂をヨードソ安息香酸を用い
    て行う請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 生成物をゲル濾過にかけ、次にＨＰＬＣ
    によってＧＲＦを精製する請求項１又は２に記載の方
    法。
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