JP2549504B2 - Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規な合成DNA塩基配列、これを含むβウロ
ガストロン分泌発現ベクター及び該ベクターで形質転換
した微生物に関する。
従来の技術 遺伝子工学的手法を用いて、インターフエロン、成長
ホルモン等を始めとする様々なポリペプチドを大腸菌、
枯草菌、酵母等の宿主細胞の利用により製造する方法は
既に確立されている。しかしながら確立された方法とい
えども未だ幾つかの未解決の問題点を有しており、天然
品と全く同一のポリペプチドを製造することは必ずしも
容易ではない。上記問題点の中で最も重要なもののひと
つとしては、ポリペプチドのＮ末端を、天然品と同一の
構造とするのが困難なことを挙げることができる。即
ち、之等のポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞
内で直接発現させるとき、遺伝子からポリペプチドへの
翻訳は、通常開始コドン（ATG）から始まるため、発現
されるポリペプチドのＮ末端は、ホルミルメチオニン残
基となつてしまう。天然型ポリペプチドのＮ末端がホル
ミルメチオニンである場合は少なく、他のＮ末端を有す
るポリペプチドの製造にはこの方法は利用できない。上
記ホルミルメチオニン残基は、シアノゲンブロマイドを
用いた化学反応によりポリペプチドから除去することが
できるが、ポリペプチドがＮ末端の他にもメチオニン残
基を有する場合、上記方法ではポリペプチド鎖自体が該
個所で切断されてしまい、やはり目的のポリペプチドは
製造できない。
また目的ポリペプチドをコードする遺伝子を、他のポ
リペプチドをコードする遺伝子と結合させて、融合ポリ
ペプチドとして発現させる方法も知られている。この方
法では、得られる融合ポリペプチドからの目的ポリペプ
チドの分離は、トリプシン等の酵素による処理やシアノ
ゲンブロマイド等を用いた化学的処理によつている。し
かしながらこの方法においても目的のポリペプチド鎖内
に使用する酵素又は化学薬品の標的となるアミノ酸が存
在すれば、その個所でペプチド鎖が切断され、結局目的
ポリペプチドは製造はできない。また、上記方法により
融合ポリペプチドからの目的ポリペプチドの分離が可能
な場合といえども、目的ポリペプチドの単離のために
は、通常菌体粗抽出液から融合ポリペプチドを分離する
工程及び融合ポリペプチドを切断した反応組成物から目
的ポリペプチドを分離する工程の２回の精製操作が必要
となり、その操作及び工程自体煩雑となり、しかも目的
物の収率の低下は避けられない。
以上のように、天然型と全く同一のポリペプチドを遺
伝子工学的手法で入手することは、従来非常に困難であ
り、この天然型と全く同一のポリペプチドを宿主細胞か
ら直接製造できる改良された方法の研究開発が、斯界で
要望されている現状にある。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、上記斯界で要望されている天然型と全く同
一のポリペプチドを宿主細胞から直接製造できる改良さ
れた方法を提供することを目的とする。また本発明は、
該方法の実施のための新しいベクター及び該ベクターを
保有する微生物を提供することをもその目的としてい
る。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、大腸菌βラクタマーゼシグナルペプ
チドをコードする新規な合成DNA塩基配列、これを含む
βウロガストロン分泌発現ベクター（以下の本明細書に
おいては、「ポリペプチド分泌発現用ベクター」及び
「成熟ポリペプチド分泌発現ベクター」ということがあ
る）及び該ベクターで形質転換した微生物が提供され
る。
本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関し
て略号で表示する場合はＩ UPAC、IUBの規定或いは当
該分野における慣用記号に従うものとし、その例を次に
挙げる。
Ｓer；セリン Ｌeu；ロイシン Ａrg；アルギニン Ｃys；システイン Ｇln；グルタミン Ｉle；イソロイシン Ｐro；プロリン Ｖal；バリン Ｈis；ヒスチジン Ｍet；メチオニン Ａla；アラニン Ｐhe；フエニルアラニン Ｇly；グリシン Ａsp；アスパラギン酸 Ａsn；アスパラギン Ａ ；アデニン Ｔ ；チミン Ｇ ；グアニン Ｃ ；シトシン シグナルペプチドとは、細胞内で生産されたポリペプ
チドを細胞外に分泌する働きをするアミノ酸配列であ
る。一般に微生物に限らず全ての細胞の生産するポリペ
プチドには、細胞内に留まつてその働きをなすものと、
細胞外に分泌されるものとがある。この細胞外に分泌さ
れるポリペプチドでは、まず、そのＮ末端に十数個乃至
数十個のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドが付加
された前駆体として細胞内に生産され、次いで該前駆体
はその有するシグナルペプチドの作用により該シグナル
ペプチドを介して細胞膜を通過すると同時にシグナルペ
プチダーゼの作用によりシグナルペプチドが切り離さ
れ、その結果一切の不要アミノ酸を持たない目的ポリペ
プチドのみが細胞外に分泌される（以下、このように細
胞外に分泌される目的ポリペプチドを「成熟ポリペプチ
ド」という。例えば、大腸菌のβラクタマーゼは、菌体
内でβラクタマーゼ前駆体、即ちβラクタマーゼと23個
のアミノ酸からなるシグナルペプチドとの融合蛋白質と
して生産された後、該シグナルペプチドの作用により細
胞膜を通過してペリプラズム、即ち細胞膜と外膜との間
の空間に分泌され、その際、シグナルペプチドは、シグ
ナルペプチダーゼにより切断され、ペリプラズム内には
成熟ポリペプチド、即ち活性型のβラクタマーゼが蓄積
されることが知られている〔J.G.Sutcliffe,Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA,75， 3737−3741（1987）〕。
本発明者らは、上記シグナルペプチドの特性に着目
し、該シグナルペプチドを利用して、目的とする外来蛋
白質をシグナルペプチドとの融合ポリペプチドとして宿
主細胞内で生産させるときには、外来蛋白質のみが細胞
外に成熟ポリペプチドとして分泌され、かくして目的ポ
リペプチドを容易に製造入手し得るとの着想から鋭意研
究を重ねた。その結果、実際に宿主細胞内に導入するこ
とによつて、目的ポリペプチドを成熟ポリペプチドとし
て細胞外に分泌させ得る新しいベクター（プラスミド）
及び該ベクターのためのポリペプチド分泌発現用ベクタ
ーの構築に成功すると共に、このベクターの利用による
目的ポリペプチドの製造に成功した。
本発明のポリペプチド分泌発現用ベクターは、目的ポ
リペプチドをコードするDNA塩基配列を直接連結できる
ように設計されたシグナルペプチドをコードするDNA塩
基配列を保有している。従つて該ベクターには、そのシ
グナルペプチドをコードするDNA塩基配列に直接目的ポ
リペプチドをコードするDNA塩基配列を連結させること
ができ、かくして得られる発現ベクターは、これを宿主
細胞に導入して形質転換させることにより、該宿主細胞
の培養によつて細胞外又はペリプラズムに目的ポリペプ
チドを成熟ポリペプチドとして分泌生産させることがで
きる。
以下、本発明ベクターの製造技術につき詳述する。
本発明ベクターの分泌構成要件とするシグナルペプチ
ドをコードするDNA塩基配列は、後記式（３）に示すDNA
塩基配列を有しており、これは下式に示すアミノ酸配列
の大腸菌シグナルペプチドをコードする配列を含んでい
る。
Met−Ser−Ile−Gln−His−Phe−Arg− Val−Ala−Leu−Ile−Pro−Phe−Phe− Ala−Ala−Phe−Cys−Leu−Pro−Val− Phe−Ala （１） また、該シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列
は、本発明者等が独自に合成したものであり、下式
（２）に示すものである。
ATGAGTATTCAACATTTCCGT GTCGCCCTTATTCCCTTTTTT GCGGCCTTTTGCCTTCCTGTC TTCGCG （２） また本発明ベクターに保有されるシグナルペプチドを
コードするDNA塩基配列は、上記のごとき具体的DNA塩基
配列を基本として、その３′側付近、即ちこれに目的ポ
リペプチドが連結される側付近、好ましくはその10塩基
以内に、又はこれに更に10塩基以内のDNA配列を付加し
てこの付加部分に、制限酵素認識配列を含ませるものと
する。これは上記シグナルペプチドをコードするDNA塩
基配列と、目的ポリペプチドをコードするDNA塩基配列
とを直接連結させるために、必須のものである。しかし
てこの制限酵素認識配列を認識する酵素としては、公知
の制限酵素のいずれでもよいが、好ましくは５塩基以上
の塩基配列を認識するものがよく、この酵素に応じて上
記３′側付近のDNA塩基配列は、任意に変化させること
ができる。
例えば、上記シグナルペプチドＣ端の２つのアミノ酸
配列を構成するPhe−Alaをコードする塩基配列として、
TTCGCGを選択する場合、その３′側に更にアデニン塩基
（Ａ）を連結させて得られるTTCGCGAの７塩基配列のう
ち、TCGCGAは制限酵素NruIにより認識され、この中央で
切断され、これにより得られるDNA塩基配列は、その
３′末端がTTCGとなる。シグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列として、この塩基配列を利用するときに
は、これと連結すべき目的ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列の５′側に、更にCT、CC、CA又はCGの２塩基
配列を付加することにより、所望の融合ポリペプチドを
コードするDNA塩基配列が得られる。
更に例えば、上記シグナルペプチドをコードするDNA
塩基配列の３′側に、AACTCAGCTGの10塩基配列を連結さ
せれば、この配列中、CAGCTGの６塩基配列は、PvuIIに
より認識され、その中央で切断される。かくして得られ
るDNA塩基配列は、シグナルペプチドをコードするDNA塩
基配列の３′側に、更にAACTCAGの７塩基配列が結合さ
れたものであり、この７塩基配列のうち、最初の３塩基
配列AACはAsnをコードしており、次の３塩基配列TCAはS
erをコードしており、最後のグアニン（Ｇ）は、Ala、G
ly、Val、Asp又はGlnをコードするコドンの第一塩基で
ある。従つてこれを、シグナルペプチドをコードするDN
A塩基配列として用いるときには、例えばβウロガスト
ロン等のようにＮ末端アミノ酸がAsn−Ser−Aspである
ポリペプチドをコードするDNA塩基配列からその５′側
の７塩基配列（例えばAACTCAG）を除いたDNA塩基配列を
結合させることによつて所望の融合ポリペプチド（βウ
ロガストロンとシグナルペプチドとの融合ポリペプチ
ド）をコードするDNA塩基配列を容易に形成させること
ができる。
従つて、本発明ベクターの構成要素とするシグナルペ
プチドをコードするDNA塩基配列としては、前記に具体
的に例示したDNA塩基配列の他に、例えばこれに更に10
個以内のDNA塩基配列を付加させたものをも、好ましい
ものとして利用することができる。その一具体例は、上
記した10塩基配列を付加させた下記式（３）に示すDNA
塩基配列を有するものである。
ATGAGTATTCAACATTTCCGT GTCGCCCTTATTCCCTTTTTT GCGGCCTTTTGCCTTCCTGTC TTCGCGAACTCAGCTG （３） 本発明における上記シグナルペプチドをコードするDN
A塩基配列又はこれを含む塩基配列は、従来公知の各種
の方法、例えばこれを含有する微生物、それから単離さ
れたプラスミド等、好ましくは例えばpBR322等から制限
酵素等を利用して切断単離する方法、そのDNA塩基配列
に従い化学合成する方法、之等の方法の組合せ等により
容易に製造することができる。また上記シグナルペプチ
ドをコードするDNA塩基配列と、目的ポリペプチドをコ
ードするDNA塩基配列との連結乃至結合手段も、従来公
知の各種方法、例えばT4DNAリガーゼ等を用いる酵素反
応等に従うことができる。
上記のごとくして得られるシグナルペプチドをコードす
るDNA塩基配列を含む本発明ベクターは、該DNA塩基配列
を、例えばプラスミド、ウイルスDNA、コスミド〔例え
ばpJB8、Ish−Horowicz,D and Burke,J.F.,Nucleic Aci
ds Res.,９,2989（1981）〕等の従来より外来遺伝子の
クローニングに用いられている各種のベクターに組込む
ことにより得られる。このDNA塩基配列の組込みのため
に好適な起源ベクターの具体例としては、上記したプラ
スミドp BR322の他、例えば以下のものを例示できる。
プラスミドp TUB4〔バチルス・ズブチリス由来のα−
アミラーゼのシグナルペプチド、H.Yamazaki et al.,J.
Bacteriol.,156,327−337（1983）〕、 プラスミドp HC5〔エシエリヒアコリー由来のマルト
ース結合蛋白のシグナルペプチド、H. Bedouelle et al.,Nature,285,78−81（1980）〕、 プラスミドp SN518〔エシエリヒアコリー由来のリン
酸結合蛋白のシグナルペプチド、K. Magota et al.,J.Bacteriol.,157， 909−917（1984）〕、 プラスミドp JP12〔エシエリヒアコリー由来のリン酸
制限下に誘導される外膜蛋白のシグナルペプチド、N.Ov
erbeeke et al.,J.Mol. Biol.,163,513−532（1983）〕等。
上記起源ベクターへのシグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列の導入操作は、従来よりこの種外来遺伝子
をベクターに組込む際に用いられているこれら操作に従
うことができる。その例としては、前述した通りであ
る。
また上記のごとくして得られる本発明のシグナルペプ
チドをコードするDNA塩基配列を含むポリペプチド分泌
発現用ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して目
的ポリペプチドを分泌発現させるためには、これに目的
ポリペプチドをコードするDNA塩基配列をさらに導入し
なければならないことは勿論のこと、他にプロモータ
ー、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結
因子等の転写調節因子や翻訳調節因子等を含んでいなけ
ればならない。これらの各因子は、既に起源ベクターに
含まれている場合があり、この場合には該起源ベクタ
ー、例えばpBR322由来のβラクタマーゼの調節因子等を
そのまま用いることができる。これに限定されることな
く、従来公知の他の微生物又はウイルス由来の各種DNA
もまた通常これらの調節因子を含んでおり、従つてこれ
らを用いることもできる。その例としては、例えば大腸
菌ラクトースオペロン、トリプトフアンオペロン、λフ
アージのPL等のプロモーター、βガラクトシダーゼのSD
配列等のリボゾーム結合部位、λフアージのL1等の転写
終結因子等を例示できる。また翻訳停止シグナルとして
は、TAA、TAG及びTGAの３通りの塩基配列を利用でき
る。更に上記調節因子は、これらを含むDNAより常法に
従い取り出した後、必要なものを適用なベクターに通常
の方法に従い導入することもできる。
特に好ましい上記調節因子と、シグナルペプチドとを
保有する本発明ベクターの一具体例としては、pBR322を
起源ベクターとして構築されたpGH54及びpGH55を例示で
きる。これらのプラスミドの内でpGH54は、βラクタマ
ーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続いてβ
ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードするDNA塩基
配列を有し、この塩基配列の３′末端にNruI及びPvuII
の制限酵素認識配列を有するものである。その特性は、
その製造概略操作と共に第２図に示した通りである。第
２図より、pGH54は図示された制限酵素開裂地図により
特徴付けられる。また該pGH54の大きさは、1.0％アガロ
ースゲル電気泳動による測定の結果、約3.9Kbである。
このプラスミドpGH54を保有する大腸菌HB101株は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH
54〕」なる表示で、微工研条寄第679号（FERM BP−67
9）として寄託されている。
またpGH55は、βラクタマーゼのプロモーター及びリ
ボゾーム結合部位に続いてβラクタマーゼのシグナルペ
プチドをコードするDNA塩基配列を有している点におい
てpGH54と共通するが、該pGH54における第２のPvuII制
限サイトを含む約0.64KbのDNAを欠くものであり、第１
のPvuII制限サイトをシグナルペプチドをコードするDNA
塩基配列の３′末端付近に有している。その特性は、そ
の製造概略操作と共に第３図に示した通りである。
第３図より、pGH55は図示された制限酵素開裂地図に
より特徴付けられ、その大きさは、上記方法に従い測定
した結果、約3.3Kbである。このプラスミドpGH55を保有
する大腸菌HB101株は、通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に「HB101〔pGH55〕」なる表示で、微工研
条寄第680号（FERM BP−680）として寄託されている。
上記各種の調節因子を含み、且つシグナルペプチドを
コードするDNA塩基配列とこれに直接結合された目的ポ
リペプチドをコードするDNA塩基配列とを有する本発明
のポリペプチド分泌発現ベクターは、上記した本発明ベ
クターと同様にして構築され、本発明はかかる成熟ポリ
ペプチド分泌発現ベクターをも提供するものである。
本発明のこの成熟ポリペプチド分泌発現ベクターに、
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列と連結され
て融合ポリペプチドをコードするDNA塩基配列として保
有されるポリペプチド及びそのDNA塩基配列としては、
βウロガストロン及びこれをコードするDNA塩基配列を
選択する。
上記ポリペプチドのDNA塩基配列と、シグナルペプチ
ドのDNA塩基配列との連結は、例えばシグナルペプチド
のDNA塩基配列を保有する本発明のポリペプチド分泌発
現用ベクターに、上記ポリペプチドのDNA塩基配列を、
前述した方法に従い制限酵素を用いる酵素反応及び例え
ばT4リガーゼを用いる酵素反応を利用して導入すること
により実施できる。また、予め上記ポリペプチドとシグ
ナルペプチドとの融合ポリペプチドのDNA塩基配列を化
学合成した後、このDNA塩基配列を、前記シグナルペプ
チドのDNA塩基配列の導入と同様にして、ベクターに導
入することによつても行なうことができる。
かくして融合ポリペプチドをコードするDNA塩基配列
を保有する本発明のポリペプチド分泌発現ベクターを得
ることができる。これは、上記融合ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列の前にプロモーター及びリボゾーム
結合部位を有し、かつ上記塩基配列を構成する目的ポリ
ペプチドのDNA塩基配列の直後に翻訳停止シグナルを有
しており、適当な宿主細胞に導入することにより、該細
胞を形質転換してポリペプチド分泌発現型とすることが
できる。
上記ポリペプチド分泌発現ベクターの好ましい一具体
例としては、pUG201を例示できる。該pUG201は、βラク
タマーゼのプロモーター、リボゾーム結合部位、βラク
タマーゼのシグナルペプチドのDNA塩基配列、βウロガ
ストロン（目的ポリペプチド）のDNA塩基配列及びその
翻訳停止シグナルが正確にこの順序で配列されたDNA塩
基配列を有している。その配列は、後記実施例において
第４表として示した通りである。該ベクター（プラスミ
ド）pUG201を保有する大腸菌HB101株は、「HB101〔pUG2
01〕」なる表示で、微工研条寄第681号（FERM BP−68
1）として寄託されている。
本発明のポリペプチド分泌発現ベクターの宿主細胞へ
の導入は、公知の各種方法に従つて行なうことができ、
用いられる宿主細胞としても特に限定はなく、公知の各
種のものでよい。この宿主細胞として利用されるものと
しては、例えば大腸菌等のグラム陰性細菌、枯草菌等の
グラム陽性細菌、放線菌、酵母等を例示できる。これら
の内で特に大腸菌K12株由来のHB101株は好ましい。之等
の宿主細胞はいずれも菌体外分泌成分、、外膜構成成分
等の、細胞の正常な機能維持に必要なポリペプチドの分
泌のための機構としてシグナルペプチターゼを有してお
り、また各種微生物由来のシグナルペプチダーゼの基質
特異性には殆んど差のないことが知られている〔D.Perl
man and H.O.Halvorson,J.Mol.Biol.,167,391（198
3）〕。
上記宿主細胞への導入方法の具体例としては、例えば
宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理
し、該溶液中にベクターを添加する方法〔E.Lederberg,
S.Cohen,J.Bacteriol.,119,1072（1974）〕を例示でき
る。
上記のようにして本発明ベクターを導入して形質転換
した細胞を培養するときには、細胞内で融合ポリペプチ
ドを生産され、続いて細胞外又はペリプラズムに成熟ポ
リペプチドが分泌蓄積される。即ち、まず、ベクター中
の融合ポリペプチドをコードする遺伝子から、ベクター
中の転写調節因子並びに宿主細胞中の諸因子の作用でmR
NAが生産される。次いで、mRNAから翻訳調節因子並びに
宿主細胞中の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産
される。更にここで生産される融合ポリペプチドは、シ
グナルペプチドの作用により、細胞外又はペリプラズム
に分泌され、同時にシグナルペプチダーゼの作用によ
り、融合ポリペプチドからシグナルペプチドが切り離さ
れるのである。その結果、シグナルペプチドも、また他
の如何なる不要なアミノ酸配列をも含まない成熟ポリペ
プチドが細胞外又はペリプラズムに分泌、蓄積される。
かくして分泌、蓄積された成熟ポリペプチドは、これ
を常法に従い分離することができ、また精製することが
できる。この分離、精製操作としては例えば培養上澄又
は浸透圧シヨツク法により調整したペリプラズム画分か
ら、ゲル過、吸着クロマトグラフイー、イオン交換ク
ロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイー等を適
宜組合せた方法を採用することができる。特に本発明に
従い得られる目的ポリペプチドは分泌されたものである
ため、その分離、精製が比較的容易である利点がある。
実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するための実施例を挙
げる。
尚、各例において用いられている各方法及び操作は、
特に明記しない限り、以下の通り行なわれたものであ
る。
1.制限酵素によるDNAの切断操作 DNAの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第１表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、37℃の水浴中で３時間静置して反応
させる。制限酵素の標準的使用量は、DNA1μｇに対して
１ユニツトであり、最終液量は10μｌ以上となるように
する。
2.フエノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させる反応を停止させ
るためにこの抽出法を行なつた。即ち、反応液に、その
液量の半量となるTE飽和フエノール（1mM EDTAを含む10
mMトリス塩酸（pH8.0）緩衝液をフエノールに飽和させ
たもの）を加えて充分混和した後、同じく半量のクロロ
ホルムを加えて更に混和し、次いで遠心分離してDNAの
含まれる緩衝液層を取る。更に0.1倍量の3M酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0）と２倍量の冷エタノールとを加え
て混和して、−20℃で１時間以上放置してDNAを沈澱と
して回収することによりフエノールを完全に除去する。
3.DNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）によるDNAのブラ
ントエンド化方法 40mMリン酸カリウム（pH7.4）、6mM塩化マグネシウ
ム、1mMβ−メルカプトエタノール、1mM ATP及び各1mM
のdATP、dCTP,dGTP及びdTTPを含む水溶液中に、DNAを溶
かし、DNA1μｇに対して１ユニツトとなる量のDNAポリ
メラーゼＩ（クレノー断片、宝酒造（株）製）を加え、
12℃で30分間反応させる。
4.T4DNAリガーゼによるDNA断片の結合（環状化）操作 66mMトリス塩酸（pH7.5）、6.6mM塩化マグネシウム、
10mMジチオスレイトール及び1mM ATPに0.01％の牛血清
アルブミンを添加した水溶液中で、DNA断片と、その１
μｇ当り３ユニツトとなる量のT4DNAリガーゼ（宝酒造
（株）製）とを、12℃で５時間以上反応させることによ
りDNAを結合（環状化）させる。
5.形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌K12株由来のHB101株を用い
る。
HB101株を、LB培地（１％バクトトリプトン、0.5％バ
クトイーストエキス、0.5％塩化ナトリウム）で、37℃
下、610nmの吸光度が0.25になるまで増殖させる。この
培養液40mlを遠心分離（6000回転／分×10分）して菌体
を回収し、次いで氷冷する。これを0.1M塩化マグネシウ
ム20mlで洗浄し、続いて氷冷した0.1M塩化カルシウム及
び0.05塩化マグネシウム溶液20mlに懸濁させ、１時間氷
冷する。遠心分離（6000回転／分×10分）後、菌体を氷
冷した0.1M塩化カルシウム及び0.05M塩化マグネシウム
溶液2mlに再懸濁させる。この懸濁液0.2mlに、T4DNAリ
ガーゼを用いて結合させたDNA断片の反応組成液0.01ml
を加え、１時間氷冷する。次いで42.5℃の水浴で90秒間
加温し、LB培地2.8mlを加え、これを37℃の水浴中で１
時間静置する。
次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選
択する。即ち、1.5％寒天を含むLB培地にアンピシリン5
0μg/ml又はテトラサイクリン20μg/mlを添加して調整
した平板培地に、上記で得た反応組成液の溶液各0.3ml
ずつを拡げ、これを37℃で一晩培養し、生育する大腸菌
コロニーを分離する。
6.プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン50μg/ml
又はテトラサイクリン20μg/mlを添加したLB培地500ml
で、610nmでの吸光度が約0.6になるまで37℃で振盪培養
する。次いでクロラムフエニコール80mgを加え、37℃で
12〜16時間振盪培養する。これを遠心分離（6000回転／
分×10分）して菌体を集め、0.85％塩化ナトリウム水溶
液で洗浄する。菌体を20％遮糖を含む50mMトリス塩酸
（pH8.0）緩衝液2.5mlに懸濁させ、次に１％リゾチーム
を含む0.25Mトリス塩酸（pH8.0）緩衝液0.5mlを加え、1
0分間氷冷する。更に0.25M EDTA（pH8.0）1mlを加え、1
0分間氷冷する。次に6mMトリス塩酸（pH8.0）、60mM ED
TA及び0.1％トリトンＸ−100の溶液4mlを加える。これ
を超遠心（25000回転／分×90分）して上清を採取す
る。この上清8.2mlに塩化セシウム9.0gを加えて溶か
し、次いで１％エチジウムブロマイド溶液0.8mlを加え
る。これを遠心分離（2000回転／分×10分）として浮遊
物を除き、溶液を超遠心（50000回転／分×15時間）す
る。次いで紫外線照射により螢光を発するプラスミド部
分を分離する。これを5M塩化ナトリウム溶液で飽和した
イソプロパノールで５〜６回抽出してこれからエチジウ
ムブロマイドを除去する。最後に1mM EDTAを含む10mMト
リス塩酸（pH8.0）緩衝液に対して透析して塩化セシウ
ムを除去する。
7.オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドの合成は、下記に示す固相合成法
（固相リン酸トリエステル法）により行なつた〔H.Ito
et al,Necleic Acids Research,10,1755−1769（198
2）〕。
即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂Ｓ−X1（200〜4
00メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）をアミノ
メチル化したものと、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルヌ
クレオシドのモノコハク酸エステルとを反応させて、ヌ
クレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社製DNA
合成機を用いて以下の操作を行なう。
上記樹脂40mgを反応管に入れ、1M臭化亜鉛のジクロロ
メタン−イソプロパノール（85:15）溶液を用いて５′
位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次に完全に保
護されたジヌクレオチド〔C.Broka et al,Nucleic Acid
s Research,８,5461−5471（1980）の方法により調製し
た〕のトリエチルアンモニウム塩500mgを加え、縮合剤
（メシチレンスルホニル−５−ニトロトリアゾール）を
用いて縮合させる。以上の操作を繰返して、順次鎖長を
のばして、保護されたオリゴヌクレオチドを担持した樹
脂を得る。尚、最後の縮合工程では、必要に応じてジヌ
クレオチドの代りに、前記文献に記載の方法により調製
されるモノヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩25
mgを使用する。
次に0.5Mピリジンカルドキシメートのピリジン−水
（1:1）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチド
を樹脂から脱離させる。これをセフアデツクスＧ−50カ
ラム（フアルマシア社製、２×100cm）で、更に高速液
体クロマトグラフイー（ポンプ；ウオーターズ社製6000
A型、検出器;440型デイテクター、カラム；マイクロボ
ンダーパツクC18、溶出溶媒；（５→40％）アセトニト
リル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液）で精製
する。次に80％酢酸により脱保護反応を行ない、再度高
速液体クロマトグラフイーにより単一ピークになるまで
精製する。この高速液体クロマトグラフイーの条件は、
溶出溶媒として（５→25％）アセトニトリル−0.1M酢酸
トリエチルアンモニウム水溶液を用いる以外は、上記と
同一とする。
8.DNA塩基配列の分析 DNA塩基配列の分析は、メシング（Messing）の方法
〔M13法、Methods Enzymol.,101,20（1983）〕に従い、
以下のように行なつた。即ち、まずDNA断片を制限酵素
により切り出し、１％アガロースゲル電気泳動により分
離する。このDNA断片をM13mp8RF（アマーシヤム社製）
をベクターとしてクローニングする。得られる組換えフ
アージDNAをマンデル（Mandel）とヒガ（Higa）の方法
（J.Mol.Biol.,53,154（1970）〕により、大腸菌JM107
株へ形質導入する。この菌体懸濁液0.2mlに、25mg/mlの
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド25μｌ及び20
mg/mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシド40μｌを加えた。次いでこの菌体懸
濁液を加熱溶解させた後、50℃で保温したＨ−トツプア
ガー液（１％バクトトリプトン、0.8％塩化ナトリウム
及び0.5％寒天）3mlを加え、1.5％寒天を加えて固化さ
せた２×TY培地（1.6％バクトトリプトン、１％酵母エ
キス及び0.5％塩化ナトリウム）の平板に重層し、37℃
で一晩培養する。DNA断片の挿入された組換えフアージ
は無色のプラークを生じるのに対し、親株のM13mp8は青
色のプラークを生じるので、目的の組換えフアージは容
易に選別できる。
次に単一の無色プラークをパスツールピペツトにて取
り出し、これとJM103株の培養液0.01mlとを２×TY培地1
mlに加え、約５時間、37℃で振盪培養して組換えフアー
ジを増殖させる。培養後、遠心にて菌体を除き、上清に
20％ポリエチレングリコール6000の0.2mlを混合し、室
温で15分以上静置した後、遠心にて沈澱するフアージを
集め、フエノール抽出によつて、フアージから一本鎖DN
Aを抽出し、これを鋳型一本鎖DNAとして用いる。
鋳型一本鎖DNAとプライマー（宝酒造（株）製、M13の
15塩基プライマー〔５′AGTCACGACGTTGTA3′〕）とのそ
れぞれ0.5p molずつを混合し、60℃で20分間熱処理後、
徐冷する。次にこの混合液にα32Ｐ−dCTP（アマシヤム
社製、400Ci/m mol）２μｌとDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノー、宝酒造（株）製）２ユニツトとを加え、充分に混
合した後、その3.2μｌずつを、下記第２表に示した４
種のdNTP−ddNTP混合液のそれぞれ２μｌを含む反応管
に加える。室温で20分間反応させた後、チエース反応液
（dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの各1mM）の１μｌをそれ
ぞれに加え、更に20分間反応させる。ホルムアミド停止
液（95％v/vホルムアミド、0.1％キシレンシアノール及
び0.1％ブロムフエノールブルー）を６μｌずつ加え、9
5℃で３分間加熱した後、急冷する。次にサンプル２μ
ｌずつを６％又は８％ポリアクリルアミドゲルにより、
電気泳動（1800V、30mA、２〜３時間）を行なう。泳動
後、ゲルを紙（ワツトマン3MM）に移し、ゲル乾燥器
にて乾燥し、オートラジオグラムをとり、DNA塩基配列
を解読する。
但し第２表中、ddAはジデオキシアデノシンを、ddCは
ジデオキシシチジンを、ddGはジデオキシグアノシン
を、またddTはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。
9.アガロースゲル電気泳動 シユライフ（Schleif）とウエンシンク（Wensink）の
手引書〔“Practical Methods in Molecular Biology"
（1981）,Springer−Verlag社、pp114−125〕に記載の
方法に従つて、アガロースゲル電気泳動及び泳動後のゲ
ルからのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源として
は、アトー社製コンスターパワーST1065型を、泳動槽と
しては12×15cmのプラスチツク製水槽（白金電極付）
を、アガロースとしてはアガロースＩ（同仁化学研究所
製）を、また泳動用緩衝液としては40mMトリス塩酸（5m
M酢酸ナトリウム及び1mM EDTA含有、pH7.9）をそれぞれ
用いる。
10.ポリアクリルアミドゲル電気泳動 上記手引書の第78−87頁及び第114−125頁に記載の方
法に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後
のゲルからのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源とし
ては、アトー社製コンスターパワーSJ1065型を、泳動槽
としてはアトー社製SJ1060SD型を用いる。アクリルアミ
ド溶液として、アクリルアミドとN,N′−メチレンビス
アクリルアミド（29:1）との水溶液を、重合促進剤とし
てN,N,N′,N′−テトラメチレンエチレンジアミンを、
重合触媒として過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。
また泳動用緩衝液として2.5mM EDTAを含有する90mMトリ
スホウ酸緩衝液（pH8.3）を用いる。
実施例１ 成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターpGH54及びpGH55の
構築 （Ａ）中間体プラスミドpGH53の構築 大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一
部をコードするDNA塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドの合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオリ
ゴヌクレオチドのそれぞれを、前記した固相リン酸トリ
エステル法により合成した。
上記オリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉の５′端を
それぞれT4ポリヌクレオチジルキナーゼ（BRL社製）を
用いてリン酸化した。即ち、各々10μｇのオリゴヌクレ
オチドを50mMトリス塩酸水溶液（10mM塩化マグネシウ
ム、5mMジチオスレイトール、1mM ATPを含む、pH9.5）5
0μｌに溶かし、これにT4ポリヌクレオチジルキナーゼ
５ユニツトを加え、37℃で30分間反応させ、フエノール
抽出により反応を停止させた。
クローニングベクターとして、プラスミドpBR322
〔Bolivar et al,Gene,２,95−113（1977）〕を利用し
た。
該プラスミドpBR322の10μｇを、制限酵素PstI（宝酒
造（株）製）とPvuI（NEB社製）とを用いて高塩濃度緩
衝液中で切断し、1.0％アガロースゲル電気泳動を行な
い、約4.24KbのDNA断片を分離した。
上記で得たDNA断片を、上記で調製されたリン
酸化したオリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉並びにリ
ン酸化していないオリゴヌクレオチド〈１〉及び〈３〉
のそれぞれ約１μｇずつと合せて、T4DNAリガーゼで結
合反応させた。反応終了後、この反応組成液で大腸菌Ｋ
−12株由来のHB101株を形質転換させた。得られたテト
ラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を選
び、これからプラスミドを単離し、目的pGH53を得た。
一連の操作の概略は第１図に示す通りである。
得られたpGH53は、1.0％アガロースゲル電気泳動の結
果、4.3Kbの大きさを有しており、そのDNA塩基配列をM1
3法により分析した結果、pBR322のPstI及びPvuIの両制
限サイト間が欠失し、代りに次に示すように、オリゴヌ
クレオチド〈１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉が挿入さ
れていることが確認された。
該pGH53を保有するHB101株は、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH53〕」なる表示で
微工研条寄第678号（FERM BP−678）として寄託されて
いる。
（Ｂ）成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターpGH54の構
築 上記（Ａ）で得たpGH53の10μｇを制限酵素NaeI（N
EB社製）及びAvaI（宝酒造（株）製）を用いて中塩濃度
緩衝液中で切断し、次いで1.0％アガロースゲル電気泳
動を行なつて、約2.22KbのDNA断片《Ａ》を分離した。
この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のDNA配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。
pBR322を制限酵素AvaI及びHindIII（いずれも宝酒
造（株）製）で、中塩濃度緩衝液を用いて切断し、1.0
％アガロースゲル電気泳動を行なつて、約1.40KbのDNA
断片《Ｂ》を得た。
この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモ
ーターの一部とテトラサイクリン耐性の構造遺伝子の全
てが含まれている。
pBR322の20μｇを制限酵素Fnu4HI（NEB社製）で低
塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いでS1ヌクレアーゼに
よりDNA断片末端の突出塩基を分解除去した。これはフ
エノール抽出後のDNAを6mM酢酸ナトリウム、40mM塩化ナ
トリウム及び1mM硫酸亜鉛緩衝液（pH4.5）1mlに溶か
し、これに2000ユニツトのS1ヌクレアーゼ（BRL社製）
を加えて20℃で30分間反応させることにより行なつた。
次いで、フエノール抽出後の、DNAを制限酵素Hind III
で中塩濃度緩衝液を用いて切断し、６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行ない、約0.28KbのDNA断片《Ｃ》
を得た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リ
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝
子の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部が含まれている。
上記で得た３つの断片《Ａ》、《Ｂ》及び《Ｃ》
を、T4DNAリガーゼを用いて結合させた。反応後、この
反応組成液でHB101株を形質転換した。得られたテトラ
サイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を選びプ
ラスミドを単離した。かくしてpGH54を得た。
pGH54は、M13法による塩基配列分析の結果、βラクタ
マーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続いて
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列を有し、こ
の塩基配列の３′末端の上流側にNruI及び下流側にPvuI
Iのそれぞれの制限酵素認識配列を有していることが確
認された。
一連の操作の概略は、第２図に示される通りである。
pGH54は、前記した通り約3.9Kbの大きさ及び第２図に
示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、またM13法
による塩基配列分析の結果、前記式（３）に示した塩基
配列によりコードされるβラクタマーゼシグナルペプチ
ドの遺伝子を有することが確認された。
（Ｃ）成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターpGH55の構
築 pBR322のAvaI及びPvuII制限サイト間の塩基配列を
欠失させたプラスミドであるpBRH02を次の操作により作
成した。即ちpBR322の５μｇを、中塩濃度緩衝液中で、
制限酵素AvaI及びPvuII（いずれも宝酒造（株）製）で
切断し、フエノール抽出後、DNAポリメラーゼＩ（クレ
ノー断片、宝酒造（株）製）で切断断片をブラントエン
ド化した。次に1.0％アガロースゲル電気泳動で約3.72K
bのDNA断片を分離し、この断片をT4DNAリガーゼで環状
化させた。反応終了後、この反応組成液でHB101株を形
質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択してプラ
スミドを単離しpBRH02を得た。得られたpBRH02はpBR322
とは異なつて、AvaIでもPvuIIでも切断されなかつた。
上記で得たpBRH02の５μｇを制限酵素PstI及びBa
mHI（いずれも宝酒造（株）製）を用いて中塩濃度緩衝
液中で切断し、次いで1.0％アガロースゲル電気泳動を
行なつて、約2.60KbのDNA断片《Ｄ》を分離した。
この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及び
プラスミドの複製開始領域を含んでいる。
pGH54の10μｇの制限酵素PstI及びBamHIで中塩濃度
緩衝液を用いて切断し、次いで1.0％アガロースゲル電
気泳動を行ない、約0.66KbのDNA断片《Ｅ》を得た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リ
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするDNA
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。
上記で得た２つの断片《Ｄ》及び《Ｅ》を、T4DNA
リガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応組成液
でHB101株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性を示す形質転換株の中から１株を選びプラスミドを
単離した。かくしてpGH55を得た。
一連の操作の概略は、第３図に示される通りである。
pGH55は、上記第３図に示される制限酵素開裂地図に
より特徴付けられ、1.0％アガロースゲル電気泳動の結
果、約3.3Kbの大きさを有していた。また該pGH55は、M1
3法による塩基配列分析の結果、pGH54における第２のPv
uII制限サイトを含む約0.64KbのDNAを欠く以外は、該pG
H54と同様であり、その第１のPvuII制限サイトは、シグ
ナルペプチドをコードするDNA塩基配列の３′末端の近
傍に存在していることが確認された。
実施例２ シグナルペプチド−βウロガストロン融合ポリペプチド
をコードするDNA塩基配列を有する分泌発現ベクターの
構築 （Ａ）βウロガストロンをコードするDNA塩基配列の合
成 この塩基配列は、グレゴリー（H.Gregory）により報
告されたアミノ酸配列〔Nature,257,325−327（197
5）〕を参考にして、まずβウロガストロンをコードす
るDNA塩基配列の前後に開始コドン、終止コドン及び制
限酵素認識部位を付加してなる下記第３表に示すDNA塩
基配列を構築することより行なつた。このDNA塩基配列
は、本発明者らにより既に特願昭59−137691号として特
許出願されている。
（Ｂ）βウロガストロンをコードするDNA塩基配列を保
有するプラスミドの構築 pBR322の10μｇを、まず高塩濃度緩衝液中でEcoRI
（宝酒造（株）製）とBamHIとで切断し、次いで1.0％ア
ガロースゲル電気泳動を行ない、約3.99KbのDNA断片を
単離した。
上記で得たDNA断片と、上記（Ａ）で得たβウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列とを、T4DNAリガー
ゼで結合させた。反応後、反応組成物でHB101株を形質
転換し、得られたアンピシリン耐性を示す形質転換株の
中から一株を選びプラスミドを単離した。かくしてβウ
ロガストロンをコードするDNA塩基配列をpBR322のEcoRI
及びBamHI制限サイト間に挿入されたプラスミドpUG3を
得た。
このプラスミドpUG3を保有するHB101株は、「HB101
〔pUG3〕」なる表示で微工研菌条第543号（FERM BP−54
3）として寄託されている。
（Ｃ）pUG201の構築 上記（Ｂ）で得たpUG3を制限酵素HinfIで切断して得
られるDNA断片を、pGH55のPvuII制限サイトに挿入し
て、シグナルペプチド−βウロガストロン融合ポリペプ
チドをコードするDNA塩基配列を含む分泌発現ベクター
であるpUG201を、以下の方法により構築した。
pUG3の15μｇを、高塩濃度緩衝液中でHinfI（宝酒
造（株）製）で切断し、フエノール抽出後、DNAポリメ
ラーゼＩ（クレノー断片）で切断断片をブラントエンド
化した。次いで６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、約0.43KbDNA断片《Ｆ》を単離した。
この断片には、βウロガストロンをコードするDNA塩
基配列（翻訳停止コドンを含む）のうち５′端の７塩基
を除く塩基配列が含まれていた。
pGH55は、βラクタマーゼのシグナルペプチドをコ
ードするDNA塩基配列の後に、βウロガストロンのＮ端
領域をコードする最初の７個のDNA塩基配列が直結し、
且つその直後で制限酵素PvuIIにより切断されるように
構成されたDNA塩基配列を有するものであり、該pGH55の
５μｇを中塩濃度緩衝液中で、PvuIIで切断して、約3.2
6KbのDNA断片《Ｇ》を得た。
この断片は、pGH55の全ての遺伝情報を有している。
上記で得た断片《Ｆ》の約１μｇと、上記で得
た断片《Ｇ》の約0.5μｇとをT4DNAリガーゼで結合させ
た。反応後、この反応組成液でHB101株を形質転換し、
得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の中から一
株を選び、プラスミドpUG201を単離した。
pUG201は、1.0％アガロースゲル電気泳動の結果、約
3.7Kbの大きさを有していた。これをBamH I又はHind II
Iで切断すると、それぞれ２種類のDNA断片が得られるこ
とから、該pUG201にはβウロガストロン遺伝子が含まれ
ていることが判り、また該断片の大きさを調べた結果よ
り、目的のプラスミドであることが判つた。更に、pUG2
01について、βラクタマーゼのプロモーター部分からβ
ウロガストロン遺伝子までを含むDNA断片の塩基配列
を、M13法による塩基配列分析により調べた。その結
果、該DNA塩基配列は下記第４表の通りであり、pUG201
がプロモーター、リボゾーム結合部位並びにβラクタマ
ーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列及びβウ
ロガストロンをコードする塩基配列（融合ポリペプチド
をコードする塩基配列）が、正確にこの順序で配列され
ていることが確認された。また第４表にはDNA塩基配列
に対応するアミノ酸配列も併記する。
上記pUG201は、これを大腸菌HB101に保有させ、この
保有株を「HB101〔pUG201〕」なる表示で通商産業省工
業技術院微生物工業研究所に寄託されている。その寄託
番号は、微工研条寄第681号（FERM BP−681）である。
実施例３ pUG201を保有する大腸菌による成熟βウロガストロンの
分泌発現 （Ａ）pUG201を保有するHB101株の培養 下記組成の修正Ｅ培地を用いた。
〈修正Ｅ培地（１当りの組成）〉 硫酸マグネシウム・７水塩 0.2g クエン酸・１水和物 2.0g 無水リン酸２カリウム 10.0g リン酸水素アンモニウム・ナトリ ウム・４水塩 3.5g ブトウ糖 2.0g カザミノ酸 1.0g Ｌ−プロリン 0.23g Ｌ−ロイシン 39.5mg 塩酸チアミン 16.85mg テトラサイクリン・塩酸塩 20.0mg pUG201株の前培養液1mlを、修正Ｅ培地200mlを含むフ
ラスコに加え、37℃で24時間振盪培養した。
（Ｂ）菌体からのペリプラズム画分と細胞内画分との抽
出 上記（Ａ）で得た培養液から遠心分離（6000回転／分
×10分）で菌体を集め、培養液の0.5倍量の洗浄緩衝液
（10mMトリス塩酸及び30mM塩化ナトリウム、pH8.0）で
菌体を洗浄した後、浸透圧シヨツク法〔H.C.NeuとL.A.H
eppel,J.B.C.,240,3685−3692（1965）〕に従い、ペリ
プラズム画分を抽出した。この抽出操作は、まず湿重量
1gの菌体を20％蔗糖を含む30mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）80mlに懸濁させ、0.25M EDTA水溶液（pH8.0）の0.32
mlを加え、ロータリーシエーカーで24℃にて180回転／
分で10分間撹拌した後、遠心分離（9000回転／分×10
分）して菌体を集め、次いでこの菌体を氷冷した水80ml
に再懸濁させ、氷中に10分間静置して時々撹拌し、遠心
分離（9000回転／分×10分）により菌体と上澄とを分離
することにより行なつたものであり、得られた上澄がペ
リプラズム画分である。
次いで、上記ペリプラズム画分を抽出した後の菌体
を、前記と同一の洗浄緩衝液で洗浄後、PBS（150mM塩化
ナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム、pH7.0）6mlに
懸濁させ、超音波破砕機（大岳製作所製5202型）を用い
て出力100Wにて30秒ずつ３回超音波破砕処理し、遠心分
離（18000回転／分×20分）して上澄を得た。これを細
胞内画分とした。
（Ｃ）ラジオイムノアツセイによるβウロガストロンの
測定 上記（Ｂ）で得たそれぞれの画分につき、以下の通り
βウロガストロンの存在をβウロガストロン特異ラジオ
イムノアツセイにより検討した。ラジオイムノアツセイ
の方法は次の通りである。即ち、精製ヒトβウロガスト
ロンを抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成した。β
ウロガストロン300μｇを蒸留水0.2mlに溶解後、50％ポ
リビニルピロリドン液1.5mlを加え室温で２時間撹拌し
た。コンプリート・フロインド・アジユバント2.0mlを
加えて乳化し、家兎３匹の胸部に皮下注射した。２週間
毎に免疫を４回くり返した後、さらに50μｇの抗原を静
注し、３日後に全採血を行ない、血清を分離した。
次にアツセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めタイト
レーシヨンカーブ、アツセイ条件を最適化するためイン
キユベーシヨン時間、抗体結合標識抗原（バウンド）と
遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、下
記測定条件を設定した。
即ち、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、140mM塩化
ナトリウム、25mM EDTAニナトリウムを含む10mMリン酸
緩衝液（pH7.4）を希釈液として用い、該希釈液400μ
ｌ、測定試料又は標準ヒトβウロガストロン100μｌ及
び抗ヒトβウロガストロン血清100μｌを加えて４℃に
て24時間インキユベートした後、125Ｉ標識ヒトβウロ
ガストロン100μｌ（約5000cpm）を加えた。更に４℃に
て48時間インキユベートした後、第２抗体（抗家兎γ−
グロブリンヤギ血清）（1:20）100μｌ、正常家兎血清
（1:200）100μｌ及び５％ポリエチレングリコールを含
む100mM PBS液900μｌを加えて４℃にて３時間インキユ
ベートした。次に3000rpmで30分間遠心分離し、上清を
除き沈澱物をカウントした。標準ヒトβウロガストロン
より得られた標準曲線より試料中のヒトβウロガストロ
ン免疫活性物の含量を求めた。
上記結果を下記第５表に示す。また第５表には、pUG2
01を保有するHB101株に代えて、同様にして作成されたp
GH55及びpUG3のそれぞれで形質転換されたHB101株を用
いて同様にした結果を併記する。
上記第５表より、シグナルペプチドのみをコードする
DNA塩基配列を含むベクターを保有する大腸菌（HB101
〔pGH55〕）及びβウロガストロンのみをコードするDNA
塩基配列を含むプラスミドを保有する大腸菌（HB101〔p
UG3〕）では、それらの培養抽出液中にβウロガストロ
ンの免疫活性物質は実質的に検出されないが、シグナル
ペプチドとβウロガストロンの融合ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列を含み、その前にプロモーター及び
リボゾーム結合部位が連結された本発明の成熟ポリペプ
チド分泌発現ベクターを保有する大腸菌（HB101〔pUG20
1〕）では、その培養抽出液中に顕著なβウロガストロ
ンの免疫活性が検出されることが明らかである。
また本発明ベクターで形質転換した上記微生物の培養
では、βウロガストロンの免疫活性物質の殆んどすべて
（99.8％）が、ペリプラズムに分布していることも確認
される。このことから、シグナルペプチドとβウロガス
トロンとの融合ポリペプチドのDNA塩基配列を利用した
本発明によれば、βウロガストロンは細胞膜を通過して
ペリプラズムに分泌されることが判る。
（Ｄ）ポリペプチドの精製 上記ペリプラズム抽出液中のβウロガストロンの免疫
活性物質を、ブチルトヨパール（東洋曹達（株）製）を
用いた吸着クロマトグラフイー、CM−トヨパール（東洋
曹達株式会社製）を用いたイオン交換クロマトグラフイ
ー、PepRPCカラム（フアルマシア社製）を用いた高速液
体クロマトグラフイー操作により、それぞれ単一のポリ
ペプチドになるまで精製した。
その結果、精製されたポリペプチドは、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、アミノ酸分析、Ｎ末端分析のすべてにおいてヒ
ト尿より単離精製されたβウロガストロンと同一物質で
あることが確認された。
【図面の簡単な説明】
第１図は起源ベクターpBR322に合成オリゴヌクレオチド
〈１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉をクローニングして
プラスミドpGH53を得る工程及びこれにより得られるpGH
53の特徴を示す図であり、図中□は合成オリゴヌクレオ
チド由来の塩基配列を示している。 第２図はpGH53とpBR322とから本発明ポリペプチド分泌
発現用ベクターpGH54を得る工程及び得られたベクターp
GH54の特性を示す図であり、図中■はシグナルペプチド
をコードする塩基配列を示す。 第３図はpBR322からpBRH02を得、該pBRH02とpGH54とか
ら本発明ポリペプチド分泌発現用ベクターpGH55を得る
工程及び得られるpGH55の特性を示す図である。 第４図はpGH55とpUG3とからシグナルペプチドと目的ポ
リペプチド（βウロガストロン）との融合ポリペプチド
をコードするDNA塩基配列を含む本発明のポリペプチド
分泌発現ベクターpUG201を得る工程及び得られるベクタ
ーpUG201の特性を示す図であり、図中白ヌキの矢印はβ
ウロガストロンの遺伝子を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 王子田 和秀 指宿市東方8075 (72)発明者 松代 愛三 吹田市青山台４丁目15番12号

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式 ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCC CTTTTTTGCGGCCTTTTGCCTTCCTGTCTTCGCGA ACTCAGCTG で示される大腸菌βラクタマーゼシグナルペプチドをコ
    ードする合成されたDNA塩基配列を含み且つその３′末
    端付近にNruI及びPvuIIによる認識部位を付与されてい
    ることを特徴とするDNA塩基配列。
  2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載のDNA塩基配
    列を含むpGH54であるβウロガストロン分泌発現用ベク
    ター。
  3. 【請求項３】pGH55である特許請求の範囲第２項に記載
    のベクター。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項に記載のDNA塩基配
    列を含むpUG201であるβウロガストロン分泌発現ベクタ
    ー。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項に記載のベクターで
    形質転換された細菌。
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