JP2622479B2 - ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド - Google Patents

ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、目的とする蛋白質生成物の観点
からは不完全なメッセンジャーＲＮＡ(以下mＲＮＡと略
す)配列からの酵素による逆転写と有機合成を組み合わ
せることにより、部分的合成遺伝子を作製する方法及び
これを微生物により発現させる方法に関する。発現され
た好ましい生成物には、「微生物を開裂させて生物活性
物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生成物に
共通して存在する、生物活性を不活性化するリーダー配
列が含まれていない。本明細書では、好ましい例とし
て、ヒトの生長ホルモン(例えば下垂体機能減退矮小発
育症の治療に有用である)をコードする(略号化する)遺
伝子の作製およびその発現について例示する。
【０００２】遺伝子を構成しているＤＮＡ(デオキシリ
ボ核酸)は、蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造
遺伝子と、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾーム
結合のための情報部位などを提供することによって構造
遺伝子の情報の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両
者を含んでいる。暗号づけされた蛋白質は、その対応す
るＤＮＡから、微生物内で、複数の過程を経て発現され
る。即ち、 １．調節領域(以下プロモーターという)内で酵素ＲＮＡ
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸(mＲＮＡ)に転写する。この転写は１個またはそれ
以上の終止コドンの位置で終了する。
【０００３】２．mＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにお
いて、そのmＲＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持
った蛋白質に翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴ
Ｇ(これはf−メチオニンと翻訳される)から始まる。Ｄ
ＮＡは遺伝暗号に従い、トリプレット、即ち、アデノシ
ン、チミジン、シチジンおよびグアニン(以下各々Ａ,
Ｔ,ＣおよびＧと表わす)から個々別々に選ばれる隣接す
る３個のヌクレオチドの「コドン」によって個々のアミノ
酸を指定する。これらはコードストランド(暗号鎖)、即
ち２本鎖(duplex)ＤＮＡの暗号配列中にある。２本鎖の
残りの鎖、即ち「相補ストランド」は、コードストランド
中の相補体と水素結合するヌクレオチド(塩基)で形成さ
れている。ＡとＴ、およびＣとＧが相補関係にある。本
発明の背景となる上記の事実およびその他の関連事項は
Ｇene Ｅxpressionに詳しく述べられている(Ｂenjamin
Ｌewin,Ｇene Ｅxpression １,２(１９７４年)およ
び３(１９７７年),Ｊone Ｗiley and Ｓons,Ｎ．
Ｙ．)。本明細書で言及するこの文献およびその他の文
献については、参考までにその都度言及することとす
る。
【０００４】ＤＮＡの組み換えには、別々のＤＮＡ断片
の結合を促進するために、その隣接末端を色々の態様に
修復する種々の方法を利用することができる。ここでい
う「結合」とは、隣接するヌクレオチド間にホスホジエス
テル結合が形成することであり、これは大抵の場合、酵
素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより達成される。例えば平滑末
端(鈍感末端)(ブラントエンド、blunt end)も直接結合
することができる。あるいはまた、隣接末端に相補性の
１本鎖を含んでいる断片は、水素結合によって、「結合」
のためのそれぞれの位置に配置されるので好都合であ
る。このような接着末端と呼ばれる１本鎖は、ターミナ
ルトランスフェラーゼを用いて鈍感末端にヌクレオチド
を付加することにより生成させることができる。またこ
れは、鈍感末端の１本の鎖をλ−エキソヌクレアーゼの
如き酵素で切り取ることにより生成させることもでき
る。しかしこれは、制限エンドヌクレアーゼ(以下制限
酵素という)によるのが最も普通である。この制限酵素
は、塩基対が４ないし６個の長さのヌクレオチドの特異
な配列(制限部位という)内またはその隣接部位のホスホ
ジエステル結合を切断するものであり、多くの制限酵素
およびその認識部位が知られている(例えばＲ．Ｊ．Ｒo
berts, ＣＲＣ Ｃritical Ｒeviews in Ｂiochemis
try,１２３,(１９７６年１１月)参照)。多くのものは互
い違いに切断し、２本鎖断片の端に短い相補性の１本鎖
配列ができる。相補性配列であるので、はみでた末端、
即ち接着末端は塩基対によって再結合することができ
る。２個の異なった分子をこの酵素で切断すると、相補
性１本鎖が交叉した対をつくり、新しいＤＮＡ分子がで
きる。この新しいＤＮＡ分子は、アニーリングした位置
にある１本鎖の切断点を結合するリガーゼを用いて、共
有結合した完全なＤＮＡ分子とすることができる。開裂
した２本鎖ＤＮＡに「コターミナル」、即ち鈍感末端を残
す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他の鈍感末端
配列のものと、例えばＴ４リガーゼにより再結合して組
換えすることができる。
【０００５】本発明の目的に使用される「クローニング
媒体」は完全な「レプリコン」を含有する非染色体性の１
つの２本鎖ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により単
細胞生物(微生物)に入れられた時、複製され得るもので
ある。この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼
ばれている。現在クローニング媒体として一般に使用さ
れているのはビールスまたは細菌から得られるものであ
り、最も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌Ｄ
ＮＡである。
【０００６】最近の生化学の進歩により、例えばプラス
ミッドが外来性のＤＮＡを含む様な、「組換型」クローニ
ング媒体が作製される様になった。特殊な例では、この
組み換え体はヘテロローガスＤＮＡを含有することがで
きる。ここでいうヘテロローガスＤＮＡとは、この組換
型媒体により形質転換することのできる微生物によって
通常は産生されないポリペプチドをコードするＤＮＡを
意味する。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して
結合可能な末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結
合可能な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生
物学的機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択
するのに有用な表現型の性質が付与されることになる。
この組み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形
質転換体を単離してクローン化する。この目的は外来性
遺伝子のコピーを含有している多数の転換体を得ること
であり、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコー
ドしている蛋白質を発現することにある。これに関連す
る技術およびその応用についてはＲecombinant Ｍolec
ules に詳しく記載されている(Ｍiles Ｉnternationa
l Ｓymposium Ｓeries １０; Ｒecombinant Ｍole
cules :Ｉmpact on Ｓcience and Ｓociety,Ｂeer
s and Ｂosseff,eds．,Ｒaven Ｐress,Ｎ．Ｙ．１９
７７年)。
【０００７】複製により遺伝子の数を増やすためにクロ
ーニング媒体を使用することとは別に、遺伝子がコード
している蛋白質を実際に発現しようという試みがなさ
れ、そのいくつかは成功している。その最初の例とし
て、脳ホルモン、ソマトスタチンがlacプロモーターの
コントロールの下に大腸菌中で発現された(Ｋ．Ｉtakur
aet al．Ｓcience １９８ １０５６．１９７７年)。
極く最近、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖が同じ方
法で発現され、結合されてこのホルモンを生成した
(Ｄ．Ｖ．Ｇoeddel et al．Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．
Ｓci．,ＵＳＡ７６ １０６、１９７９年)。この両者で
は、遺伝子はその全てを合成により作製したものであっ
た。いづれの場合も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的と
する生成物を分解するのは明らかであるので、その生成
物を複合体の形で、即ち、「隔離」(compartmentalizatio
n)により目的物を保護し、そして細胞外で切り離される
ことができて所望の生成物を与え得る別の蛋白質と結合
した複合体の形で生成させる必要があった。この研究は
本出願人の出願に係る英国特許ＧＢ２００７６７５Ａ
号、ＧＢ２００７６７０Ａ号、ＧＢ２００７６７６Ａ号
およびＧＢ２００８１２３Ａ号明細書に記載されてい
る。
【０００８】以上述べたいくつかの例で合成遺伝子によ
る方法が有用であることがわかったが、生成物がもっと
大きい蛋白質である場合、例えば成長ホルモン、インタ
ーフェロンなどである場合には、それらの遺伝子はそれ
に応じてさらに複雑であり、手軽に合成することができ
ないという現実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を
伴なっていない生成物を発現することが望ましいであろ
うが、この様な発現の必要性から、使用する微生物を、
目的とする生成物を製造するのにもっとも好適な微生物
に変更しなければならない。
【０００９】ある研究者たちは、有機合成からではな
く、組織から精製した相当するmＲＮＡからの逆転写に
より得られた遺伝子を発現しようと試みた。この試みに
は２つの問題があった。まず第１は、逆転写酵素は所望
の全アミノ酸配列のためのcＤＮＡ(相補ＤＮＡ)を完成
しない前に、mＲＮＡからの転写を停止することがあ
る、ということである。従って、例えばＶilla−Ｋomar
offらはラットのプロインシュリンのためのcＤＮＡを得
たが、それにはそのインシュリンプリカーサー(前駆体)
の最初の３個のアミノ酸のためのコドンが欠落していた
(Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．,ＵＳＡ、７５ ３７２
７、１９７８年)。次に、プリカーサーの形で発現され
るポリペプチドのためのmＲＮＡを逆転写したところ、
生物活性蛋白質ではなくそのプリカーサーのためのcＤ
ＮＡが生成した。ところでこの生物活性蛋白質は、真核
細胞内においてはリーダー配列が酵素的に切断除去され
た結果として生成するものである。現在まで、この様な
機能を発揮する細菌は知られていない。従って、mＲＮ
Ａ転写体は、生物活性蛋白質自体ではなくプリカーサー
の形の、リーダー配列を含んだ発現生成物を製造してし
まうのである(Ｖilla−Ｋomaroff、前記(ラットプロイ
ンシュリン)、Ｐ．Ｈ．Ｓeeburg et al．Ｎature ２
７６、７９５ １９７８年(ラットのプレ生長ホルモ
ン))。最後に、ヒトのホルモン類(またはそれらのプリ
カーサー)をmＲＮＡ転写体から細菌により発現しようと
いう試みでは、明らかに細胞外で開裂され得ない複合蛋
白質が製造されただけであった(例えば、Ｖilla−Ｋoma
roff、前記(ペニシリナーゼ・プロインシュリン)、Ｓee
burg、前記(ベータ−ラクタマーゼ−プレ生長ホルモ
ン))。
【００１０】ヒト生長ホルモン(ＨＧＨ)はヒトの脳下垂
体で分泌される。１９１個のアミノ酸からなり、分子量
が約２１,５００であるこのＨＧＨはインシュリンの３
倍以上大きい。これまで、ＨＧＨは限られた供給源、即
ちヒトの死体の下垂体から面倒な抽出によって得られる
だけであった。この物質は絶えず不足しており、その適
用は下垂体機能減退矮小発育症の治療に制限されてお
り、またそれですら、信頼できる計算によると、ヒト由
来のＨＧＨは約５０％の患者に供給するのがやっとであ
る。
【００１１】従って、ＨＧＨおよびその他のポリペプチ
ド生成物を多量に製造し得る新規な方法を開発する必要
があり、この要求は、有機合成で製造するには大きすぎ
るか、従ってまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現
させることが困難なポリペプチド類において特に火急を
要するものである。哺乳類のホルモンをmＲＮＡ転写体
から発現する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得
ることを約束するものではあるが、現在のところ、所望
のホルモンを実際に切り離すことのできない、生物活性
のない複合体を微生物により製造することができるに過
ぎない。
【００１２】本発明は、面倒な全合成による作製に頼ら
ず、暗号配列の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転
写により得、一方その暗号配列の残りを合成することに
より、生物活性を不活性化するリーダー配列またはその
他の異質蛋白質を伴なっていない所望のポリペプチドを
発現することのできる完全な遺伝子を得、この部分的合
成遺伝子を発現する方法を提供するものである。あるい
は、この合成による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞
外で開裂されて生物活性体が得られる様に設計された、
蛋白質分解に抵抗する複合体を生成させるものであって
もよい。従って、本発明は、従来、組織から多額の費用
をかけて抽出することにより、限られた量だけ生産され
ていた種々の物質、およびこれまで工業的に生産するこ
との出来なかったその他の物質を、微生物学的に生産す
る方法を可能にするものである。本明細書では、その最
も好ましい実施形式として、細胞内での蛋白質分解を避
け、かつ細胞外での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中
に隔離しておく必要性を避けながら、医学的に重要なポ
リペプチドホルモン(ＨＧＨ)を細菌により発現する最初
の例を提供する。本発明によって利用できる様になった
ＨＧＨのための微生物資源により、下垂体機能減退矮小
発育症の治療、並びにこれまで組織から得ていたホルモ
ンではまかないきれなかったその他の症状、例えば汎発
性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロフィ
ーおよび骨結合用として、このホルモンを多量に提供す
ることが初めて可能となった。
【００１３】本発明の以上述べた、およびその他の目的
や特徴は以下の記載および好ましい実施形式を例示した
添付の図面から、より明らかになるであろう。図１は、
クローニングに使用するリンカー、開始信号ＡＴＧおよ
びＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードする遺伝子
断片を作製するための合成機構を示す。コードストラン
ド、即ち上側の鎖(Ｕ)および相補性ストランド、即ち下
側の鎖(Ｌ)の矢印は、描かれた断片の形式に使用される
オリゴヌクレオチドを表わしている。図２は、Ｕおよび
Ｌオリゴヌクレオチドを結合させて図１の遺伝子断片を
形成させる結合媒体および該遺伝子断片のプラスミッド
クローニング媒体への挿入を示している。図３には、下
垂体mＲＮＡ転写体のＨaeＩＩＩ制限酵素断片のＤＮＡ
配列(コードストランドのみ)が描かれており、それらが
コードしているヒト生長ホルモンのアミノ酸も番号付け
して記入してある。ここには非翻訳mＲＮＡに相当する
ＤＮＡ(ストップ以下)および主要な制限部位も示されて
いる。図４には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸を
コードする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製
およびヒト下垂体から単離されたmＲＮＡからの逆転写
による相補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されて
いる。図５は、図２および図４のプラスミッドを用い
て、細菌内でＨＧＨを発現し得るプラスミッドを作製す
る方法を示す。
【００１４】本発明の一般的手法は、一緒になって所望
の生成物の発現をコードする複数個の遺伝子断片を、１
つのクローニング媒体中に組み合わせることにある。こ
れらの内少なくとも１個は、Ｕllrichらの方法(Ａ．Ｕl
lrich et al,Ｓcience １９６ １３１３、１９７７
年)などにより組織から単離されたmＲＮＡの逆転写によ
って得られるcＤＮＡ断片である。このcＤＮＡは目的生
成物のためのコドンの実質的な部分、好ましくは少なく
とも大部分を提供し、一方遺伝子の残りの部分は合成に
より供給される。この合成による断片およびmＲＮＡ転
写による断片は別々にクローンし、最後の組合わせ段階
での使用のために量産する。
【００１５】合成遺伝子と、ＭaxamおよびＧilbert(Ｐr
oc．Ｎat'l Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７４ ５６０、１９
７７年)の方法で決定された相補ＤＮＡの間に、目的産
物のためのコドンをどの様に分配するかは、種々の考え
方によって影響を受ける。逆転写によって得られる相補
ＤＮＡは必ず、少なくとも目的生成物のカルボキシル末
端部のためのコドンを含有しており、そのカルボキシル
末端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳mＲＮＡの
ためのその他のコドンを合せて含有している。非翻訳Ｒ
ＮＡのためのＤＮＡの存在はほとんど無関係である。こ
の種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのＤＮＡ
を複製し、発現するのに使用され細胞源を確保しつつ、
制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特殊な
場合には、このcＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配列と
共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドンを含
んでいる。例えば、全部ではないが、多くのポリペプチ
ドホルモンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連
する蛋白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で発現
される。真核細胞内で発現される場合には、これらの配
列は酵素により除去され、ホルモンはその遊離した形、
即ち生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし微生
物細胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないので、
mＲＮＡ転写体からこの様な信号配列やリーダー配列を
除去しておくことが望ましい。この様な除去操作中に、
翻訳開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目的産
物のためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部分的
合成遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコドン
を回復するものであり、さらに、このハイブリッド(雑
種)遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適切
に配置された開始信号を欠いている場合には、新たに翻
訳開始信号を供給するものである。
【００１６】前駆体生長ホルモンcＤＮＡからのリーダ
ー配列の除去は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけてい
る部分の内部にある制限部位を利用することによって好
適に行なうことができる。しかし本発明はこの様な部位
を利用できるかどうかに無関係に実施することもでき
る。即ち、mＲＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成
する必要性を避けるための、所望のポリペプチドのアミ
ノ末端に十分近い場所の制限部位を利用できるかどうか
に無関係に実施することができる。所望のポリペプチド
およびリーダー配列または他の生物活性を不活性化する
配列をコードしているcＤＮＡにおいて、後者のコドン
と完全な(成熟)ポリペプチドのためのコドンとの境界
は、その完全なポリペプチドのアミノ酸配列からわか
る。単に選択したそのペプチドをコードしている遺伝子
内へ消化していき、望ましくないリーダー配列またはそ
の他の配列を除去すればよい。従って、例えば次の様な
cＤＮＡであるとすると、
【００１７】
【化１】 [ここで矢印は消化の終止を表わす]
【００１８】上側の配列aおよびbを除去する様にエキソ
ヌクレアーゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓ１ヌク
レアーゼ消化により下側の配列cおよびdが自動的に除去
される。あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート(d(Ａ,Ｔ,Ｃ,Ｇ)ＴＰ)の存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼ消化を行なうこともできる。例えば、
上の例では、dＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを
作用させて配列Ｃを除去し(Ｇで停止する)、次いでＳ１
ヌクレアーゼでaを消化する。dＴＴＰの存在下でＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させてdを除去し(Ｔで停止する)、
次いでＳ１ヌクレアーゼでbを切断する、等々(Ａ．Ｋor
nberg,ＤＮＡ Ｓynthesis,Ｐ８７−８８、Ｗ．Ｈ．Ｆr
eeman and Ｃo．,Ｓan Ｆrancisco、１９７４年参
照)。
【００１９】より好ましくは、Ｒazinらのミスマッチ
(不適切な組み合せ)修復合成法(Ａ．Ｒazin et al,Ｐ
roc．Ｎat'l Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７５,４２６８、１
９７８年)を利用して、目的産物をコードしているcＤＮ
Ａの部分内の好都合な位置に制限部位を作製してもよ
い。この方法によって、ミスマッチ置換分を含んでいる
プライマーを用いて存在しているＤＮＡ配列中の１個ま
たはそれ以上の塩基を置換することができる。少なくと
も７種の回文的４−塩基対配列が、既知の制限酵素によ
って特異的に認識される。それらは、ＡＧＣＴ(Ａlu
Ｉ)、ＣＣＧＧ(ＨpaＩＩ)、ＣＧＣＧ(Ｔha Ｉ)、ＧＡ
ＴＣ(Ｓau ３Ａ)、ＧＣＧＣ(Ｈha)、ＧＧＣＣ(Ｈae
ＩＩＩ)およびＴＣＧＡ(Ｔaq Ｉ)である。確率的には
非常にしばしばあり得ることであるが、cＤＮＡ配列
が、上記の様な認識部位と１個の塩基だけが異なってい
る配列を含んでいる場合は、修復合成によって、適切な
置換塩基を含んでる、従って所望の制限部位を含有して
いる複製cＤＮＡが得られる。開裂によって望ましくな
いリーダー配列のＤＮＡが除去され、その後、完全なポ
リペプチドの発現に必要なコドンが合成により回復され
る(下式参照)。
【００２０】
【化２】 勿論、所望によりもっと長い制限部位を同様にして挿入
することができるし、また、希望する位置に、その制限
部位に共通している塩基が２個しか存在しない場合で
も、連続修復によって４−塩基制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
【００２１】この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だ
けでなく、外来性ではあるが特別に設計したある大きさ
の蛋白質を発現するのが望ましい場合にも応用される。
この様な応用例として次の４種類のものを挙げることが
できる。まず第１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋
白と結合することによって免疫原性が付与されるハプテ
ンまたはその他の免疫決定因子を発現してもよく、この
様にしてワクチンが製造され得る(英国特許第２００８
１２３Ａ号明細書参照)。また、生物学的安全性の見地
から、目的とする生成物を、細胞外で開裂して活性体に
変換し得る様に設計したその他の生物活性不活性化蛋白
質との複合体の形で発現してもよい。第３の応用は、細
胞膜を通って排泄された生成物の輸送信号ポリペプチド
を開裂することが出来るならば、所望の生成物の前に輸
送信号ポリペプチドをつけて、細胞膜を通して排泄させ
ることにより目的産物を製造することができる。最後
に、細胞外で特異的に開裂され得る様に設計された外来
性蛋白質との複合体は、そうしなければ微生物宿主にと
って内因性の蛋白質分解酵素で容易に分解されてしまう
目的産物を隔離するのに使用し得る。これらの内、少な
くとも最後の３つの応用例では、mＲＮＡ転写体の暗号
配列を完全にする為に使用される合成によるこの「アダ
プター分子」は、例えば酵素の作用によって特異的に開
裂され得るアミノ酸配列のためのコドンをさらに持って
いてもよい。例えば、トリプシンまたはキモトリプシン
はアルギニン−アルギニン(arg−arg)またはリジン−リ
ジン(lys−lys)などで特異的に開裂する(英国特許第２
００８１２３Ａ号、前記)。
【００２２】以上記載したことから明らかな様に、本発
明は非常に多方面の応用性を持っており、それらはいづ
れも以下に述べる共通した特質を持っている。 １．目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な
部分をコードしているmＲＮＡ転写体であるが、それ自
体を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さ
い、異なったポリペプチドが産生されるであろうmＲＮ
Ａ転写体を使用する。 ２．目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、
これを除去する。 ３．有機合成により、所望の配列の残りの部分をコード
する断片を製造する。 ４．mＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。
【００２３】勿論、発現生成物はいづれの場合も、翻訳
開始信号によって暗号化されているアミノ酸から始まる
(ＡＴＧの場合はf−メチオニン)。これは細胞内で除去
されると期待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物
の生物活性には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベータ−エンドル
フィン、インターフェロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
【００２４】ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒
体の作製および発現 １．mＲＮＡ転写体のＨae ＩＩＩ断片のクローニング Ｕllrichらの方法により、ＨＧＨのためのポリアデニル
化mＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(Ａ．Ｕllrich et al．Ｓcience１９６．１３１
３、１９７７年)。Ｗickensらの方法に従い、このＲＮ
Ａ５μgから２本線(dsと略す)cＤＮＡ１.５μgを作製し
た(Ｗickens et al．Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５３ ２
４８３、１９７８年)。ただし、２番目の鎖の合成に
は、ＤＮＡポリメラーゼＩの代りにＲＮＡポリメラーゼ
「Ｋlenow fragment」を使用した(Ｈ．Ｋlenow Ｐroc．
Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ．６５ １６８,１９７０
年)。ＨＧＨの制限パターンについては図３に示す様
に、Ｈae ＩＩＩ制限部位が３'非暗号領域内およびＨ
ＧＨの２３および２４番目のアミノ酸をコードする配列
内に存在する。このds ＨＧＨ cＤＮＡをＨae ＩＩ
Ｉで処理するとＨＧＨの２４から１９１番目のアミノ酸
をコードする５５１の塩基対(bpと略す)からなるＤＮＡ
断片が得られる。例えばcＤＮＡ９０ngをＨae ＩＩＩ
で処理し、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
５５０bpの領域を溶離すると、約１ngのcＤＮＡが得ら
れる。
【００２５】Ｂolivarらの方法によって調製したpＢ３
２２を、このcＤＮＡのためのクローニング媒体として
選択した(Ｆ．Ｂolivar et al．Ｇene ２ ９５−１
１３、１９７７年)。pＢＲ３２２の特徴は十分に解明さ
れており(Ｊ．Ｇ．Ｓutcliffe,Cold Ｓpring Ｈarbor
Ｓymposium ４３ ７０、１９７８年参照)、これは
多数のコピーを複製するプラスミッドである。また、こ
のプラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子(それぞれＡpR、ＴcRと表わす。図４参照)を
含んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリンの
両者に対して耐性を有し、また、制限酵素Ｐst Ｉ、Ｅ
co ＲＩおよびＨind ＩＩＩの認識部位を含んでい
る。
【００２６】Ｈae ＩＩＩおよびＰst Ｉの両者とも、
それによる開裂生成物は鈍感末端を有する。従ってＣha
ngらの「ＧＣテイリング法」(Ｃhang．Ａ．Ｃ．Ｙ．et a
l．Ｎature２７５ ６１７、１９７８年)を用いて、pＢ
Ｒ３２２をＰst Ｉで開裂した鈍感末端生成物とmＲＮ
Ａ転写体をＨae ＩＩＩで消化したものを結合すること
ができ、cＤＮＡ断片をpＢＲ３２２のＰst Ｉ部位に挿
入してcＤＮＡ上にＨae ＩＩＩ制限部位(ＧＧ↓ＣＣ)
を復元する一方、その挿入体のそれぞれの末端にＰst
Ｉ制限部位(ＣＴＧＣＡ↓Ｇ)を復元することができる。
【００２７】前記した様に、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ(ＴdＴ)を用いて、３'末端
に約２０dＣを付加した(Ｃhang,Ａ．Ｙ．Ｃ．,前記)。
同様にして、６０ngのＰst Ｉで処理したpＢＲ３２２
の３'末端に約１０個のdＧを付加した。このdＣ付加ds
cＤＮＡとdＧ付加ベクター(媒体)ＤＮＡを、１０mＭト
リス−Ｈcl(pＨ７.５)、１００mＭ ＮaＣl、０.２５m
Ｍ ＥＤＴＡの１３０μl中でアニーリングした。この
混合物をＥ．Ｃoli×１７７６の形質転換に使用する前
に、７０℃に加熱し、徐々に３７℃まで冷却し(１２時
間)、次いで２０℃に冷却した(６時間)。×１７７６で
クローンしたこのプラスミッドpＨＧＨ３１につき、Ｍa
xamおよびＧilbertの方法(Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ７４ ５６０、１９７７年)を用いてＤＮＡ配
列を分析した結果、図３に示す様にＨＧＨの２４から１
９１のアミノ酸のためのコドンが確認された。
【００２８】Ｅ．Ｃoli Ｋ−１２株×１７７６はＦ-to
nＡ５３dapＤ８min Ａ１ supＥ４２△４０[gal−uvr
Ｂ]λ-minＢ２ rfb−２ nalＡ２５oms−２ thyＡ５
７＊metＣ６５oms−１△２９[bioＨ−asd] cycＢ２ c
ycＡ１ hsdＲ２の遺伝子型を有する。×１７７６はア
メリカ予防衛生研究所(ＮＩＨ)により、ＥＫ２宿主ベク
ター系として公認されている。
【００２９】×１７７６はジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)
偏性要求性菌であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic ac
id)を合成することができない。従って、細胞の代謝お
よび生長を支えるに十分な栄養は存在しているが、ＤＡ
Ｐが欠乏している環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。これ
はチミンまたはチミジンを要求し、代謝活性を維持する
に十分な栄養はあるがチミンおよびチミジンがない環境
では、ＤＮＡの崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。
×１７７６は胆汁に対する感受性が極めて強く生存する
ことができない。従ってラットの胃腸管を生きて通過す
ることができない。また、×１７７６は洗剤、抗生物
質、薬物および化学薬品に対して感受性が非常に強い。
さらに×１７７６は紫外線による損傷を暗回復または光
回復することができず、従って野生型のＥ．Ｃoli(大腸
菌)により太陽光に対する感受性が数オーダー強い。×
１７７６は多くの形質導入ファージに対して抵抗し、種
々の突然変異がために、異なったタイプの複合プラスミ
ッド(conjugative plasmids)の遺伝には複合が不十分
である(conjugation deficient)。×１７７６は、ナリ
ジクシックアシッド(nalidixic acid)、サイクロセリ
ンおよびトリメトプリムに対して抵抗性がある。従っ
て、これらの薬物を培地に加えることにより、この株を
モニターし、形質転換中、汚染菌の形質転換を不可能に
することができる。
【００３０】×１７７６は、１００μg ＤＡＰ／mlお
よび４μgチミジン／mlを追加したＬブロスまたはペナ
セイ(penassay)ブロス中、約５０分の世代時間で生長
し、定常期には８〜１０×１０8細胞／mlの密度に達す
る。１〜２分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪して
細胞を１００％生存可能の状態に保って懸濁する。×１
７７６についてのさらに詳しいことはＣurtisらの文献
を参照のこと(Ｒ．Ｃurtiset al．,Ｍol enular Ｃl
oning of Ｒecombinant ＤＮＡ、９９−１７７、Ｓc
ott and Ｗerner eds．,Ａcademic Ｐress、Ｎ．
Ｙ．１９７７年)。×１７７６は１９７９年７月３日、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴ
ＣＣ)に寄託された(ＡＴＣＣ番号３１５３７、無制限寄
託)。
【００３１】２．合成遺伝子断片の作製およびクローニ
ング(図１および図２参照) ＨＧＨ部分的合成遺伝子の作製計画は、mＲＮＡ転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった。従っ
て、図１に示す様に、このＨＧＨの最初の２４個のアミ
ノ酸のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸に続い
てＨae ＩＩＩ開裂部位を含んでいる。この合成断片の
遠位末端にはリンカーが設けられている。このリンカー
により、合成断片は、mＲＮＡ転写体および合成断片が
最終的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって生
じる１本鎖末端とアニーリングすることができる。
【００３２】図１に示す様に、２本鎖断片の５'末端に
は、Ｅco ＲＩおよびＨind ＩＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼのための一本鎖接着末端が含まれており、これに
よりプラスミッドの作製が容易に促進される。左末端の
メチオニンコドンは翻訳開始部位を提供している。１１
量体から１６量体の種々の大きさの１２本の異なったオ
リゴヌクレオチドをＣreaの改良ホスホトリエステル法
により合成した(Ｃrea,Ｒ．Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ７５ ５７６５、１９７８年)。Ｕ1からＵ6、
およびＬ1からＬ6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢印
で示してある。
【００３３】１０μgのＵ2からＵ6およびＬ2からＬ
6を、公知の方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼおよび(γ32−Ｐ)ＡＴＰを用いて加燐酸化(phosphory
late)した(Ｇoeddel,Ｄ．Ｖ．ら、Ｐroc．Ｎat'l Ａca
d．Ｓci．ＵＳＡ７６ １０６、１９７９年)。Ｔ４リガ
ーゼを触媒として用いた３つの別々の反応を行なった:
即ち、１０μgの５'−ＯＨ断片Ｕ1を加燐酸化したＵ2,
Ｌ5およびＬ6と結合し;加燐酸化したＵ3,Ｕ4,Ｌ3および
Ｌ4を結合し;そして１０μgの５'−ＯＨ断片Ｌ1を加燐
酸化したＬ2,Ｕ5およびＵ6と結合した。これらの結合反
応は３００μlの２０mＭトリス−塩酸(pＨ７.５)、１m
Ｍ ＭgＣl2、１０mＭジチオトレイット、０.５mＭ Ａ
ＴＰ中、Ｔ４リガーゼ１００単位を用い、４℃で６時間
行なった。次いで、これらの３種の結合混合物を合わ
せ、Ｔ４リガーゼ１００単位を加え、２０℃で１２時間
反応させた。この混合物をエタノールで沈殿させ、１０
％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。８４塩基
対移動帯をゲルから切取り、溶離した。pＢＲ３２２(１
μg)をＥco ＲＩおよびＨind ＩＩＩで処理し、大き
い断片をゲル電気泳動法で単離し、合成ＤＮＡと結合し
た。この混合体を用いてＥ.Ｃoli．Ｋ−１２株２９４(e
ndＡ．thi-hsr-、hsmk+を形質転換した。２９４株は１
９７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された(ＡＴＣ
Ｃ番号３１４４６、無制限寄託)。１個の形質転換体の
プラスミッドpＨＧＨ3からのＥco ＲＩ−ＨindＩＩＩ
挿入体の配列をＭaxamおよびＧilbertの方法(前記)によ
り分析した結果、図１に示した通りであることを確認し
た。
【００３４】３．細菌によるＨＧＨの発現のためのプラ
スミッドの作製(図５) pＨＧＨ３中の合成断片およびpＨＧＨ３１中のmＲＮＡ
転写体を用い、発現用プラスミッドpＧＨ６を使用し
て、図５に示す様に、両方の断片を含有する複製可能な
プラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロモーター
を含有するこの発現用プラスミッドを次の様にして作製
した。Ｂackmanらの方法に従い、９５塩基対の非相同(h
eterologous)ＤＮＡ断片で分離されている２個の９５塩
基対ＵＶ５lacプロモーター断片を含有する２８５塩基
対Ｅco ＲＩ断片をプラスミッドpＫＢ２６８から単離
した(Ｋ．Ｂackman,et al．,Ｃell １３巻 ６５−７
１、１９７８年)。この２８５塩基対断片をpＢＲ３２２
のＥco ＲＩ部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を持った適切な解読相内に向って配置しているプロモ
ーター群を有するクローンpＧＨ１を単離した。このテ
トラサイクリン耐性遺伝子から遠位のＥco ＲＩ部位を
Ｅco ＲＩによる部分消化で破壊し、その結果得られる
１本鎖Ｅco ＲＩ末端をＤＮＡポリメラーゼＩで修復
し、鈍感末端結合によりプラスミッドを再環化した。作
成されたプラスミッドpＧＨ６は、完成したＨＧＨ用遺
伝子を挿入することができるプロモーター系について適
切に配置された単一のＥco ＲＩ部位を含有している。
【００３５】ＲＮＡ転写体と結合させるための合成断片
を得るために、１０μgのpＨＧＨ３をＥco ＲＩおよび
Ｈae ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧ
Ｈアミノ酸１〜２３の暗号配列を含有している７７塩基
対断片を８％ポリアクリルアミドゲルで分離した。
【００３６】次いで５μgのプラスミッドpＨＧＨ３１を
Ｈae ＩＩＩで切断した。５５１塩基対ＨＧＨ配列およ
び一緒に移動したpＢＲ３２２の５４０塩基対をゲル電
気泳動法により精製した。次いでＸma Ｉで処理してＨ
ＧＨ配列のみを切断し、３'非コード領域から３９塩基
対を除去した。得られた５１２塩基対断片を、５４０塩
基対のpＢＲ３２２Ｈae ＩＩＩ切片から、６％ポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離した。
０.３μgの７７塩基対Ｅco ＲＩ−Ｈae ＩＩＩ断片を
１６μlの反応液中、Ｔ４リガーゼを用いて４℃で１４
時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化するために、
この混合物を７０℃で５分間加熱し、次いでＥco ＲＩ
(Ｅco ＲＩ部位によってダイマー化(二量化)した断片
を開裂するため)およびＳma Ｉ(Ｘma Ｉダイマーを開
裂するため)で処理し、Ｅco ＲＩ接着末端およびＳma
Ｉ鈍感末端を有する５９１塩基対断片を得た。６％の
ポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、この断片約３
０ngを得た。ところで、発現用プラスミッドpＧＨ６は
Ｘma Ｉ認識部位を含んでいないことを留意すべきであ
る。しかしながら、Ｓma ＩはＸma Ｉと同じ部位を認
識し、しかしその中間部を切断し、鈍感末端を生成する
のである。従ってpＨＧＨ３１から導かれたこの断片の
Ｓma−切断末端は、鈍感末端でpＧＨ６に結合していく
ことができる。
【００３７】縦列lacＵＶ５プロモーターを含む発現用
プラスミッドpＧＨ６を、順次ＨindＩＩＩ、ヌクレアー
ゼＳ１およびＥco ＲＩで処理し、ゲル電気泳動法によ
り精製した。この様にして得た１個のＥco ＲＩ接着末
端および１個の鈍感末端を有するベクター５０ngを、１
０ngの５９１塩基対ＨＧＨ ＤＮＡと結合させた。この
結合混合物を用いてＥ．Ｃoli×１７７６を形質転換し
た。テトラサイクリン(１２.５μg／ml)に抵抗して生長
するコロリーを選択した。ハイブリッド(雑種)ＨＧＨ遺
伝子をpＧＨ６に挿入することによってテトラサイクリ
ン耐性遺伝子のためのプロモーターが破壊されるが、縦
列lacプロモーターによってテトラサイクリン耐性のた
めの構造遺伝子が通読され、この選択特性が保持される
ことに注目すべきである。この様にして約４００の形質
転換体を得た。Ｇrunstein−Ｈognessの方法によるフィ
ルターハイブリダイゼーションによってＨＧＨ配列を含
む１２のコロニーを確認した(Ｐroc．Ｎat'l Ａcad．
Ｓci．ＵＳＡ,７２ ３９６１、１９７５年)。これらの
コロニーの内、３種のコロニーから分離したプラスミッ
ドがＨae ＩＩＩ、Ｐvu ＩＩおよびＰst Ｉで開裂し
た時、期待する制限パターンを示した。１個のクロー
ン、pＨＧＨ１０７のＤＮＡ配列を測定した。
【００３８】この形質転換体によって発現されたヒト生
長ホルモンは、ファデバスＨＧＨプライストキット(Ｐh
adebas ＨＧＨ ＰＲＩＳＴ Ｋit、Ｆarmacia)を用
い、溶菌上澄液を順次希釈したものを直接放射免疫分析
することにより簡単に検出された。ＨＧＨの発現がlac
プロモーターのコントロール下(支配下)で行なわれたこ
とを示すために、pＨＧＨ１０７をlacレプレッサーを過
剰生産するＥ．Ｃoli株Ｄ１２１０ lac＋(iQo＋Ｚty
＋)に入れた。インデューサー、ＩＰＴＧ(イソプロピル
チオガラクトシド)を添加するまで、有意な量のＨＧＨ
発現生成物は検出されなかった。
【００３９】pＨＧＨ１０７のＥco ＲＩ部位を除去す
ることにより、lacプロモーターのリボゾーム結合部位
コドンとＡＴＧ開始信号との距離は、天然におけるその
リボゾーム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのた
めの開始信号との間の距離と同じになるであろう。この
天然の距離を模倣することによって発現が増加するかど
うかを調べる為に、pＨＧＨ１０７をＥco ＲＩで開裂
し、得られた１本鎖末端をＳ１エンドヌクレアーゼで消
化し、次いでＴ４リガーゼを用いて鈍感末端結合して再
環化することにより、pＨＧＨ１０７をpＨＧＨ１０７−
１に変換した。この様にして得たプラスミッドは同様に
ＨＧＨを発現することができるけれども、驚くべきこと
に、発現の程度はpＧＨ１０７より低いことが直接放射
免疫分析によってわかった。
【００４０】本発明は上に述べた好ましい実施形式に限
定されるのではなく、特許請求の範囲の記載によっての
み限定されるものであることは、当業者には容易に理解
されるだろう。プロモーター系、親プラスミッド、目的
とするポリペプチド生成物またはその他の因子を種々選
択し直すことにより、これまで述べたものに種々の変更
を加えることは勿論可能である。例えば、他のプロモー
ター系を本発明において使用することができる。この様
なプロモーター系としてはラムダープロモーター、アル
ビノースオペロン(Ｐhi８０dara)、またはコリシンＥ
１、ガラクトース、アルカリホスファターゼあるいはト
リプトファンプロモーター系などを挙げることができ
る。細菌による発現のために使用する宿主生物として
は、例えばエンテロバクテリアケア(Ｅnterobacteriace
ae)、例えば大腸菌株、サルモネラ(Ｓalmonella);バシ
ラーケア(Ｂacillaceae)、例えば枯草菌(bacillussubti
lis);肺炎球菌(Ｐneumococcus);連鎖球菌(Ｓtreptococc
us);およびインフルエンザ菌(Ｈaemophilus influenza
e)などが挙げられる。勿論、どの微生物を選ぶかによっ
て、アメリカ予防衛生研究所の組み換えＤＮＡのための
ガイドライン(４３Ｆed．Ｒeg．６０,０８０、１９７８
年)に従って行なわれなければならないクローニングお
よび発現操作において、物理的封じ込めの程度を調節し
なければならない。
【００４１】本発明は実験室規模で実施するのは好まし
いけれども、Ｅ．Ｃoli×１７７６は、生物学的安全性
の為に故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工
業生産するには限界があることがわかった。生物学的封
じ込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込めを行え
ば、Ｅ．Ｃoli．Ｋ−１２株２９４(前記)およびＥ．Ｃo
li．株ＲＲＩ、遺伝子型:Ｐro-Ｌeu-Ｔhi-ＲB -recＡ＋
Ｓtrr Ｌacy-の様な微生物を大規模操作に使用するこ
とができる。Ｅ．Ｃoli．ＲＲＩは、Ｈfrドナー(高頻度
組換型供与菌)としてのＥ．Ｃoli．Ｋ１２株ＫＬ１６と
かけあわせることにより、Ｅ．Ｃoli ＨＢ１０１(Ｈ．
Ｗ．Ｂoyerら、Ｊ．Ｍol．Ｂio．４１ ４５９−４７
２、１９６９年参照)から得ることができる(Ｊ．Ｈ．Ｍ
iller,Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics;Ｃol
d Ｓpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork,１９７２年参照)。
Ｅ．Ｃoli．ＲＲＩは、１９７８年１０月３０日、ＡＴ
ＣＣに寄託された(無制限寄託、ＡＴＣＣ番号３１３４
３)。×１７７６株も同様に１９７９年７月３日、ＡＴ
ＣＣに寄託された(ＡＴＣＣ番号３１５３７)。その他、
プラスミッドpＨＧＨ１０７(ＡＴＣＣ番号４００１
１)、プラスミッドpＧＨ６(ＡＴＣＣ番号４００１２)、
pＨＧＨ１０７で形質転換した×１７７６株(ＡＴＣＣ番
号３１５３８)およびpＧＨ６で形質転換したＥ．Ｃoli
Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ番号３１５３９)も１９７９年
７月３日、ＡＴＣＣに寄託された。
【００４２】本発明によって製造される微生物は、ヒト
生長ホルモンを工業的スケールで発酵により製造する方
法に使用することができ、多量の生成物を得ることがで
き、従来不可能であった分野に使用することができる。
例えば形質転換Ｅ．Ｃoli株は、常法により通気し、攪
拌している鋼鉄製またはその他の発酵容器中の水性培
地、例えば、適当な栄養物(例えば炭水化物またはグリ
セロール)、硫酸アンモニウムの様な窒素源、燐酸カル
シウムの如きカリウム源、微量元素、硫酸マグチシウム
などを含んだ、ほぼ中性pＨの(例えばpＨ７±０.３)、
約３７℃の水性培地中で増殖させることができる。形質
転換微生物は、抗生物質耐性の如き１またはそれ以上の
選択特性を示すことが好ましく、それによって選択圧が
かかって野生型Ｅ．Ｃoliの競合増殖が抑制される。例
えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性微生物
の場合、その抗生物質を発酵培地に加え、それに対する
耐性を持っていない野生型生物を選別することができ
る。
【００４３】発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離す
るかあるいはブロスから細菌固形物を集め、次いで物理
的または化学的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残
骸を除去し、可溶性生長ホルモンを単離精製する。ヒト
生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれかの方
法により、またはそれらを組み合わせることによって精
製することができる。(１)ポリエチレンイミン分別法、
(２)セフアクリル(Ｓephacryl)Ｓ−２００によるゲル濾
過クロマトグラフィー、(３)ビオレックス(Ｂiorex)−
７０レジンまたはＣＭセファデックスによるイオン交換
クロマトグラフィー、(４)硫酸アンモニウムおよび／ま
たはpＨ分別法、および(５)ハイブリードマス(hybridom
as)または免疫感作動物から単離した抗−ＨＧＨ ＩgＧ
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー;このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図である。
【図２】 合成遺伝子のプラスミッドへの挿入を示す模
式図である。
【図３】 ＨＧＨをコードしているmＲＮＡ転写体のＤ
ＮＡ配列を示す模式図である。
【図４】 mＲＮＡ転写体のプラスミッドへの挿入を示
す模式図である。
【図５】 ＨＧＨを発現し得るプラスミッドの作製を示
す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 形質転換細菌中でヒト成長ホルモンリー
    ダー配列、あるいは結合した他の外来蛋白質を伴ってい
    ないヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細
    菌プラスミドであって、該ヒト成長ホルモンをコードす
    るＤＮＡは合成ＤＮＡ及びｃＤＮＡからなる半合成ＤＮ
    Ａであり、その５’末端の上流に翻訳開始コドンＡＴＧ
    が存在し、該ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは発
    現プロモーターの適切な読み取り枠に位置づけられるこ
    とにより、該ヒト成長ホルモンの発現生成物はＡＴＧ出
    発コドンによりコードされた５’末端のメチオニンを有
    することを特徴とする細菌プラスミド。
  2. 【請求項２】 ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の
    実質的な部分がcＤＮＡあるいはその複製物である請求
    項１記載のプラスミド。
  3. 【請求項３】 少なくとも１つの抗生物質に対する耐性
    を示す請求項１記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】 tetプロモーターを欠失しているがテト
    ラサイクリン耐性を示す請求項３記載のプラスミド。
  5. 【請求項５】 縦列lacプロモーターの制御下にヒト成
    長ホルモンをコードする遺伝子が存在する請求項４記載
    のプラスミド。
  6. 【請求項６】 プラスミドpＨＧＨ１０７である請求項
    １記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】 プラスミドpＨＧＨ１０７−１である請
    求項１記載のプラスミド。
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