PL149278B1

PL149278B1 - Method of constructing a replicating vector for cloning

Info

Publication number: PL149278B1
Application number: PL1980225376A
Authority: PL
Inventors: David V Goeddel; Herbert L Heyneker
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-07-01
Publication date: 1990-01-31
Also published as: WO1981000114A1; NO167673C; EP0022242B1; SG56984G; MY8500764A; HK87584A; JPH02478A; US4634677A; KE3446A; AU574351B2; FI850198A7; GB2055382B; IL69492A; NZ201312A; IT1131393B; BR8008736A; FI850198A0; CS254973B2; NO167674B; NO860680L

Description

OPIS PATENTOWY 149 278

POLSKA

RZECZPOSPOLITA

LUDOWA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 80 07 01 (P. 225376)

Int. Cl.4 _C12n 15/00

Pierwszeństwo: 79 07 05 Stany Zjednoczone Ameryki

URZĄD

PATENTOWY

PRL

Zgłoszenie ogłoszono: 83 07 18

C 2 i i -·:

urzędu

Al. Niepodległości Warszawa

I I

.. νϋ Kr

Λ y: ;>

A·*

138

Opis patentowy opublikowano: 90 07 31

Twórcy wynalazku: David V. Goeddel, Herbert L. Heyneker

Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., i San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)'

Sposób konstruowania replikującego się wektora do klonowania

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania replikującego się wektora do klonowania, zwłaszcza plazmidu.

DNA, kwas dezoksyrybonukleinowy, który jest tworzywem genów, zawiera zarówno geny kodujące białka, czyli “strukturalne, jak i regiony kontrolne regulujące ekspresję genów kodujących przez zapewnienie miejsc przyłączania polimerazy DNA, informację dotyczącą miejsc przyłączania rybosomów itd. Ekspresja genu, czyli wytwarzanie polipeptydu polega na odbywającym się w organizmie procesie wielostopniowym, w którym: 1/enzym polimereza RNA zostaje zaktywowany w regionie kontrolnym, określanym w dalszej części opisu terminem „promotor, i przemieszcza się wzdłuż genu strukturalnego, a w toku tego procesu zakodowana w genie informacja ulega transkrypcji do informacyjnego kwasu rybonukleinowego /mRNA/, aż do zakończenia transkrypcji na jednym lub więcej kodonie „stop, 2/ informacja zawarta w mRNA ulega z udziałem rybosomów translacji do białka, którego sekwencję aminokwasów koduje dany gen, przy czym translacja zaczyna się na sygnale „start, najczęściej ATG, który w translacji odpowiada f-metioninie.

Zgodnie z kodem genetycznym, wyznacznikiem każdego aminokwasu jest DNA jako tryplet czyli „kodon składający się z trzech sąsiadujących ze sobą nukleotydów indywidualnie wybranych spośród adenozyny, tymidyny, cytydyny i guaniny, określanych w opisie symbolami A, T, C i G. Znajdują się one w kodującej nici lub kodującej sekwencji dwuniciowego DNA, podczas gdy pozostała, czyli „komplementarna nić utworzona jest z nukleotydów /„zasad/, które łączą się wiązaniami wodorowymi z odpowiadającymi im zasadami w nici kodującej. A jest komplementarna z T, a C z G. Te i inne zagadnienia stanowiące podstawę teoretyczną dziedziny, w której dokonano wynalazku wyczerpującego omówił Benjamin Levin w Gene Expression, 12 /1974/ i 3 /1977,/, John Wiley and Sons, N.Y.

Znane są różne sposoby rekombinacji DNA polegające na kształtowaniu sąsiadujących końców oddzielnych fragmentów DNA w celu ułatwienia łączenia. Termin łączenie oznacza proces

149 278 tworzenia się wiązań fosfodwuestrowych między sąsiadującymi nukleotydami, najczęściej za pomocą enzymu ligazy DNAT4. Tak więc, wolne końce mogą być połączone bezpośrednio. Alternatywnie, fragmenty zawierające komplementarne, pojedyncze nici na sąsiadujących końcach zostają korzystnie usytuowane przez tworzenie wiązań wodorowych dla następującego po tym łączenia. Takie pojedyncze nici, do których odnosi się termin lepkie końce, można tworzyć przez dodawanie nukleotydów do wolnych końców z użyciem terminalnej transferazy, a czasem po prostu przez działanie na wolny koniec jednej nici takim enzymem, jak λ— egzonukleaza. A wreszcie, co spotyka się najczęściej, można użyć endonukleaz restrykcyjnych, w niniejszym tekście określanych terminem „enzymy restrykcyjne, które rozszczepiają wiązanie fosfodwuestrowe w/i obok unikalnych sekwencji nukleotydów o długości około 4-6 par zasad /„miejsca restrykcyjne/. Znane są liczne enzymy restrykcyjne i ich miejsce rozpoznawania, co opisał np. R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 /listopad 1976/. Wiele z nich tworzy oddzielone od siebie nacięcia, a przez to krótkie, komplementarne, jednoniciowe sekwencje na końcach dwuniciowych fragmentów. Jako sekwencje komplementarne, występujące, czyli będące końcami lepkimi mogą one ulec rekombinacji przez parowanie zasad. Gdy dwie odrębne cząsteczki zostają rozszczepione enzymem, to krzyżowe parowanie komplementarnych, pojedynczych nici tworzy nową cząsteczkę DNA, której można nadać integralność pod względem wiązań kowalencyjnych przez użycie ligazy w celu ponownego połączenia przecięć pojedynczych nici, pozostających w punkcie stapiania. Enzymy restrykcyjne tworzące jednakowo przecięte, czyli „wolne końce dwuniciowego DNA, który został rozszczepiony, umożliwiają rekombinację za pomocą DNA T4 z innymi sekwencjami o wolnych zakończeniach.

W opisie terminem „wektor do klonowania określa się dwuniciowy DNA o długości niechromosomalnej, zawierający nienaruszony replikon, czyli taki, który może ulegać replikacji gdy w wyniku transformacji znajdzie się w organizmie jednokomórkowym /„drobnoustrój/. Tak transformowany organizm określa się terminem „transformant. Obecnie zwykle używane wektory do klonowania otrzymuje się z wirusów i bakterii, a najczęściej są one pętlami bakteryjnego DNA zwanymi „plazmidami.

Postępy w biochemii w ostatnich latach doprowadziły do możliwości konstruowania rekombinowanych wektorów do klonowania, czyli plazmidów zawierających egzogenny DNA. Rekombinowany wektor włącza heterologiczny DNA, a więc DNA kodujący polipeptydy nie wytwarzane normalnie przez organizm poddany transformacji. Tak więc, plazmidy rozszczepia się enzymami restrykcyjnymi w celu uzyskania linearnego DNA o końcach nadających się do połączenia. Łączy się je z egzogennym genem mającym końce nadające się do połączenia w celu otrzymania biologicznie czynnej cząstki z nienaruszonym, replikonem o właściwościach fenotypowych użytecznych w selekcji transformantów. Cząstkę rekombinowaną wprowadza się do drobnoustroju przez transformację, a transformanty wyodrębnia się i klonuje w celu otrzymania dużych populacji zawierających kopie egzogennego genu oraz, w szczególnych przypadkach, w celu doprowadzenia do ekspresji białka, które koduje dany gen. Przegląd in extenso związanej z tym technologii i jej potencjalnych zastosowań znajduje się w Miles Intenational Symposium Series 10, Recombinant Molecules, Impacet on Science, wyd. Beers and Bosseff, Raven Press, N.Y. /1977/.

Oprócz użycia wektorów do klonowania w celu zwiększenia przez replikację zapasu genów przeprowadzono również ekspresje białek kodowanych przez te geny. Pierwszym takim przykładem było doprowadzenie do ekspresji w bakterii E.coli genu neurohormonu, somatostatyny, znajdującej się pod wpływem promotora lac /K. Itakura i wsp., Science, 198,1056 /1977/. Ostatnio doprowadzono w ten sam sposób do ekspresji łańcucha A i B ludzkiej insuliny, które połączono z utworzeniem hormonu /D.V.Goeddel i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76, 106 /1979/. W każdym przypadku przez syntezę wytworzono całkowite geny. Enzymy proteolityczne zawarte w komórce mogłyby zawsze rozkładać pożądany produkt, czyniąc koniecznym wytwarzanie go w postaci sprężonej, np. z innym białkiem, które chroniłoby je przez kompartmentalizację i mogłyby zostać odszczepione poza komórkę z uzyskaniem przewidzianego produktu. Prace te są opisane w następujących brytyjskich opisach patentowych nr nr 2007 675 A, 2007 670 A, 2007 676 A oraz 2008123 A.

149 278

Podczas gdy sposób podejścia do zagadnienia w oparciu o gen syntetyczny okazał się użyteczny w szeregu przypadków dyskutowanych wyżej, to znaczne trudności powstały w przypadku produktów białkowych o dużo większej cząsteczce, np. hormon wzrostu, interferonu itp., których geny są odpowiednio bardziej złożone i w mniejszym stopniu nadają się do prostej syntezy. Jednocześnie byłoby pożądane doprowadzenie do ekspresji tych produktów bez sprzężonych białek, gdyż potrzeba ich ekspresji wymaga zmiany wykorzystania zasobów w organizmie bardziej przystosowanym do wytwarzania zamierzonego produktu.

Inni badacze przeprowadzili próby doprowadzenia do ekspresji genów otrzymanych nie na drodze syntezy organicznej, ale przez odwrotną transkrypcję odpowiedniego, pochodzącego z tkanki i oczyszczonego mRNA. W pracach tych napotkano dwa problemy. Po pierwsze, odwrotna transkryptaza może zakończyć transkrypcję z mRNA przed utworzeniem całkowitego cDNA kodującego nienaruszoną, pożądaną sekwencję aminokwasów. Tak np. Villa-Komaroff i wsp. otrzymali cDNA kodujący szczurzą proinsulinę, w którym brakowało kodonów dla pierwszych trzech aminokwasów prekursora insuliny /Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,3727 /1978/. Po drugie, odwrotna transkrypcja mRNA kodującego polipeptydy ulegające ekspresji w postaci prekursorów pozwala uzyskać cDNA kodujący prekursory, a nie biologicznie czynne białko, które w komórce eukariotycznej powstaje wtedy, gdy sekwencje kierujące zostaną usunięte na drodze enzymatycznej. Jak dotychczas, nie stwierdzono istnienia komórek bakteryjnych wykazujących taką zdolność, więc transkrypty mRNA pozwalają uzyskać produkty ekspresji zawierające sekwencje kierujące, a nie biologicznie czynne białko jako takie /Villa Komaroff, j.w. /proinsulina szczurza/ i P.H. Seeburg i wsp., Naturę, 276, 795, /1978// /szczurzy prehormon wzrostu//.

Wreszcie, przeprowadzone przez innych autorów próby ekspresji przez bakterie ludzkich hormonów lub ich prekursorów, w oparciu o transkrypty mRNA, dały w wyniku tylko wytworzenie sprężonego białka bez widocznej podatności na rozszczepianie zewnątrzkomórkowe /np. Villa-Komaroff, jak wyżej /penicylinaza-proinsulma/, Seeburg, jak wyżej /β—laktamaza-prehormon wzrosną//.

Ludzki hormon wzrostu /„HGH“/jest wydzielany przez przysadkę. Składa się on ze 191 aminokwasów i z racji swego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego około 21500 jest ponad trzykrotnie większy od insuliny. Aż do chwili opracowania sposobu według wynalazku ludzki hormon wzrostu można było otrzymywać laboratoryjną metodą ekstrakcji z ograniczonego ilościowo źródła, a mianowicie z przysadek mózgowych pochodzących z ludzkich zwłok. W konsekwencji, brak takiej substancji ograniczał zakres jej stosowania do leczenia karłowatości przysadkowej. Z realnej oceny wynika nawet, że pochodzący od ludzi HGH jest dostępny w ilości wystarczającej do zastosowania u nie więcej niż 50% chorych.

Podsumowując należy stwierdzić, że istnieje potrzeba opracowania nowego sposobu otrzymywania HGH i innych produktów polipeptydowych w znacznej ilości. Konieczność ta występuje szczególnie wyraźnie w przypadku polipeptydów o łańcuchach zbyt długich, aby istniała możliwość syntezy organicznej i w jej wyniku ekspresji przez drobnoustroje genów całkowicie syntetycznych. Ekspresja hormonów ssaków w oparciu o transkrypty mRNA stwarza możliwość uniknięcia , trudności związanych z metodą syntetyczną, ale jak dotychczas, pozwala ona na wytwarzanie przez drobnoustroje tylko biologicznie nieczynnych koniugatów, z których praktycznie nie można odszczepić pożądanego hormonu.

Sposób według wynalazku umożliwia przeprowadzenie ekspresji quasi-syntetycznych genów, w których odwrotna transkrypcja daje dużą część, korzystnie większość sekwencji kodującej, bez uciekania się do pracochłonnego konstruowania sekwencji, całkowicie na drodze syntezy, podczas gdy synteza pozostałej części sekwencji kodującej daje całkowity gen zdolny do ekspresji pożądanego polipeptydu, bez udziału biodezaktywujących sekwencji kierujących lub innego białka ubocznego. Alternatywnie, syntetyczna pozostałość może zapewnić koniugat oporny na proteolinę o takiej budowie, aby możliwe było zewnątrzkomórkowe odszczepienie ubocznego białka z uzyskaniem postaci biologicznie czynnej. Wektor skonstruowany sposobem według wynalazku umożliwia wytwarzanie przez drobnoustroje takich produktów, które dotychczas otrzymywano tylko w ograniczonej ilości, kosztowną metodą ekstrakcji z tkanki,niemożliwych do wytwarzania w skali przemysłowej. Sposób według wynalazku daje więc po raz pierwszy możliwość wykorzystania ekspresji przez bakterie ważnego leczniczo hormonu polipeptydowego, takiego jak ludzki hormon

149 278 wzrostu, bez wewnątrzkomórkowej proteoliny i konieczności kompartmentalizacji czynnej biologicznie postaci z ubocznym białkiem do momentu zewnątrz.komórkowego rozszczepienia. Ludzki hormon wzrostu otrzymany za pomocą wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku ma zastosowanie do leczenia karłowatości przysadkowej, a także innych schorzeń, takich jak rozlane krwawienie żołądkowe, staw rzekomy, oparzenia, trudno gojące się rany, dystrefia, złamania kości.

Sposób konstruowania replikującego się wektora do klonowania, zdolnego w organizmie drobnoustroju . do ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu, polegający na konstruowaniu genu przez syntezę chemiczną i odwrotną transkrypcję mRNA, a następnie włączenia do wektora do klonowania otrzymanego genu kodującego ludzki hormon wzrostu, znajdujący się pod kontrolą promotora ekspresji, według wynalazku polega na tym, że przez odwrotną transkrypcję z informacyjnego RNA otrzymuje się pierwszy fragment genu dla produktu ekspresji, który zawiera część sekwencji kodującej ludzki hormon wzrostu, a w przypadku gdy pierwszy fragment genu zawiera kodony, nie ulegające translacji usuwa się te kodony, a pozostawia się część sekwencji kodującej, przy czym otrzymany fragment pomimo to koduje produkt ekspresji inny niż ludzki hormon wzrostu, i na drodze chemicznej syntezy organicznej wytwarza się drugi lub następne fragmenty genu kodującego pozostałą część sekwencji ludzkiego hormonu wzrostu, przy czym przynajmniej jeden z syntetycznych fragmentów koduje aminową część końcową ludzkiego hormonu wzrostu, a następnie otrzymane fragmenty włącza się do zdolnego do replikacji wektora do klonowania, w prawidłowej względem siebie fazie odczytywania i pod kontrolą promotora ekspresji.

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia syntetyczny schemat konstrukcji fragmentu genu kodującego pierwsze 24 aminokwasy ludzkiego hormonu wzrostu, łącznie z sygnałem startu ATG i łącznikami użytymi do klonowania. Strzałki wskazują w kodującej, czyli górnej części nici /„U“/ i w komplementarnej, czyli niższej nici /„L“/ oligonukleotydy połączone z utworzeniem przedstawionego fragmentu, fig. 2 — łączenie oligopeptydów „U“ i „L“ z utworzeniem fragmentu genu przedstawionego na fig. 1 oraz jego insercję do plazmidowego wektora do klonowania, fig. 3 — sekwencję DNA /tylko nić kodującą/ fragmentu transkryptu przysadkowego mRNA tworzonego przez enzym restrykcyjny Hae III z ponumerowaniem kodowanych aminokwasów ludzkiego hormonu wzrostu.

Wskazano kluczowe miejsce restrykcyjne, takie jak w DNA, następujące po sygnale „stop“, dla nie ulegającego translacji mRNA. Fig. 4 na rysunku przedstawia konstrukcję wektora do klonowania fragmentu genu nie otrzymanego na drodze syntezy, kodującego aminokwasy ludzkiego hormonu wzrostu i konstrukcję tego fragmentu genu w postaci komplementarnego DNA przez odwrotną transkrypcję mRNA wyodrębnionego z ludzkiej przysadki jako źródła. Fig. 5 na rysunku przedstawia konstrukcję plazmidu, zdolnego do ekspresji w organizmie bakterii z wytworzeniem ludzkiego hormonu wzrostu zaczynającą się od plazmidów przedstawianych na fig. 2 i 4.

Sposób według wynalazku polega na kombinacji pojedynczego wektora do klonowania i więcej niż jednego fragmentu genu. W wyniku kombinacji kodują one z ekspresją pożądany produkt. Z tych fragmentów co najmniej jeden otrzymuje się przez odwrotną transkrypcję mRNA wyodrębnionego z tkanki, np. sposobem zastosowanym przez A. Ullricha i wsp., Science, 196,1313 /1977/. cDNA dostarcza zasadniczą częś, korzystnie przynajmniej większość kodonów pożądanego produktu, podczas gdy pozostałe części genu otrzymuje się syntetycznie. Fragmenty syntetyczne i fragmenty transkryptu mRNA klonuje się oddzielnie z zapewnieniem dostatecznej ilości do zastosowania w późniejszym etapie kombinacji.

Różne okoliczności wpływają na rozdzielenie kodonów produktu końcowego, np. między DNA syntetyczny a cDNA szczególnie sekwencji komplementarnego DNA oznaczoną np. metodą podaną przez Maxama i Gilberta w Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74,560 /1977/. Komplementarny DNA otrzymywany przez odwrotną transkrypcję będzie niezmiennie zawierał kodony przynajmniej karboksylowego końca produktu, jak również inne kodony odpowiadające mRNA nie ulegającemu translacji, następujące pod translacyjnym sygnale lub sygnałach „stop połączonych z końcem karboksylowym. Obecność DNA odpowiadającego mRNA nie ulegającemu translacji jest bardzo niekorzystne, chociaż nadmiernie długie sekwencje tego rodzaju można usunąć, np. przez rozszczepienie enzymem restrykcyjnym, w celu zachowania zasobów komórkowych zaangażo anych w replikacji i ekspresji DNA odpowiadającego produktowi. W poszczególnych przypadkach

149 278 cDNA będzie zawierać kodony odpowiadające całkowitej potrzebnej sekwencji aminokwasów, jak również uboczne kodony przed aminowym końcem produktu. Np. liczne o ile nie wszystkie hormony polipeptydowe ulegają ekspresji w postaci prekursorów z kierującymi, czyli sygnałowi sekwencjami białka związanego np. z transportem przez błonę komórkową. Przy ekspresji dotyczącej komórek eukariotycznych sekwencje te zostają enzymatycznie usunięte- tak, że hormon przedostający się do przestrzeni periplazmatycznej występuje w wolnej, biologicznie czynnej postaci.

Natomiast nie można liczyć na to, że komórki drobnoustrojów przeprowadzą ten proces i zgodnie z tym korzystne jest usunięcie sekwencji kodujących te sygnałowe, czyli kierujące sekwencje z transkryptu mRNA. W czasie tego usuwania traci się translacyjny sygnał startu i prawie stale usuwane są niektóre kodony produktu. Syntetyczny komponent quasi — syntetycznego genu przywraca te ostatnie kodony, jak również dostarcza nowego translacyjnego sygnału startu, jeżeli wektor do którego zostanie ostatecznie włączony hybrydowy gen jest pozbawiony prawidłowo usytuowanego sygnału startu.

Eliminację sekwencji kierującej z cDNA prehormonu wzrostu ułatwia dostępność miejsca restrykcyjnego w części kodującej hormon wzrostu. Tym niemniej sposób według wynalazku, może być praktycznie zastosowany bez względu na dostępność takiego miejsca, czyli w każdym przypadku bez względu na dostępność miejsca restrykcyjnego dostatecznie blisko aminowego końca wytwarzanego polipeptydu z uniknięciem niezbędnej ekstensywnej syntezy komponentów genu nie otrzymanych z mRNA. Tak więc, w jakimkolwiek cDNA kodującym polipeptyd i kierującą lub inną biodezaktywującą sekwencją, granica między tymi ostatnimi kodonami, a odnoszącymi się do dojrzałego polipeptydu będzie wynikać z sekwencji aminokwasów dojrzałego polipeptydu. Można łatwo przeprowadzić trawienie z otrzymaniem genu kodującego peptyd z wyboru, usuwając niepożądaną kierującą lub inną sekwencję. I tak, np. w przypadku cDNA takiego jak:

5' —a— | -bTTAAG CCCTG AGCGT...

AATTC GGGAC TACCA... itd

3' -c-* —d— w którym końcowy punkt trawienia wskazany jest przez strzałkę, można dobrać warunki reakcji trawienia egzonukleazą w celu usunięcia górnych sekwencji „a“ i „b“, podczas gdy trawienie nukleazą SI automatycznie wyeliminuje niższe sekwencje „c“ i „d“. Alternatywnie i dokładniej można działać polimerazą DNA w obecności trójfosforanów dezoksynukleotydów /„d/A, T, C, G/ TP“/. Tak więc, w poprzednim przykładzie polimeraza DNA w obecności dGTP usuwać będzie sekwencję „c“ /zatrzymując się na „G“/, nukleaza S1 będzie następnie trawić „a“, polimeraza DNA w obecności dTTP usunie „d“ /zatrzymując się na „T“/, po czym nukleaza SI usunie „b“ itd. Ogólne zasady podał A. Kornberg, DNA Synthesis, str. 87-88, W.H. Freeman Co., San Francisco /1974/.

Korzystniej można łatwo skonstruować miejsce restrykcyjne w dogodnym punkcie części cDNA kodującej produkt przez zastosowanie mieszanej syntezy reperacyjnej metodą A. Rezina i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,4268 /1978/. Za pomocą tej metody można podstawić jedną lub więcej zasad w istniejącej sekwencji DNA przy użyciu primerów zawierających mieszane podstawniki. Co najmniej 7 palindromowych sekwencji o długości czterech par zasad jest wybiórczo rozpoznawanych przez znane enzymy restrykcyjne, to jest AGCT, /Alu 1/, CCGG /Hpa 11/, CGCG /Tha 1/, GATC /Sau 3A/, GCGC /Hha/, GGCC /Hae III/ i TCGA /Taq 1/.

W przypadku gdy sekwencja cDNA zawiera sekwencję różniącą się od jednego z tych miejsc pojedynczą zasadą, co statystycznie jest wysoce prawdopodobne, synteza reperacyjna pozwoli uzyskać kopię cDNA zawierającą prawidłowo podstawioną zasadę, a przez to pożądane miejsce restrykcyjne. Przecięcie spowoduje usunięcie DNA odpowiadającego niepożądanej sekwencji kie6 149 278 rującej, a następnie na drodze syntezy wprowadzi się kodony konieczne do zejścia ekspresji całkowitego polipeptydu, np.:

Należy oczywiście zaznaczyć, że dłuższe miejsca restrykcyjne można, w razie potrzeby, włączyć w podobny sposób lub kolejne reperacje mogą tworzyć miejsca restrykcyjne o długości 4 par zasad, jeśli tylko 2 zasady spotykane w tym miejscu restrykcyjnym znajdują się w odpowiednim punkcie.

Z zastosowania okaże się dlaczego korzystna jest ekspresja nie tylko sekwencji aminokwasów produktu, lecz także, w pewnej mierze, białka ubocznego lub specyficznie zaprojektowanego. Cztery takie zastosowania można rozważyć jako przykłady. Po pierwsze, ąuasi-syntetyczny gen może reprezentować hapten lub inną immunologiczną determinantę, której nadano immunogenność przez sprzężenie z dodatkowym białkiem, dzięki czemu można wytwarzać szczepionki. Zagadnienie to omówiono w brytyjskim opisie patentowym nr 2008 123 A. Po drugie, z uwagi na bezpieczeństwo biologiczne może okazać się korzystne doprowadzenie do ekspresji produktu jako koniugatu z innym, biodezaktywującym białkiem tak dobranym, aby umożliwić pozakomórkowe rozszczepienie z uzyskaniem produktu w postaci biologicznie czynnej. Po trzecie, poniżej zostanie przedstawiony przykład, w którym transportowe polipeptydy sygnałowe będą poprzedzać produkt, umożliwiając jego wytwarzanie jako produktu wydzielanego przez błonę komórkową tak długo, aż peptyd sygnałowy zostanie następnie odszczepiony. Wreszcie można zastosować uboczny koniugat w celu umożliwienia specyficznego zewnątrzkomórkowego rozszczepienia, a to dla kompartmentalizacji produktu, który w innym przypadku byłby podatny na rozłożenie przez endogenne proteazy drobnoustroju - gospodarza. Co najmniej w ostatnich trzech przykładach syntetyczny fragment przedłużający cząsteczkę zastosowany w celu uzupełnienia kodującej sekwencji transkryptu mRNA może dodatkowo zawierać kodony sekwencji aminokwasów specyficznie podatnych na rozszczepienie w wyniku działania enzymów. Np. trypsyna i chymotrypsyna będzie specyficznie rozszczepiać wiązanie przy arg-arg lub lys-lys itd. /brytyjski opis patentowy nr 2008 123 A/.

Z powyższej części opisu widać, że najogólniej biorąc możliwe są różnorodne zastosowania sposobu według wynalazku i wszystkie one mają następujące wspólne cechy:

— stosuje się transkrypt mRNA kodujący dużą część sekwencji aminokwasów ludzkiego hormonu wzrostu, który jednak wywołując ekspresję samodzielnie, może powodować wytwarzanie innego polipeptydu, albo mniejszego albo większego, od ludzkiego hormonu wzrostu, — usuwa się kodony kodujące białko, odpowiadające sekwencjom aminokwasów innych niż w ludzkim hormonie wzrostu, — otrzymuje się na drodze syntezy organicznej fragment lub fragmenty genu kodujące pozostałą część sekwencji i — łączy się transkrypt mRNA i syntetyczny fragment lub fragmenty i włącza się do wektora do klonowania w prawidłowy względem siebie wzajemnie fazie odczytywania i pod kontrolą promotora ekspresji.

^sekwencja kierująca kodony odpowiadająces | [produktowi r·

U---a--------CAGG syntetyczny „a _|cDNA ia '1 Hpa II

GG -Ϊ------1 quasi-syntetyczny __nANA___| “kodony odpowiadające ---produktowi-mieszana syntezy reperacyjna ---CCGG -i----1

149 278

Oczywiście, produkt ekspresji będzie w każdym przypadku zaczynał się od aminokwasu kodowanego przez translacyjny sygnał startu, przy czym w przypadku ATG jest to f—metionina. Można oczekiwać, że będzie ona usunięta wewnątrzkomórkowo i w każdym przypadku bez naruszenia aktywności biologicznej końcowego produktu.

W poniższych przykładach zostanie omówione zastosowanie sposobu według wynalazku.

Przykład I. Klonowanie fragmentu Hae III transkryptu mRNA /fig. 3 i 4/.

Przeprowadza się preparatykę poliadenylowanego mRNA odpowiadającego ludzkiemu hormonowi wzrostu /HGH/ z nowotworów przysadki hormonalnie czynnych metodą A. Ullricha i wsp., Science, 196,1313 /1977/. Używając 5 pg tego RNA przygotowuje się 1,5 pg dwuniciowego /„ds“/ cDNA, w zasadzie metodą opisaną przez Wickensa i wsp., w J. Biol. Chem. 253, 2483 /1978/, z tym wyjątkiem, że w syntezie drugiej nici, zamiast polimerazy DNA I, używa się polimerazy RNA „Klenow fragment, patrz. H. Klenow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 168 /1970/. Układ miejsc restrykcyjnych w HGH jest taki, że miejsca restrykcyjne Hae ' III znajdują się w niekodującym regionie 3' i w sekwencji kodującej 23 i 24 aminokwas HGH, jak to przedstawiono na fig. 1. Działanie Hae III na ds cDNA HGH daje fragment o długości 551 par zasad /„b.p“/ kodujący aminokwasy HGH od 24 do 191. Tak więc, 90 ng cDNA poddaje się działaniu Hae III i elektrofoezie w 8% żelu poliakrylamidowym i eluuje się region o 530 b.p. Otrzymuje się około 1 ng cDNA.

Jako nośnik do klonowania cDNA wybiera się pBR322 przygotowany metodą F. Bolivara i wsp., Gene, 2, 95-113 /1977/. pBR322 został całkowicie scharakteryzowany, patrz J.G.Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium, 43,70 /1978/. Jest on plazmidem replikującym się z dużą ilością kopii, który wykazuje oporność zarówno na ampicylinę jak i tetracyklinę, wynikającą z obecności odpowienich genów /na fig. 4 odpowiednio „Ap^R“ i „Tc^R“/ oraz zawiera . miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych Pst I, Eco RI i Hind III, jak to przedstawiono na tej figurze.

Produkty rozszczepienia zarówno Hae III jak i Pst I mają wolne zakończenia. Można zastosować metodę zakończeń GC opisaną przez A.C.Y. Chang i wsp., Naturę, 275, 617 /1978/, w celu połączenia produktu rozszczepienia pBR322 za pomocą Pst, o wolnych zakończeniach i transkryptu mRNA potraktowanego Hae III, a następnie włączyć fragment cDNA do miejsca Pst I w pBR322 w taki sposób, aby odtworzyć miejsca restrykcyjne Hae III /GGCC/ w cDNA przy odtworzeniu miejsc restrykcyjnych Pst I /CTGCAG/ na każdym z końców włączanego fragmentu.

Tak więc, używa się terminalnej transferazy dezoksynukleotydowej /TdT/ w celu dodania około 20 reszt dC na zakończenie 3' w sposób uprzednio opisany przez A. Y.A. Chang, j.w. 60 ngpBR322 potraktowanego Pst I poddaje się operacji z użyciem około reszt dC na zakończenie 3'. Stapianie ds cDNA zakończonego dC z nośnikiem DNA zakończonym dG przeprowadza się w objętości 130 μ\ 10 mM Tris-Hcl o pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,25 mM EDTA. Mieszaninę ogrzewa się do temperatury 70°C, po czym pozwala się powoli ostygnąć do temperatury 37°C /12 godzin/, a następnie 20°C /6 godzin/, po czym używa do transformacji E.coli x 1776. Wyniki analizy sekwencji DNA plazmidu pHGH31 klonowanego w x 1776 metodą Maxama i Gilberta, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 /1977./ potwierdzają obecność kodonów odpowiadających aminokwasom HGH 24-191, przedstawionym na fig. 3.

E.coli K-12 szczep x 1776 posiada genotyp F” tonA53 dapD8 minAl supE42 Δ40 /gal-uvrB/ A^_minB2rfb-2nalA25 oms-2 thyA57^xmetC65 oms-1 A29A>ioH-asd/cycB2cycAl HsdR2x 1776 uzyskał certifikat National Institutes of Health jako układ gospodarz-wektor EK2.

x 1776 potrzebuje kwasu dwuaminopimelinowego /DAP/ jako składnika niezbędnego i jest niezdolny do syntezy mukopolisacharydowego kwasu cholanowego. Tak więc w podłożu z niedoborem lub brakiem DAP następuje śmierć tego szczepu zależna od braku DAP, pomimo dostatecznej do podtrzymywania metabolizmu i wzrostu ilości składników pokarmowych. Potrzebuje on tyminy lub tymidyny i w podłożu z brakiem tyminy i tymidyny następuje śmierć tego szczepu z degradacją DNA zależna od braku tyminy, pomimo obecności składników pokarmowych w ilości dostatecznej do zachowania aktywności metabolicznej. x 1776 jest niezwykle wrażliwy na żółć i z tego powodu niezdolny do przeżycia pasaży jelita szczura. x 1776 jest niezwykle wrażliwy na detergenty, antybiotyki, leki i chemikalia. x 1776jest niezdolny do prowadzenia zarówno reperacji ciemnej, jak i fotoreaktywacji uszkodzeń spowodowanych przez UV i jest przez to o kilka rzędów wielkości bardziej wrażliwy na światło słoneczne od szczepu E.coli typu dzikiego. x 1776 jest

149 278 oporny na wiele fagów wywołujących transdukcję i jest koniugacyjnie upośledzony pod względem dziedziczenia wielu sprzęganych plazmidów związanych z zaistnieniem różnych mutacji. x 1776jest oporny na kwas nalidiksinowy, cykloserynę i trimetoprin. Leki te można więc dodać do podłoża w celu umożliwienia kontroli szczepu i zapobiegania transformacji zanieczyszczających drobnoustrojów w czasie jej prowadzenia.

Czas jednej generacji rozwijającego się x 1776 wynosi około 50 minut, zarówno w podłożu L jak i Penassay przy uzupełnieniu 100 //zg DAP/ml i 4//zg tymidyny/ ml i osiąga końcową gęstość komórek wynoszącą 8-10 X 108 komórek/ml w fazie stacjonarnej. Łagodne mieszanie przez obroty i wstrząsanie posuwisto-zwrotne w ciągu 1-2 minut powoduje odpowiednie zawieszenie komórek z utrzymaniem żywotności w 100%. Dodatkowo szczegóły odnoszące się do x 1776 ukazały się w pracy R. Curtisa i wsp. pt. Molecular Cloning of Recombinat DNA, wyd. Scott i Werner Academic Press /Nf.Y. 1977/, str. 99-177. x 1776 został zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem rejestracyjnym 31537 w dniu 3 lipca 1979 r. i jest dostępny bez ograniczeń.

Przykład II. Konstruowanie i klonowanie syntetycznego fragmentu genu /fig. 1 i 2/.

Strategia konstrukcji quasi-syntetycznego genu HGH obejmuje konstrukcję syntetycznego fragmentu zawierającego restrykcyjne miejsce rozszczepienia z wolnym zakończeniem w punkcie, w którym fragment byłby połączony z transkryptem mRNA. Tak więc, jak to uwidoczniono na fig. 1, syntetyczny gen odpowiadający pierwszym 24 aminokwasom HGH zawiera miejsce rozszczepienia Hae III po 23-cim aminokwasie. Przeciwległy koniec syntetycznego fragmentu jest zaopatrzony w „łącznik ułatwiający stapianie z jednoniciowym zakończeniem powstałym w wyniku restrykcyjnego rozszczepienia plazmidu, w którym transkrypt mRNA i syntetyczny fragment byłby ostatecznie połączone.

Jak to przedstawiono na fig. 1 koniec 5' dwuniciowego fragmentu ma ułatwiające konstrukcję plazmidu jednoniciowe lepkie końce tworzone przez endonukleazy restrykcyjne Eco RI i Hind III. Kodon metioniny z lewej strony zapewnia miejsce inicjacji translacji, 12 różnych oligonukleotydów, różniących się wielkością w zakresie od undekameru do keksadekameru, syntetyzuje się ulepszoną fosfotriestrową metodą opisaną przez R.Crea w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 /1978/. Nukleotydy te, a mianowicie Ui do He i Li do L6 wskazane są strzałkami.

U₂ do Ue i L2 do Le fosforyluje się z użyciem kinazy polinukleotydowej T 4 i /y³²-P/ ATP metodą opublikowaną przez D.V. Goeddela i wsp. w Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 76,106 /1979/.

Przeprowadza się trzy oddzielne reakcje katalizowane ligazą T 4:10 /tg fragmentu Ui5'-OH łączy się z fosforylowym U2, L5 i Le łączy się fosforylowane U3, U4, L3 i L4 oraz 10/zg fragmentu Li 5'-OH łączy się z fosforylowym L2, U5 i U6. Reakcje łączenia prowadzi się w temperaturze 4°C przez 6 godzin w objętości 300μ\ 20mM Tris-HCl o pH 7,5, mM MgCl, 10 mM dwutiotreitolu, 0,5 mM ATP z użyciem 100 jednostek ligazy T 4. Następnie łączy się te trzy mieszaniny reakcyjne, dodając 100 jednostek ligazy T 4 i prowadzi się reakcję przez 12 godzin w temperaturze 20°C. Mieszaninę poddaje się wytrącaniu etanolem i elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym. Pasmo migrujące tak jak pasmo o długości 84 par zasad wycina się z żelu i eluuje. 1 /zg pBR322 poddaje się działaniu Eco RT i Hind III, a następnie duży fragment wyodrębniony przez elektroforezę w żelu łączy się z syntetycznym DNA. Mieszaniny używa się do transformowania E. coli szczep 294 /koniec A, thi\ har”, hem//. Szczep 294 został zdeponowany 30 października 1978 r. w American Type Collection /ATTC nr 31 446/ i jest dostępny bez ograniczeń. Wyniki analizy sekwencji insercji Eco RI-Hind III z plazmidu pHGH3 z jednego z transformantów, przeprowadzonej metodą Maxama i Gilberta, j.w. potwierdziłyby budowę przedstawioną na fig. 1.

Przykład III. Konstruowanie plazmidu w celu doprowadzenia do bakteryjnej ekspresji HGH /fig. 5/.

Konstruuje się replikujący się plazmid zawierający syntetyczny fragment z pHGH3 i transkrypt mRNA z PHGH31, z użyciem zdolnego do ekspresji plazmidu pGH6, jak to przedstawiono na fig. 5. Zdolny do ekspresji plazmid zawierający tandemowe promotory lac, konstruuje się najpierw w sposób następujący. Fragment Eco RI o długości 285 par zasad zawierający fragment promotora lac UV5 o długości 95 zasad, wyodrębniony za pomocą fragmentu heterologicznego DNA o długości 95 par zasad, który wyodrębnia się z plazmidu pKB68, patrz K. Backman i wsp. Celi, tom 13, 65-71 /1978/. Fragment o 285 b.p. włącza się do miejsca Eco RI w pBR322 i klonuje pGHl wyodrębniony z promotorami zorientowanymi w kierunku i w prawidłowej fazie odczytywania z

149 278 genem oporności na tetracyklinę. Miejsce Eco RI dalsze od tego ostatniego genu niszczy się przez częściowe trawienie za pomocą Eco RI, reperuje powstające jednoniciowe zakończenia Eco RI za pomocą polimerazy DNA i dokonuje recyrkularyzacji plazmidu przez łączenie wolnych końców. Otrzymany plazmid pGH6 zawiera pojedyncze miejsce Eco RI prawidłowo usytuowane w odniesieniu do układu promotorowego, do którego całkowity gen HGH może zostać włączony.

W celu przygotowania syntetycznego fragmentu do łączenia z transkryptem mRNA rozszczepia się 10 //g pHGH3 za pomocą endonukleaz restrykcyjnych Eco RI i Hae III, a następnie wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w 8% żelu poliakrylamidowym fragment o długości 77 par zasad zawierający sekwencję kodującą aminokwasy HGH od 1 do 23.

Następnie rozszczepia się za pomocą elektroforezy w żelu fragment o 551 b.p. odpowiadający sekwencji HGH i migrujący wspólnie z nim fragment pBR322 tworzony przez Hae III o 540 b.p. Następnie działanie Xma 1 rozszczepia tylko sekwencje HGH usuwając 39 par zasad z niekodującego regionu 3'. Powstający fragment o 512 b.p. oddziela się za pomocą elektroforezy w 6% żelu poliakrylamidowym od fragmentu pBR322 tworzonego przez Hae III o długości 540 b.p. 0,3 //g fragmentu Eco III — Hae III o 77 b.p. polimeryzuje się za pomocą ligazy T 4 prowadząc reakcję w objętości 16μ/1 przez 14 godziny w temperaturze 4°C. Mieszaninę ogrzewa się do 70°C przez 5 minut w celu inaktywacji ligazy, a następnie działa się na nią Eco III, w celu rozszczepienia fragmentów, które stały się dimerami w obrębie miejsc Eco RI, oraz Sma I, w celu rozszczepienia dimerów Xma

1. W wyniku otrzymuje się fragment o 591 b.p. z końcami: Eco Rl „lepkim i Sma 1 „wolnym. Po oczyszczeniu w 6% żelu poliakrylamidowym, otrzymuje się około 30 ng tego fragmentu. Należy zauważyć, żezdolnydo ekspresji plazmid pCH6 nie zawiera miejsca rozpoznawania Xma 1. Tym nie mniej Sma 1 rozpoznaje to samo miejsce co Xma 1 , ale dokonuje przecięcia w jego środku z uzyskaniem wolnych końców. Koniec fragmentu rozszczepionego Sma 1, otrzymanego z pHGH31, może być zgodnie z tym wolny i włączony do pGH6.

Na zdolny do ekspresji plazmid pGH6 zawierający tandem promotorów lac UV5, działa się kolejno Hind III, nukleazą S 1 i Eco RI i oczyszcza za pomocą elektroforezy w żelu. 50 ng powstałego nośnika o jednym końcu Eco RI lepkim i jednym końcu wolnym łączy się z 10 ng DNA HGH o 591 b.p. Po połączeniu mieszaniny reakcyjnej używa się do transformowania E.colix 1776. Kolonie selekcjonuje się przez naśladowanie tego naturalnego odstępu, przeprowadza się pCH 107 w pGH 107-1 za pomocą otwarcia tego pierwszego przy użyciu Eco RI, trawienie powstałych jednoniciowych końców endonukleazą SI i recyrkularyzacją przez łączenie wolnych końców za pomocą ligazy T4. Aczkolwiek powstający plazmid okazuje się również zdolny do ekspresji, niespodziewanie wykazuje ją, w bezpośrednim badaniu radioimmulogicznym, w stopniu mniejszym niż pGH 107.

Podczas gdy E.coli x 1776 jest korzystny w sposobie według wynalazku, wykonywanym w warunkach laboratoryjnych, to mógłby on wykazać ograniczoną jedynie przydatność praktyczną w dużej skali przemysłowej, pod względem wzrostu w obecności tetracykliny w stężeniu 12,5//g/mł. Godne uwagi jest to, że włączenie hybrydowego genu HGH do pGH6 niszczy promotor genu oporności na tetracyklinę, lecz tandem promotorów lac pozwala na odczytanie strukturalnego genu oporności na tetracyklinę, zachowując charakterystykę selekcyjną. Otrzymuje się około 400 transformantów.

Za pomocą hybrydyzacji z zastosowaniem filtrów metodą Grunsteina-EIognessa, Proc, Natl, Acad. Sci., USA, 72, 3961 /1975/ identyfikuje się 12 kolonii zawierających sekwencję HGH. Plazmidy wyodrębnione z trzech z tych kolonii wykazują oczekiwany układ miejsc restrykcyjnych po rozszczepieniu Hae III, Pvu II i Pst I. Określa się też sekwencję DNA jednego klonu, pHGH 107.

Ekspresję ludzkiego hormonu wzrostu w transformantach można łatwo stwierdzić przez bezpośrednie . badanie radioimmunologiczne, przeprowadzane za pomocą seryjnych rozcieńczeń supernatantów lizatów komórkowych, za pomocą zestawu Phadebas HGH PRIST /Pharmacia/.

W celu wykazania, że ekspresja HGH znajduje się pod kontrolą promotora lac, transformuje się za pomocą pGHG107 E.coli szczep D1210 lac + /l^aO + zly + /, z nadprodukcją represora lac. Znaczącego poziomu ekspresji HGH nie można stwierdzić przed dodaniem induktora IPTG /izopropylotiogalaktozyd/.

Usunięcie miejsca Eco RI w pGH107 prowadziłoby do utraty sygnału startowego ATG znajdującego się w takiej samej odległości od kodonów miejsca wiązania rybosomów promotora

149 278 lac, jaka istnieje w naturze między tymi kodonami a sygnałem startowym jJ-galaktozydazy i do stwierdzenia, czy można by było zwiększyć ekspresję z powodu ograniczeń celowo włączonych ze względu na bezpieczeństwo pod względem biologicznym. Przy odpowiednim poziomie ograniczeń raczej fizycznych niż biologicznych, można zastosować w operacjach na wielką skalę takie organizmy jak E.coli K-12 szczep 294, jw. oraz E.coli szczep RR1, genotyp: Pro^_Leu~Thi^_RB-recA + Str^rLac y”. E.coli RR1 można otrzymać z E.coli HB101. Patrz. H.W. Boyer i wsp. J. Mol. Biol., 41,459-472/1969/ przez krzyżowanie z E.coli K12 szczep KL 16 jako dawcą Hfr. Patrz J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics /Cold Spring Harbor, New York, 1972/. Hodowlę E.coli RR1 zdeponowano w dniu 10 października 1978 r. w American Type Culture Collection, pod numerem rejestracyjnym ATCC 31 343 i jest dostępny bez ograniczeń. Podobnie w dniu 3 lipca 1979 r. zdeponowano w American Type Culture Collection hodowlę x ' 1776 /ATCC nr 31 537?/. Również 3 lipca 1979 r. zdeponowano w American Type Culture Collection plazmid pHGH107 /ATCC nr 40 01 , plazmid pGH6 /ATCC nr 40 012./, szczepx!l776 transformowany pHGH107 /ATCC nr 31 538/ i E.coli K12 szczep 294 transformowany pGH6 /ATCC nr 31539,/.

Organizmy otrzymane sposobem według wynalazku można zastosować w wytwarzaniu metodą fermentacyjną w skali przemysłowej ludzkiego hormonu wzrostu, uzyskując produkt w znacznej ilości i do zastosowań dotychczas niedostępnych. Np. hodowle transformantu E.coli mogą rozwijać się w wodnych podłożach w fermentorach stalowych lub innych przy standardowym napowietrzaniu i mieszaniu, w temperaturze około 37°C i w pH bliskim obojętnego, takim jak np. pH 7±0,3, z dostarczeneiem odpowiednich składników pokarmowych, takich jak węglowodan lub gliceryna, źródło azotu, takie jak siarczan amonowy, źródło potasu, takie jak fosforan potasowy, pierwiastki śladowe, siarczan magnezowy itp. Transformowane organizmy korzystnie wykazują jedną lub więcej selekcyjną cechę charakterystyczną, taką jak oporność na antybiotyki tak, że można narzucić ciśnienie selekcyjne w celu utrudnienia kompetetywnego wzrostu E.coli dzikiego typu. Np. w przypadku organizmu opornego na ampicylinę lub tetracyklinę można dodać antybiotyku do podłoża fermentacyjnego w celu wyeliminowania przez selekcję dzikiego typu organizmu, któremu brak oporności jako cechy charakterystycznej.

Po zakończeniu fermentacji odwirowuje się zawiesinę bakteryjną lub w inny sposób wydziela się biomasę z brzeczki pofermentacyjnej i poddaje się lizie środkami fizycznymi lub chemicznymi. Komórkowy debris usuwa się z supernantantu, po czym wyodrębnia i oczyszcza rozpuszczalny hormon wzrostu.

Ludzki hormon wzrostu z ekstraktów bakteryjnych można oczyścić stosując jedną z następujących metod, lub ich kombinację: 1/ frakcjonowanie polietylenoiminą, 2/ sączenie molekularne na Sephacryl S—20^, 3/ chromatografia jonowymienna na żywicy Biorex-70 lub na CM Sephadex, 4/ frakcjonowanie siarczanem amonowym i/lub zależne od pH, 5/ chromotografia powinowactwa z użyciem żywicy z przeciwciałami przygotowanej z wykorzystaniem IgG przeciw HGH otrzymanej od uodpornionych zwierząt wsobnych lub mieszańców i desorpcją w warunkach kwasowych lub słabo denaturujących.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposóbkonssnuowama replikującego się wektora do kkonowama, z<l<^ll^^e^ow organizmie drobnoustroju do ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu, polegający na konstruowaniu genu przez syntezę chemiczną i odwrotną transkrypcję mRNA, a następnie włączeniu do wektora do klonowania otrzymanego genu kodującego ludzki hormon wzrostu, znąjduąccy się pod kontrolą promotora ekspresji, znamienny tym, że przez odwrotną transkrypcję z informacyjnego RNA otrzymuje się pierwszy fragment genu dla produktu ekspresji, zawierający część sekwencji kodującej ludzki hormon wzrostu, a w przypadku, gdy pierwszy ' fragment genu zawiera kodony nie ulegające translacji usuwa się te kodony, a pozostawia się część sekwencji kodującej, przy czym otrzymany fragment pomimo to koduje produkt ekspresji inny niż ludzki hormon wzrostu, i na drodze chemicznej syntezy organicznej wytwarza się drugi lub następne fragmenty genu kodującego pozostałą część sekwencji ludzkiego hormonu wzrostu, przy czym przynajmniej jeden z syntety11

149 278 cznych fragmentów koduje aminową część końcową ludzkiego hormonu wzrostu, a następnie otrzymane fragmenty włącza się do zdolnego do replikacji wektora do klonowania, w prawidłowej względem siebie wzajemnie fazie odczytywania i pod kontrolą promotora ekspresji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor do klonowania stosuje się plazmid bakteryjny. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wytwarza się na drodze chemicznej syntetyczny fragment lub fragmenty kodujące aminową część końcową ludzkiego hormonu wzrostu, który dodatkowo koduje z ekspresją sekwencję aminokwasów nadającą się do specyficznego rozszczepiania, przy czym syntetyczny fragment lub fragmenty włącza się w kierunku i we wspólnej fazie odczytywania ze -zdolnymi do ekspresji kodonami kodującymi białka.

4. Sposób według zastrz. '1, znamienny tym, że przez odwrotną transkrypcję wytwarza się pierwszy fragment zawierający większą część sekwencji kodującej ludzki hormon wzrostu.

5. Sposób według zastrz. -2, znamienny tym, że fragment syntetyczny i fragment transkryptu informacyjnego RNA łączy się między sobą przed umieszczeniem ich w wektorze do klonowania i tworzy się przeciwległe końce syntetycznego fragmentu i fragmentu transkryptu jako jednoniciowe albo wolne, żeby ułatwić łączenie obu fragmentów w porządku prawidłowym pod względem ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu.

6. Sposób według zastrz.4, znamienny tym, że jako pierwszy wytwarza się fragment genu zawierający kodony nie ulegające transkrypcji, które usuwa się i otrzymuje fragment przez działanie enzymem restrykcyjnym Hae III.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że fragment utworzony przez trawienie Hae III trawi się różnymi enzymami - restrykcyjnymi i odszczepia się kodony odpowiadające nie ulegającemu translacji informacyjnemu RNA, a jednocześnie wytwarza się jednoniciowe zakończenia na jednym z końców otrzymywanego fragmentu.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako drugi enzym restrykcyjny stosuje się Xma I.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się fragmenty genu zawierającego głównie cDNA lub jego kopię.

10. Sposób według zastrz. 2 albo 9, znamienny tym, że plazmidowi nadaje się oporność na co najmniej jeden antybiotyk.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wytwarza się plazmid bez promotora tet, wykazujący mimo to oporność na tetracyklinę.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że gen kodujący ludzki hormon wzrostu umieszcza się tak, żeby znajdował się pod kontrolą tandemu promotorów lac.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się plazmid pHGH107.

14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się plazmid pHGH107-l.

149 278 <

<

GCC UUU GAC ACC UAC CAG GAG UUU GAA GAA GCC UAU AUC CCA AAG GAA CAG AAG UAU UCA UUC CUG CAG AAC CCC CAG ACC UCC

O ao

3 O Ui X c o CL X X Φ X >. < (0 < o X o H X o o < x X x 3 o t-H X o (0 o 4J o o Φ X CO X < V 3) o X x > O — X < 2C < x X U o u O V o CL O U φ o rn < X 3) (0 < U un o < < PU X < o U X o V x M x V x X (0 o X 3) V o X X >, < o k-U < W X X < -JJ X < X «ł O 00 X a. u C o 00 o 33 u o (0 < X < u o O a X o O o < < a o 3 x U x o V u 33 V X V o X x X X < X X w X O o Cu X O U 3 U C X u X C o o V X X X X O X o 3» X O < O H < x 3) O o 3 O X O 00 x łu X o < i—l x lu o X < x o o O o < u H 3) o o 3 < M x O o 3 x x V o X < U o V 3) 33 X o H 3) P o X O o. x C υ 1— o U u 3 O 0 o (0 < (0 X V u V X u* < < < > x W X X o un 33 U o 3 < ΪΝ u X o V X V o V 3) o X o Os X 33 un X X o o X O o Pu 33

«I β

χ|

C3

O \O

(0 < o U X C 33 O U o X u X < o V X C < X X < «— o X < X ω < < O -d H 33 O o c O u x 3 < C CJ (0 33 f— < u < X < C < X O o u < < X O X < O 33 e < x 3 X u o U Q łH < X x Φ 33 X < Φ O o u < X U X < ω < U < V X 00 X 3 o X O X u X 33 U X V 33 «— O H < Pu 33 < < X O O o 3 < ·— X O X X 3 < 3 o X < u 33 CM »—1 X V 33 i— < X o > X o X 1— C_ O o 3 x U 33 4-1 X C < i— o — < V X V 33 --I O 33 X o CO < X < < o > O 00 X 00 O 3 X a. U Ui X Ui X Uu X Φ 33 0) X Φ X X X X X X U X X un X c X 3 X Ui X CL X 00 X (Λ X Φ 33 X X C X M X X X X U H X X X X X U« X Φ O C < c X C X Φ X X 33 < co X X X CO 33 Pu 33 X X X X X X o X c O Φ X co X C X Ul X X X ł— X •rl X r— X Pu X X X uu X X X X X Ui X X X X Ul X o X X X X 33 1— X Φ X 00 n X H < > U O X CC X > X O X o X 3 X c X Φ X Ui X Ui X »—l X co X 1— X Pu X Pu X O X X X m X Φ 33 3 X 3 X Ui X 00 X i—1 33 X «X X X X Ui X X X X X rj X E-i X X X Ul 33 3 X 3 X cx X 3 X Φ U Φ 33 Φ X (0 X Φ X cn 33 hJ O X X X X X 3 O CL X CL X Φ X Φ X X X Ui X 0) X X X X X O O Hi 33 X X (Lu X Pu X Ui X Uu O (0 X C X Ui X Φ X Φ X X X X X X X cn 33 CO 33 X X X X H X O X C O 3 X Ui X 3 X X 33 X Φ X Φ X 1— X Pu 33 X X X X co X X X (Λ 33 Φ c_> 3 X U X X X X t-H 33 Φ X X X «0 X o 33 '-d X X X H X > X 3 U 3 O CL X Ui X C X Φ 33 Φ 33 rn X X X X X X U X O X X H X X X

GCCUCUCCUGGCC.

Eco RI

Pctl

HiniTS.

I mRNA ]pdnrotna transkryptaza

Klanów Roli t

d.s. CDNA oczyszczanie fragmentu o 551 bp z żelu \terminalna transferaza | ♦dGTP '

HooTL cccc

Odwrotna transferaza dCTP stapianie transformacja κ 1776

ECO RI

4.

Ap ftoRI \68yszaanie fragmentu fragmentu o 77bp 2 ietu \pći2pclancef^mentu *»» *».» ^z ZeLu lioaza T4 oczyszczanie fragmentu nukLeazaSl lioaza T4 transformacja ί 17ro seLekcja pod mzgLęcLern

Tc ^K fwRI

3.

Pracownia Poligraficzna UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 1500 zł