JPH0720436B2 - 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法 - Google Patents
合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法Info
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- JPH0720436B2 JPH0720436B2 JP63500756A JP50075688A JPH0720436B2 JP H0720436 B2 JPH0720436 B2 JP H0720436B2 JP 63500756 A JP63500756 A JP 63500756A JP 50075688 A JP50075688 A JP 50075688A JP H0720436 B2 JPH0720436 B2 JP H0720436B2
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- Japan
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- growth hormone
- salmon growth
- vector
- yeast
- escherichia coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ この発明は酵母またはエシェリヒア・コリに合成遺伝子
を使用してサケ成長ホルモンを製造する方法に関するも
のである。
を使用してサケ成長ホルモンを製造する方法に関するも
のである。
今日まで養魚場では、飼料効率を高めるため、使用する
飼料に高タンパク質含有飼料またはホルモン性ステロイ
ドを添加してきた。しかし米国を含めて文明国では、ス
テロイドがすぐに代謝されず投与後魚体内に長期間残留
するため、ステロイドの存在が魚を食べたものに有害で
あることが判明して、これらのステロイドの使用を禁止
するところが増加してきた。
飼料に高タンパク質含有飼料またはホルモン性ステロイ
ドを添加してきた。しかし米国を含めて文明国では、ス
テロイドがすぐに代謝されず投与後魚体内に長期間残留
するため、ステロイドの存在が魚を食べたものに有害で
あることが判明して、これらのステロイドの使用を禁止
するところが増加してきた。
一方、サケの成長ホルモンは投与後魚体内に残留せず、
またそれがサケ自身のタンパク質であるから種特異性を
有するため、飼料効率を増大し得るのに最も好ましい物
質である。
またそれがサケ自身のタンパク質であるから種特異性を
有するため、飼料効率を増大し得るのに最も好ましい物
質である。
この発明者は、遺伝子操作技術により酵母またはエシェ
リヒア・コリでサケの成長ホルモンを経済的かつ大量に
生産し得ることを発見した。
リヒア・コリでサケの成長ホルモンを経済的かつ大量に
生産し得ることを発見した。
［発明の要約］ この発明の一目的は、酵母を発現ベクターの宿主として
使用し、サケの成長ホルモンを生産する方法を提供する
ことにある。
使用し、サケの成長ホルモンを生産する方法を提供する
ことにある。
この発明のもう一つの目的は、エシェリヒア・コリを発
現ベクターの宿主として使用し、サケの成長ホルモンを
生産する方法を提供することにある。
現ベクターの宿主として使用し、サケの成長ホルモンを
生産する方法を提供することにある。
第一に、酵母を発現ベクターの宿主として使用するサケ
成長ホルモンを生産する方法は （ａ）サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、Xba
I、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を有するオリゴヌク
レオチドを合成し、 （ｂ）ライゲーション・ストラテジーにしたがった、Xb
aI/HindIII部位を有する一断片およびHindIII/SalI部位
を有する他の断片をそれぞれプラスミドpUC18へつな
ぎ、（ｃ）２個のクローン化した断片をプラスミドpUC1
8へ再ライゲーションして、Ｎ−末端部分を欠いたサケ
成長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）プロモーターおよびタ
ーミネーターからなるプラスミドへ部分サケ成長ホルモ
ン遺伝子およびＮ−末端合成アダプターを挿入して、Ｎ
−末端合成アダプター・ターミネーターを有するプロモ
ーター・サケ成長ホルモンカセットを作成し、（ｅ）酵
母に形質発現するためのエシェリヒア・コリ−酵母−シ
ャトルベクターカセットを挿入し、（ｆ）得られたベク
ターを酵母細胞で形質発現することからなる。
成長ホルモンを生産する方法は （ａ）サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、Xba
I、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を有するオリゴヌク
レオチドを合成し、 （ｂ）ライゲーション・ストラテジーにしたがった、Xb
aI/HindIII部位を有する一断片およびHindIII/SalI部位
を有する他の断片をそれぞれプラスミドpUC18へつな
ぎ、（ｃ）２個のクローン化した断片をプラスミドpUC1
8へ再ライゲーションして、Ｎ−末端部分を欠いたサケ
成長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）プロモーターおよびタ
ーミネーターからなるプラスミドへ部分サケ成長ホルモ
ン遺伝子およびＮ−末端合成アダプターを挿入して、Ｎ
−末端合成アダプター・ターミネーターを有するプロモ
ーター・サケ成長ホルモンカセットを作成し、（ｅ）酵
母に形質発現するためのエシェリヒア・コリ−酵母−シ
ャトルベクターカセットを挿入し、（ｆ）得られたベク
ターを酵母細胞で形質発現することからなる。
Ｎ−末端合成アダプターは下記のNcoI部位およびXbaI部
位を有するヌクレオチド配列である。
位を有するヌクレオチド配列である。
酵母形質発現ベクターは、Ｎ−末端合成アダプター・タ
ーミネーター、完全な２ミクロン、Leu2d遺伝子および
複製起源を有するプロモーター−サケ成長ホルモン遺伝
子からなるカセットを含有し、pC1/1−SGHと命名され
る。
ーミネーター、完全な２ミクロン、Leu2d遺伝子および
複製起源を有するプロモーター−サケ成長ホルモン遺伝
子からなるカセットを含有し、pC1/1−SGHと命名され
る。
第二に、エシェリヒア・コリを発現ベクターの宿主とし
て使用するサケ成長ホルモンを生産する方法は （ａ）サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、Xba
I、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を有するオリゴヌク
レオチドを合成し、（ｂ）ライゲーション・ストラテジ
ーにしたがったXbaI/HindIII部位を有するＮ−末端断片
およびHindIII/SalI部位を有するＣ−末端断片をそれぞ
れプラスミドpUC18へつなぎ、（ｃ）２個のクローン化
した断片をプラスミドpUC18へ再ライゲーションして、
Ｎ−末端部分を欠いたサケ成長ホルモン遺伝子を得、
（ｄ）部分サケ成長ホルモン遺伝子およびＮ−末端合成
アダプターをプラスミドpBR322へ挿入し、（ｅ）得られ
たサケ成長ホルモン遺伝子および合成アダプターをtrp
プロモーターを有する形質発現ベクターへライゲーショ
ンし、（ｆ）作成した合成アダプターを含有するベクタ
ーをエシェリヒア・コリで形質発現することからなる。
て使用するサケ成長ホルモンを生産する方法は （ａ）サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、Xba
I、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を有するオリゴヌク
レオチドを合成し、（ｂ）ライゲーション・ストラテジ
ーにしたがったXbaI/HindIII部位を有するＮ−末端断片
およびHindIII/SalI部位を有するＣ−末端断片をそれぞ
れプラスミドpUC18へつなぎ、（ｃ）２個のクローン化
した断片をプラスミドpUC18へ再ライゲーションして、
Ｎ−末端部分を欠いたサケ成長ホルモン遺伝子を得、
（ｄ）部分サケ成長ホルモン遺伝子およびＮ−末端合成
アダプターをプラスミドpBR322へ挿入し、（ｅ）得られ
たサケ成長ホルモン遺伝子および合成アダプターをtrp
プロモーターを有する形質発現ベクターへライゲーショ
ンし、（ｆ）作成した合成アダプターを含有するベクタ
ーをエシェリヒア・コリで形質発現することからなる。
エシェリヒア・コリ形質発現ベクターのＮ−末端合成ア
ダプターはNdeIおよびXbaI部位を有し、38量体（５′−
T ATG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AAC ATT GCA ATT
T−３′）からなる上流鎖および40量体（３′−AC TAG
CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT CAA AGA TC−
５′）からなる下流鎖を含んだヌクレオチド配列であ
る。
ダプターはNdeIおよびXbaI部位を有し、38量体（５′−
T ATG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AAC ATT GCA ATT
T−３′）からなる上流鎖および40量体（３′−AC TAG
CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT CAA AGA TC−
５′）からなる下流鎖を含んだヌクレオチド配列であ
る。
部分プロモーター配列のもう一つの合成アダプターは、
HpalおよびNdeI部位を有し、36量体（５′−AAC TAG TA
C GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT AAT ACA−３′）から
なる上流鎖および38量体（３′−TTG ATC ATG CGT TCA
AGT GCA TTT TTC CCA TTA TGT AT−５′）からなる下流
鎖を含んだヌクレオチド配列である。
HpalおよびNdeI部位を有し、36量体（５′−AAC TAG TA
C GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT AAT ACA−３′）から
なる上流鎖および38量体（３′−TTG ATC ATG CGT TCA
AGT GCA TTT TTC CCA TTA TGT AT−５′）からなる下流
鎖を含んだヌクレオチド配列である。
この発明についてさらに理解を深めるため、この発明の
好ましい態様を説明した添付図面ならびに記載事項につ
いて説明する。
好ましい態様を説明した添付図面ならびに記載事項につ
いて説明する。
［図面の簡単な説明］ 第１図は５′−末端から３′−末端へ塩基配列によって
示したサケ成長ホルモン遺伝子に対応する合成オリゴヌ
クレオチドである。
示したサケ成長ホルモン遺伝子に対応する合成オリゴヌ
クレオチドである。
第２図は第１図の合成オリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン・ストラテジーである。
ョン・ストラテジーである。
第３図は合成オリゴヌクレオチドをプラスミドpUC18へ
クローンするクローニング手順を示した略図である。
クローンするクローニング手順を示した略図である。
第４図は確認したサケ成長ホルモン遺伝子の塩基配列お
よび推定アミノ酸配列である。
よび推定アミノ酸配列である。
第５図は酵母でサケ成長ホルモンを生産するための酵母
形質発現ベクター（pC1/1）へのクローニング手順であ
る。
形質発現ベクター（pC1/1）へのクローニング手順であ
る。
第６図はサケ成長ホルモン遺伝子をエシェリヒア・コリ
で形質発現するためのクローニング・ストラテジーであ
る。
で形質発現するためのクローニング・ストラテジーであ
る。
第７図は酵母細胞で生産されたサケ成長ホルモンをSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した成績
である。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した成績
である。
第８図はエシェリヒア・コリで生産されたサケ成長ホル
モンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確
認した成績である。
モンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確
認した成績である。
［好ましい態様の詳細な説明］ この発明では、セキネら［プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・USA、82巻（1985年）、4308頁］によって報告
されたサケ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づき、酵母
細胞によって優勢に利用されるアミノ酸コドンを有する
サケ成長ホルモンの塩基配列を選び、DNAシンセサイザ
ー（アプライド・バイオシステム・モデル380B、USA）
を使用し、ホスホルアミデート法によって成熟サケ成長
ホルモンの完全な遺伝子を化学的に合成した。
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・USA、82巻（1985年）、4308頁］によって報告
されたサケ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づき、酵母
細胞によって優勢に利用されるアミノ酸コドンを有する
サケ成長ホルモンの塩基配列を選び、DNAシンセサイザ
ー（アプライド・バイオシステム・モデル380B、USA）
を使用し、ホスホルアミデート法によって成熟サケ成長
ホルモンの完全な遺伝子を化学的に合成した。
エシェリヒア・コリのベクター、pUC18［ノーランダ
ー、J.ら、ジーン、36巻（1983年）、101頁］に合成オ
リゴヌクレオチドをライゲーションして挿入し、533bp
のXbaI/SalI制限断片を含んだpSGH（533）を作成した
が、このものは完全なサケ成長ホルモン遺伝子のＮ−末
端領域を有していない（第３図参照）。
ー、J.ら、ジーン、36巻（1983年）、101頁］に合成オ
リゴヌクレオチドをライゲーションして挿入し、533bp
のXbaI/SalI制限断片を含んだpSGH（533）を作成した
が、このものは完全なサケ成長ホルモン遺伝子のＮ−末
端領域を有していない（第３図参照）。
第一に酵母細胞でサケ成長ホルモンを生産する方法は、
下記のように、合成アダプターを有する完全なサケ成長
ホルモンを含んだクローンをプロモーターおよびターミ
ネーター遺伝子を有するベクター、pBS100［イースト、
２巻、72頁（1986年）；シロン・コーポレーション、エ
マリービル、CA94608、USA］のNcol部位およびSalI部位
の間にライゲーションして酵母で形質発現する（ここで
該アダプターはNcoI制限酵素部位、開始コドンおよびサ
ケ成長ホルモンのＮ−末端領域に対応する若干のアミノ
酸コドンを含んでいる）。得られたベクターはpBS−SGH
である。
下記のように、合成アダプターを有する完全なサケ成長
ホルモンを含んだクローンをプロモーターおよびターミ
ネーター遺伝子を有するベクター、pBS100［イースト、
２巻、72頁（1986年）；シロン・コーポレーション、エ
マリービル、CA94608、USA］のNcol部位およびSalI部位
の間にライゲーションして酵母で形質発現する（ここで
該アダプターはNcoI制限酵素部位、開始コドンおよびサ
ケ成長ホルモンのＮ−末端領域に対応する若干のアミノ
酸コドンを含んでいる）。得られたベクターはpBS−SGH
である。
ベクターpBS−SGHをBamHI制限酵素で処理し、プロモー
ター、サケ成長ホルモン遺伝子およびターミネーターを
含んだBamHI断片（約2.7Kb）を分離した。エシェリヒア
・コリおよび酵母自動的に複製される酵母形質発現ベク
ターpC1/1［ATCC37115;ブレークら、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・USA、81巻（1984年）、4642頁］のB
amHI制限酵素部位へこのBamHI断片を挿入してpC1/1−SG
Hを作成した（第５図参照）。
ター、サケ成長ホルモン遺伝子およびターミネーターを
含んだBamHI断片（約2.7Kb）を分離した。エシェリヒア
・コリおよび酵母自動的に複製される酵母形質発現ベク
ターpC1/1［ATCC37115;ブレークら、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・USA、81巻（1984年）、4642頁］のB
amHI制限酵素部位へこのBamHI断片を挿入してpC1/1−SG
Hを作成した（第５図参照）。
上記の酵母形質発現ベクターを、ヒネンらの方法によ
り、酵母株DC04［ブローチ、J.R.＆ヒックス、J.B.、セ
ル、21巻、501頁（1980年）；イースト・ジェネティッ
ク・ストック・センター・ユニバーシティー・オブ・カ
リホルニア、バークレイ、USA］にクローンした。形質
転換した酵母細胞を実施例４に示したように２％グルコ
ースを含有するYEPD培地で48時間培養した。グルコース
濃度が消耗されるとサケ成長ホルモンは自動的に誘導さ
れ、OD650＝15で培養１リットル当り約50mgのサケ成長
ホルモンが生産された。
り、酵母株DC04［ブローチ、J.R.＆ヒックス、J.B.、セ
ル、21巻、501頁（1980年）；イースト・ジェネティッ
ク・ストック・センター・ユニバーシティー・オブ・カ
リホルニア、バークレイ、USA］にクローンした。形質
転換した酵母細胞を実施例４に示したように２％グルコ
ースを含有するYEPD培地で48時間培養した。グルコース
濃度が消耗されるとサケ成長ホルモンは自動的に誘導さ
れ、OD650＝15で培養１リットル当り約50mgのサケ成長
ホルモンが生産された。
第二にエシェリヒア・コリでサケ成長ホルモンを生産す
る方法は、下記のように、XbaI/SalI制限酵素断片およ
びコドンとして設計されたＮ−末端合成アダプター［こ
こで、ATG領域（開始コドン）はNdeI制限酵素で切断さ
れてもよく、エシェリヒア・コリ内で優勢に使用され
る］をエシェリヒア・コリのベクターpBR322へ最終的に
ライゲーションする（実施例３参照）。
る方法は、下記のように、XbaI/SalI制限酵素断片およ
びコドンとして設計されたＮ−末端合成アダプター［こ
こで、ATG領域（開始コドン）はNdeI制限酵素で切断さ
れてもよく、エシェリヒア・コリ内で優勢に使用され
る］をエシェリヒア・コリのベクターpBR322へ最終的に
ライゲーションする（実施例３参照）。
SD（シャイン・ダルガーノ）配列およびATG（開始コド
ン）間の塩基がmRNAの二次構造を生じないよう好適に配
置されている合成オリゴヌクレオチドを有する完全成長
ホルモン遺伝子を含んだ571塩基対のNdeI/SalI制限酵素
断片を、エシェリヒア・コリに形質発現するベクターpt
rp322［ラッセル、D.R.＆ベンネット、G.N.、ジーン、2
0巻、23頁（1981年）；ファルマシア・Inc.ピカタウエ
イ、N.J.08854、USA］にライゲーションし、これをHpaI
およびSalI制限酵素で切断した。その後、得られたベク
ター（ptrp322HSGH）をエシェリヒア・コリW3110（ATCC
27325）にクローニングした（実施例３参照）。M9培地
中、IAA（インドールアクリル酸）を誘導剤として使用
することにより、サケ成長ホルモン遺伝子はエシェリヒ
ア・コリで発現され、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって成長ホルモンを同定した（実施例５参
照）。
ン）間の塩基がmRNAの二次構造を生じないよう好適に配
置されている合成オリゴヌクレオチドを有する完全成長
ホルモン遺伝子を含んだ571塩基対のNdeI/SalI制限酵素
断片を、エシェリヒア・コリに形質発現するベクターpt
rp322［ラッセル、D.R.＆ベンネット、G.N.、ジーン、2
0巻、23頁（1981年）；ファルマシア・Inc.ピカタウエ
イ、N.J.08854、USA］にライゲーションし、これをHpaI
およびSalI制限酵素で切断した。その後、得られたベク
ター（ptrp322HSGH）をエシェリヒア・コリW3110（ATCC
27325）にクローニングした（実施例３参照）。M9培地
中、IAA（インドールアクリル酸）を誘導剤として使用
することにより、サケ成長ホルモン遺伝子はエシェリヒ
ア・コリで発現され、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって成長ホルモンを同定した（実施例５参
照）。
以下に実施例をあげてこの発明を説明する。実施例は単
に発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限
定する目的をもつものではない。
に発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限
定する目的をもつものではない。
実施例１ サケ成長ホルモン遺伝子の合成オリゴヌクレオチドのラ
イゲーションおよびクローニング 第１図に示した配列を有する合成オリゴヌクレオチドか
ら完全なサケ成長ホルモン遺伝子を得るため、第２図に
示したライゲーション・ストラテジーおよびベクターpU
C18を使用した。
イゲーションおよびクローニング 第１図に示した配列を有する合成オリゴヌクレオチドか
ら完全なサケ成長ホルモン遺伝子を得るため、第２図に
示したライゲーション・ストラテジーおよびベクターpU
C18を使用した。
サケ成長ホルモン遺伝子のＣ−末端HindIIIおよびSalI
制限断片に対応する各オリゴヌクレオチド（U8−U14/L9
−L14）をそれぞれ0.05（OP260量取り、別々に乾燥し
た。50mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM ATP、1mM DTTおよ
び10mM MgCl2を含有する全量30μ１にT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ４単位を添加し、各オリゴヌクレオチドの
５′−末端残基をリン酸化するため、これらを30分間反
応した。
制限断片に対応する各オリゴヌクレオチド（U8−U14/L9
−L14）をそれぞれ0.05（OP260量取り、別々に乾燥し
た。50mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM ATP、1mM DTTおよ
び10mM MgCl2を含有する全量30μ１にT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ４単位を添加し、各オリゴヌクレオチドの
５′−末端残基をリン酸化するため、これらを30分間反
応した。
オリゴヌクレオチドをプールし、これと同量のフェノー
ルおよびクロロホルム混合液（24:1、v/v）で処理し、
エタノールで沈殿する。沈澱を60mMトリス−HCl（pH7.
5）、1mM DTTおよび10mM MgCl2からなる緩衝液53μｌに
溶解した。この溶液を95℃の水浴に入れ、ついで温度が
室温に戻るまで６時間室温に保った。
ルおよびクロロホルム混合液（24:1、v/v）で処理し、
エタノールで沈殿する。沈澱を60mMトリス−HCl（pH7.
5）、1mM DTTおよび10mM MgCl2からなる緩衝液53μｌに
溶解した。この溶液を95℃の水浴に入れ、ついで温度が
室温に戻るまで６時間室温に保った。
T4 DNA20単位および10mM ATP5μｌをこの溶液に加え、
室温で10分間ライゲーション反応を実施した。この反応
液を前記と同様にフェノールおよびクロロホルム混合液
で処理し、エタノールで沈殿させた。
室温で10分間ライゲーション反応を実施した。この反応
液を前記と同様にフェノールおよびクロロホルム混合液
で処理し、エタノールで沈殿させた。
60mM トリス−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2および100mM
NaClからなる緩衝液の存在で、この沈殿にHindIIIおよ
びSalI制限酵素各10単位を加え、37℃で１時間反応す
る。
NaClからなる緩衝液の存在で、この沈殿にHindIIIおよ
びSalI制限酵素各10単位を加え、37℃で１時間反応す
る。
７％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、220〜300塩
基対に対応するバンドをゲルから切り出す。電気溶出
後、沈殿を蒸留水20μｌに溶解した。
基対に対応するバンドをゲルから切り出す。電気溶出
後、沈殿を蒸留水20μｌに溶解した。
DNA3μｌおよびHindIIIおよびSalI制限酵素で切断した
ベクターpUC18 10ngを、60mM トリス−HCl（pH7.
5）、10mM MgCl2および1mM ATPからなる溶液中、T4 DN
Aリガーゼ10単位の存在で14℃で16時間、ライゲーショ
ンした。
ベクターpUC18 10ngを、60mM トリス−HCl（pH7.
5）、10mM MgCl2および1mM ATPからなる溶液中、T4 DN
Aリガーゼ10単位の存在で14℃で16時間、ライゲーショ
ンした。
エシェリヒア・コリJM103［BRL、USA、メッシング、
J.、メソッズ・イン・エンザイモロジー、101巻、20頁
（1983年）］受容細胞をライゲーション混合液に加え、
ハナハンの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、118巻、557頁（1983年）］により37℃で一
夜形質転換した。
J.、メソッズ・イン・エンザイモロジー、101巻、20頁
（1983年）］受容細胞をライゲーション混合液に加え、
ハナハンの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、118巻、557頁（1983年）］により37℃で一
夜形質転換した。
バーンボイムおよびドリーの方法［ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、７巻、1513頁（1979年）］により、白
色コロニーから組換え体ベクターp3′−SGHを選び出し
た。
ッズ・リサーチ、７巻、1513頁（1979年）］により、白
色コロニーから組換え体ベクターp3′−SGHを選び出し
た。
一方、合成オリゴヌクレオチドのＮ−末端XbaIおよびHi
ndIII制限断片に対応するオリゴヌクレオチド（U1−U7/
L2−L8）を上記と同様の方法によってそれぞれライゲー
ションし、pUC18へ挿入して、XbaIおよびHindIII制限酵
素で切断することにより、第３図に示した方法によって
p5′−SGHを得た。
ndIII制限断片に対応するオリゴヌクレオチド（U1−U7/
L2−L8）を上記と同様の方法によってそれぞれライゲー
ションし、pUC18へ挿入して、XbaIおよびHindIII制限酵
素で切断することにより、第３図に示した方法によって
p5′−SGHを得た。
最後に、サンガー・ジデオキシ・チエイン・ターミネー
ション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、7
4巻、5473頁（1977年）］により、p3′−SGHおよびp5′
−SGHのDNA配列を確認した（第４図参照）。
ション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、7
4巻、5473頁（1977年）］により、p3′−SGHおよびp5′
−SGHのDNA配列を確認した（第４図参照）。
p3′−SGHからのHindIII/SalI制限断片およびp5′−SGH
からのXbaI/HindIII制限断片をそれぞれ単離し、これら
をベクターpUC18にライゲーションし、XbaIおよびSalI
制限酵素で切断してpSGH（533）を作成した。（第３図
参照）。
からのXbaI/HindIII制限断片をそれぞれ単離し、これら
をベクターpUC18にライゲーションし、XbaIおよびSalI
制限酵素で切断してpSGH（533）を作成した。（第３図
参照）。
実施例２ 酵素細胞で形質発現する合成サケ成長ホルモン遺伝子の
操作pSGH（533）には完全なサケ成長ホルモン遺伝子の
５′−末端欠損部分が存在しており、DNAシンセサイザ
ーによってこれを合成した。この合成アダプターには、
酵母細胞で優勢に使用される選択コドンによりNcoI制限
酵素部位、開始コドンおよびサケ成長ホルモンのNH2−
末端12アミノ酸に対応するコドンを合成した（第５図参
照）。
操作pSGH（533）には完全なサケ成長ホルモン遺伝子の
５′−末端欠損部分が存在しており、DNAシンセサイザ
ーによってこれを合成した。この合成アダプターには、
酵母細胞で優勢に使用される選択コドンによりNcoI制限
酵素部位、開始コドンおよびサケ成長ホルモンのNH2−
末端12アミノ酸に対応するコドンを合成した（第５図参
照）。
クローニングの手順は、下記のようにXbaIおよびSalI制
限酵素でpSGH（533）を処理して、533bpに対応する制限
酵素切断断片を得、アガロース電気泳動によってこの断
片を分離することからなる。
限酵素でpSGH（533）を処理して、533bpに対応する制限
酵素切断断片を得、アガロース電気泳動によってこの断
片を分離することからなる。
合成アダプターを、前記と同様にT4 ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化した。リン酸化したアダプター試薬
１μｌ、成長ホルモン遺伝子のXbaI/SalI断片３μｌ（3
0ng）およびNcolおよびSalI制限酵素で切断したベクタ
ーpBS100［イースト、２巻、72頁（1986年）］１μｌ
（7ng）を10mM ATP2μｌ、10倍濃厚なライゲーション反
応緩衝液２μｌ、リガーゼ１μｌおよび蒸留水10μｌの
存在で混合し、14℃で16時間インキュベートした。実施
例１の記載と同様に、ライゲーション混合物をエシェリ
ヒア・コリ細胞HB101（ATCC33694）にクローニングし、
酵母で形質発現するプロモーター、完全なサケ成長ホル
モン遺伝子およびターミネーターからなる組換え体ベク
ターpBS−SGHを得た。
キナーゼでリン酸化した。リン酸化したアダプター試薬
１μｌ、成長ホルモン遺伝子のXbaI/SalI断片３μｌ（3
0ng）およびNcolおよびSalI制限酵素で切断したベクタ
ーpBS100［イースト、２巻、72頁（1986年）］１μｌ
（7ng）を10mM ATP2μｌ、10倍濃厚なライゲーション反
応緩衝液２μｌ、リガーゼ１μｌおよび蒸留水10μｌの
存在で混合し、14℃で16時間インキュベートした。実施
例１の記載と同様に、ライゲーション混合物をエシェリ
ヒア・コリ細胞HB101（ATCC33694）にクローニングし、
酵母で形質発現するプロモーター、完全なサケ成長ホル
モン遺伝子およびターミネーターからなる組換え体ベク
ターpBS−SGHを得た。
上記のベクターpBS100はアルコールデヒドロゲナーゼII
プロモーターおよびグリセルアルデヒド−３′−リン酸
デヒドロゲナーゼプロモーターのハイブリッドプロモー
ターを含有している。
プロモーターおよびグリセルアルデヒド−３′−リン酸
デヒドロゲナーゼプロモーターのハイブリッドプロモー
ターを含有している。
ベクターpBS−SGHをBamHI制限酵素で処理して、ハイブ
リッドプロモーター、サケ成長ホルモン遺伝子およびグ
リセルアルデヒド−３′−リン酸デヒドロゲナーゼのタ
ーミネーターを含んだ約2700bpのBamHI制限断片を分離
した。このBamHI制限断片を酵母形質発現ベクターpC1/1
（ATCC37115）のBamHI制限酵素部位へ挿入し、pC1/1−S
GHを得た（第５図参照）。
リッドプロモーター、サケ成長ホルモン遺伝子およびグ
リセルアルデヒド−３′−リン酸デヒドロゲナーゼのタ
ーミネーターを含んだ約2700bpのBamHI制限断片を分離
した。このBamHI制限断片を酵母形質発現ベクターpC1/1
（ATCC37115）のBamHI制限酵素部位へ挿入し、pC1/1−S
GHを得た（第５図参照）。
pC1/1−SGH遺伝子10μｇを、ヒネンの方法［プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・USA、75巻（1978年）、1929
頁］により、酵母株DCO4［イースト・ジェネティック・
ストック・センター、ユニバーシティー・オブ・カリフ
ォルニア、バークレイ、USA、ブローチ、J.R.＆ ヒッ
クス、J.B.、セル、21巻、501頁（1980年）］にクロー
ニングし、１リットル当り、アミノ酸無含有酵母窒素塩
基6.7g、ソルビット−２％グルコース182g、Leu−サッ
プルメント0.25gおよびバクトアガール20gを含有するロ
イシン無含有寒天プレートでこれを培養した。
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・USA、75巻（1978年）、1929
頁］により、酵母株DCO4［イースト・ジェネティック・
ストック・センター、ユニバーシティー・オブ・カリフ
ォルニア、バークレイ、USA、ブローチ、J.R.＆ ヒッ
クス、J.B.、セル、21巻、501頁（1980年）］にクロー
ニングし、１リットル当り、アミノ酸無含有酵母窒素塩
基6.7g、ソルビット−２％グルコース182g、Leu−サッ
プルメント0.25gおよびバクトアガール20gを含有するロ
イシン無含有寒天プレートでこれを培養した。
形質転換３〜５日後に、サケ成長ホルモン遺伝子を含ん
だ組換え体クローンが認められた。
だ組換え体クローンが認められた。
実施例３ 完全な成長ホルモン遺伝子をエシェリヒア・コリ形質発
現ベクターへ挿入する操作 完全なサケ成長ホルモン遺伝子のNH2−末端に相当するD
NA配列として、エシェリヒア・コリで優勢に使用される
コドンを選んだ。
現ベクターへ挿入する操作 完全なサケ成長ホルモン遺伝子のNH2−末端に相当するD
NA配列として、エシェリヒア・コリで優勢に使用される
コドンを選んだ。
38量体（５′−T ATG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AA
C ATT GCA GTT T−３′）からなる上流鎖および40量体
（３′−AC TAG CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT
CAA AGA TC−５′）からなる下流鎖を含んだNdeIおよ
びXbaIアダプターを合成した。pSGHから分離した533塩
基対からなるXbaI/SalI断片および合成アダプターをエ
シェリヒア・コリに対するベクターpBR322［ATCC3701
7］へ挿入し、これをNdeIおよびSalI制限酵素で切断し
て完全なサケ成長ホルモン遺伝子を含んだpBR SGHクロ
ーンを得た（第６図参照）。
C ATT GCA GTT T−３′）からなる上流鎖および40量体
（３′−AC TAG CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT
CAA AGA TC−５′）からなる下流鎖を含んだNdeIおよ
びXbaIアダプターを合成した。pSGHから分離した533塩
基対からなるXbaI/SalI断片および合成アダプターをエ
シェリヒア・コリに対するベクターpBR322［ATCC3701
7］へ挿入し、これをNdeIおよびSalI制限酵素で切断し
て完全なサケ成長ホルモン遺伝子を含んだpBR SGHクロ
ーンを得た（第６図参照）。
trp−プロモーターを有する形質発現ベクターptrp322を
HpaIおよびSalI制限酵素で切断した。2.3Kbの断片をア
ガロースゲル電気泳動に掛けて電気溶出し、エタノール
で沈殿した。
HpaIおよびSalI制限酵素で切断した。2.3Kbの断片をア
ガロースゲル電気泳動に掛けて電気溶出し、エタノール
で沈殿した。
上記のpBR SGHをNdeIおよびSalI制限酵素で処理して571
bpの断片を得た。trpプロモーターのSD配列（５′−AAG
G−３′）およびサケ成長ホルモン遺伝子の開始コドン
の間に９塩基対が存在し、該領域に対応するmRNAが２次
構造を形成しないように合成アダプターを設計した。両
末端がHpaIおよびNdeI制限部位に適合するように、36量
体（５′−AAC TAG TAC GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT
AAT ACA−３′）からなる上流鎖および38量体（３′−T
TG ATC ATG CGT TCA AGT GCA TTT TTC CCT TTA TGT AT
−５′）からなる下流鎖を含んだアダプターを設計し
た。
bpの断片を得た。trpプロモーターのSD配列（５′−AAG
G−３′）およびサケ成長ホルモン遺伝子の開始コドン
の間に９塩基対が存在し、該領域に対応するmRNAが２次
構造を形成しないように合成アダプターを設計した。両
末端がHpaIおよびNdeI制限部位に適合するように、36量
体（５′−AAC TAG TAC GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT
AAT ACA−３′）からなる上流鎖および38量体（３′−T
TG ATC ATG CGT TCA AGT GCA TTT TTC CCT TTA TGT AT
−５′）からなる下流鎖を含んだアダプターを設計し
た。
571bpのNdeI/SalI制限断片および合成アダプターをptrp
322にライゲーションし、HpaIおよびSalI制限酵素で切
断した。
322にライゲーションし、HpaIおよびSalI制限酵素で切
断した。
エシェリヒア・コリHB101（ATCC33694）を形質転換し
て、サケ成長ホルモン遺伝子およびtrp−プロモーター
を含有する組換え体クローンを得、これはptrp322HSGH
と呼ばれる（第６図参照）、さらにこのクローンをエシ
ェリヒア・コリW3110（ATCC27325）に形質発現する宿主
へ導入する。
て、サケ成長ホルモン遺伝子およびtrp−プロモーター
を含有する組換え体クローンを得、これはptrp322HSGH
と呼ばれる（第６図参照）、さらにこのクローンをエシ
ェリヒア・コリW3110（ATCC27325）に形質発現する宿主
へ導入する。
実施例４ 酵母細胞にサケ成長ホルモンを生産する培養およびその
同定ベクターpC1/1−SGHを導入した酵母細胞各3mlをロ
イシン無含有培地（培地１リットル当り）、アミノ酸無
含有酵母窒素塩基6.7g、Leu−サップルメント0.25gおよ
び６％グルコース含有）中、30℃で24時間培養した。１
夜培養物1mlを２％ペプトン、１％酵母抽出物および２
％グルコースを含有するYEPD培地（100ml）に接種し、3
0℃で24時間培養した。これにエタノール40mlを加え、
さらに溶液を24時間培養した。
同定ベクターpC1/1−SGHを導入した酵母細胞各3mlをロ
イシン無含有培地（培地１リットル当り）、アミノ酸無
含有酵母窒素塩基6.7g、Leu−サップルメント0.25gおよ
び６％グルコース含有）中、30℃で24時間培養した。１
夜培養物1mlを２％ペプトン、１％酵母抽出物および２
％グルコースを含有するYEPD培地（100ml）に接種し、3
0℃で24時間培養した。これにエタノール40mlを加え、
さらに溶液を24時間培養した。
得られたOD650は約40であった。その10（1ml当りO
D650）を取り、遠心した。これを10mM トリス−HCl（p
H7.5）、1mM EDTA、2mM フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（PMS）および8M尿素を含有する緩衝液400μｌ
に溶解し、さらにこれと同量の直径0.45mmのガラスビー
ズを加えて激しく振とうした。細胞壁を破壊し、サケ成
長ホルモンを緩衝液に溶出した後、溶出液の４μｌを1
2.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けて測
定した。
D650）を取り、遠心した。これを10mM トリス−HCl（p
H7.5）、1mM EDTA、2mM フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（PMS）および8M尿素を含有する緩衝液400μｌ
に溶解し、さらにこれと同量の直径0.45mmのガラスビー
ズを加えて激しく振とうした。細胞壁を破壊し、サケ成
長ホルモンを緩衝液に溶出した後、溶出液の４μｌを1
2.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けて測
定した。
その結果を第７図に示す。
１枠はバイオ・ラド社の蛋白質の標準分子量を示す。
２枠はサケ成長ホルモン遺伝子を含有しないベクターpC
1/1を導入した酵母細胞の全蛋白質を表す。
1/1を導入した酵母細胞の全蛋白質を表す。
３枠はサケ成長ホルモン遺伝子を含有するベクターpC1/
1−SGHを導入した酵母細胞の全蛋白質を表す。
1−SGHを導入した酵母細胞の全蛋白質を表す。
ゲルスキャンニングにより、第７図の３枠に示されたよ
うにサケ成長ホルモンは総蛋白質量の５％に相当する量
で約22Kdのバンドに出現する。
うにサケ成長ホルモンは総蛋白質量の５％に相当する量
で約22Kdのバンドに出現する。
精製したサケ成長ホルモンのペプチド配列決定による
と、これは開始コドンがイソロイシンである成熟サケ成
長ホルモンである。
と、これは開始コドンがイソロイシンである成熟サケ成
長ホルモンである。
実施例５ エシェリヒア・コリW3110におけるサケ成長ホルモンの
高水準形質発現およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による確認 形質発現ベクターptrp322HSGHを含むW3110をアンピシリ
ン40μg/mlを含有するLB培地中、37℃で16時間培養し、
ついでM9培地へ接種した。
高水準形質発現およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による確認 形質発現ベクターptrp322HSGHを含むW3110をアンピシリ
ン40μg/mlを含有するLB培地中、37℃で16時間培養し、
ついでM9培地へ接種した。
OD650が0.5に達したら、IAA（インドールアクリル酸）6
0μg/mlを添加してさらに37℃で24時間培養した。OD650
が1.0に相当する培養菌を遠心し、ラエムリのサンプル
緩衝液［ラエムリ、D.K.（1970年）、ネーチャー、227
巻、680頁］100μｌに溶解した。溶液を100℃で５分間
加温し、ついでその10μｌを12.5％SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に掛けた。
0μg/mlを添加してさらに37℃で24時間培養した。OD650
が1.0に相当する培養菌を遠心し、ラエムリのサンプル
緩衝液［ラエムリ、D.K.（1970年）、ネーチャー、227
巻、680頁］100μｌに溶解した。溶液を100℃で５分間
加温し、ついでその10μｌを12.5％SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に掛けた。
その結果を第８図に示す。
１枠はBRL低分子量マーカーである。
２〜９枠はIAAによって誘導されたサケ成長ホルモン遺
伝子を含有する（ptrp322HSGH）W3110株の結果を示す。
伝子を含有する（ptrp322HSGH）W3110株の結果を示す。
10〜13枠はIAAによって誘導されたサケ成長ホルモン遺
伝子を含有しない（ptrp322）W3110株の結果を示す。
伝子を含有しない（ptrp322）W3110株の結果を示す。
第８図から判るように、サケ成長ホルモン遺伝子を含有
しないptrp322−W3110では認められなかった22Kdのバン
ドが、ptrp322SGH−W3110ではエシェリヒア・コリ総蛋
白質量の20％を超える量で出現する。
しないptrp322−W3110では認められなかった22Kdのバン
ドが、ptrp322SGH−W3110ではエシェリヒア・コリ総蛋
白質量の20％を超える量で出現する。
M9培地は40mM K2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7
mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10μg/mlビタミン
B1、0.4％カザミノ酸、１％グルコースおよびアンピシ
リン40μg/mlを含有している。
mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10μg/mlビタミン
B1、0.4％カザミノ酸、１％グルコースおよびアンピシ
リン40μg/mlを含有している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 李 庸范 大韓民国300‐01忠清南道大田市中区龍門 洞276‐８ (72)発明者 李 泰揆 大韓民国132ソウル特別市道峰区水踰１洞 486‐573 (72)発明者 朴 榮祐 大韓民国300‐31忠清南道大田市中区道龍 洞386‐１ (72)発明者 韓 圭范 大韓民国300‐31忠清南道大田市中区道龍 洞386‐１ (56)参考文献 特開 昭62−224297（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−210100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−21596（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，1985〔82〕Ｐ．4306−4310
Claims (3)
- 【請求項１】Ｎ−末端合成アダプターが、 （ａ）サケの成長ホルモンのアミノ酸配列にしたがって
XbaI、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を有するオリゴ
ヌクレオチドを合成し、 （ｂ）ライゲーション・ストラテジーにもとづきXbaI/H
indIIIを有する一断片およびHindIII/SalIを有する他の
断片をそれぞれエシェリヒア・コリのベクターにつな
ぎ、 （ｃ）２個のクローン化した断片をエシェリヒア・コリ
のためのベクターヘライゲーションして、Ｎ−末端部分
を欠いたサケ成長ホルモン遺伝子を得、 （ｄ）プロモーターおよびターミネーターからなるエシ
ェリヒア・コリのベクターへ部分サケ成長ホルモン遺伝
子およびＮ−末端合成アダプターを挿入して、プロモー
ター−サケ成長ホルモン遺伝子ターミネーターカセット
を得、 （ｅ）酵母で形質発現するためのエシェリヒア・コリ酵
母−シャトルベクターへカセットを挿入し、 （ｆ）得られたベクターを酵母細胞で発現することから
なるサケ成長ホルモンの生産方法であって、 上記のＮ−末端合成アダプターが、下記の で示されるNocIおよびXbaI制限酵素部位を有するヌクレ
オチド配列であるサケ成長ホルモンの生産方法。 - 【請求項２】得られた形質発現ベクターが、プロモータ
ー−完全サケ成長ホルモン遺伝子−ターミネーターを含
んだカセットをクローン化したベクターである請求項１
記載のサケ成長ホルモンの生産方法。 - 【請求項３】合成アダプターが、酵母によって優勢に使
用されるアミノ酸コドンによって合成されたものである
請求項１記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019860011709A KR900006998B1 (ko) | 1986-12-31 | 1986-12-31 | 합성유전자에 의한 대장균으로부터 연어 성장호르몬의 제조방법 |
| KR86-11709 | 1986-12-31 | ||
| KR1019860011708A KR920003662B1 (ko) | 1986-12-31 | 1986-12-31 | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 연어 성장 호르몬의 제조방법 |
| KR86-11708 | 1986-12-31 | ||
| PCT/KR1987/000014 WO1988005079A1 (en) | 1986-12-31 | 1987-12-28 | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02501259A JPH02501259A (ja) | 1990-05-10 |
| JPH0720436B2 true JPH0720436B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=26627643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63500756A Expired - Lifetime JPH0720436B2 (ja) | 1986-12-31 | 1987-12-28 | 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0295286B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0720436B2 (ja) |
| AT (1) | ATE119573T1 (ja) |
| DE (1) | DE3751144D1 (ja) |
| WO (1) | WO1988005079A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8901264L (sv) * | 1988-04-11 | 1989-10-12 | Phillips Petroleum Co | Uttryck av laxtillvaexthormon i metylotropisk jaest av slaektet pichia |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| JPS61210100A (ja) * | 1985-03-13 | 1986-09-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
| CA1272144A (en) * | 1984-06-29 | 1990-07-31 | Tamio Mizukami | Fish growth hormone polypeptide |
| US4894362A (en) * | 1985-07-10 | 1990-01-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Eel growth hormone |
| JPS62224297A (ja) * | 1986-03-25 | 1987-10-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモンポリペプチドの製造法 |
-
1987
- 1987-12-28 EP EP88900597A patent/EP0295286B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-28 JP JP63500756A patent/JPH0720436B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-28 DE DE3751144T patent/DE3751144D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-28 WO PCT/KR1987/000014 patent/WO1988005079A1/en active IP Right Grant
- 1987-12-28 AT AT88900597T patent/ATE119573T1/de not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８５〔８２〕Ｐ．４３０６−４３１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0295286A1 (en) | 1988-12-21 |
| WO1988005079A1 (en) | 1988-07-14 |
| EP0295286B1 (en) | 1995-03-08 |
| DE3751144D1 (de) | 1995-04-13 |
| ATE119573T1 (de) | 1995-03-15 |
| JPH02501259A (ja) | 1990-05-10 |
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