JPH07278195A - 組み換えg−csf - Google Patents
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Abstract
来の組み換えG-CSF 、ならびに組み換えG-CSF を含有す
る医薬組成物。 【効果】 他のタンパク質による汚染がきわめて少な
く、治療用途に適している。
Description
より得られたタンパク質をIgA プロテアーゼ(Igase と
も言う) で配列特異的に切断する方法に関し、特に原核
生物内で組み換えタンパク質またはペプチドを生産し、
その後N-末端配列を除去する方法に関する。
生産は、好ましくは培養が簡単で、生産されたタンパク
質が単純な方法で単離できる微生物を使って実施され
る。そのための適当な微生物は、例えばグラム陰性菌の
大腸菌 (Escherichia coli) 、グラム陽性菌のストレプ
トコッカス・カルノサス (Streptococcus carnosus) お
よびパン酵母のサッカロミセス・セレビシエ (Saccharo
myces cerevisiae) である。しかしながら、かかる微生
物による外来遺伝子の発現はしばしば不利なことがあ
る。E. coli では、例えば翻訳の結果である天然タンパ
ク質のアミノ末端メチオニン残基が通常プロテアーゼに
よって効率よく切断される。しかし、外来タンパク質の
場合は、一般に最初のメチオニン残基が部分的に切断さ
れるだけである。従って、定められたアミノ末端を有す
るタンパク質の適当な生産方法は、初めに融合タンパク
質の形でそれらを生産し、その後配列特異的プロテアー
ゼを使って一定の方法でそれらを切断することである。
合タンパク質は微生物の細胞内で凝集して、他の細胞成
分から簡単に分離できる濃密な沈殿体 (“inclusion bo
dies”) を形成し、その結果目的タンパク質の単離・精
製が容易になるという利点がある。一方、初めに遺伝子
工学的手法で実際の目的タンパク質に融合された担体タ
ンパク質は、融合相手に非特異的タンパク質加水分解に
対する特別の安定性を付与するものである; 外来である
と認識されたポリペプチドの切断の問題は特にバイオテ
クノロジーによる小さいペプチドの生産に関係がある。
さらに、他の担体タンパク質は目的タンパク質を特定の
細胞区画 (その区画からそれらを簡単に精製することが
でき、そこでは特にそれらが安定しておりかつ/また試
験のために接近しやすい) に移動させることができる。
最後に、担体タンパク質は効率のよい精製 (例えばアフ
ィニティークロマトグラフィー精製) を可能にする特別
の性質をもつものであり得る。大抵の場合、融合タンパ
ク質はそのアミノ末端に担体タンパク質を、そのカルボ
キシル末端に目的タンパク質を保有することが好適であ
る。しかしながら、その逆の形態、あるいは目的タンパ
ク質と2つの融合相手とのカップリングも特殊な場合に
は望ましい。さらに、1つの融合体内に目的タンパク質
を反復させることも有利であり得る。
ク質を得るために、共有結合で結合された融合相手を互
いに切断することが必要である。原理的に、これは化学
的または生化学的 (酵素的) 方法で達成できる。しかし
ながら、これまでに利用された方法は特異性が十分でな
いために応用範囲が狭く、目的タンパク質を得るために
は、かかる切断が融合相手間の切断配列 (すなわち結合
部) で起こり、いかなる状況下でも目的タンパク質それ
自体の内部で追加的に切断が起こらないことが重要であ
る。かくして、融合相手の切断は高度に特異的に実施さ
れねばならない。
に使用されてきた化学的方法には、例えばタンパク質中
のアミノ酸メチオニンでの臭化シアンによる切断、およ
びギ酸を使用した酸性媒体中でのアミノ酸 Asp・!・Pr
o 間の切断がある。これらの方法は目的タンパク質中の
特異的切断部位が結合相手への結合部以外に存在しない
ときだけ有効である。一般的には、生化学的切断法の方
が化学的方法よりも好ましい。なぜならば、前者の方法
は通常目的タンパク質を変性させない生理学的条件下
で、すなわち少なくとも温和な化学反応条件下で実施さ
れるからである。
だけ特異的なプロテアーゼを使用することを土台として
いる。例えば、トリプシンはタンパク質中のアミノ酸ア
ルギニンおよびリシンの次に来るペプチド結合を切断す
る。この特異性はアミノ酸 Lysを予め化学的に修飾する
ことによって増加させることができ、これによりアミノ
酸アルギニンに対する特異的認識が制限される。バイオ
テクノロジーの分野で使用される別のプロテアーゼはク
ロストリパインであり、この酵素はアミノ酸アルギニン
とこれに続くアミノ酸の間のペプチド結合を切断する。
今までに使用された融合タンパク質の酵素的切断法の研
究は F.A.O. Marston ([D.M..Glover, E.]: DNA clonin
g III, IRL Press Oxford and Washington DC, 1987)に
よって論じられている。酵素的切断法も、切断部位に特
異的なアミノ酸が目的タンパク質それ自体中に同時に存
在しうる点で制限される。従って、タンパク質融合体の
生化学的切断においては、切断するために1個のアミノ
酸を認識するのではなく、アミノ酸の配列を認識する酵
素が特に好適である。と言うのは、特定のアミノ酸配列
が融合相手間の切断部位のほかに目的タンパク質中にも
う一度存在する可能性は、切断配列の認識および切断に
必要なアミノ酸の数が多ければ多いほど、少なくなるか
らである。
るプロテアーゼは知られている。このような選択的プロ
テアーゼ (例えばヒトの補体系や血液凝固系中に存在す
る)の大多数は基質中の定められた部位を切断するが、
対応する切断部を他のタンパク質 (例えば融合タンパク
質) 中に移し変えても、一般にこの種のプロテアーゼは
もうその部位を切断することができない。その理由は数
多くあり、例えばプロテアーゼが基質の特定の二次また
は三次構造を認識するからであり、またプロテアーゼが
融合タンパク質中の切断部位に接近できないからであ
る。
ある配列特異的プロテアーゼとしては、現在ファクター
Xa を筆頭に挙げることができる。このプロテアーゼは
切断配列 Ile-Glu-Gly-Arg・!・X ( ここで・!・は切
断部位を表し、X は任意のアミノ酸を示す) を特異的に
切断する。しかしながら、このプロテアーゼは対応する
切断配列を結合部に有する融合タンパク質の切断には一
般に使用できないことが分かっている。かかる基質 (す
なわち担体タンパク質に共有結合で結合された目的タン
パク質を含む融合タンパク質) は往々にして全く切断さ
れないか、不十分な程度にまたは可溶性形態で切断され
るにすぎない。
物での組み換えタンパク質の生産において特に重要とな
ってくる。この場合、実際のDNA 配列の出発前に開始コ
ドンとしてAUG を含むDNA 配列をクローニングすること
が必要である。その結果、アミノ酸位置 -1 にメチオニ
ン残基を含む組み換えタンパク質が E. coliのような原
核生物内で発現される。
を含まない組み換えタンパク質を生産する必要がある。
かかるタンパク質の原核生物からの単離は、例えばN-末
端メチオニンを切断するメチオニン特異的ペプチダーゼ
により実施することができる。この方法は、しかし、切
断をタンパク質の配列決定によって確認しなければなら
ないので非常に煩雑である。その上、-1位にメチオニン
を含むタンパク質とメチオニンを含まないタンパク質の
分離は、それらがほぼ等しい分子量を有するために極め
て困難であり、従って部分的に達成されるにすぎない。
らのN-末端アミノ酸の切断を開示している。この方法で
は、タンパク質の数個のアミノ酸がエキソペプチダーゼ
(好ましくはロイシンペプチダーゼ) による段階的切断
でN-末端から配列 X-Proまで除去される。配列 X-Proは
ポストプロリン- ジペプチジル- アミノペプチダーゼ(E
C 3.4.14)を使う二段階または一段階反応でこの生産物
から切り離される。しかしながら、この方法には、タン
パク質のN-末端からのアミノ酸の段階的切断の結果とし
て、均一な生産物を形成することができず、代わりに不
完全な分解タンパク質や分解されすぎたタンパク質を目
的産物のほかに含む混合物が常に形成されるという欠点
がある。
特許第 0 020 290号により知られている。この方法で
は、特定の認識配列からタンパク質の融合成分を切断す
るために酵素コラゲナーゼが使用される。その後、融合
成分の更なるアミノ酸を更なる酵素処理によって除くこ
とができる。しかし、コラゲナーゼと他のエンドペプチ
ダーゼ類は低い特異性をもつにすぎないことが立証され
た (Biochim. Biophys.Acta 271 (1972) 133-144 を参
照されたい) 。さらに、コラゲナーゼは特定の空間構造
を有するタンパク質に対してのみ活性を有する。
めの上記ファクターXaの使用はすでに知られている。し
かし、先に述べた切断効率の問題とは別に、この方法は
タンパク質の内部配列をも認識して切断するという更な
る欠点をもっている。その上、ファクター Xa はウシ血
清から単離しなければならず、その結果治療用タンパク
質の切断にそれを用いる場合、存在しうる病原性因子や
ウイルスを検出するために十分な精製と分析がその後必
要となる。
ば淋菌 (Neisseria gonorrhoea) や髄膜炎菌 (Neisseri
a meningitis) のようなナイセリア属またはインフルエ
ンザ菌 (Haemophilus influenzae) やエジプトヘモフィ
ルス (Haemophilus aegypticus) のようなヘモフィルス
属に含まれるもの] はプロテアーゼを分泌し、それらの
プロテアーゼの配列は互いに密接に関係があり、ヒトIg
A1に対して特異的であるために、分かりやすくIgA プロ
テアーゼまたはIgase と呼ばれる。免疫グロブリンIgA1
はこのような病原微生物による感染から防御する分泌免
疫応答の重要な成分である (Kornfeld and Plaut, Rev.
Infect. Dis. 3 (1981) 521-534)。さらに、IgA プロ
テアーゼはまた自己タンパク質加水分解によりそれ自体
の前駆体タンパク質を切断する。真正細菌株やグラム陰
性宿主細胞による淋菌 MS11 由来のIgA プロテアーゼの
生成がすでに詳細に開示されている (DE 36 22 221.6)
。
(Nature 325 (1987) 458-462)により記載されるよう
に、次の認識配列を切断する: 1. Pro-Ala-Pro・!・Ser-Pro 2. Pro-Pro・!・Ser-Pro 3. Pro-Pro・!・Ala-Pro 4. Pro-Pro・!・Thr-Pro ここで記号・!・はそれぞれの場合にIgA プロテアーゼ
の切断部位を表す。IgAプロテアーゼのクローニングは
例えば Pohlnerら(1987)同上に記載されている。
は融合タンパク質の改良された生化学的 (酵素的) 切断
法を提供することであり、融合相手とその結合部に特定
の切断配列を含む遺伝子工学的手法により作製された融
合タンパク質を基質として使用して、出来るだけ高い収
量および再現性で目的タンパク質(例えば、G-CSF )を
単離することにある。
ク質の結合部に認識部位または切断配列 Pro・!・X-Pr
o を導入し、この切断配列を・!・で示した切断部位で
IgA プロテアーゼにより特異的に切断することにより、
遺伝子工学的手法を使って達成された (ここでX は好ま
しくはアミノ酸 Ser、Thr および Alaを表し、特に好ま
しくは SerまたはThr であるが、他のアミノ酸を表すこ
ともできる) 。
素的に切断し、これらの融合タンパク質の目的成分を単
離するための方法を提供し、その方法は(1) 融合タンパ
ク質の2つの成分が一緒に結合される結合部を遺伝子工
学的手法により修飾して、この結合部にアミノ酸配列Y-
Pro ・!・X-Pro (ここでX はアミノ酸であり、Y は1
個または数個の任意のアミノ酸である) を有するIgA プ
ロテアーゼ認識部位を少なくとも1つ形成し、(2) 段階
(1) から得られた融合タンパク質を・!・で示した認識
部位中の位置でIgA プロテアーゼにより切断し、そして
(3) 切断後、融合タンパク質の1つまたは数個の目的成
分を単離することを特徴としている。
ゼ”にはIgA を特異的に切断するプロテアーゼが含ま
れ、例えば Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534 に記
載されている。DE-A 36 22 221、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 79 (1982) 7881-7885、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80 (1983) 2681-2685、Nature 325 (1987) 458-46
2および EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601に記載される
ような組み換えIgA プロテアーゼも同様に適している。
部位またはその一部をコードするヌクレオチド配列を融
合タンパク質の結合部に組み込み、それによりこれらの
ヌクレオチド配列がタンパク質融合体の目的の部分をコ
ードする1またはそれ以上のDNA セクションの上流およ
び/または下流に組み込まれるような方法で、融合タン
パク質の結合部の修飾を実施することが好ましい。この
ために、好ましくは化学的に合成されたヌクレオチド配
列が使用される。
ともと (すなわち結合部の修飾前には) 天然IgA プロテ
アーゼ認識部位をもっていなかった融合タンパク質の切
断に特に適していることが判明した。本発明方法のため
の IgAプロテアーゼ認識部位はアミノ酸の共通配列 Y-P
ro・!・X-Pro を有する。この場合、X はアミノ酸を表
し、Y は1 個または数個の任意のアミノ酸を表す。X は
好ましくはセリン、トレオニンまたはアラニンを表し、
特に好ましくはセリンまたはトレオニンである。Y は好
ましくは次の配列: Pro 、Pro-Ala 、Arg-Pro 、Pro-Ar
g-Pro 、Ala-Pro-Arg-Pro またはPro-Ala-Pro-Arg-Pro
を末端に有する数個のアミノ酸を表す。
ゼで目的タンパク質を切断し、単離するために使用でき
る少なくとも共通の切断配列Pro ・!・X-Pro を有する
IgAプロテアーゼ認識部位を、融合タンパク質の結合部
(例えば担体タンパク質と目的タンパク質の間) に組み
込むことから成っている。このために、切断配列 Pro・
!・X-Pro 中の位置X にはアミノ酸 Ser、Ala またはTh
r を使用することが好ましい。この部位での切断をさら
に最適化するために、切断配列の前に特定のアミノ酸、
特にPro を挿入することができる。
パク質の切断に本発明方法を適用する場合、IgA プロテ
アーゼによる切断後に、アミノ末端に配列 X-Proを有す
るタンパク質が形成される。この配列は目的タンパク質
の一部として有利であったり、不利であったり、あるい
は無意味であったりする。遺伝子工学的手法により得ら
れた目的タンパク質がそのアミノ末端に天然型として対
応する2つのアミノ酸 X-Proを含む場合には、一般にこ
の配列は有利である。バイオテクノロジーの分野で重要
な、アミノ末端が X-Proで特徴づけられるタンパク質は
自然界に存在する。
の既知切断法と比べて、驚いたことに結合部に上記切断
配列を有する融合タンパク質に普遍的に応用でき、さら
に不溶性、可溶性、膜に結合した、または細胞に結合し
たタンパク質融合体にも同様に適用できるという利点が
ある。その上、この方法は、微生物内で生じるような沈
殿体 (それ自体を容易に濃縮できる) の形で融合タンパ
ク質またはタンパク質融合体の切断が可能であるという
特別の利点を有する。この方法の更なる利点は、使用す
る切断酵素 Igaseが非病原菌の培地から簡単に単離でき
る点である。
断配列の組み込みは遺伝子工学的手法を使って行われ
る。従って、例えば切断配列またはその一部をコードす
る一連のヌクレオチドすなわちヌクレオチド配列を化学
的に合成して、既知の遺伝子工学的手法を使って担体タ
ンパク質と目的タンパク質のDNA セクション間に組み込
むことができる。適当な切断配列またはその一部をコー
ドする天然のヌクレオチド配列も相応の方法で組み込む
ことができる。好ましくは、タンパク質融合体をコード
する遺伝子を適当な (有利には誘導可能な) 発現シグナ
ルの制御下に置いて、融合タンパク質が必要条件に従っ
て生産されるようにする。タンパク質融合体の生産に
は、宿主細胞として適当な原核または真核 (植物および
動物) 細胞が使用されるが、無細胞系も可能である。こ
の方法で使用する担体タンパク質は、それらがタンパク
質融合体に付与すべき性質に応じて、特定の輸送機能、
タンパク質融合体の精製またはその安定性を改善する機
能などの機能をもち得る。好適な担体タンパク質は以下
に記載する。
過剰生産性の非病原性細菌株により生産されかつ培養上
清から単離・精製しうる Igaseを用いて行うことが好適
である (例えば DE-36 22 221 を参照) 。本発明の方法
は分析のためだけでなく生産のために使用することがで
きる。生産面では、本方法は医薬、研究、環境保護、工
業的方法または製品において使用される重要なタンパク
質の生命工学的製造に役立つ。分析面では、本方法は、
例えば適当な発現系と組み合わせて、遺伝子融合の日常
的実験に使用される。
合タンパク質の目的成分の単離から成る本発明方法の好
適な実施態様は、(1) 結合部に少なくとも1つのIgA プ
ロテアーゼ認識部位を含む融合タンパク質をコードする
少なくとも1コピーの遺伝子を保有する組み換えDNA ま
たは組み換えベクターで細胞を形質転換し、(2) 適当な
培地で該形質転換細胞を培養し、(3) 該融合タンパク質
をコードする遺伝子を該形質転換細胞において発現さ
せ、(4) 該融合タンパク質をIgA プロテアーゼで切断
し、そして(5) 該融合タンパク質の1つまたはいくつか
の目的成分を単離する、ことを特徴としている。
合タンパク質の処理を、細胞溶解後および/または細胞
タンパク質の部分または完全分離後に、培地 (培養ブロ
ス)中で行うことができる。融合タンパク質 (好ましく
は原核生物の発現産物) を処理するために、例えばEP-B
0 141 223 または EP-B 0 141 224 に記載されるよう
な、当業界で知られた方法を使ってIgA プロテアーゼを
固定化することがさらに好ましい。
配列 Met-Y-Pro・!・X-Pro-A を有する融合タンパク質
またはペプチドからN-末端メチオニン残基を含まない組
み換えタンパク質またはペプチドを生産することであ
り、ここでX はアミノ酸、好ましくはThr 、Ala または
Ser を表し、Y はX がThr またはAla を表すとき好まし
くはPro で終わる1 個または数個の任意のアミノ酸を表
すが、X がSer を表すときは好ましくは配列Pro-Ala ま
たはPro-Pro で終わる数個の任意のアミノ酸を表し、そ
してA は任意のアミノ酸の配列を表す。この方法では、
融合タンパク質またはペプチドをIgA プロテアーゼで切
断すると、アミノ酸配列 X-Pro-Aを有する切断産物が得
られる。例えば、N-末端メチオニン残基を含まない組み
換えタンパク質の原核細胞からの生産方法は、次の段
階: (1) アミノ酸配列 Met-Y-Pro・!・X-Pro-A ( ここでX
、Y およびA は上記の意味を有する) を有するタンパ
ク質またはペプチドをコードする遺伝子で原核細胞を形
質転換し、(2) 該形質転換細胞を適当な培地で培養し
て、形質転換遺伝子を発現させ、(3) IgA プロテアーゼ
を使ってアミノ酸配列 Met-Y-Pro・!・X-Pro-A を有す
る該形質転換細胞からの発現産物を切断し、そして(4)
N-末端メチオニン残基を含まないアミノ酸配列 X-Pro-A
を有する切断産物を単離する、から成っている。
メチオニン残基を含まずかつN-末端配列 X-Pro (ここで
X は好ましくはThr 、Ala またはSer を表す) を有する
タンパク質を驚くべき高収量でしかも良好な特異性で得
ることが一段階で可能である。融合タンパク質の担体成
分Y は、IgA プロテアーゼで認識される切断配列を末端
に有する少なくとも1 個、好ましくは100 個まで、特に
1-50個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を表す。X がア
ミノ酸セリンを表すとき、Y は好ましくは配列Pro-Ala
またはPro をその末端に有する。X がThr またはAla を
表すときは、Yは好ましくはその末端にPro を、特にArg
-Pro 、Pro-Arg-Pro またはAla-Pro-Arg-Pro を有す
る。
端に配列 Pro-Ala-Pro-Arg-Proを有する少なくとも5 個
のアミノ酸を表す。しかし、IgA プロテアーゼで認識さ
れる切断部位は本発明方法にとってどれも適している。
担体成分Y はさらに任意のアミノ酸、好ましくは100 個
まで、特に好ましくは50個までのアミノ酸を含むことが
できる。しかし、DNA レベルでタンパク質 Met-Y-Pro・
!・X-Pro-A の発現を高めかつ/またアミノ酸レベルで
細胞からのその精製を容易にするアミノ酸配列をこのた
めに使用することが好ましい。
現は例えばβ- ガラクトシダーゼ遺伝子の断片との融合
(すなわち担体成分Y がβ- ガラクトシダーゼタンパク
質の一部を含む) によりDNA レベルで改善される。タン
パク質 Met-Y-Pro・!・X-Pro-A の発現を高めるための
他の方法も当業界で知られている。発現産物の分離・精
製は他のポリペプチド、特に高度に荷電されたポリペプ
チドまたはタンパク質(例えばポリ(Lys, Arg)) との融
合により、あるいは高い親和性で特定の物質に結合しう
るもの (例えばストレプトアビジン) との融合により容
易にすることができる (例えば EP-A 0 089 626 、EP-A
0 306 610を参照) 。
ド成分を含み、かつ異なるポリペプチド成分間の少なく
とも1 つの結合部にアミノ酸配列 Pro・!・X-Pro ( こ
こでX はアミノ酸を表すが、好ましくはThr 、Ala また
はSer を表す) を有する1 つまたはいくつかのIgA プロ
テアーゼ認識部位が組み込まれた融合タンパク質を提供
する。この認識部位はアミノ酸配列 (a) Pro-Ala-Pro・
!・Ser-Pro 、(b) Pro-Pro ・!・Ser-Pro 、(c) Pro-
Arg-Pro-Pro ・!・Ala-Pro 、(d) Pro-Pro ・!・Thr-
Pro 、(e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ・!・Thr-Pro または
(f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ・!・Thr-Pro ( ここで
・!・は切断部位を表す) を有することが特に好まし
い。
et-Y-Pro・!・X-Pro-A を有するタンパク質またはペプ
チドを包含し、ここでX は好ましくはThr 、Ala または
Serを表し、Y は1 個または数個の任意のアミノ酸を表
し、X がThr またはAla を表すときは、Y は好ましくは
その末端にPro を有し、X がSer を表すときは、Y は好
ましくはその末端に配列Pro-Ala またはPro を有し、そ
してA は任意のアミノ酸配列を表す。かかるタンパク質
またはペプチドは、本発明に従って前記タンパク質また
はペプチドをコードする少なくとも1 コピーの遺伝子を
含む組み換えベクターで原核細胞を形質転換することに
より発現される。
できる。このアミノ酸配列には、IgA プロテアーゼの切
断部位が存在しないことが好ましい。本発明はまた、融
合タンパク質の少なくとも1 つの結合部に1 つまたはい
くつかのIgA プロテアーゼ認識部位または切断配列が組
み込まれた本発明によるタンパク質またはペプチドをコ
ードする組み換えDNA を提供する。
で知られた方法により得られる。この場合、アミノ酸配
列 AをコードするDNA 配列を含むベクターが通常その遺
伝子の5'末端の領域で制限エンドヌクレアーゼにより切
断され、所望の配列を含むオリゴヌクレオチドと再連結
される。この方法では、オリゴヌクレオチドはIgA プロ
テアーゼの切断部位またはその一部をコードする配列を
含まねばならない。
発明による組み換えDNA を含む組み換えベクターを提供
する。原核生物でのタンパク質発現の土台となる好適な
ベクターは当業界で知られている。このベクターは好ま
しくは本発明の組み換えDNAの高度発現を可能にするも
のである。ベクターに担持された組み換えDNA は誘導可
能な発現シグナル (例えばλ、tac 、lac またはtrp プ
ロモーター) の制御下に置くことが好ましい。
ることも (例えばプラスミド) 、宿主生物のゲノムに組
み込むこともできる (例えばバクテリオファージラム
ダ) 。本発明のベクターは好ましくはプラスミドであ
る。特定の宿主生物による遺伝子発現のそれぞれの場合
に適しているベクターは分子生物学の分野で当業者によ
く知られている。それは真核生物ベクターであってもよ
いが、原核生物ベクターの方が好ましい。本発明による
原核生物でのDNA 発現に適するベクターの例は市販され
ているpUC およびpUR ベクターである。
び/または本発明の組み換えベクターで形質転換された
細胞、好ましくは原核細胞、特に E. coli細胞を提供す
る。本発明方法により一段階で得られるN-末端配列 X-P
ro (ここでX はThr 、AlaまたはSer を表す) を有する
タンパク質の例としては、ヒト・エリトロポエチン、ヒ
トT細胞レセプターのβ鎖、特にヒト顆粒球コロニー刺
激因子 (G-CSF)がある。
ジ、および一連の他の細胞系によりリンフォカインとし
て合成される。リンフォカインは免疫または血液細胞系
の細胞の成熟化に関与する。それらは十分に分化した細
胞への骨髄幹細胞の成熟化を刺激する。かくして、G-CS
F は例えば好中球や顆粒球の形成を誘導する。G-CSF は
短期間で好中球細胞の集団を顕著に増加させることがで
きるので、G-CSF の治療上の使用分野は相当に広い。例
えば、G-CSF は免疫系の細胞が破壊される癌の化学療法
の後に使用することができる。さらに、骨髄移植、重症
の火傷、免疫不全症が原因の日和見感染、および白血病
にG-CSF を使用することができるだろう。
て、一次翻訳産物は分泌されるときに切断されるN-末端
シグナル配列を含み、その結果成熟G-CSF の配列はアミ
ノ酸Thr(+1)-Pro(+2) (アミノ酸位置+1および+2) から
始まる。G-CSF を原核生物に生産させると、このシグナ
ルペプチドが少しきり切断されないか、または全く切断
されないので、シグナル配列を含まない原核生物からの
G-CSF を調製するために、タンパク質レベルで Thr(+1)
-Pro(+2)から始まる成熟G-CSF をコードするDNA 配列の
出発前に開始コドンとしてAUG (Met) をクローン化しな
ければならない。その結果として、E. coli のような原
核生物ではアミノ酸位置-1にメチオニンを含むG-CSF が
発現される。
位置-1にメチオニンを含まないアミノ酸 Thr(+1)-Pro(+
2)から始まるG-CSF を、原核生物から簡単な方法で生産
することができる。これは、アミノ酸配列の位置+1およ
び+2にアミノ酸 Thr(+1)-Pro(+2)を含み、その前に、す
なわちアミノ酸配列の位置-1から前方にIgA プロテアー
ゼで認識されかつ Thr(+1)-Pro(+2)から始まるアミノ酸
配列 G-CSFから切断され得るアミノ酸配列を含むG-CSF
誘導体を原核生物から単離することにより行われる。
置-1と-2にそれぞれPro を、位置-3から-1にアミノ酸配
列 Arg-Pro-Proを、位置-4から-1にアミノ酸配列 Pro-A
rg-Pro-Proを、または位置-5から-1にアミノ酸配列 Ala
-Pro-Arg-Pro-Proを含んでいる。特に好適な実施態様で
は、この誘導体は位置-6から-1にアミノ酸配列: -6 -5 -4 -3 -2 -1 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro を含んでいる。本発明の意味において、G-CSF は天然に
存在するG-CSF(その配列は例えば Science 232 (1986)
61に記載されている) とそれから誘導される顆粒球コロ
ニー刺激活性を有する誘導体 (そのアミノ酸配列は X(+
1)-Pro(+2)から始まる) を含むことが理解される。X は
Thr 、Ala またはSer を表し、好ましくはThr である。
の発現後に、位置+1と-1の間 (Thr(+1) とPro(-1) の
間) をIgA プロテアーゼで処理することにより切断する
ことができる。こうして、位置-1にメチオニンを含ま
ず、N-末端のアミノ酸配列が天然に存在するG-CSF のア
ミノ酸 Thr(+1)-Pro(+2)から始まるG-CSF が一回の加水
分解工程で得られる。
の難溶性凝集体 (屈折性物体) が形成される。このタン
パク質を例えば治療のために使用する前に、それを活性
型に変換しなければならない。当業界でよく知られた方
法 (例えば EP-A 0 219 874、EP-A 0 114 506、WO 84/0
3711)を使って、初めに変性剤を添加して可溶化を行
い、次に再生を行い、所望によりさらに精製段階を行
う。IgA プロテアーゼによる本発明タンパク質の処理は
可溶化の前、可溶化の後、または再生の後に行うことが
できる。IgA プロテアーゼによる処理を可溶化の後に直
接実施する場合には、IgA プロテアーゼの添加前に可溶
化剤 (例えばグアニジン塩酸塩または尿素)を透析によ
って除かなければならない。しかし、IgA プロテアーゼ
による処理は再生後に行うことが好ましく、この場合は
G-CSF の収量が特に高い。
パク質を切断処理するのに必要な条件は特に決まってい
ない。しかし、この方法では、G-CSF(または他のタンパ
ク質) 対IgA プロテアーゼの重量比は1:1 ないし100:1
であることが好適である。この反応はpH6.5-8.5 の緩衝
化水溶液中で行うのが好ましい。緩衝液の濃度は有利に
は50-300 mmol/l の範囲であり、所望により20-100 mmo
l/l の塩化ナトリウムを添加する。切断は好ましくは室
温で20-60 分間行う。
る切断後に得られた切断産物は、イオン交換および大き
さによる分画化によって精製することが好ましい。この
ようにして得られた位置-1にメチオニンを含まないG-CS
F は、他のタンパク質によって0.1%未満、好ましくは10
-3% 未満汚染されているにすぎない。かくして、位置-1
にメチオニンを含まないG-CSF は、IgA プロテアーゼ切
断によってメチオニンを含む融合タンパク質からほぼ定
量的に分離・精製され得る。
パク質によって0.1%未満、好ましくは10-3% 未満汚染さ
れているにすぎず、位置-1にメチオニンを含む原核生物
由来のG-CSF を含まない組み換えG-CSF が得られる。本
発明はまた、本発明方法により得られた活性物質として
の原核生物由来のG-CSF 、および所望により慣用の製剤
学的担体、充填剤、補助剤を含有してなる医薬組成物を
提供する。かかる医薬組成物は特に顆粒球 (とりわけ好
中球) の形成を刺激すべき治療に適している。
として適用することが好ましい。これは本発明組成物を
含むすでに注射可能な溶液を用意することにより可能で
ある。しかし、本組成物を凍結乾燥品の形で供給するこ
ともできる。これらはその後注射目的に適した既知の溶
剤または溶液を用いて用時調製される。注射媒体として
水が好適に使用されるが、これは安定剤、可溶化剤、緩
衝剤、生理学的NaCl濃度のような等張添加剤といった注
射液用の慣用添加剤を含む。この種の添加剤は例えばマ
ンニトール、酒石酸塩またはクエン酸塩緩衝液、エタノ
ール、錯化剤 (例えばエチレンジアミン四酢酸とその無
毒性塩) 、粘度調節用の高分子ポリマー(例えば液体ポ
リエチレンオキシド) などである。注射液用の液状担体
は無菌でなければならず、アンプルで分配することが好
ましい。
成物を調製するための、位置-1にメチオニンを含まない
原核生物由来のG-CSF の使用を意図している。タンパク
質 X-Pro-Aが本発明方法によって融合タンパク質の切断
産物として得られ (ここでX はアミノ酸を表し、A は任
意のアミノ酸配列を表す) 、そのタンパク質がアミノ末
端に望ましくないジペプチド X-Proをもつ場合、この望
ましくないジペプチドは本発明方法の一部としてジペプ
チジルアミノペプチダーゼ (DPAP) で処理することによ
り除去することができる。ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼはこれまでに一連の微生物、昆虫、両生類および異
なるヒト組織において見つかっている。それらは例えば
前駆体タンパク質の段階的プロセッシングに役立ち、そ
の一部はジペプチド X-Proのアミノ末端分解に対し相当
の特異性をもっている (X-Pro-DPAPase; G. Kreil, Tre
nds in Biochemical Sciences 15, 23-26,1990)。かく
して、本発明に従って Igaseと X-Pro-DPAP とを組み合
わせることによって、あらゆるアミノ末端アミノ酸を有
する目的タンパク質を生成することができる。
ることにより、位置-1にメチオニンを含まない原核生物
由来の別のN-末端アミノ酸配列を有するタンパク質を生
産することが可能である。このために、最初に、アミノ
酸配列 Met-Y-Pro・!・X-Pro-A を有する融合タンパク
質が得られ、この場合は2 個のN-末端アミノ酸 X-Proを
含まないアミノ酸配列 Aが発現すべきタンパク質の目的
成分である。
有する原核細胞の発現産物は、最初に、アミノ酸配列 X
-Pro-Aを有する第一の切断産物が形成されるように、Ig
A プロテアーゼで切断する。このタンパク質はその後、
配列 X-Proを特異的に認識してPro の後を切断する上記
のジペプチジルアミノペプチダーゼで処理する。このよ
うにして、任意のアミノ酸配列 Aを有する第二の切断産
物が形成される。従って、本発明方法はN-末端メチオニ
ン残基を含まない様々なタンパク質の生産に非常に有用
であることが分かり、N-末端配列 X-Pro (ここでX は好
ましくはThr 、Ala またはSer を表す) を有するタンパ
ク質の生産に限定されない。
ような) IgA プロテアーゼ認識部位をコードする領域を
含みかつ融合タンパク質の結合部へ組み込むのに適して
いる組み換えDNA を意図している。これは好ましくは化
学的に合成されたDNA 断片であり、その両末端に1 つま
たはいくつかの適当な制限切断部位をもつことが好まし
い。 用語の定義:本発明方法は希望するタンパク質のバイオ
テクノロジーによる生産を意図している。これに関連し
て、「バイオテクノロジーによる生産」とは、遺伝子工
学的手法および他の生命工学的手法 (例えば微生物の発
酵) を使った目的タンパク質またはその中間体産物の生
産を意味する。
分野、研究、環境保護、産業的方法または製品において
使用される中間産物または最終産物を意味する。本発明
方法は「融合タンパク質」 (「タンパク質融合体」とも
言う) から目的タンパク質を形成することから成り、こ
こで融合タンパク質またはタンパク質融合体は互いに共
有結合で結合されたいくつかの「融合相手」から成って
いる。これに関連して、融合相手の少なくとも1 つは目
的タンパク質を表す。ある融合タンパク質中の融合相手
の順序およびそれらの反復の程度は任意である。しか
し、それはアミノ末端の担体タンパク質とカルボキシ末
端の目的タンパク質から成るのが好ましい。
ある種の性質を備えた融合タンパク質の形で目的タンパ
ク質を提供するように作用する。かかる性質は例えば特
定の構造特性に基づいた融合タンパク質の安定性の増
加、それ故細胞プロテアーゼに対する耐性の増加をもた
らし、またそれらはタンパク質加水分解活性のより少な
い環境へ融合タンパク質を輸送することができる。さら
に、担体タンパク質は融合タンパク質の効率のよい精製
を可能にする性質を備えていてもよい。これらには例え
ばアフィニティークロマトグラフィー法と関連した特定
のリガンドの結合、容易に単離できる沈殿体への融合タ
ンパク質の沈降、および接近しやすい部位へのタンパク
質の輸送が含まれる。
目的タンパク質)が結合した融合タンパク質内の領域は
「結合部」と呼ばれる。それぞれの結合部は1 つまたは
いくつかの「アミノ酸配列」により定義される。アミノ
酸配列 (およびアミノ酸とタンパク質の他の全ての配
列) はアミノ末端(左) からカルボキシ末端 (右) の方
向で示される。
により切断可能な結合部の全てのアミノ酸配列には本発
明による「切断配列」または認識配列が含まれる。融合
タンパク質またはタンパク質融合体の切断が起こるアミ
ノ酸配列の2 個のアミノ酸間の部位は「切断部位」と呼
ばれる。本発明方法は「IgA プロテアーゼ」による結合
部での融合タンパク質の酵素的切断を意図している。本
発明方法の範囲内で、「IgA プロテアーゼ」または Iga
seは、菌株 Neisseria gonorrhoeae MS11 のIgA プロテ
アーゼと、ヌクレオチドレベルおよび生成法に関してこ
のプロテアーゼと関連した他のあらゆる酵素を包含す
る。また、これらは特に Neisseria属と Haemophilus属
のIgA プロテアーゼを含む。
00、グリーセバッハストラーゼ8 のジャーマン・コレク
ション・フォー・マイクロオーガニズム (the German C
ollection for Microorganisms) に受託番号 DSM 2102
として寄託された。図面と合わせて以下の実施例により
本発明をさらに詳しく説明する。
パク質 MS2ポリメラーゼ (99アミノ酸) とN.gonorrhoea
e MS11由来のIgA プロテアーゼ前駆体のβ- ドメイン
(アミノ酸位置1195-1505)の間のタンパク質融合体の模
式図を示す。これらの二成分間の結合部は12のアミノ酸
から成り、Igase の切断配列-Pro-Pro・!・Thr-Pro-を
含む。切断部位の構築のために、制限切断部位 EcoRIと
HindIIIの間に4 つのオリゴヌクレオチド(1) から(4)
を組み込んだ。ポリペプチドの生産および精製Igase に
よる切断については実施例 5で詳述する。
ゼの99アミノ酸およびプラスミドによりコードされる6
アミノ酸) とヒトTリンパ球からのCD8 タンパク質の20
6 アミノ酸から成るタンパク質融合体を示す。Igase に
より切断される天然の切断配列がCD8 タンパク質のアミ
ノ酸配列中に存在する (実施例 6参照) 。図3は、発現
分泌系を用いて E. coli細胞により生産されたタンパク
質融合体B63* を示す。これはアミノ末端のコレラ毒素B
サブユニット (103 アミノ酸)と、これに続くIgase 切
断部位を含む結合部 (11アミノ酸) と、カルボキシル末
端のIgA プロテアーゼ前駆体のβ- ドメインの一部 (ア
ミノ酸位置1097-1160)から成る。Igase 切断部位は2 つ
のオリゴヌクレオチド TK006およびTK007 を用いて2 つ
のタンパク質ドメインの間に組み込まれた。
の模式図を示す。それらはコレラ毒素B サブユニットと
IgA プロテアーゼ前駆体のβ- ドメインから成る。これ
らの成分間には2 つの異なるIgase 切断配列 (-Pro-Pro
-Ala-Pro- および-Pro-Pro-Thr-Pro-)を有する2 つの異
なる結合部が存在する。切断配列は合成オリゴヌクレオ
チドを使って構築された (図3参照) 。
を使って行う。このために、発現ベクター pPZ07-mglla
c をNcoIで切断し、突出末端をヤエナリ (mungbean)ヌ
クレアーゼで除く。その後このベクターをBam HIで再び
切断する。次のオリゴヌクレオチドによりDNA レベルで
IgA 認識配列を作製する。 オリゴヌクレオチド A: 5' AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTG GGC CCT G 3' オリゴヌクレオチド B: 5' GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3' 上記のように切断したベクター pPZ07-mgllac に、等モ
ル量の2 つのオリゴヌクレオチドを加え、約100 倍過剰
で挿入する。再連結後、常法でコンピテント細胞にした
E. coli K12の細胞を形質転換する。常法に従って細胞
からDNA を単離し、ApaIとBam HIで切断する。制限エン
ドヌクレアーゼApaIとBam HIを使ってG-CSF 配列から約
520 bp長のG-CSF 断片を単離する (Science 232 (198
6), 61-65)。この断片をApaIとBam HIで切断したベクタ
ーに連結する。実施例 2 IgA1認識配列のほかに、融合タンパク質は精製を容易に
するペプチドを含み得る。それはストレプトアビジンを
コードするDNA を含むことができる。このために、IgA
プロテアーゼ認識配列の前に正しい翻訳枠でストレプト
アビジン遺伝子(WO 89/03422)をクローン化する。実施例 3 実施例 1に記載したプラスミドで E. coli K12細胞 (ED
8654 、DSM 2102) を形質転換し、抗生物質マーカー
(アンピシリン) で選択し、そしてプラスミドを制限分
析で同定する。このようなクローンを培養およびG-CSF
の発現のために使用する。細胞を完全培地で増殖させ
る。この培地はリットル当たり16 gのバクトトリプトン
(Difco)、10 gの酵母エキス (Difco)、および5 g の塩
化ナトリウムを含む。細胞をOD 546が2.0 になるまで増
殖させ、その後10-3mol/l のIPTGで誘導する。さらに4
時間後、細胞を遠心により回収し、リゾチーム/EDTAで
溶解し、inclusion bodies (IB's、EP-A 0 219 874参
照) としてG-CSF を単離する。
たは再生は、EP-A 0 219 874に記載されるように行う。
変性は6 mol/l のグアニジン塩酸塩に対する透析により
行う。この時点でアリコートを取り、5 mmol/lのリン酸
カリウム緩衝液、pH7 に対して透析後、これをIgA プロ
テアーゼで切断する (実施例 4) 。別法として、グアニ
ジン塩酸塩での変性後に、1 mmol/l GSHと3 mmol/l GSS
Gを含む5 mmol/lのリン酸カリウム緩衝液、pH7 に対し
て透析を行う。再生後、これを5 mmol/lのリン酸カリウ
ム緩衝液、pH7 に対して透析する。実施例 4 位置-1にメチオニンを含まない天然G-CSF を製造するた
めのIgA1プロテアーゼによる融合タンパク質の切断 EMBO Jour. 3 (1984), 1595-1601に記載されるようにIg
A1プロテアーゼを単離する。実施例 3に従って再生また
は変性したG-CSF 10μg に2-5 μg のIgA プロテアーゼ
を加え、室温で30分間インキュベートする。メチオニン
を含まないG-CSF は、Mono-Qや Mono-S のようなイオン
交換カラムにかけて単離することができる。アミノ末端
のタンパク質の配列決定は、精製したG-CSF が正しいア
ミノ酸配列 Thr(+)-Pro(+2) から始まることを示す。実施例 5 タンパク質融合体の生産および Igase特異的切断部位で
の“inclusion bodies”からの不溶性タンパク質凝集体
の切断 原核生物発現ベクター pEX31C (K. Strebel, Journal o
f Virology 57, 983-991, 1986) は、この系を使って
E. coli細胞で過剰生産されたタンパク質融合体が Igas
eによって担体タンパク質と目的タンパク質に切断され
るような方法で修飾した。
アミノ酸配列 Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro・!・Thr-
Pro をコードする二本鎖DNA 断片を構築する。このDNA
断片を遺伝子工学的手法を使って発現ベクター pEX31C
の EcoRI切断部位に挿入する。さらに、これに直接隣接
して、2 つの合成DNA 断片 (一連の制限エンドヌクレア
ーゼのための適当な切断部位と遺伝子発現に関与する細
菌酵素のための終止シグナルを含んでいた) をHindIII
切断部位に挿入する。このようにして形成された発現プ
ラスミド pEV37に、SmaIとHindIII の切断部位を使っ
て、Neisseria gonorrhoeae MS11由来のIgA プロテアー
ゼ前駆体タンパク質のβ- ドメインをコードするDNA 断
片を挿入する。これは、E. coli で発現させたとき融合
タンパク質を形成するハイブリッド遺伝子が構築された
ことを意味する。これはアミノ末端に担体タンパク質と
してMS2 ポリメラーゼの99アミノ酸を、続いて Igase切
断配列を有する12アミノ酸の中央結合部を、そしてカル
ボキシル末端に目的のβ- ドメインを含んでいた (図 1
参照) 。精製したIgase を使って、タンパク質融合体の
カルボキシル末端のβ- ドメインを結合部内の切断部位
Pro・!・Thr で切断することができるだろう。
タンパク質融合体の制御可能な過剰生産のためにバクテ
リオファージラムダ由来の調節因子 CI857を含む E. co
li細胞に形質転換することにより導入した (E. Remaut,
Gene 22, 103-113, 1983)。CI857 リプレッサーは温度
を28℃から42℃へ上げて不活性化し、その結果組み換え
E. coli細胞でのタンパク質の生産が活性化された。こ
のために、28℃で12時間増殖させた E. coli培養物 50
mlを、予め45℃に加熱しておいた培地 200 mlに移し、4
2℃でさらに2 時間培養した。この段階で、タンパク質
融合体が“inclusion bodies”の形で細菌の細胞質中に
大量に蓄積する。その後細胞を遠心により回収し、20 m
l の溶解緩衝液 (10% サッカロース、50 mM トリス/HCl
pH8.0、1 mM EDTA)に懸濁し、400 μl のリゾチーム溶
液 (5 mg/ml)の添加後22℃で30分間インキュベートす
る。洗剤トリトンX-100 を加えて0.1%の最終濃度とな
し、この溶液を再度30分間インキュベートした。細胞の
溶解により放出されたDNA を超音波処理で破壊し、沈殿
体中に存在するタンパク質融合体を含む不溶性成分を遠
心し、その後5 mlのU1NTE 緩衝液 (1 M 尿素、50 mM Na
Cl、50 mM トリス/HCl pH8.0、1 mM EDTA)で洗った。再
遠心後、沈殿物を5 mlのPBS 緩衝液 (20 mM リン酸カリ
ウム pH7.5、140 mM NaCl)中で音波処理を行って懸濁
し、洗浄した。残留尿素を完全に除くためにこの方法を
数回繰り返した。最後に融合タンパク質を含む不溶性画
分は音波処理により5 mlのPBS 緩衝液に懸濁した。
2.5%)とその後のクーマシーブルーによる染色を用い
て、懸濁したタンパク質融合体の品質および量を測定し
た。切断のために、タンパク質懸濁体を酵素/基質比 1
/100(W/W) で37℃で3 時間インキュベートした。未精製
の不溶性タンパク質融合体から得られた切断を分析用SD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、これにより
β- タンパク質の予期されたサイズを有するポリペプチ
ドが形成されたことが分かった。このタンパク質をニト
ロセルロース膜に移し、自動配列解析にかけた。末端ア
ミノ酸の配列により、それがIgase 切断部位での正しい
切断によりタンパク質融合体から形成されたものである
ことを確認した。
% までが変換されたにすぎなかった。より多量のIgase
を加えても、より長い時間反応させても増加が見られな
かった。このことは、Igase の切断部位が融合タンパク
質の非切断部分では接近しにくいことを示している。ハ
イブリッドタンパク質および切断産物は、Igase とのイ
ンキュベーション後でさえ、まだ不溶性の凝集体の形を
しており、その結果懸濁体から遠心により沈殿した。
に、予め追加の精製段階に付したタンパク質融合体を使
用した場合は、90% までの切断収率が達成された。この
ために、不溶性沈殿物は、U1NTE 緩衝液 (上記) で洗っ
た後、5 mlのU7NTE 緩衝液 (7M 尿素、50 mM NaCl、50
mM トリス/HCl pH8.0、1 mM EDTA)に加えた。不溶性成
分を遠心により除き、可溶性画分を4 ℃で5 l のPBS 緩
衝液に対して透析した。透析による尿素の除去中、融合
タンパク質が不溶性凝集体の形で溶液から沈殿した。沈
殿した凝集体を超音波処理で微細な懸濁体に変換し、Ig
ase で切断して、上記のように分析した。実施例 6 Igase による再生した可溶性タンパク質融合体の特異的
切断 pEX 発現系を使って、MS2 ポリメラーゼとヒト細胞障害
性Tリンパ球のCD8 タンパク質の一部 (図 2参照) から
成るハイブリッドタンパク質を生産した (実施例 1参
照) 。初期の精製およびU7NTE 緩衝液中での“inclusio
n bodies”からのタンパク質の可溶化後に、更なる精製
段階として分離用12.5% SDS ポリアクリルアミドゲルを
使用した。クーマシーブルー染色後にタンパク質融合体
を単一バンドとしてゲルから切りだし、Hunkapiller の
方法 (Methods in Enzymology 91,227-235, 1983)に従
ってゲル材料から分離した。この方法では、0.1% SDS
(ドデシル硫酸ナトリウム) を加えたTAE 緩衝液 (40 mM
トリス/ 酢酸塩 pH7.9) 中で電気溶出を行った。その
後22℃で5 l のTAE 緩衝液に対して透析してSDS を除い
た。タンパク質は更なる透析で貯蔵緩衝液 (20 mM リン
酸カリウム pH7.5、140mM NaCl 、50% グリセロール)
に移した。このようにして得られた可溶性融合タンパク
質を精製Igase (実施例 5参照) とインキュベートし、
この方法で融合タンパク質はCD8 分子中に含まれる切断
部位 (-Pro-Pro・!・Thr-Pro-Ala 、図 2参照) で2 つ
のポリペプチド断片に完全に切断された。切断の特異性
は、小さい方の切断産物のアミノ末端のアミノ酸配列を
分析して調べた。この試験の結果は、予期した通りに、
Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile であった。実施例 7 培養上清から単離した可溶性融合タンパク質のIgase に
よる特異的切断 コレラ毒素B-サブユニットとN. gonorrhoeae MS11 由来
のIgase プロテアーゼ前駆体のβ- ドメインの一部 (Po
s. 1097-1160; J. Pohlner, Nature 325, 458-462, 198
7)から成るタンパク質融合体を、組み換え E. coli細胞
の培養上清から可溶性形態で単離した。2 つのタンパク
質成分を互いから分離するために、Igase の人工的な切
断配列 (Pro-Pro ・!・Thr-Pro-) をコレラ毒素B-サブ
ユニットとβ- ドメイン間に遺伝子工学的手法を使って
挿入した。このために、オリゴヌクレオチドTK006 およ
びTK007 を結合部の制限切断部位EcoRI およびSacII 間
に挿入した (図 3参照) 。37℃で12時間増殖させた細菌
培養物の上清 2 lから融合タンパク質を硫安沈殿により
濃縮し、その後5 l のPBS 緩衝液に対して透析した。切
断のために、それを精製Igase とPBS 緩衝液中50μg/ml
の濃度で酵素/基質比 1/50 (w/w) で37℃、2 時間イン
キュベートした。イムノブロット分析により、完全な切
断により生じた大きい方の切断断片は、その分子量およ
び抗血清との反応に関して、天然コレラ毒素B-サブユニ
ットに一致することが分かった。実施例 8 Igase を用いたグラム陰性菌の表面上のタンパク質融合
体の特異的切断 発現分泌系を使って、コレラ毒素B-サブユニットとIgA
プロテアーゼβ- ドメインから成るタンパク質融合体 T
KB49および TKB59を、組み換えサルモネラ菌の表面に露
出させた。TKB49 をコードするハイブリッド遺伝子は、
毒素とβ- ドメイン間の結合部にIgase のもとの切断配
列 (c)(-Pro-Pro ・!・Ala-Pro-) を含んでいた。これ
に対して、TKB59 の遺伝子には制限切断部位 EcoRIとSa
cII 間に、切断配列 (-Pro-Pro・!・Thr-Pro-) をコー
ドするオリゴヌクレオチド TK006および TK007から成る
合成DNA 断片が挿入された (図 3参照) 。かかるタンパ
ク質融合体が表面に固着された細菌を精製Igase とイン
キュベートしたら、Igase切断部位で特異的切断が観察
された。イムノブロット分析により、切断により生じた
小さい切断断片は、その分子量および抗血清との反応に
関して、天然コレラ毒素B-サブユニットに一致すること
が分かった。実施例 9 組み換え E. coli細胞の培養上清からの活性Igase の精
製 修飾したIgA プロテアーゼ遺伝子を有するプラスミド p
EX1070 (DE 36 22 221.6) を含む組み換え E. coli C60
0 細胞は培養上清に活性Igase を分泌する。上清中のこ
の酵素は膜濾過とこれに続く硫安 (0.42 g/ml)による溶
液からの沈殿により濃縮した。遠心後、沈殿物を Biore
x 緩衝液 (50 mM リン酸カリウム pH7.0、8.6%グリセロ
ール) に溶解し (1 l の培養上清当たり緩衝液 1 ml)、
2 l の緩衝液に対して透析して平衡化し、その後カチオ
ン交換クロマトグラフィー (Biorex 70)にかけた。結合
したIgA プロテアーゼは溶離緩衝液 (500 mM リン酸カ
リウム pH7.0、8.6%グリセロール) を使って一段階でカ
ラムから溶離し、分画化した。次いでIgA プロテアーゼ
含有画分をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (12.5
%)で分析した。精製のこの時点で、平均純度>90%が得ら
れた。純粋なIgaseの調製のために、Sephacryl HR300
によるゲル濾過を Biorex 緩衝液で行い、続いて更なる
カチオン交換クロマトグラフィー (上記参照) を行っ
た。Igase の活性は、IgA1抗体とのインキュベーション
および得られた切断産物のSDS ポリアクリルアミドゲル
での分離により調べた。実施例 10 メチオニン不含インターロイキン3 の発現用プラスミド
の構築 この構築は発現ベクター pPZ07-mgllac (WO88/09373)を
使って行う。このために、発現ベクター pPZ07-mgllac
をNCOIで切断し、突出末端をヤエナリ (mung bean)のヌ
クレアーゼで除去する。次に、このベクターをBam HIで
再度切断する。融合タンパク質の最適化されたアミノ末
端領域は以下のオリゴヌクレオチドを使ってDNA レベル
で作製される: プライマー 1A: 5' AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACC ATGGAG 3' プライマー 1B: 5' GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTT TCCTCCGAATT 3' 両方のオリゴヌクレオチドを等モル量で加え、上記のよ
うに切断したベクター pPZ07-mgllac に100 倍過剰で挿
入する。連結後、常法でコンピテント細胞にしたE. col
i K12の細胞を形質転換する。既知の方法により細胞か
らDNA を単離し、SalI/Bam HI で切断し、そしてシグナ
ル配列を含まないインターロイキン3 をコードする領域
を含むDNA 断片と連結する (以下に記載する) 。
ーロイキン3 をコードする領域は公知のPCR 法を使って
DNA レベルで作製され、PCR 反応は鋳型としてのインタ
ーロイキン3 のcDNAおよび下記のプライマーを用いて行
う: プライマー 2A: 5' AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3' プライマー 2B: 5' TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3' 生成されたPCR 断片は酵素 SalI と Bam HI で切断し、
上記のベクターDNA に直接挿入し、リガーゼで共有結合
させる。
のDNA の形質転換後、Il 3をE. coli にRb'sの形で合成
させ、その後単離する。タンパク質の変性および再生は
G-CSF に関して記載したように行い、再生したタンパク
質をIgA プロテアーゼで切断する。このようにして調製
されたメチオニン不含 Il 3 は更なる精製段階後に治療
のために使用することができる。実施例 11 メチオニン不含インターロイキン2 の発現用プラスミド
の構築 この構築は、実施例 10 に記載したように、プライマー
1A および1Bの挿入後にSalI/Bam HI で切断した発現ベ
クター pPZ07-mgllac (WO88/09373)を使って行うことが
できる。IgA プロテアーゼ認識領域を有するインターロ
イキン2 をコードする領域はPCR 法を使ってDNA レベル
で作製され、PCR 反応は鋳型としてのインターロイキン
2 のcDNAおよびIgA プロテアーゼ認識領域をコードする
プライマー3Aおよび3Bを用いて行う。 プライマー3A: 5' AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3' プライマー3B: 5' TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3' このようにして得られたPCR 断片を酵素 SalI と Bam H
I で切断し、上記のベクターDNA に直接挿入する。Il 3
に関して述べたようにその後の手順を行う。
ら始まるメチオニン不含治療用タンパク質がIgA プロテ
アーゼ認識切断部位の使用と更なる方法によりどのよう
にして得られるかについて記載した。上記実施例から類
推して、すなわちIgA プロテアーゼの認識領域および発
表された配列の5'または3'末端に相当する領域を含み、
かくしてPCR 増幅により作製できるオリゴヌクレオチド
を使うことにより、他のメチオニン不含タンパク質を生
産することができる。以下に、天然に存在する成熟体が
Ala-Proで始まり、従って本発明方法と類似の方法で生
産し得る治療上関係のあるタンパク質を示してある: カテプシン L (EC 3.4.22.15), Mason, R.W. et al. Bi
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em. 263, 6579-6587,1988. さらに、成熟体がアミノ酸配列 Ser, Pro で始まるタン
パク質も生産できる。これらの例は次のものである: アルファ-1 アンチトリプシン, Hill, R.E. et al., N
ature 311, 175-177,1984. 心房性ナトリウム利尿因子, Kambayashi, Y. et al., F
EBS Lett. 259, 341-345, 1990. 成熟体が Thr Proで始まり、治療上関係のあるタンパク
質の他の例は次のものである: 補体因子 B, Campell, R.D. et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. 80, 4464-4468,1983. アポリポタンパク質 A, Eaton, D.L. et al., Proc. Na
t. Acad. Sci. 84, 3224-3228, 1987. 上記微生物の寄託に関する詳細を以下に示す。
酸) とN.gonorrhoeae MS11由来のIgA プロテアーゼ前駆
体のβ- ドメイン (アミノ酸位置1195-1505)の間のタン
パク質融合体を示す模式図である。
酸およびプラスミドによりコードされる6 アミノ酸) と
ヒトTリンパ球からのCD8 タンパク質の206 アミノ酸か
ら成るタンパク質融合体を示す模式図である。
れたタンパク質融合体 B63* を示す模式図である。
である。
Claims (3)
- 【請求項1】 N-末端メチオニン残基を有する原核生物
由来のG-CSF を定量的に含まず、他のタンパク質によっ
て0.1%未満汚染されている、N-末端メチオニン残基の存
在しない原核生物由来の組み換えG-CSF または組み換え
G-CSF 誘導体。 - 【請求項2】 他のタンパク質によって10-3% 未満汚染
されている、請求項1記載の組み換えG-CSF またはG-CS
F 誘導体。 - 【請求項3】 活性物質としての請求項1または2に記
載したG-CSF またはG-CSF 誘導体および、所望により、
慣用の製剤上の添加剤、補助剤および/または担体を含
有する、免疫賦活剤として使用するための医薬組成物。
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