JPH02291294A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒトオステオカルシンの２１位及び２４位の
γ一カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）をグルタミン酸
（Ｇｌｕ）に置換した新規ポリペプチド、及び該ポリペ
プチドの製造方法、並びに生体由来の他の成分を含有し
ない純化されたヒト才ステオカルシン及びその製造方法
に関する。
γ一カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）をグルタミン酸
（Ｇｌｕ）に置換した新規ポリペプチド、及び該ポリペ
プチドの製造方法、並びに生体由来の他の成分を含有し
ない純化されたヒト才ステオカルシン及びその製造方法
に関する。
オステオカルシン（以下ＯＣと略称する）は骨で生産さ
れるビタミンＫ依存性カルシウム結合蛋白である。ＯＣ
は、造骨過程において骨形成の成長因子として機能して
いることが示唆されており、骨代謝異常に起因する疾病
の治療薬となることが期待される。ＯＣの生合成は骨組
織、特に骨芽細胞で行われ、骨代謝、骨の石灰化、異所
石灰化に関与し、癌の骨転移、ページエット病、原発性
副甲状腺機能冗進症、オステ才ベニアとも関連している
。ヒトＯＣは４９個のアミノ酸からなり、２１位及び２
４位にＧｌａを含有するＧｌａ蛋白質である。
れるビタミンＫ依存性カルシウム結合蛋白である。ＯＣ
は、造骨過程において骨形成の成長因子として機能して
いることが示唆されており、骨代謝異常に起因する疾病
の治療薬となることが期待される。ＯＣの生合成は骨組
織、特に骨芽細胞で行われ、骨代謝、骨の石灰化、異所
石灰化に関与し、癌の骨転移、ページエット病、原発性
副甲状腺機能冗進症、オステ才ベニアとも関連している
。ヒトＯＣは４９個のアミノ酸からなり、２１位及び２
４位にＧｌａを含有するＧｌａ蛋白質である。
天然のＯＣはウシ等の骨から抽出できるが、純化された
ヒトＯＣを大量に得ることは困難であり、またウシとヒ
トＯＣではその構造も異なる。
ヒトＯＣを大量に得ることは困難であり、またウシとヒ
トＯＣではその構造も異なる。
ヒトＯＣは４９個アミノ酸と比較的長鎖ポリペプチドで
あり、化学合成法も困難である。ヒ｝ＱＣを大量にかつ
安価に得るためには、その前駆体ポリペブチド、すなわ
ちヒトＯＣの２１位及び２４位のＧｌａをＧｌｕに置換
したポリペブチド（以下、Ｇｌｕ−ＤＣと略称する）を
安価に大量に供給することが必要とされる。
あり、化学合成法も困難である。ヒ｝ＱＣを大量にかつ
安価に得るためには、その前駆体ポリペブチド、すなわ
ちヒトＯＣの２１位及び２４位のＧｌａをＧｌｕに置換
したポリペブチド（以下、Ｇｌｕ−ＤＣと略称する）を
安価に大量に供給することが必要とされる。
本発明の目的はＧｌｕ−ＱＣのの製造方法、及び該Ｇｌ
ｕ−ＤＣを前駆物質とし、ＧｌｕをＧｌａ化したヒトＯ
Ｃの製造方法を提供し、生体由来の他の成分を含有しな
い純化されたヒトＯＣを提供することにある。
ｕ−ＤＣを前駆物質とし、ＧｌｕをＧｌａ化したヒトＯ
Ｃの製造方法を提供し、生体由来の他の成分を含有しな
い純化されたヒトＯＣを提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はポリベプチ
ドに関する発明であって、下記式Ｉ：（式中ＸはＨ又は
｝Ｉ−Ｌｙｓ基、Ｙは０■又はＬｙｓ−ＤＨ基を示す》
で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。
ドに関する発明であって、下記式Ｉ：（式中ＸはＨ又は
｝Ｉ−Ｌｙｓ基、Ｙは０■又はＬｙｓ−ＤＨ基を示す》
で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。
また本発明の第２の発明は純化されたヒトＯＣに関する
発明であって、生体の他の成分を含有しないことを特徴
とする。
発明であって、生体の他の成分を含有しないことを特徴
とする。
また本発明の第３の発明は、上記式Ｉにおいて、ＸがＨ
であり、ＹがＤＨで表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの製造方法に関する発明であって、前記式■に
おいて、ＸがＨであり、ＹがＬｙｓ一ＤＨ基で表される
アミノ酸配列を有するポリベプチドをカルボキシペブチ
ダーゼＢで分解することを特徴とする。
であり、ＹがＤＨで表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの製造方法に関する発明であって、前記式■に
おいて、ＸがＨであり、ＹがＬｙｓ一ＤＨ基で表される
アミノ酸配列を有するポリベプチドをカルボキシペブチ
ダーゼＢで分解することを特徴とする。
また本発明の第４の発明は、上記第２の発明の純化され
たヒトＯＣの製造方法に関する発明であって、第３の発
明で得られるポリペプチドに、ビタミンＫ依存性力ルポ
キシラーゼを作用させることを特徴とする。
たヒトＯＣの製造方法に関する発明であって、第３の発
明で得られるポリペプチドに、ビタミンＫ依存性力ルポ
キシラーゼを作用させることを特徴とする。
更に、本発明の第５の発明は、第１の発明のポリペブチ
ドの前駆体に関する発明であって、下記式■： （式中ｎは２以上の整数を示す）で表されるアミノ酸配
列を有することを特徴とする。
ドの前駆体に関する発明であって、下記式■： （式中ｎは２以上の整数を示す）で表されるアミノ酸配
列を有することを特徴とする。
遺伝子組換え技法によって小分子のペプチドを大量生産
することは一般に困難とされている。
することは一般に困難とされている。
その理由は、微生物の宿主細胞中で作られた小分子のべ
ブチドは細胞内で酵素作用により容易に分解されてしま
うためであると考えられている。
ブチドは細胞内で酵素作用により容易に分解されてしま
うためであると考えられている。
本発明者らは、第１の発明の目的ポリペブチドすなわち
Ｇｌｕ−ＤＣをコードする遺伝子を複数個連結してベク
ターに組込み、得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌に入れ
、形質転換体を培養する方法によれば、目的ポリペブチ
ドが重合した高分子ペブチドとして得られ、この重合ペ
プチドを切断することによりＧｌｕ−ＱＣを製造するこ
とができること、また最終目的ポリベプチドすなわちヒ
トＯＣは、前記Ｇｌｕ−ＱＣにビタミンＫ依存性力ルポ
キシラーゼを作用させることによって製造することがで
きることを見出した。
Ｇｌｕ−ＤＣをコードする遺伝子を複数個連結してベク
ターに組込み、得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌に入れ
、形質転換体を培養する方法によれば、目的ポリペブチ
ドが重合した高分子ペブチドとして得られ、この重合ペ
プチドを切断することによりＧｌｕ−ＱＣを製造するこ
とができること、また最終目的ポリベプチドすなわちヒ
トＯＣは、前記Ｇｌｕ−ＱＣにビタミンＫ依存性力ルポ
キシラーゼを作用させることによって製造することがで
きることを見出した。
以下本発明を詳細に説明する。
遺伝子組換え法によるＯＣ前駆体の製造は例えば下記の
とおり行うことができる。
とおり行うことができる。
添付図面において、第１図はプラスミドｐＯ［１’１２
及びブラスミドｐＯｃ ２ １の、第２図はプラスミド
ｐｏｃ ７ ３の、第３図はプラスミドｐＯｃ ８２及
びブラスミドｐＯｃ ８ ３の、及び第４図はプラスミ
ドｐＯｃ ９ ８ ０の各々造成工程、制限酵素認識部
位、及び機能地図を表す模式図である。
及びブラスミドｐＯｃ ２ １の、第２図はプラスミド
ｐｏｃ ７ ３の、第３図はプラスミドｐＯｃ ８２及
びブラスミドｐＯｃ ８ ３の、及び第４図はプラスミ
ドｐＯｃ ９ ８ ０の各々造成工程、制限酵素認識部
位、及び機能地図を表す模式図である。
工程１ （第１図参照）
遺伝子断片の合成：
まず、下記弐■、■、■及び■で表されるＤＮＡを化学
合成する。
合成する。
５′＾ＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡ＾＾ＴＡＣＣＴＧＴＡ
ＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧ
ＴＡＣＣ［：ＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡ＾ＣＣＧＣＧＴ
ＣＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣ３’
（式■）５′ ＾ＡＣＧＡＡＴＴ［：ＣＴＡ八Ａ（１’
ＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧＡＡＡＣＧ＾ＣＧＧＴ八＾Ｇ［ｌ
：ＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧＧＴＣ＾ＧＣ
ＣＡＧＴＴＣＧＴＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴ
ＴＣ−ＧＣＡＡＡＣＴＴＣ八Ｃ３′ （式■）５’
ＡＡＣＣＴＴＴ＾＾＾ＴＡ［：ＣＴＧＴ八ＣＣＡＧＴ
ＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣ［：ＧＴＡＣＣ
ＣＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧ八
＾ＧＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧ＾八Ｃ３’（式■） ５’ ＡＡＣＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧ＾＾＾ＣＧＡＣＧ
ＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣ−ＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧ
ＧＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣ−ＧＣＡＧＴＣＣＧＧ
ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣ３’ （
式■）（式中、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃはそれぞれヌクレ才チド
中の塩基アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す
。以下同じ） これらのＤＮＡの合成は、リン酸アミダイト法による固
相合成法に従い、ＤＮＡ自動合成機により行う。
ＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧ
ＴＡＣＣ［：ＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡ＾ＣＣＧＣＧＴ
ＣＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣ３’
（式■）５′ ＾ＡＣＧＡＡＴＴ［：ＣＴＡ八Ａ（１’
ＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧＡＡＡＣＧ＾ＣＧＧＴ八＾Ｇ［ｌ
：ＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧＧＴＣ＾ＧＣ
ＣＡＧＴＴＣＧＴＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴ
ＴＣ−ＧＣＡＡＡＣＴＴＣ八Ｃ３′ （式■）５’
ＡＡＣＣＴＴＴ＾＾＾ＴＡ［：ＣＴＧＴ八ＣＣＡＧＴ
ＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣ［：ＧＴＡＣＣ
ＣＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧ八
＾ＧＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧ＾八Ｃ３’（式■） ５’ ＡＡＣＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧ＾＾＾ＣＧＡＣＧ
ＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣ−ＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧ
ＧＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣ−ＧＣＡＧＴＣＣＧＧ
ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣ３’ （
式■）（式中、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃはそれぞれヌクレ才チド
中の塩基アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す
。以下同じ） これらのＤＮＡの合成は、リン酸アミダイト法による固
相合成法に従い、ＤＮＡ自動合成機により行う。
式■で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ３という》と式■
で示されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ４という）から形成さ
れる、一部が二重鎖になったＤＮＡをクレノウ酵素で二
重鎖にして下記式■で表される二重鎮ＤＮＡ断片《以下
、遺伝子７という》を造成する。
で示されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ４という）から形成さ
れる、一部が二重鎖になったＤＮＡをクレノウ酵素で二
重鎖にして下記式■で表される二重鎮ＤＮＡ断片《以下
、遺伝子７という》を造成する。
ロｒａｌ
ＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣ［：ＧＧＴＴＣＣＧＴＡＣ
ＣＣＧ＾ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧ［：ＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＧＧＧ［：−ＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧ
ＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣ
ＧＣＡＧ［：ＡＣＴＴＣＡ八’ｒＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡ
ＣＣＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡ−＾ＣＧＣＴＴＧＡ
ＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴ
ＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣ
ＧＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣＡ八八ＧＧＴＣＣＴＴ−Ｇ
ＣＴＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＧＧＴ（’ＣＧＧ
ＴＴ−ＣＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣ八八八Ｇ八ＴＧＣＣＡＧ
Ｇ［：Ｃ八八一ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴ３’ ＾ＴＣＣＴＴＡ＾６Ｃ八＾５′
（式■）（式中、ロｒａ Ｉに向かう引出し線は制限
酵素Ｄｒａ Ｉによる切断部位を示す。以下同じ）同様
に、式■で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ５という）と
式■で表されるＤＮＡ （以下ＤＮ八〇という）から下
記式■で表される二重鎮ＤＮＡ断片（以下、遺伝子８と
いう）を造成する。
ＣＣＧ＾ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧ［：ＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＧＧＧ［：−ＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧ
ＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣ
ＧＣＡＧ［：ＡＣＴＴＣＡ八’ｒＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡ
ＣＣＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡ−＾ＣＧＣＴＴＧＡ
ＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴ
ＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣ
ＧＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣＡ八八ＧＧＴＣＣＴＴ−Ｇ
ＣＴＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＧＧＴ（’ＣＧＧ
ＴＴ−ＣＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣ八八八Ｇ八ＴＧＣＣＡＧ
Ｇ［：Ｃ八八一ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴ３’ ＾ＴＣＣＴＴＡ＾６Ｃ八＾５′
（式■）（式中、ロｒａ Ｉに向かう引出し線は制限
酵素Ｄｒａ Ｉによる切断部位を示す。以下同じ）同様
に、式■で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ５という）と
式■で表されるＤＮＡ （以下ＤＮ八〇という）から下
記式■で表される二重鎮ＤＮＡ断片（以下、遺伝子８と
いう）を造成する。
Ｏｒａ Ｉ
ＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧ（：ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＴＡ［
：ＣＣＧ＾ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣ
ＧＴＧ＾ＡＧＴＴＣＴＧＧＧ（：ＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧ
ＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡ＾ＴＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣ
ＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡ＾一ＡＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴ
ＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣ
ＣＡＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡ＾ＧＡ．ＣＣＧＡ
ＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣ＾八ＡＧＧＴＣＣＴＴ−ＧＣＴ
ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＧＧＴＣＣＧＧＴＴ３
’Ｃ６＾＾ＴＧＧＣＡＧＣＡＡ＾６＾ＴＧＣＣＡＧＧＣ
Ｃ＾＾５′《式■》工程２（第１図参照》 遺伝子７、８を含むブラスミドの造成：プラスミドｐｌ
Ｉｃ １ ９ （宝酒造製》を制限酵素ｌ１ｉｎｃ［［
で切断後、遺伝子７をリガーゼで結合してプラスミドｐ
ｏｃ １ ２を造成する。同様に旧ｎｃ■で切断したプ
ラスミドｐＵｃ ｌ ９に遺伝子８をリガーゼで結合し
てブラスミドｐｏｃ ２ １を造成する。
：ＣＣＧ＾ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣ
ＧＴＧ＾ＡＧＴＴＣＴＧＧＧ（：ＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧ
ＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡ＾ＴＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣ
ＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡ＾一ＡＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴ
ＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣ
ＣＡＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡ＾ＧＡ．ＣＣＧＡ
ＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣ＾八ＡＧＧＴＣＣＴＴ−ＧＣＴ
ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＧＧＴＣＣＧＧＴＴ３
’Ｃ６＾＾ＴＧＧＣＡＧＣＡＡ＾６＾ＴＧＣＣＡＧＧＣ
Ｃ＾＾５′《式■》工程２（第１図参照》 遺伝子７、８を含むブラスミドの造成：プラスミドｐｌ
Ｉｃ １ ９ （宝酒造製》を制限酵素ｌ１ｉｎｃ［［
で切断後、遺伝子７をリガーゼで結合してプラスミドｐ
ｏｃ １ ２を造成する。同様に旧ｎｃ■で切断したプ
ラスミドｐＵｃ ｌ ９に遺伝子８をリガーゼで結合し
てブラスミドｐｏｃ ２ １を造成する。
工程３（第２図参照）
ｐｓｔＳ−（Ｇｌｕ−ＱＣ）融合遺伝子を含むブラスミ
ドの造成： ブラスミドｐＯｃ ２ １を制限酵素ロｒａ Ｉと旧口
Ｃ■で切断し、Ｇｌｕ−ＱＣのＮ末端にＬｙｓ残基が付
加したポリペプチド〔以下、Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−Ｑ
Ｃ）と略称する〕をコードする断片（以下ＤＮＡ９とい
う）を単離する。ＤＮＡ９をリガーゼで連結したのち、
制限酵素Ｄｒａ Ｉと旧ｎｃＩＩで切断する。これによ
り、ＤＮＡ９が同じ向きに複数個結合した線状及び環状
の二重鎮ＤＮＡが得られる。
ドの造成： ブラスミドｐＯｃ ２ １を制限酵素ロｒａ Ｉと旧口
Ｃ■で切断し、Ｇｌｕ−ＱＣのＮ末端にＬｙｓ残基が付
加したポリペプチド〔以下、Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−Ｑ
Ｃ）と略称する〕をコードする断片（以下ＤＮＡ９とい
う）を単離する。ＤＮＡ９をリガーゼで連結したのち、
制限酵素Ｄｒａ Ｉと旧ｎｃＩＩで切断する。これによ
り、ＤＮＡ９が同じ向きに複数個結合した線状及び環状
の二重鎮ＤＮＡが得られる。
一方、ｐｓｔ Ｓ遺伝子をコードする１． ５ ｋｂ
Ｐｓｔ１−ＭｌｕｌＤＮＡ断片をｐＢＲ ３２２のＰｓ
ｔ ＩＨｃｏＲ １部位に組込んだＪ）ＳＮ ５１８２
（マゴタ（κ．Ｍａｇｏｔａ）ら、ジャーナル オブ
バクテリ才ロジー（ Ｊ， Ｂａｃｔｅｒ ｉｏ１．
）第１５７巻、第９０９頁（１９８４）］のＰｓｔ Ｉ
− ＢｃｏＲ Ｉ断片をｐｕｃ １９に移しかえたプ
ラスミドであるｐＳＮ ５１８２−＾ｐを制限酵素Ｈｐ
ａ ！で切断し、先のＤＮＡ ９を連結、切断した反応
液に混合してリガーゼで連結することによりｐｓｔＳ遺
伝子の途中にｐｓｔＳと同じ読取り枠で、また同じ向き
に（ｎ − １ ）個のＬｙｓ（Ｇｌｕ−ＤＣ）遺伝子
をもつブラスミドを造成する。
Ｐｓｔ１−ＭｌｕｌＤＮＡ断片をｐＢＲ ３２２のＰｓ
ｔ ＩＨｃｏＲ １部位に組込んだＪ）ＳＮ ５１８２
（マゴタ（κ．Ｍａｇｏｔａ）ら、ジャーナル オブ
バクテリ才ロジー（ Ｊ， Ｂａｃｔｅｒ ｉｏ１．
）第１５７巻、第９０９頁（１９８４）］のＰｓｔ Ｉ
− ＢｃｏＲ Ｉ断片をｐｕｃ １９に移しかえたプ
ラスミドであるｐＳＮ ５１８２−＾ｐを制限酵素Ｈｐ
ａ ！で切断し、先のＤＮＡ ９を連結、切断した反応
液に混合してリガーゼで連結することによりｐｓｔＳ遺
伝子の途中にｐｓｔＳと同じ読取り枠で、また同じ向き
に（ｎ − １ ）個のＬｙｓ（Ｇｌｕ−ＤＣ）遺伝子
をもつブラスミドを造成する。
ｎは２以上の整数であればよいが、例えばブラスミドｐ
Ｏｃ７３は４個のＬｙｓ−（Ｇｌｕ−（ＩＣ）遺伝子を
もつ。
Ｏｃ７３は４個のＬｙｓ−（Ｇｌｕ−（ＩＣ）遺伝子を
もつ。
王程４（第３図参照）
ｎ個のＬｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＱＣ）遺伝子を含むプラ
スミドの造成： ｐＯｃ７３はｐｓｔＳのシグナルペブチド２５アミノ酸
残基、ｐｓｔＳ成熟蛋白のＮ；ｌ１：端部分３ｌアミノ
酸残基に続いてＬｙｓ− （Ｇ ｌｕ−０［’）が４個
、更にｐｓｔＳ成熟蛋白のＣ末端部分２３８アミノ酸残
基から成るベブチドをコードする遺伝子を含む。この遺
伝子から生成するポリベブチドはＣ末端部分に２３８ア
ミノ酸残基から成る不要な配列を含むのでこれを除去す
ることが望ましい。
スミドの造成： ｐＯｃ７３はｐｓｔＳのシグナルペブチド２５アミノ酸
残基、ｐｓｔＳ成熟蛋白のＮ；ｌ１：端部分３ｌアミノ
酸残基に続いてＬｙｓ− （Ｇ ｌｕ−０［’）が４個
、更にｐｓｔＳ成熟蛋白のＣ末端部分２３８アミノ酸残
基から成るベブチドをコードする遺伝子を含む。この遺
伝子から生成するポリベブチドはＣ末端部分に２３８ア
ミノ酸残基から成る不要な配列を含むのでこれを除去す
ることが望ましい。
ｐＯｃ １ ２をＨｉｎｃｌＩ −Ｄｒａ Ｉで切断し
てＬｙｓ（Ｇｌｕ−ＤＣ）をコードするＤＮＡ断片を単
離する（以下ＤＮＡＩＯという）。一方ｐｏｃ ７３を
ＨｐａＩで切断する。両ＤＮＡを連結することによって
Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＱＣ）遺伝子を５個含むプラス
ミドｐｏｃ ８２を造成する。
てＬｙｓ（Ｇｌｕ−ＤＣ）をコードするＤＮＡ断片を単
離する（以下ＤＮＡＩＯという）。一方ｐｏｃ ７３を
ＨｐａＩで切断する。両ＤＮＡを連結することによって
Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＱＣ）遺伝子を５個含むプラス
ミドｐｏｃ ８２を造成する。
同様に工程３において（ｎ−１）個のＬｙｓ−（Ｇｌｕ
−ＤＣ）遺伝子をもつプラスミドを造成し、これを本工
程に適用することによりＬｙｓ−（Ｇｌｕ−０［：）遺
伝子をｎ個含むプラスミドを造成することができる。こ
の遺伝子を発現させることにより、前記式■で表される
Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＤＣ）がｎ個連結されたポリベ
ブチドが生産される。
−ＤＣ）遺伝子をもつプラスミドを造成し、これを本工
程に適用することによりＬｙｓ−（Ｇｌｕ−０［：）遺
伝子をｎ個含むプラスミドを造成することができる。こ
の遺伝子を発現させることにより、前記式■で表される
Ｌｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＤＣ）がｎ個連結されたポリベ
ブチドが生産される。
以下ｎが５の場合の遺伝子発現について説明する。
ｐｏｃ ８２のｐｓｔＳ− （Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ−ロＣ
）〕５融合遺伝子の転写はｐｓｔＳプロモーターの支配
下にあり、リン酸欠乏下誘導される。リン酸欠乏培地で
は宿主菌の生育が良くないために大量の産物を得ること
が困難である。
）〕５融合遺伝子の転写はｐｓｔＳプロモーターの支配
下にあり、リン酸欠乏下誘導される。リン酸欠乏培地で
は宿主菌の生育が良くないために大量の産物を得ること
が困難である。
ｐｏｃ ８２を制限酵素旧ｎｆｌで切断し、ｐｓｔＳ［
Ｌｙｓ（Ｇｌｕ−ＱＣ）］ ｓ遺伝子を含むＤＮＡ切断
を単離する（以下ＤＮＡＩＩという）。Ｄ Ｎ Ａ １
１の両端をクレノウ酵素によって平滑末端にし、１１ｉ
ｎｃＩ［で切断したｐｕｃ １１９に連結してｐｏｃ
８３を造成する。ｐｏｃ ａａのＩ）！ｌｌｔＳ− Ｃ
Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ−ＤＣ》〕，遺伝子の転写はｐｕｃ
１１９由来のＩａｃプロモーターの支配下におかれる
。
Ｌｙｓ（Ｇｌｕ−ＱＣ）］ ｓ遺伝子を含むＤＮＡ切断
を単離する（以下ＤＮＡＩＩという）。Ｄ Ｎ Ａ １
１の両端をクレノウ酵素によって平滑末端にし、１１ｉ
ｎｃＩ［で切断したｐｕｃ １１９に連結してｐｏｃ
８３を造成する。ｐｏｃ ａａのＩ）！ｌｌｔＳ− Ｃ
Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ−ＤＣ》〕，遺伝子の転写はｐｕｃ
１１９由来のＩａｃプロモーターの支配下におかれる
。
」ニ程５（第４図参照）
Ｇｌｕ−ＤＣ生産性の向上：
大腸菌を宿主として異種蛋白を生産する場合、シグナル
配列に変異を導入すると分解を受けにくくなり、産物が
細胞内に大量に蓄積する例がある〔ジエンッ（Ｒ． Ｇ
ｅｎｔｚ）ら、ジャーナル オブ バクテリオロジー、
第１７０巻、第２２１２頁（１９８８）］。
配列に変異を導入すると分解を受けにくくなり、産物が
細胞内に大量に蓄積する例がある〔ジエンッ（Ｒ． Ｇ
ｅｎｔｚ）ら、ジャーナル オブ バクテリオロジー、
第１７０巻、第２２１２頁（１９８８）］。
ｐｏｃ ８３のシグナル配列をコードする部分にあるＣ
ｌａ １部位でプラスミドを切断し、エキソヌクレアー
ゼ■とマングビーンヌクレアーゼでシグナル配列をコー
ドするＤＮＡを欠失させ、クレノウ酵素で平滑末端にし
たのちりガーゼで環状にしてｐｏｃ ９８０を造成する
。
ｌａ １部位でプラスミドを切断し、エキソヌクレアー
ゼ■とマングビーンヌクレアーゼでシグナル配列をコー
ドするＤＮＡを欠失させ、クレノウ酵素で平滑末端にし
たのちりガーゼで環状にしてｐｏｃ ９８０を造成する
。
ｐｏｃ ８３を導入した大腸菌を培養し、全菌体蛋白の
ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動及び抗ウシＯＣ
モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング
を行ったところ、蛋白染色では宿主と区別ができず、ウ
エスタンブロッティングでは予想される分子量よりも低
分子量の数個のバンドが見られる。これに対してｐＯｃ
９８０を導入した大腸菌の蛋白を同様に分析すると、蛋
白染色で予想される分子量の位置に主要なバンドがみら
れ、ウエスタンブロッティングでは単一のバンドとなる
。
ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動及び抗ウシＯＣ
モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング
を行ったところ、蛋白染色では宿主と区別ができず、ウ
エスタンブロッティングでは予想される分子量よりも低
分子量の数個のバンドが見られる。これに対してｐＯｃ
９８０を導入した大腸菌の蛋白を同様に分析すると、蛋
白染色で予想される分子量の位置に主要なバンドがみら
れ、ウエスタンブロッティングでは単一のバンドとなる
。
以上の遺伝子組換え手法を用いて多量に生産されたｐｓ
ｔＳに連結したｎ個のしｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＱＣ）融
合遺伝子産物から以下の手順でＧｌｕ−ＱＣが製造され
る。
ｔＳに連結したｎ個のしｙｓ− （Ｇ ｌｕ−ＱＣ）融
合遺伝子産物から以下の手順でＧｌｕ−ＱＣが製造され
る。
菌体を超音波破砕し、その不溶化物から細胞内に蓄積し
た目的の産物を含む頚粒をシヨ糖密度勾配遠心によって
得る。この顆粒を尿素で可溶化したのちリシルエンドペ
ブチダーゼで加水分解するとＧｌｕ−ＤＣのカルボキシ
ル末端側にＬｙｓが結合したポリペプチド、〔以下、（
Ｇｌｕ−ＱＣ）Ｌｙｓと略称する〕が得られる。（Ｇｌ
ｕ−ロ［：） −ＬｙｓをカルボキシペブチダーゼＢで
加水分解するとカルボキシル末端のＬｙｓが除かれて旧
ｕ−ＱＣが単一の生成物として得られる。
た目的の産物を含む頚粒をシヨ糖密度勾配遠心によって
得る。この顆粒を尿素で可溶化したのちリシルエンドペ
ブチダーゼで加水分解するとＧｌｕ−ＤＣのカルボキシ
ル末端側にＬｙｓが結合したポリペプチド、〔以下、（
Ｇｌｕ−ＱＣ）Ｌｙｓと略称する〕が得られる。（Ｇｌ
ｕ−ロ［：） −ＬｙｓをカルボキシペブチダーゼＢで
加水分解するとカルボキシル末端のＬｙｓが除かれて旧
ｕ−ＱＣが単一の生成物として得られる。
以上のようにＧｌｕ−ＤＣが遺伝子組換え手法により容
易に、かつ大量に得られる。本発明のＧｌｕＯＣの製造
方法は酵素的に除去可能なスベーサーを介して目的の遺
伝子を合成して重合化し、適当な遺伝子と融合させ、微
生物によって融合遺伝子産物を大量に生産し、得られた
産物を化学的、酵素的に処理して単量体に変換する方法
である。
易に、かつ大量に得られる。本発明のＧｌｕＯＣの製造
方法は酵素的に除去可能なスベーサーを介して目的の遺
伝子を合成して重合化し、適当な遺伝子と融合させ、微
生物によって融合遺伝子産物を大量に生産し、得られた
産物を化学的、酵素的に処理して単量体に変換する方法
である。
本発明ではスペーサーとしてＬｙｓ ’ｓ単量体化にリ
シルエンドペブチダーゼ、スペーサーの除去にカルボキ
シペブチダーゼＢを用いたが、目的のポリペブチドを切
断しない他の方法を用いることができる。例えば臭化シ
アンはメチオニン（Ｍｅｔ）のカルボキシル側を切断す
るので、Ｇ Ｉ Ｌｌ−ＤＣに続いてしｙｓ−Ｎｅｔか
ら成るスペーサーをコードする遺伝子を合成し、重合化
発現した後臭化シアンによって単量体化し、カルボキシ
ペブチダーゼＡによってＮｅｔから生じたホモセリン（
Ｈｓｅ）を除去し、カルボキシペプチダーゼ已によっ
てＬｙｓを除去して目的のＧｌｕ−ＤＣを得ることがで
きる。
シルエンドペブチダーゼ、スペーサーの除去にカルボキ
シペブチダーゼＢを用いたが、目的のポリペブチドを切
断しない他の方法を用いることができる。例えば臭化シ
アンはメチオニン（Ｍｅｔ）のカルボキシル側を切断す
るので、Ｇ Ｉ Ｌｌ−ＤＣに続いてしｙｓ−Ｎｅｔか
ら成るスペーサーをコードする遺伝子を合成し、重合化
発現した後臭化シアンによって単量体化し、カルボキシ
ペブチダーゼＡによってＮｅｔから生じたホモセリン（
Ｈｓｅ）を除去し、カルボキシペプチダーゼ已によっ
てＬｙｓを除去して目的のＧｌｕ−ＤＣを得ることがで
きる。
Ｇｌｕ−ＤＣのヒ｝ＱＣへの変換は、例えばカルボキシ
ラーゼを用い、６１ｕをカルボキシル化することにより
行うことができる。カルボキシラーゼとしては、例えば
ビタミンＫ依存性力ルポキシラーゼを例えばウシ肝臓か
らギラルドット（Ｇｉｒａｒｄｏｔ）らの方法〔アナリ
チカル バイオケ ミ ス ト リ ー
（ ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、第１２１巻、第３１５〜３
２０頁（１９８２））で調製すれば良い。
ラーゼを用い、６１ｕをカルボキシル化することにより
行うことができる。カルボキシラーゼとしては、例えば
ビタミンＫ依存性力ルポキシラーゼを例えばウシ肝臓か
らギラルドット（Ｇｉｒａｒｄｏｔ）らの方法〔アナリ
チカル バイオケ ミ ス ト リ ー
（ ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、第１２１巻、第３１５〜３
２０頁（１９８２））で調製すれば良い。
Ｇｌｕ−ＤＣにカルボキシラーゼを作用させて得たヒト
ＯＣは公知の方法で精製することができる。
ＯＣは公知の方法で精製することができる。
精製方法の一例を示せば、Ｇｌｕ−ＱＣは認識せず、ヒ
トＯＣを認識するモノクローナル抗体ＯＣＡ−３０（宝
酒造社製）固定化力ラムを用いる方法により、効率よく
精製することができる。またヒトＯＣはヒドロキシアバ
タイトに吸着することを利用し、ヒドロキシアバタイト
力ラムクロマトグラフィーを行っても良い。
トＯＣを認識するモノクローナル抗体ＯＣＡ−３０（宝
酒造社製）固定化力ラムを用いる方法により、効率よく
精製することができる。またヒトＯＣはヒドロキシアバ
タイトに吸着することを利用し、ヒドロキシアバタイト
力ラムクロマトグラフィーを行っても良い。
以上一連の方法により、萌駆物質Ｇｌｕ−ＯＣ及び目的
物質ヒトＯＣを効率よく得ることができ、生体由来の他
成分を含有しない純化されたヒトＯＣを工業的に製造す
ることができる。
物質ヒトＯＣを効率よく得ることができ、生体由来の他
成分を含有しない純化されたヒトＯＣを工業的に製造す
ることができる。
以下に本発明の実施例を示す。本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例ｌ
（１）ブラスミドｐＯｃ １２ ． ｐＯｃ ２１の作
製：ＤＮＡ３、４各々０．２５μｇをＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ｝ リ ス ・ ＨＣ１ ｐＨ ８．
１ｍＭ ＢＵＴ八ＮＯμｌに溶解し、６５℃でイン
キユベートしたのち３７℃まで徐冷した。これにｄＡＴ
Ｐ ， ｄＧＴＰ ，ｄ［：ＴＰ ． ＴＴＰを各々最
終濃度１ｍＭになるよう加え、クレノウ酵素（宝酒造）
２Ｕを添加して３７℃で１時間インキユベートした後６
５℃で１５分間熱失活した。一方、ｐｕｃ １９ （宝
酒造）０．１μｇをＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）５Ｕを含
む中塩濃度緩衝液（Ｍｅｄｉｕｍ−ｓａｌｔ ｂｕｆｆ
ｅｒ） ［ ７ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら編、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第４５３頁、
コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇｆｌａｒｂｏｒ）社刊〕５μβ中３７℃１時間切断
し、６５℃で１５分間熱失活したのち上記のクレノウ酵
素処理したＤＮＡ３、４の反応液と混合し、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造）を用いて連結した。これを
ＪＭ １０９コンピテントセル（宝酒造）に導入し、ア
ンピシリンとＸ −ｇａｌを含む寒天培地で白色コロニ
ーを形成する株を得た。このコロニーよりアルカリ処理
法（前述のモレキュラー クローニング、第３６８頁）
によってブラスミドＤＮＡを回収してｐｏｃ １２を得
た。
製：ＤＮＡ３、４各々０．２５μｇをＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ｝ リ ス ・ ＨＣ１ ｐＨ ８．
１ｍＭ ＢＵＴ八ＮＯμｌに溶解し、６５℃でイン
キユベートしたのち３７℃まで徐冷した。これにｄＡＴ
Ｐ ， ｄＧＴＰ ，ｄ［：ＴＰ ． ＴＴＰを各々最
終濃度１ｍＭになるよう加え、クレノウ酵素（宝酒造）
２Ｕを添加して３７℃で１時間インキユベートした後６
５℃で１５分間熱失活した。一方、ｐｕｃ １９ （宝
酒造）０．１μｇをＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）５Ｕを含
む中塩濃度緩衝液（Ｍｅｄｉｕｍ−ｓａｌｔ ｂｕｆｆ
ｅｒ） ［ ７ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら編、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第４５３頁、
コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇｆｌａｒｂｏｒ）社刊〕５μβ中３７℃１時間切断
し、６５℃で１５分間熱失活したのち上記のクレノウ酵
素処理したＤＮＡ３、４の反応液と混合し、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造）を用いて連結した。これを
ＪＭ １０９コンピテントセル（宝酒造）に導入し、ア
ンピシリンとＸ −ｇａｌを含む寒天培地で白色コロニ
ーを形成する株を得た。このコロニーよりアルカリ処理
法（前述のモレキュラー クローニング、第３６８頁）
によってブラスミドＤＮＡを回収してｐｏｃ １２を得
た。
ＤＮＡ ５、６を用いて全く同様にｐｏｃ １２を得た
。
。
ｐｏｃ １２、ｐｏｃ ２１の挿入ＤＮＡの配列はジデ
オキシ法〔メッシング（Ｊ， Ｍｅｓｓｉｎｇ． ）
メソッズイン エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｂｎｚｙ−ｍｏ１ｏｇｙ）第１０１巻、第２０〜
７８頁（１９８３）〕により確認した。
オキシ法〔メッシング（Ｊ， Ｍｅｓｓｉｎｇ． ）
メソッズイン エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｂｎｚｙ−ｍｏ１ｏｇｙ）第１０１巻、第２０〜
７８頁（１９８３）〕により確認した。
（２）プラスミドｐＯＣ ７３の作製：ｐＳＮ ５１８
２の１μｇをＢａｍ旧， ＥｃｏＲｌ各々ｌＯＵを含む
１ ０μｆの高塩濃度緩衝液（ｌｌｉｇｈ−ｓａｌｔｂ
ｕｆｆｅｒ） （前述のモレキュラー クローニング
、第４５３頁》中で３７℃２時間切断、６５℃で１５分
間熱失活した。ｐｔｌｃ １９ ０． １ μｇをＢ
ａｍ１１１、Ｂｃｏ旧各々５Ｕを含むｌＯμｌの高塩濃
度緩衝液中で３７℃、２時間切断し、６５℃で１５分間
熱失活した。両ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキットで
１６℃、３０分間連結し、ＪＭ １０９コンビテントセ
ルに導入した。アンビシリン、Ｘ−ｇａｌを含む寒天培
地で白コロニーを形成する株からアルカリ処理法によっ
てブラスミドρＳＮ ５１Ｂ２・＾ｐを得た。
２の１μｇをＢａｍ旧， ＥｃｏＲｌ各々ｌＯＵを含む
１ ０μｆの高塩濃度緩衝液（ｌｌｉｇｈ−ｓａｌｔｂ
ｕｆｆｅｒ） （前述のモレキュラー クローニング
、第４５３頁》中で３７℃２時間切断、６５℃で１５分
間熱失活した。ｐｔｌｃ １９ ０． １ μｇをＢ
ａｍ１１１、Ｂｃｏ旧各々５Ｕを含むｌＯμｌの高塩濃
度緩衝液中で３７℃、２時間切断し、６５℃で１５分間
熱失活した。両ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキットで
１６℃、３０分間連結し、ＪＭ １０９コンビテントセ
ルに導入した。アンビシリン、Ｘ−ｇａｌを含む寒天培
地で白コロニーを形成する株からアルカリ処理法によっ
てブラスミドρＳＮ ５１Ｂ２・＾ｐを得た。
ｐＳＮ ５１８２・Ａｐ ０． １ ｕｇをｔｌｐａ
Ｉ ５Ｕを含むＴＡ緩衝液〔オファレル（０’ Ｆａ
ｒｒｅｌｌ）ら、モレキュラー アンド ジエネラル
ジエネテイクス（Ｍｏｌ， Ｇｅｎ， Ｇｅｎｅｔ，
）第１７９巻、第４２１頁（１９８０）］５μ！中で切
断し、６５℃１５分間熱失活した。１００μｇのｐｏｃ
２１をＨｉｎｃＩ［、ロｒａ Ｉ各々１００Ｕを含む
中塩濃度緩衝液２００μβ中で３７℃２時間切断した。
Ｉ ５Ｕを含むＴＡ緩衝液〔オファレル（０’ Ｆａ
ｒｒｅｌｌ）ら、モレキュラー アンド ジエネラル
ジエネテイクス（Ｍｏｌ， Ｇｅｎ， Ｇｅｎｅｔ，
）第１７９巻、第４２１頁（１９８０）］５μ！中で切
断し、６５℃１５分間熱失活した。１００μｇのｐｏｃ
２１をＨｉｎｃＩ［、ロｒａ Ｉ各々１００Ｕを含む
中塩濃度緩衝液２００μβ中で３７℃２時間切断した。
２％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイ
ドで染色して１５０塩基対（ｂｐ）の断片を切出し、透
析チューブに封入して電気溶出した（前述のモレキュラ
ー クローニング、第１６４頁）。更にフェノール処理
、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。このＤＮ
ＡをＤＮＡライゲーションキ．ットで連結し、フエノ−
ＪＬ，処理、エタノール沈殿ののち中塩濃度緩衝液５０
ｔｒ＋Ｉ！に溶かし、Ｄｒａ Ｉと旧ｎｃＩ［各々５０
Ｕで３７℃２時間反応させ、６５℃で１５分間熱失活し
た。
ドで染色して１５０塩基対（ｂｐ）の断片を切出し、透
析チューブに封入して電気溶出した（前述のモレキュラ
ー クローニング、第１６４頁）。更にフェノール処理
、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。このＤＮ
ＡをＤＮＡライゲーションキ．ットで連結し、フエノ−
ＪＬ，処理、エタノール沈殿ののち中塩濃度緩衝液５０
ｔｒ＋Ｉ！に溶かし、Ｄｒａ Ｉと旧ｎｃＩ［各々５０
Ｕで３７℃２時間反応させ、６５℃で１５分間熱失活し
た。
これとＨｐａ Ｉで切断したｐＳＮ ５１８２−静 ０
．１μｇをＤＮＡライゲーションキットで連結し、｝Ｉ
Ｂ １０１コンピテントセル（宝酒造）に導入してアン
ピシリン耐性コロニーを得た。これらの中からＧｌｕ−
ＱＣ遺伝子を４個、ｐｓｔＳ遺伝子と同じ向きに持つプ
ラスミドｐｏｃ ７３をアルカリ処理法により得た。
．１μｇをＤＮＡライゲーションキットで連結し、｝Ｉ
Ｂ １０１コンピテントセル（宝酒造）に導入してアン
ピシリン耐性コロニーを得た。これらの中からＧｌｕ−
ＱＣ遺伝子を４個、ｐｓｔＳ遺伝子と同じ向きに持つプ
ラスミドｐｏｃ ７３をアルカリ処理法により得た。
（３）プラスミドｐｏｃ ８２、ｐｏｃ ８３の作製：
ｐｏｃ １２の５／Ｊｇを２０ＵのＨｉｎｃＩＩを含む
中塩濃度緩衝液５０μβ中で３７℃２時間切断し、アガ
ロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色後約１
７０ｂｐ ＤＮＡを含むアガロース片を透析チューブ
に封入して電気溶出を行い、フェノール処理、エタノー
ル沈殿でＤＮＡを回収した。
ｐｏｃ １２の５／Ｊｇを２０ＵのＨｉｎｃＩＩを含む
中塩濃度緩衝液５０μβ中で３７℃２時間切断し、アガ
ロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色後約１
７０ｂｐ ＤＮＡを含むアガロース片を透析チューブ
に封入して電気溶出を行い、フェノール処理、エタノー
ル沈殿でＤＮＡを回収した。
一方ｐＯｃ ７３ ０． １ μｇを５ＵのＨｐａ
Ｉを含むＴＡ緩衝液１０μβ中で３７℃１時間切断し、
熱失活の後上記のＤＮＡとＤＮＡライゲーションキット
で連結した。これをＨａ １０１コンピテントセルに導
入し、アンピシリン耐性コロニーから４個のＧｌｕ−Ｑ
Ｃ遺伝子同じ向きに５個目のＧｌｕ−ＯＣ遺伝子を持つ
プラスミドｐｏｃ ８２を得た。
Ｉを含むＴＡ緩衝液１０μβ中で３７℃１時間切断し、
熱失活の後上記のＤＮＡとＤＮＡライゲーションキット
で連結した。これをＨａ １０１コンピテントセルに導
入し、アンピシリン耐性コロニーから４個のＧｌｕ−Ｑ
Ｃ遺伝子同じ向きに５個目のＧｌｕ−ＯＣ遺伝子を持つ
プラスミドｐｏｃ ８２を得た。
ｐｏｃ ８２の１０μｇを旧口ｆｌｌＯＵを含む１０μ
ｌのＴＡ緩衝液で切断し、７０℃１５分間熱失活した。
ｌのＴＡ緩衝液で切断し、７０℃１５分間熱失活した。
アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色後
、約１０００ｂｐのＤＮＡを電気溶出法により抽出し、
フェノール処理、エタノール沈殿で回収した。これにｄ
ＡＴＰ， ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰＳ ＴＴＰ 各々０．
１ ｍＭ， １ ０ ｍＭ｝ リスｔｌｃｌ
ｐｌｌ８、５ ｍＭ ＭｇＣＬを含む溶液１ ０μｌ
ｌとクレノウ酵素２Ｕを加え、３７℃５分間反応させ、
６５ｔ’１５分間熱失活した。
、約１０００ｂｐのＤＮＡを電気溶出法により抽出し、
フェノール処理、エタノール沈殿で回収した。これにｄ
ＡＴＰ， ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰＳ ＴＴＰ 各々０．
１ ｍＭ， １ ０ ｍＭ｝ リスｔｌｃｌ
ｐｌｌ８、５ ｍＭ ＭｇＣＬを含む溶液１ ０μｌ
ｌとクレノウ酵素２Ｕを加え、３７℃５分間反応させ、
６５ｔ’１５分間熱失活した。
これをＨｉｎｃｌＩで切断したｐｕｃ １９に連結し、
ＪＭ１０９コンビテントセルに導入し、アンピシリン、
Ｘ−ｇａｌを含む寒天培地で白コロニーを形成する株か
らブラスミドｐｏｃ ８３を得た。
ＪＭ１０９コンビテントセルに導入し、アンピシリン、
Ｘ−ｇａｌを含む寒天培地で白コロニーを形成する株か
らブラスミドｐｏｃ ８３を得た。
（４）プラスミドｐｏｃ ９８０の作製：ｐｏｃ ８３
の２μｇをＩＯＵのＣｌａ Ｉを含むＴＡ緩衝液中で３
７℃１時間切断する。これをキロシークエンス用デレー
ションキット （宝酒造）を用い、取扱説明書に従って
シグナル配列をコードする部分を欠くブラスミドを作製
した。但しＢＸＯＩＩ［の反応時間は１５秒、３０秒、
４５秒、６０秒、９０秒、１０５秒とした。このブラス
ミドを■ロ１０１コンピテントセルに導入し、アンピシ
リン耐性コロニー８０個を各々５ｒｎｌ．のＬＢ−Ａｐ
培地［１０ｇバタト トリブトン、５ｇ酵母エキス〔共
にディフ：Ｉ （Ｄｉｆｃｏ）社］ 、５ ｇＮａｃＩ
、１ ０ ０ ｍｇアンピシリン／Ｉ！、ｐＨ７．７］
で培養して各々の全菌体蛋白をＳロＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分析し、分子量３５，０００から４
０，０００の位置に強いバンドを与える株の中からブラ
スミドｐＯｃ９８０を保持する株を得た。ウシＯＣでマ
ウスを免疫して得られたハイブリドーマＯ Ｃ − Ｇ
２ （ ＦＢＲＭＢＰ−２０７７）の生産する抗ＯＣ
モノクローナル抗体ＱＣ−０２を用いたウエスタンブロ
ッティングによって分子量３５．０００ 〜４０．００
０の蛋白がＧｌｕ−ＤＣの重合体であることを確認した
。
の２μｇをＩＯＵのＣｌａ Ｉを含むＴＡ緩衝液中で３
７℃１時間切断する。これをキロシークエンス用デレー
ションキット （宝酒造）を用い、取扱説明書に従って
シグナル配列をコードする部分を欠くブラスミドを作製
した。但しＢＸＯＩＩ［の反応時間は１５秒、３０秒、
４５秒、６０秒、９０秒、１０５秒とした。このブラス
ミドを■ロ１０１コンピテントセルに導入し、アンピシ
リン耐性コロニー８０個を各々５ｒｎｌ．のＬＢ−Ａｐ
培地［１０ｇバタト トリブトン、５ｇ酵母エキス〔共
にディフ：Ｉ （Ｄｉｆｃｏ）社］ 、５ ｇＮａｃＩ
、１ ０ ０ ｍｇアンピシリン／Ｉ！、ｐＨ７．７］
で培養して各々の全菌体蛋白をＳロＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分析し、分子量３５，０００から４
０，０００の位置に強いバンドを与える株の中からブラ
スミドｐＯｃ９８０を保持する株を得た。ウシＯＣでマ
ウスを免疫して得られたハイブリドーマＯ Ｃ − Ｇ
２ （ ＦＢＲＭＢＰ−２０７７）の生産する抗ＯＣ
モノクローナル抗体ＱＣ−０２を用いたウエスタンブロ
ッティングによって分子量３５．０００ 〜４０．００
０の蛋白がＧｌｕ−ＤＣの重合体であることを確認した
。
このプラスミドｐｏｃ ９８０を保持する大腸菌は、ロ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｝１８ １０１ ／
ｐＯｃ ９８０と表示し、微工研菌寄第１０３７０号
（ＦＢＩＩＭ Ｐ−１０３７０）として、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｝１８ １０１ ／
ｐＯｃ ９８０と表示し、微工研菌寄第１０３７０号
（ＦＢＩＩＭ Ｐ−１０３７０）として、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。
（５）Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈロ１０１
／ ｐＯｃ ９８０によるＬｙｓ−（Ｇｌｕ−ＱＣ）
重合体蛋白質の生産と精製二本菌株を５ｒｎｌ．のＬＢ
−Ａｐ培地に接種し、３７℃で１晩培養し、これを２０
０ｒｎｌのＬＢ一静培地に接種してエアポンプで通気を
行いながら３７℃で１晩培養した。この培養液を７ ０
０ Ｏ ｒｐｍで５分間遠心して菌体を集め、２０ｍ
Ｍ｝ＩＪスー｝ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８）で洗浄したのち
同緩衝液１０ｍｊ！に懸濁してｌＯ分間超音波処理し、
１００００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿をとった。２
０ｍＭトリスー１１ｃＩ緩衝液（ｐ｝１８）に７０％及
び５０％になるようにシヨ糖を溶解した溶液を遠心管中
に重層し、更に上で得られた沈殿を２０ｍＭ｝リスーＨ
ＣＩ緩衝液（ｐＨ８）に懸濁したものを重層して１ ４
０ ０ ０ ｒｐｍで４０分間遠心した。
／ ｐＯｃ ９８０によるＬｙｓ−（Ｇｌｕ−ＱＣ）
重合体蛋白質の生産と精製二本菌株を５ｒｎｌ．のＬＢ
−Ａｐ培地に接種し、３７℃で１晩培養し、これを２０
０ｒｎｌのＬＢ一静培地に接種してエアポンプで通気を
行いながら３７℃で１晩培養した。この培養液を７ ０
０ Ｏ ｒｐｍで５分間遠心して菌体を集め、２０ｍ
Ｍ｝ＩＪスー｝ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８）で洗浄したのち
同緩衝液１０ｍｊ！に懸濁してｌＯ分間超音波処理し、
１００００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿をとった。２
０ｍＭトリスー１１ｃＩ緩衝液（ｐ｝１８）に７０％及
び５０％になるようにシヨ糖を溶解した溶液を遠心管中
に重層し、更に上で得られた沈殿を２０ｍＭ｝リスーＨ
ＣＩ緩衝液（ｐＨ８）に懸濁したものを重層して１ ４
０ ０ ０ ｒｐｍで４０分間遠心した。
５０％シヨ糖と７０％シヨ糖の間に層をなす不溶物を集
め、２０ｍＭ｝リス一〇ＣＩ緩衝液（ｐ｝１８）で洗浄
し、顆粒を得た。この顆粒を８Ｍ尿素を含む２０ｍＭ｝
リスーＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８ ） ０． ５ ｍｌに懸
濁し、１０分間超音波処理して可溶化した。
め、２０ｍＭ｝リス一〇ＣＩ緩衝液（ｐ｝１８）で洗浄
し、顆粒を得た。この顆粒を８Ｍ尿素を含む２０ｍＭ｝
リスーＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８ ） ０． ５ ｍｌに懸
濁し、１０分間超音波処理して可溶化した。
ＣＧ） （Ｇ ｌｕ−ＤＣ）−Ｌｙｓ単量体の製造：〔
５）で得られた溶液５０μｌに尿素を含まない上記緩衝
液５０μｌを加えた後、リシルエンドペプチダーゼ（和
光純薬社製）０．０１Ｕを加えて３０℃で１時間反応さ
せた。
５）で得られた溶液５０μｌに尿素を含まない上記緩衝
液５０μｌを加えた後、リシルエンドペプチダーゼ（和
光純薬社製）０．０１Ｕを加えて３０℃で１時間反応さ
せた。
（７） （Ｇｌｕ−ＤＣ）−ＬｙｓからのＬｙｓ残基の
除去：（６）で得られた（Ｇｌｕ−ＯＣ）−Ｌｙｓ単量
体の溶液１００μｌにカルボキシペブチダーゼＢ〔シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）社）１０μｇを加え、３７℃で２時間
放置した後、０． １％トリフル才口酢酸溶液５０μｌ
を加えて反応を停止した。これをＣｌ８逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）で分離し
、定量的収率で旧ｕ＝Ｏｃを得た。
除去：（６）で得られた（Ｇｌｕ−ＯＣ）−Ｌｙｓ単量
体の溶液１００μｌにカルボキシペブチダーゼＢ〔シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）社）１０μｇを加え、３７℃で２時間
放置した後、０． １％トリフル才口酢酸溶液５０μｌ
を加えて反応を停止した。これをＣｌ８逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）で分離し
、定量的収率で旧ｕ＝Ｏｃを得た。
実施例２
（１）ビタミンＫ依存性力ルポキシラーゼの調製ウシ肝
臓３００ｇを緩衝液Ａ｛５０ｍＭ３（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸〔ＭＯＰＳＥｐＨ７．４、１ ｍＭ
ＢＤＴ八、ｌｍＭ２−メノレカプトエタノール、１ｍ
Ｍフッ化フエニルメチルスルホニル｝３００ｒｎｌ中で
ホモジナイズし、２０，ＯＯＯＸ ｇで２０分遠心した
後、その上清を１００．０００ ｘ ｇで１時間遠心し
、沈殿の表面を緩衝液Ｂ （ ５ ０ ｍＭ ＭＯＰＳ
ｐＨ ７．４、０． １ Ｍ ＮａＣＩ）で洗って
ミクロソームを得た。このミクロソームを、３−［（３
−コールアミドブ口ピル）ジメチルアンモニオ〕 １−
プロパンスルホネート（ ＣＨＡＰＳ）を含む緩衝液Ｂ
に懸濁し、４℃で１時間かくはんした。Ｃ｝ＩＡＰＳは
最終濃度が１％になるように加えた。これを２００，０
００ Ｘ ｇで１時間遠心し、上清に７５％飽和になる
ように硫酸アンモニウムを加えて４℃で３０分かくはん
し、１０．ｏ００Ｘｇで２０分遠心した沈殿を緩衝液已
に懸濁して同緩衝液に対して透析することによって可溶
化ミクロソームを得た。
臓３００ｇを緩衝液Ａ｛５０ｍＭ３（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸〔ＭＯＰＳＥｐＨ７．４、１ ｍＭ
ＢＤＴ八、ｌｍＭ２−メノレカプトエタノール、１ｍ
Ｍフッ化フエニルメチルスルホニル｝３００ｒｎｌ中で
ホモジナイズし、２０，ＯＯＯＸ ｇで２０分遠心した
後、その上清を１００．０００ ｘ ｇで１時間遠心し
、沈殿の表面を緩衝液Ｂ （ ５ ０ ｍＭ ＭＯＰＳ
ｐＨ ７．４、０． １ Ｍ ＮａＣＩ）で洗って
ミクロソームを得た。このミクロソームを、３−［（３
−コールアミドブ口ピル）ジメチルアンモニオ〕 １−
プロパンスルホネート（ ＣＨＡＰＳ）を含む緩衝液Ｂ
に懸濁し、４℃で１時間かくはんした。Ｃ｝ＩＡＰＳは
最終濃度が１％になるように加えた。これを２００，０
００ Ｘ ｇで１時間遠心し、上清に７５％飽和になる
ように硫酸アンモニウムを加えて４℃で３０分かくはん
し、１０．ｏ００Ｘｇで２０分遠心した沈殿を緩衝液已
に懸濁して同緩衝液に対して透析することによって可溶
化ミクロソームを得た。
（２）Ｇｌｕ−ＤＣのカルボキシル化とヒトＯＣの精製
実施例１ −（７）の方法で得られたＧｌｕ−ＱＣ
ｌ ｍｇを ２０ｍＭ｝ リ ス ーＨＣＩ
ｐＨ ７． ５、 １ ５ ０
ｍＭ ＮａＣ１０． ５ Ｍ （Ｎｌ１４）
２ＳＯ．、ｇ ｍＭ ＭｎＣ１ｚ、８ｒｎＭ ジチオ
スレイトール、２ ０ ｍＭ ＮａＨＣＬ 、０． ２
５ ｍｇ／ ｍｌビタミンＫを含む混合液８ｒｎ！．
に溶解し、実施例２−（１）で得られた可溶化ミクロソ
ーム２ｍｌ（約２０ｍｇ蛋白／一》を加えて１７℃で１
６時間カルボキシル化反応を行った。これをｌ ｍＭ
ＣａＣＩｚを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して
透析し、Ｇｌｕ−ＱＣは認識しないが天然型ウシＯＣは
認識するモノクローナル抗体ＯＣＡ−３０ （宝酒造社
製》を常法通リセファロース４Ｂ（ファルマシア社）に
固定化したカラムに吸着させ、０．５％ツィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）８ ０、１ ｍＭ ＣａＣＬ、８Ｍ尿素を含む
ＰＢＳで溶出した。モノクローナル抗体ＯＣ４−３０と
ＤＣ−６４ （宝酒造社製）を用いたサンドイッチＢ
ＬＩＳ＾によってヒトＯＣが溶出画分にあることを確認
した。ヒドロキシアパタイトを充てんしタＨＰＬＣ力ラ
ムテあルＨＣＡ−ＣＯＬＵＭＮ （ 三井東圧）を用い
てｌＯｍＭから２００ｍＭのリン酸ナトリウム＆ｌ衡液
（ρ８６．８）の濃度勾配で更に精製を進めた。この条
件ではＧｌｕ−ＤＣはカラムに吸着せず、ウシＯＣは約
８０ｍＭで溶出されてくる。Ｏ［：４−３０カラム溶出
物を分離したところ、約８０ｍＭの濃度で溶出されるピ
ークに純化されたヒトＯＣの存在することがＢＬＩＳ＾
とＮ末端から１０残基目までのアミノ酸配列分析によっ
て確認された。
実施例１ −（７）の方法で得られたＧｌｕ−ＱＣ
ｌ ｍｇを ２０ｍＭ｝ リ ス ーＨＣＩ
ｐＨ ７． ５、 １ ５ ０
ｍＭ ＮａＣ１０． ５ Ｍ （Ｎｌ１４）
２ＳＯ．、ｇ ｍＭ ＭｎＣ１ｚ、８ｒｎＭ ジチオ
スレイトール、２ ０ ｍＭ ＮａＨＣＬ 、０． ２
５ ｍｇ／ ｍｌビタミンＫを含む混合液８ｒｎ！．
に溶解し、実施例２−（１）で得られた可溶化ミクロソ
ーム２ｍｌ（約２０ｍｇ蛋白／一》を加えて１７℃で１
６時間カルボキシル化反応を行った。これをｌ ｍＭ
ＣａＣＩｚを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して
透析し、Ｇｌｕ−ＱＣは認識しないが天然型ウシＯＣは
認識するモノクローナル抗体ＯＣＡ−３０ （宝酒造社
製》を常法通リセファロース４Ｂ（ファルマシア社）に
固定化したカラムに吸着させ、０．５％ツィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）８ ０、１ ｍＭ ＣａＣＬ、８Ｍ尿素を含む
ＰＢＳで溶出した。モノクローナル抗体ＯＣ４−３０と
ＤＣ−６４ （宝酒造社製）を用いたサンドイッチＢ
ＬＩＳ＾によってヒトＯＣが溶出画分にあることを確認
した。ヒドロキシアパタイトを充てんしタＨＰＬＣ力ラ
ムテあルＨＣＡ−ＣＯＬＵＭＮ （ 三井東圧）を用い
てｌＯｍＭから２００ｍＭのリン酸ナトリウム＆ｌ衡液
（ρ８６．８）の濃度勾配で更に精製を進めた。この条
件ではＧｌｕ−ＤＣはカラムに吸着せず、ウシＯＣは約
８０ｍＭで溶出されてくる。Ｏ［：４−３０カラム溶出
物を分離したところ、約８０ｍＭの濃度で溶出されるピ
ークに純化されたヒトＯＣの存在することがＢＬＩＳ＾
とＮ末端から１０残基目までのアミノ酸配列分析によっ
て確認された。
以上詳細に説明した通り、本発明によりヒトＯＣ前駆体
重合体の遺伝子が創製された。該遺伝子を含有するプラ
スミドで形質転換した微生物により、該重合体が効率よ
く生産される。該重合体よりスベーサーを酵素学的に除
去すること、続いて該ヒ｝ＱＣ前駆体を酵素学的に処理
することにより医薬品として有用な純化ヒトＯＣを効率
よく製造することができる。
重合体の遺伝子が創製された。該遺伝子を含有するプラ
スミドで形質転換した微生物により、該重合体が効率よ
く生産される。該重合体よりスベーサーを酵素学的に除
去すること、続いて該ヒ｝ＱＣ前駆体を酵素学的に処理
することにより医薬品として有用な純化ヒトＯＣを効率
よく製造することができる。
第１図はプラスミドｐｏｃ １２及びブラスミドｐＯＣ
２ｌの、第２図はブラスミドｐｏｃ ７３の、第謡はブ
ラスミドｐｏｃ ８２及びブラスミドｐｏｃ ８３の、
及び第４図はプラスミドｐｏｃ ９８０の各々造成工程
、制限酵素認識部位、及び機能地図を表す模式図である
。
２ｌの、第２図はブラスミドｐｏｃ ７３の、第謡はブ
ラスミドｐｏｃ ８２及びブラスミドｐｏｃ ８３の、
及び第４図はプラスミドｐｏｃ ９８０の各々造成工程
、制限酵素認識部位、及び機能地図を表す模式図である
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 下記式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・（ I ） （式中ＸはＨ又はＨ−Ｌｙｓ基、ＹはＯＨ又はＬｙｓ−
ＯＨ基を示す）で表されるアミノ酸配列を有することを
特徴とするポリペプチド。 ２、生体の他の成分を含有しないことを特徴とする純化
されたヒトオステオカルシン。 ３、請求項１記載の式 I において、ＸがＨであり、Ｙ
がＬｙｓ−ＯＨ基で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをカルボキシペプチダーゼＢで分解することを
特徴とする該式 I において、ＸがＨであり、ＹがＯＨ
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方
法。 ４、請求項３記載の製造方法で得られるポリペプチドに
、ビタミンに依存性カルボキシラーゼを作用させること
を特徴とする請求項２記載のヒトオステオカルシンの製
造方法。 ５、下記式II： ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・（II） （式中ｎは２以上の整数を示す）で表されるアミノ酸配
列を有することを特徴とするポリペプチド。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1214239A JP2781997B2 (ja) | 1988-12-06 | 1989-08-22 | ポリペプチドの製造方法 |
| US07/993,980 US5434245A (en) | 1988-12-06 | 1992-12-16 | Polypeptides and method for preparing the same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30693188 | 1988-12-06 | ||
| JP63-306931 | 1988-12-06 | ||
| JP1214239A JP2781997B2 (ja) | 1988-12-06 | 1989-08-22 | ポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02291294A true JPH02291294A (ja) | 1990-12-03 |
| JP2781997B2 JP2781997B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=26520211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1214239A Expired - Fee Related JP2781997B2 (ja) | 1988-12-06 | 1989-08-22 | ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5434245A (ja) |
| JP (1) | JP2781997B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040259167A1 (en) * | 1997-08-15 | 2004-12-23 | Jukka Hellman | Isolated osteocalcin fragments |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4438208A (en) * | 1982-05-27 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Region-specific determinants for vitamin K dependent bone protein |
| US4795804A (en) * | 1983-08-16 | 1989-01-03 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic agents |
-
1989
- 1989-08-22 JP JP1214239A patent/JP2781997B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-12-16 US US07/993,980 patent/US5434245A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2781997B2 (ja) | 1998-07-30 |
| US5434245A (en) | 1995-07-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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