JPH03285684A - メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、遺伝子組換え技術を利用して、Ｎ末端のメチ
オニンを欠失する蛋白質やペプチドを得る」二で有用な
メチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列
に関する。

［従来の技術と発明か解決しようとする課題］細胞内で
の蛋白質の生合成において、そのアミノ末端は、開始コ
ドンに対応するメチオニンから始まっている。このメチ
オニンは、その後のプロセシングにより除去されるので
、完成された成熟型蛋白質には、通常、メチオニンが存
在しない。

一方、遺伝子組換え技術を利用して蛋白質、ペプチドを
生体内に生産する場合には、開始コドンＡＴＧなどに由
来するメチオニンがアミノ末端にイ」加した蛋白質（以
下、前駆体蛋白質という）か産生される例が見いたされ
ている。このアミノ末端にメチオニンか付加した前駆体
蛋白質は、蛋白質の高次構造なとの相違に基づいて、メ
チオニンか付加していない蛋白質である成熟型蛋白質に
比較して抗原性の増加が指摘されている。従って、遺伝
子組換え技術を利用して産生じた前駆体蛋白質を医薬品
などに利用するためには、アミノ末端に付加したメチオ
ニンを選択的に除去し、成熟型蛋白質を得る必要がある
。

成熟型蛋白質を前駆体蛋白質から製造する方法として、
メチオニンがアミノ末端に付加した前駆体蛋白質に、メ
チオニンアミノペプチダーゼをイ′１用させてメチオニ
ンを選択的に除去し、成熟型蛋白質を得る方法が提案さ
れている。この方法に利用できるメチオニンアミノペプ
チダーゼとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）由来のメチオニンアミノペプチダーゼ［特開
昭８２−１１５２８１号公報、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ
、、　１Ｂ９．２．７５１−７５７　（１，９８７）　
］　、およびサルモネラティフィムリウム　（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌ　ｌａｔｙｐｈｊｍｕｒｌｕｍ）［ＷＯ８８０
５９９３，Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ。

１８０、２３−３２　（１９８９）　］由来のメチオニ
ンアミノペプチダーゼが提案されている。これらのメチ
オニンアミノペプチダーゼは、蛋白質として単離され、
その遺伝子も明らかにされている。

また、ラット肝臓膜結合型メチオニンアミノペプチダー
ゼも、単離には至っていないものの高度に精製され、そ
の性質が部分的に明らかされている［Ｂｊｏｃｈｅｍ、
、　Ｊ、、　２３４．４８９−４７８　（１９８Ｂ）　
］が、その遺伝子は未知である。

また、エキソペプチダーゼやエンドペプチダーゼの基質
特異性を利用して成熟型蛋白質のアミノ末端に適当なア
ミノ酸配列を付加し、適当なペプチダーゼにより付加ア
ミノ酸を除去することにより成熟型蛋白質を得る方法も
提案されている［特開昭ＩＩ　２−１７１６９９号公報
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５．８２４８２７　
（１，９８７）、特表昭８２−５００００３号公報］。

さらに、複数種のアミノペプチダーゼを組み合わせる方
法（特表昭ｆｉｏ−５０００４３号公報）、ジペプチジ
ルアミノペプチダーゼ（Ｄｉｐｅｐｔｊｄｙｌ　ａｍｉ
ｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　ＩＶのみによる方法（特開
昭８０−２５６３９６号公報）も提案されている。また
同様の方法は、特表昭６２−５０１８０９号公報、特開
平１−１８１７９６号公報にも開示されている。

これらの方法は、全て、アミノ末端に特定のアミノ酸配
列を有する蛋白質のみに適用可能であり、汎用性に欠け
る。また開始コドンに由来するＭｅｔ以外にいくつかの
アミノ酸を挿入したり、複数のペプチダーゼを組み合わ
せて用いる必要があるので、実用的でない。

このような点から、前駆体蛋白質から、開始コドンに由
来するＭｅｔのみを選択的に除去するには、生体内で本
来この役割を担っているメチオニンアミノペプチダーゼ
を用いるのか好ましい。

従って、本発明の目的は、既知の２種類のメチオニンア
ミノペプチダーゼとは異なる新規なメチオニンアミノペ
プチダーゼをコードするＤＮＡ配列を提供することにあ
る。

［発明の構成］ 」二記目的を達成するため、本発明は、枯草菌のメチオ
ニンアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を提供
する。

本発明のメチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤ
ＮＡは、枯草菌に由来する。枯草菌の菌株は、ｍａｐ遺
伝子を含む限り特に制限されない。

枯草菌の菌株としては、例えば、バチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣ３３２３４株［アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）から人手可能である］
、バチルス・ズブチリスＩＦ０１４４１２株、バチルス
・ズブチリスＩ　Ｆ　Ｏ１，４４１５株、バチルス・ズ
ブチリスＩ　Ｆ　Ｏ１，４４１９株（これらはいずれも
財団法人醗酵研究所から人手可能である）などが挙げら
れる。

枯草菌由来のメチオニンアミノペプチダーゼをコードす
るＤＮＡは、アミノ酸ベースで、大腸菌のｍａｐ遺伝子
との相同性が４６．２％、サルモネラのｍａｐ遺伝子と
の相同性が４６．６％であり、相同性が高い。従って、
枯草菌のｍａｐ遺伝子により発現したメチオニンアミノ
ペプチダーゼは、前記既知の２種類のメチオニンアミノ
ペプチダーゼと同様に、開始コドンに由来するアミノ末
端に付加したメチオニンを特異的に切断する。

また、表に示されるように、大腸菌やサルモネラのメチ
オニンアミノペプチダーゼのＩＩＩａｐ遺伝子は２６４
のアミノ酸からなり、７つのＣｙｓ残基が存在するのに
対して、枯草菌のメチオニンアミノペプチダーゼをコー
ドするＤＮＡは２４８のアミノ酸からなり、３つのＣｙ
ｓ残基しか存在しない。従って、大腸菌やサルモネラの
メチオニンアミノペプチダーゼのｍａｐ遺伝子では、高
発現した場合に誤ってジスルフィド結合が形成する可能
性が高く、活性が発現しない虞がある。特に、サルモネ
ラでは、すべてのＣｙｓがフリーな状態で存在している
ので、その可能性が高い。一方、枯草菌のメチオニンア
ミノペプチダーゼをコートするＤＮＡは、Ｃｙｓ残基が
有意に少ないため、誤ってジスルフィド結合する可能性
が小さく、不活性化の危険が少なく有用である。

（以下、余白） 　０ メチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列
は、枯草菌のｍａｐ遺伝子を含む限り制限されないが、
−例として下記式で表されるＤＮＡ配列が挙げられる。

１、０　　　　　　　２０　　　　　　　３０ΔＴＧＡ
ＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡ（ＪＴＧＡＡＣＴ
Ｔ４０　　　　　　　５０　　　　　　　６０ＧＧＴＡ
ＴＣＡＴＧＣＧＧＧＡ八ＧＣＡＧＧＧＣＧＡＡＴＣＧＴ
Ｇ７０　　　　　　　８０　　　　　　　９０ＧＣＴＴ
ＴＡＡＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡ八ＧＣＡ
Ｃ＋　００　　　　　　１．１．　Ｏ］　２０ＡＴＴＡ
＾＾ＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴ
Ｇ＋３０　　　　　　１４０　　　　　　　＋５０ＧＡ
ＴＣＡＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＡＡＧ
八ＡＧ１６０　　　　　　１７０　　　　　　１８０Ｃ
ＡＧＧＧＴＧＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＡＧＧＧ
ＧＴＡＴ１、９０　　　　　　２００　　　　　　２１
．０ＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＧＣＡＴＴＴＧ
ＣＣＴＡＴＣＡ２２０　　　　　　２３０　　　　　　
２４０ＧＴＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧ
ＧＣＡＴＡＣＣＴ］ ２５０　　　　　　　２［１０２７０ ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧ
ＡＣＡＴＣ２８０２９０３００ ＡＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴ
ＴＡＡＡＴ３１０　　　　　　３２０　　　　　　３３
０ＧＧＴＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧ
ＡＣＡＴＡＴ３４０　　　　　　３５０　　　　　　３
６０ＣＣＧＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡ
ＴＧＡＣＡＡＡ３７０　　　　　　　３８０　　　　　
　　３９０ＡＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡ
ＧＧＡＧＴＣＴＴＴＡ４００　　　　　　４１０　　　
　　　４２０ＴＡＴＡＡＡＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＧ
ＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴ４３０　　　　　　４４０　　
　　　　４５０ＧＡＡＣＧＴＴＴＧＴＣＧＡ八ＴＡＴＴ
ＴＣＣＣＡＣＧＣＡＡＴＡ４［ｉｏ　　　　　　　４７
０　　　　　　４８０ＣＡＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＡ
ＡＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡ４９０　　　　　　５
００　　　　　　５１．０ＧＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＧＴ
ＡＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＴＴ５２０　　　　　
　５３０　　　　　　５４０ＧＧＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧ
ＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＧＣＡＡＡＴＴ］　２ ５５０　　　　　　５６０　　　　　　５７０ＣＣＴＣ
ＡＴＴＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＣ
Ａ５８０　　　　　　５９０’　　　　　　６００ＣＧ
ＧＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＴ
ＡＴＴ６１０　　　　　　６２０　　　　　　６３０Ｇ
ＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧ
ＣＴＡＣ６４０６５０６６０ ＧＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡ
ＣＧＧＴＴ６７０　　　　　６８０　　　　　６９０Ｇ
ＴＡＡＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣ
ＴＣＡＴ７００　　　　　　７１、０　　　　　　７２
０１ゴＴＧＡＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＣＧ
ＧＡＡＡＣＧ７３０　　　　　　７４０ ＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＧＡＣＧＡＧＡＧＴＣＴ
ＡＧなお、本発明のＤＮＡ配列により発現したメチオニ
ンアミノペプチダーゼには、アミノ末端のメチオニンを
特異的に切断する機能上、実質的に等しいメチオニンア
ミノペプチダーゼも含まれる。

例えば、メチオニンアミノペプチダーゼには、中性形や
塩形、並びに非蛋白質成分、例えば、グリ３ コシル残基、アセチル残基、脂質残基を含む形も含まれ
る。

枯草菌由来のメチオニンアミノペプチダーゼをコードす
るＤＮＡ、メチオニンアミノペブチダゼおよび成熟蛋白
質の製造において、ＤＮＡの調製、ベクターの調製、組
換えベクターＤＮＡの調製、形質転換方法、および形質
転換株の選択などには’Ｍｏ１ｅｃｕｌｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｊｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１
″　（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、　（＋
９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇｔｌａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌ
ａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）を参照できる。

枯苧菌由来のメチオニンアミノペプチダーゼをコードす
るＤＮＡは、次のようにして調製できる。

枯草菌の染色体ＤＮＡに、制限酵素を作用させ、慣用の
分離方法、例えば、ポリアクリルアミドゲルやアガロー
スゲル電気泳動法により、メチオニンペプチダーゼをコ
ードするｍａｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片を抽出する。制
限酵素によるＤＮＡの切断は、−射的な条件や制限酵素
の製造業者によるマニュアルに記載された条件で行なう
ことがてき］４ る。ｍａｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、既知のメチオニ
ンアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ断片、例えば
、大腸菌の５ｅｃＹ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプローブ
として、ハイブリタイモーション法により検出てきる。

なお、メチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤＮ
Ａは、公知の化学的合成法、例えば、コーエンらのトリ
エステル法［Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　５ｏｃ（＋９
８１）　１０３．３１．８５］　、自動オリゴヌクレオ
チド合成機を利用して化学的に合成することもてきる。

枯草菌由来のメチオニンアミノペプチダーゼは１、次の
ようにして得ることができる。

ｍａｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ベクターＤＮＡに連
結し、絹換えベクターＤＮＡを調製する。

ＤＮＡ断片の連結は、慣用の方法、例えば、制限酵素を
用いて切断したＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とをリ
ガーゼを用いて連結する制限酵素法、リンカ−法などに
より行なうことができる。得られた絹換えベクターＤＮ
Ａを宿主微生物に移入して形質転換する。

５ ベクターは、宿主に応じて、慣用のベクタ例えば、Ｃｏ
　］、　Ｅ　１、ｐＢＲ３２２、ｐ　Ｓ　Ｃ１０１、Ｔ
ｉプラスミド、ｐ　Ｔ　Ｕ　Ｂ　４　　［Ｔａｋｅｊｃ
ｈ、　Ｙ。

ｅｔ　ａｌ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
、４７．１５９　（１９８３）：　Ｙａｍａｚａｋｉ、
　Ｉｌ、　ｅｔ、　ａｌ、　Ｊ、　ＢａｃＬｃｒｉａｌ
、　１５Ｂ（＋）、　３２７（１９８３）］などのプラ
スミド、バクテリオファージλ、Ｓ　Ｖ　４．　Ｏウィ
ルスなどから選択できる。好ましいベクターはプラスミ
ドである。

またメチオニンアミノペプチダーゼを高発現させるため
、絹換えベクターＤＮＡにおいて、前記ＩＴｌａｐ遺伝
子を含むＤＮＡ断片の開始コドンＡＴＧのに流には、そ
れら自身のプロモータ、または（＝１加したトリプトフ
ァン ラクタマーゼ及びラクトース（　Ｉ　ａｃ）プロモータ
なとのプロモータ、リポソーム結合部位などが存在する
。

絹換えベクターＤＮＡの宿主微生物への移入は慣用の方
法、例えばカルシウムイオンの存在下で処理する方法［
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｔ．　（１
９７２）６９、　２１．１−０］　、プロトプラスト化
法などを利用して６ 行なうことができる。

宿主微生物は、例えば、酵母、カビなどであってもよい
が、大腸菌又は枯草菌であるのが好ましい。宿主は、形
質転換株を選別するためのマーカとなるアンピシリン（
Ａｍｐ）　、テトラザイクリン（Ｔｃ）、カナマイシン
（　Ｋ　ｍ　）などの抗生物質に対して耐性を示す遺伝
子を含んでいる。

形質転換した宿主を培養し、マーカーを利用する慣用の
スクリーニング法により、ｍａｐ遺伝子を高発現する形
質転換株を選別する。得られた高発現性形質転換株を適
当な培地で培養し、培養液から菌体を集菌し、単離する
ことにより、メチオニンアミノペプチダーゼが得られる
。

成熟蛋白質は、（１）菌体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でＭｅ
ｔが除去された成熟型蛋白質を産生させる方法、（２）
菌体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でＭｅｔが付加した前駆体
蛋白質に、メチオニンアミノペプチダーゼを作用させる
方法などにより得ることができる。

前記（１）の方法においては、次のような方法が採用で
きる。

７ （　１−　１．’）ベクターＤＮＡ断片に、ｍａｐ遺伝
子を含むＤＮＡ断片と、成熟蛋白質をコードするＤＮＡ
断片とを連結して組換えベクターＤＮＡを調製する。得
られた組換えベクターＤＮＡを宿主に移入して形質転換
し、スクリーニングすることにより、ｍａｐ遺伝子およ
び蛋白質を高発現する形質転換株を得る。この形質転換
株を適当な培地で培養することにより、菌体内で、前駆
体蛋白質のＭｅｔがメチオニンアミノペプチダーゼで切
断された成熟型蛋白質が産生ずる。

（１−２）　ｍ　ａ　ｐ遺伝子を含む組換えベクターＤ
ＮＡと、成熟蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含む組換
えベクターＤＮＡの二種の組換えベクターＤＮＡで宿主
を同時に形質転換することにより、上記と同様にして成
熟型蛋白質を得る。すなわちｍａｐ遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡ断片とを連結した組換えベクター
ＤＮＡと、成熟蛋白質をコードするＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片とを連結した組換えベクターＤＮＡとを宿
主に同時に移入して形質転換し、ｍａｐ遺伝子および蛋
白質８ を高発現する形質転換株を選別する。得られた形質転換
株を培養することにより成熟型蛋白質が得られる。

前記（２）の方法では、成熟蛋白質をコードするＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡ断片とを連結した絹換えベクター
ＤＮＡを宿主に移入して形質転換し、形質転換株を培養
し、Ｍｅｔが付加した前駆体蛋白質を得る。次いで、前
記のようにして調製された酵素メチオニンアミノペプチ
ダーゼを、前駆体蛋白質に作用させ、アミノ末端のＭｅ
ｔを特異的に切断して、成熟型蛋白質を得る。

なお、前記（１，）（２）の組換えベクターＤＮＡにお
いて、蛋白質を高発現させるため、成熟型蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片の開始コドンの上流には、ｍａｐ遺伝
子を含むＤＮＡ断片と同様に、ブロモタ、リポソーム結
合部位などが存在する。

前記蛋白質の種類は、特に制限されず、例えば、α−イ
ンターフェロン、γ−インターフェロン；ヒトインター
ロイキン−］−、］ヒトインターロイキンーなとのリン
ホカイン；ヒト成長ホルモン、］９ ウマ成長ホルモンなどの成長ホルモン、インシュリンな
どのホルモン；腫瘍壊死因子；ウロキナゼ、プラスミノ
ーゲン活性化因子、アルコールデヒドロゲナーゼ、β−
ラクタマーセ、アミラーゼ、イソメラーゼなとのタンパ
ク酵素；ジフテリア、コレラ毒素、ヒト血漿アルブミン
なとの蛋白質成分などであってもよい。これらの蛋白質
をコードするＤＮＡは、公知の方法により調製できる。

前記（２）の方法において、メチオニンアミノペプチダ
ーゼを繰返し使用できるようにするため、メチオニンア
ミノペプチダーゼは担体に固定化されていてもよい。担
体は、メチオニンアミノペプチダーゼを固定化するもの
であればよいが、好ましくは水に不溶でかつ親和性の高
いポリマーである。ポリマーとしては、例えば、アガロ
ースとその誘導体、セルロースとその誘導体、架橋デキ
ストランとその誘導体、ポリスチレン、ポリアクリルア
ミドなどのホモポリマー、およびアガロースとポリアク
リルアミドとのコポリマーなどが挙げられる。メチオニ
ンアミノペプチダーゼは、慣用０ の方法、例えば、包括法、吸着法、共有結合法により、
担体に固定できる。共有結合法では、臭化シアンなどの
ハロゲン化シアンにより担体を活性化して酵素を直接結
合させてもよく、ジアミンやアミノカルボン酸をスペー
サとして間接的に結合させてもよい。

前記（２）の方法において、メチオニンアミノペプチダ
ーゼの量は、通常、前駆体蛋白質１モルに対して、０．
００１〜１モル、好ましくは０．０１〜０，２５モル程
度である。前駆体蛋白質とメチオニンアミノペプチダー
ゼとの反応は、通常、酵素反応を阻害しない緩衝液、例
えば、リン酸、塩酸などの無機酸または酢酸などの有機
酸と、ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどの無機
塩基との塩を含む緩衝溶液の存在下で行なうことができ
る。反応条件は、酵素反応を阻害しない範囲で選択でき
、例えば、反応系のｐＨは、通常、６〜９程度、反応温
度は、通常１５〜７０℃、好ましくは３０に５０℃程度
である。反応生成物を、抽出、塩析、再結晶、クロマト
グラフィーなどの２］。

分離精製手段に供することにより、アミノ末端のメチオ
ニンが除去された成熟型蛋白質が得られる。

なお、メチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝
子は、前記メチオニンアミノペプチダゼ、および成熟型
蛋白質の産生に限らず、ｍａｐ遺伝子をプローブとして
、他のＢａｃｊ　Ｉ　ｌｕｓ属などの細菌や酵母、カビ
、高等動物などのメチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子
を探索するためにクローニングすることにも利用できる
。

本発明のメチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤ
ＮＡ配列は、Ｍｅｔをアミノ末端に有さず、天然の生理
活性ペプチドと同一のアミノ酸配列及び活性を有し、低
毒性で安全性の高い医薬品や診断用薬剤を製造するため
に好適に使用される。

なお、本明細書は、下記のプラスミドおよび微生物をも
開示する。

（Ａ）少なくとも前記枯草菌由来のメチオニンアミノペ
プチダーゼをコードするＤＮＡが、プロモタ、リポソー
ム結合部位の下流に連結されているプラスミド。

　２ （１３）上記（Ａ）のプラスミドにより形質転換された
微生物、好ましくは大腸菌および枯草菌。

本明細書において、アミノ酸を略号で表示する場合、ア
ミノ酸の略号は次の通りである。また、アミノ酸は、特
に断わりのない限りＬ一体を示す。

Ｇｌｙニゲリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｌ　ｅ　ｕ　：ロイシン ｌｉｅ：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｐｒｏニブロリン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｌｙｓ：リジン Ａｒｇ　：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ｇｉｎ：グルタミン Ｃｙｓ　：シスチン 　３ Ｍｅｔ：メチオニン Ｔｒｐ　　トリプトファン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｈｉｓ：ヒスチジン ［発明の効果］ 以」二のように、本発明によれば、開始コドンに由来す
るアミノ末端のメチオニンを特異的に除去できる新規な
メチオニンアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列
か提供される。従って、遺伝子組換え技術を利用して、
Ｎ−末端のメチオニンを欠失し、天然の活性を有する蛋
白質やペプチドを得ることができる。

［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
。

なお、ＤＮＡの調製方法および大腸菌の形質転換方法は
、Ｍｏ１ｅｃｕｌｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　　（Ｔ、　Ｍａｎｊａ
ｔｉｓ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

４ Ｎ、Ｙ、）に記載の方法に従って行った。

枯草菌のｍａｐ遺伝子をクローニングするため、サザン
ハイプリダイゼーション法（Ｅ、　Ｍ、　５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ　（１９７５）　Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　９
８．５０３−５１７　）を利用した。

先ず、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３３２３４株より
染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡを制限酵素旧ｎｄ
ｌｌＩで消化した。得られた試料を０゜８％アガロース
ゲル電気泳動に供し、泳動終了後、ＤＮＡ断片を、アガ
ロースゲルからジーンスクリニングプラスハイプリダイ
ゼーショントランスファーメンブレン（ＮＥＮ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）へ移した。次いで
、プラスミドｐＫＹ３　（Ｋ、　５ｈｉｂａ、ａｔ　ａ
ｌ、　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３．８３１−８３
５　）に挿入されている大腸菌の５ａｃＹ遺伝子を含む
１．１．Ｋｂの旧ｎｄｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を［ａ　−”
Ｐ］ｄ　ＣＴ　Ｐを用いて標識し［Ａ、　Ｐ、　Ｆｅｆ
ｎｂｅｒｇ、ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）　Ａｎａｌ。

１３ｉｏｃｈｅｍ、　１３２．６−１３　］　、それを
プローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その
結果、３゜５ＫｂのＤＮＡ断片が検出された。

５ そこで、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３３２３４株の
染色体ＤＮＡをｌ１ｉｎｄＩＩＩで完全消化し、０゜８
％アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルより
３．５　Ｋ　ｂ　ｆ；Ｊ近のＤＮＡ断片を抽出した。

次に、ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１Ｂの旧ｎｄ■部
位と連結し、大腸菌Ｊ　Ｍ　１．０９株を形質転換した
。得られた１０００個のアンピシリン耐性株についてプ
ラスミドを調製し、サザンハイプリダイゼーション法に
より同様の解析を行ったところ、３個のクローンが得ら
れた。得られた３つのクローンを、それぞれｐＴＵＢ８
０１．８０２および８０３と命名した。制限酵素による
解析から、得られたプラスミドには、いずれも３．５Ｋ
ｂの旧ｎｄＩＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片が同一方向で挿入さ
れていた。

これらの中からプラスミドｐＴＵＢ８０１中に挿入され
たＤＮＡ断片について、ジデオキシ法［Ｆ、　Ｓａｎｇ
ｅｒ、　ｅＬ　ａｌ、　（Ｊ−９７７）　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４．５４６３−５４６７１
を利用してＤＮＡ塩基配列の解析を行った。その結果、
５つのオーブンリーディングフレームが存在しており、
その６ １つは下記ＤＮＡ塩基配列を有していた。なお、ＤＮＡ
塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併せて示す。

１０　　　　　　２０　　　　　　３０ＡＴＧＡＴＴＡ
ＴＣＴＧＴＡＡＡ八ＣＣＣＣＡＣＧＴＧＡΔＣＴＴへｅ
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ＡＧＧＩｙＰｈｅＡｓｐｌ　ＩｅＬｅｕＴｈｒＡｒｇＶ
ａｌ＊ＨこのＤＮＡ塩基配列とそれから予想されるアミ
ノ酸配列について、大腸菌のｍａｐ遺伝子と比較したと
ころ、ＤＮＡレベルで５５．３％、アミノ酸レベルで４
６．２％の相同性が認められ、このＤＮＡ塩基配列は枯
草菌のｍａｐ遺伝子であると同定２つ した。

なお、 相同性は５ＤＣ ＧＥＮＥＴＹＸ解析ソフト解析ソ フト束めた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、枯草菌のメチオニンアミノペプチダーゼをコードす
   るＤＮＡ配列。 ２、式 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表される請求項１記載のＤＮＡ配列。