JP4815568B2 - 好熱性プロリルエンドペプチダーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規好熱性プロリルエンドペプチダーゼ、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡにより形質転換された形質転換体、および形質転換体を用いる好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリルエンドペプチダーゼは、生理的条件下で、ペプチド中に存在するプロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解開裂を触媒する。この酵素は、反応条件と基質によって、縮合またはペプチド転移によるペプチド断片のカップリングも触媒することができる。従って、プロリルエンドペプチダーゼは、活性なペプチドを遊離させるための前駆体ペプチドの選択的開裂やペプチドのカップリングの触媒用に使用できる。
【０００３】
前駆体ペプチドの選択的開裂は、インビトロにおいては、例えば前駆体タンパク質あるいは融合タンパク質として発現させる遺伝子工学的手法により得られる組換え体ペプチドのインビトロでのプロセシング等に重要である。プロリルエンドペプチダーゼ特有の特異性の為に、非特異的ペプチダーゼにおいて見られる副反応を伴うことなく目的のペプチドを得られる利点から、この酵素の必要性は大きい。
【０００４】
プロリルエンドペプチダーゼは、ヒトの子宮において発見され、哺乳類の各臓器にも広く分布している。生体内において、この酵素は、生理活性ペプチドの代謝制御に関与し、重要な作用を有している。
【０００５】
哺乳類のプロリルエンドペプチダーゼと同じ基質特異性を示すエンドペプチダーゼが細菌のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）中にも発見された。しかしながら、Ｆ．メニンゴセプチカムからのプロリルエンドペプチダーゼの調製は、この細菌が病原性であること、およびこの細菌が、プロリルエンドペプチダーゼだけでなく相当量の他の特異的または非特異的ペプチダーゼも生産することから、不都合が伴っていた。
【０００６】
さらに、一般的にプロリルエンドペプチダーゼはペプチダーゼ触媒反応に通常使われる条件によって阻害または失活を非常に受けやすい。すなわち、前駆体ペプチドの開裂に使われる緩衝液中の変性剤あるいは可溶化剤に敏感である。また、カップリング生成物の形成を行うために通常用いられる条件、例えば高濃度の有機溶剤、極端なｐＨおよび／または高温にも敏感である。
【０００７】
プロリルエンドペプチダーゼをペプチドの工業生産用の触媒として多目的に利用できるようにするためにプロリルエンドペプチダーゼの安定性を改善することを目指して、熱安定性であるプロリルエンドペプチダーゼが見出された（特表平１０-５０１９８１）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまで見出されているいずれのプロリルエンドペプチダーゼも、至適温度は、３５℃から６０℃付近である。反応効率の観点から言えばさらにより高温で反応を行う方が望ましい。また、遺伝子工学的手法で本酵素を得る場合および得られた酵素を使用してペプチダーゼ反応を行わせる場合等に混入物を除去しあるいは混入物の反応への影響を除く為に、１００℃近い高温でもなお、安定かつ触媒活性を保持し得るプロリルエンドペプチダーゼ（以下、「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」という）が渇望されている。本発明の目的は、新規な好熱性プロリルエンドペプチダーゼ、そのアミノ酸配列、それをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを提供することにある。さらに、該ＤＮＡを含む発現ベクター、それを含む形質転換体、およびこのような好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意検討した結果、９０-１００℃で生育する超好熱性細菌に着目し、高温（100℃以上）で生育する好熱菌であるパイロコッカス・ホリコシ（JCM９９７４）から新規好熱性プロリルエンドペプチダーゼを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、以下の特性を有する新規なプロリルエンドペプチダーゼが提供される：
a．分子量約７０，０００;
b．至適温度９５℃以上１００℃以下；
c. 至適ｐＨ５．４；
d．安定性 約９５℃で２４時間安定。
【００１０】
１つの実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、パイロコッカス（Pyrocucous）属に由来する。
【００１１】
さらに、１つの実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
別の実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明においてはまた、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１４】
別の実施態様では、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１５】
さらに別の実施態様では、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１６】
さらに別の実施態様では、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１７】
本発明においてはまた、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む発現ベクター、このような発現ベクターにより形質転換された形質転換体、および形質転換体を用いた好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書中で使用するペプチドという用語は、短鎖ペプチドのみを意味するとは限らず、ペプチド結合によって結合したアミノ酸から構成されるすべての分子を示す。すなわち、本明細書において、ペプチドとは、短鎖ペプチド、オリゴペプチドのような短鎖ペプチドからたんぱく質を構成するようなポリペプチドまでを含む。
【００１９】
本明細書の用語「プロリルエンドペプチダーゼ」は、任意のプロリルエンドペプチダーゼ、即ちプロリン残基のカルボキシル末端で特異的にペプチドの加水分解的開裂を触媒する任意のプロテアーゼを意図する。そのようなプロリルエンドペプチダーゼのＥＣ番号は3.4.21.26である。
【００２０】
本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」は、９０℃から１００℃付近の高温下で安定でかつその温度領域を至適温度とするプロリルエンドペプチダーゼである。好ましくは、さらに以下の特性を有する：
a．分子量約７０，０００;
b．至適温度９５℃以上１００℃以下；
c. 至適ｐＨ５．４；
d．安定性 約９５℃で２４時間安定。
【００２１】
本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」には、熱により活性が高められたプロリルエンドペプチダーゼも含まれる。熱活性の条件は特に限定されないが、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ産生菌等から得られた酵素を、好ましくは、６０℃から１００℃、より好ましくは８０℃から１００℃、最も好ましくは９５℃の温度条件下、３０分から２００分、好ましくは６０分から２００分の間、処理することができる。
【００２２】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、原核生物、好ましくは、古細菌パイロコッカス（Pyrococcus）属、より好ましくは、超好熱性細菌で最適成長温度が９８℃である硫黄代謝好熱菌 パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii, 登録番号JCM９９７４JCM微生物株カタログ第７版，１９９９年１月発行）から得られ得る。
【００２３】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、例えば配列表の配列番号１に記載の天然型のアミノ酸配列を有する。あるいは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと実質的に同等の活性を有するポリペプチドも、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼに含まれる。
【００２４】
人為的に作製される機能的に同等の活性を有するポリペプチドには、多様な変異が導入され得る。このようなポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変し、改変したＤＮＡを発現させることにより得られ得る。得られたポリペプチドが天然型のポリペプチドと同等の活性を有するか否かは、その活性を測定することにより容易に決定され得る。
【００２５】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、融合タンパクとして調製することもできる。融合タンパクは、ペプチド結合により融合した第一のペプチドと第二のペプチドを含む。第一のペプチドは、本発明で定義される好熱性プロリルエンドペプチダーゼである。第二のペプチドは、特定のタンパク質またはその断片であり得る。そのような第二のペプチドになり得る特定のたんぱく質には、ベータガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等がある。
【００２６】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列である。あるいは、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００２７】
一般的に、ポリヌクレオチド配列の変異体またはホモログの人為的調製法は、当業者に周知であり、そのような技術を用いて、例えば天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を保持する変異体またはホモログを調製することができる。このような変異体またはホモログも本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼに含まれる。
【００２８】
ここで、ハイブリダイズの為の「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃における０．２×ＳＳＣをいう。
【００２９】
天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼポリヌクレオチドは、例えば、パイロコッカス・ホリコシ培養後、BLAST探索法を使用して、本好熱性細菌の遺伝子配列からPyrococcus furiosusのプロリルエンドペプチダーゼ配列に類似し、本酵素活性を示すと思われる遺伝子（配列番号２）を、PCR反応で増幅し抽出して得られる。次に本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、培養物から好熱性アミノペプチダーゼを採取する。
【００３０】
用いるベクターは、特に限定されるものではないが、宿主細胞内で自立複製可能なものでも、染色体に１コピーもしくは複数のコピーが挿入されるものでも良く、上記ＤＮＡすなわち好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を組み込むことができる挿入部位を持ち、更にこの組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現させ得る領域が必要である。
【００３１】
なお、ベクターに組み込む好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子としては、ｃＤＮＡだけでなく、ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列をコードするように設計して合成されたＤＮＡでも良い。このようなアミノ酸配列を基にした遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結することなどにより、容易に行うことができる。
【００３２】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を発現させるプロモーターとしては、通常異種タンパク質の発現に用いられる強力なプロモーターを用いることができる。また、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の下流にはターミネーターを挿入することもできる。例えば、trp、tac、lac、trc、λPL、T7等のプロモーター、tpA、lpp、T4等のターミネーターが挙げられる。
【００３３】
また、翻訳の効率化のために、ＳＤ配列の種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組成、配列、長さを好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の発現に最適になるようにすることも可能である。
【００３４】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼ発現に必要なプロモーターから翻訳開始点までの領域は、従来公知のＰＣＲ法や化学合成法などにより調製することができる。
【００３５】
本発明の組換えＤＮＡは、所望の発現系に応じた公知の発現ベクターに、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡを従来公知の方法によって挿入することにより得ることが可能である。ここで用いる発現ベクターは多コピーのものであることが望ましい。
【００３６】
本発明の組換えＤＮＡの調製に用いることのできる公知のベクターとしてはpUC18、pHSG299、Pet-11a等が挙げられる。
【００３７】
次に、前記組換えＤＮＡ、発現ベクターが挿入されて得られる種々の形質転換体について説明する。
【００３８】
該形質転換体となりうる細胞としては、E.coli等の細菌が挙げられる。E.coliの一具体例としては、JM109株（recA、endA1、gyrA96、thi、hsdR17、supE44、relA1、Δ(lac-proAB)/F'[traD36、proAB+、lacIq、lacZΔM15])がある。
【００３９】
この他の形質転換体となりうる宿主細胞には、枯草菌、酵母、麹菌等があり、これらのタンパク質分泌能を利用して、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼを培地中に生産させる方法も考えられる。さらには、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞も含まれる。
【００４０】
次いで、上記組換えベクターを宿主細胞内に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。コンピテントセル法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々のものが挙げられる。
【００４１】
このような形質転換体の内部で調製されたタンパク質または分泌されて得られるタンパク質を公知の方法で単離し、精製することにより、目的とする酵素が得られる。
【００４２】
E.coliを宿主とした場合には、不活性な会合体、すなわちタンパク質封入体として好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子産物を得た後、これを適当な方法で活性化することも可能であり、活性再生後、活性型タンパク質を公知の方法で分離精製することにより、目的の酵素を得てもよい。
【００４３】
形質転換体を培養する為の培地は公知であり、例えば、E.coliではLB培地などの栄養培地や、M9培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主に応じて、通常16−42℃、好ましくは25−37℃で5−168時間、好ましくは8−72時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌、通気を行ってもよい。
【００４４】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼの単離、精製方法としては、形質転換体の抽出物より、公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法などが挙げられ、これらを組み合わせることにより精製が可能である。
【００４５】
あるいは、生産された酵素は、加熱処理にて簡単に単離精製できる。熱遺伝子組換えによる製造方法については、以下の実施例で詳細に説明するが、当業者にとっては、当分野における通常の技術を使用して本発明の記載に種々の変更等を加えることが可能であり、かかる変更等も本発明に含まれる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
(実施例１)
パイロコッカス・ホリコシの培養
パイロコッカス・ホリコシは公知の好熱菌であり、その培養条件なども知られているが、ここではその一例を挙げる。
【００４７】
13.5ｇのNaCl、4gのNa2SO4、0.7 gのKCl、0.2gのNaHCO3、0.1gのKBr、30 mgのH3BO3、10gのMgCl2・6H2O、1.5gのCaCl2、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを蒸留水1Lに溶かし、pHを6.8に調整した後、加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％となるように加え、この培地をアルゴンガスで飽和して嫌気性とした後、パイロコッカス・ホリコシOT３を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で２−4日培養した。
【００４８】
(実施例２)
染色体ＤＮＡの調製
培養後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌した。菌体を10mM Tris(pH 7.5)-1mM EDTA溶液で２回洗浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％N-ラウロイルサルコシン-1mg/mlプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAをAgaroseブロック中に分離調製した。
【００４９】
（実施例3）染色体ＤＮＡを含むライブラリークローンの作製
実施例2で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Hind III により部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断片を調整した。このＤＮＡ断片を、制限酵素Hind III によって完全分解したBacベクターpBAC108LまたはpFOS１に、T4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合には、結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold（ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBACライブラリーまたはFosmidライブラリーとした。ライブラリーからJCM９９７４の染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行った。
【００５０】
（実施例4）各BACクローンまたはFosmid クローンの塩基配列決定
整列化されたBAC或いはFosmid クローンについて順次以下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpＵＣ118のＨinc II 制限酵素部位に挿入したショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン当たり500クローン作製した。各ショットガンクローンの塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列読み取り装置373または377を用いて決定していった。各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定していった。
【００５１】
（実施例5）プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の同定
上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列の大型計算機による解析を行い、古細菌JCM9974のゲノム解析データと照合して、プロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子（配列表の配列番号２）を確認した。この遺伝子は、開始コドンから終止コドンまでで１８５４塩基対からなり、そのコードするアミノ酸（ ６１７アミノ酸）配列（配列番号１）は、パイロコッカスフリオシス（Pyrococcus furiosus） のプロリルエンドペプチダーゼと８６％の相同性を有していた。
【００５２】
（実施例6）発現プラスミドの構築
構造遺伝子領域の前後に制限酵素（Nde I とXho I ）サイトを構築する目的で、次の２種のDNAプライマーを合成した。プライマー１：５'-TTTTGAATTCTTGCATATGATGTCAATGATAGAGAAG-３'（上流用プライマー、配列表の配列番号３）プライマー２：５'-TTTTGGTACCTTTGGATCCTTATCCCTCCTAGAGCTCAAATGCTAA-３')（下流用プライマー、配列表の配列番号４）。このプライマー対を用いて、PCRでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。PCR反応後、制限酵素（Nde I とXho I ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。
【００５３】
ｐET-11ａ（Novagen社製）を制限酵素Nde I とXho I で切断・精製した後、上記の構造遺伝子とT4リガーゼで16℃,2時間反応させ連結した。連結したDNAの一部をE.coli-ＸＬ2−BlueＭＲＦ’（Stratagene社製）のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。
【００５４】
（実施例7）組換遺伝子の発現
大腸菌（E.coliBL21(DE3), Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL移した。その中に発現プラスミド溶液を0.005ｍLを加え氷中に30分間放置した後42℃でヒートショックを30秒間行い、ＳＯＣmedium0.9mLを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む2ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
当形質転換体をアンピシリンを含む2ＹＴ培地1Lで600ｎｍの吸収が1に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogaractopyranoside）100mＭ溶液を10ｍｌ加えさらに6時間培養した。培養後遠心分離（6,000ｒｐｍ、20ｍｉｎ）で集菌した。
【００５５】
（実施例8）好熱性酵素の精製
集菌した菌体の2培量のアルミナを加え,菌体を粉砕した後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を85℃で30分加熱後遠心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。
【００５６】
（実施例9）酵素の諸性質
（１）分子量
Phastシステム（ファルマシア社製）を用いて１０％から１５％のゲル勾配上でSDS-PAGEを実施した。溶出した画分はアミノ酸配列から計算される適当な分子量（７０ｋ）に相当する単一のバンドを示し、これを酵素の性状解析のために使用した。
【００５７】
測定分子量は、SDS-PAGEと共に、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＨＯ，東京）上で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って決定した。溶出は０．３M NaClを含む５０ｍM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６．８）で、流速0.8ｍｌ／分、室温で行った。溶出したタンパク質を280nmにおけるUV吸収で検出した。精製した酵素はSDS-PAGEでも、ゲルろ過の溶出液からも共に７０キロダルトンであることが解った。
【００５８】
（２）至適ｐＨ
酵素活性の至適ｐＨの測定は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液，５０ｍＭリン酸緩衝液及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ4〜9までの基質(Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val)3mM溶液を調整し、８５℃で酵素の加水分解活性の初速度を測定することにより求めた。ｐＨ5.4最大速度が得られたため、最適ｐＨは5.4と結論した。
【００５９】
（３）至適温度
基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを使用し、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）中に一定量の酵素を加えて１０分反応させ、相対活性を調べた。最大活性（至適温度）は95℃であった。
【００６０】
（４）耐熱性（安定性）
当該酵素溶液（0.1mg/mL）を50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.4）中、95℃で24時間加熱後、温度を85℃に低下させ残存活性を調べたが、活性の低下は見られなかった。
【００６１】
（５）基質特異性
基質特異性は、基質として、i) Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val、ii) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Pro-Leu-Gly-Pro、iii) Cbz-Ala-Pro-pNA(パラニトロアニリド) iv) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Ala-pNA を用いて測定した。さらに、v) Ala-Pro-pNA, vi) Gly-Pro-pNAも基質として使用した。すなわち、酵素溶液（0.1mg/mL）を各種の基質（２mM)を含む50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.4）中、８５℃で １時間インキュベートした後、触媒活性を調べた。
【００６２】
活性は、加水分解後に生じるα-アミノ酸をカドミウムニンヒドリンあるいは、p-ニトロアニリドの吸収から検出した。その結果、基質i) Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val、基質 ii) Cbz-Ala-Pro-Leu-Gly-Pro、基質iii) Cbz-Ala-Pro-pNAでは、プロリンのＣ末端側の開裂が確認された。基質 iv) Ala-Pro-pNAおよびv) Gly-Pro-pNAでは、加水分解した基質を得ることができなかったが、カルボベンゾキシルを結合させた同基質では、プロリンのＣ末端側の開裂が観察された。
これらをまとめた結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
従って、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、95℃の高温において、プロリンのＣ末端側の選択的な加水分解開裂を触媒することが確認された。
【００６５】
一方、遺伝子レベルでは、パイロコッカスホリコシ由来の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと高い相同性を有するパイロコッカスフリオシス由来のプロリルエンドペプチダーゼは、６５℃で不安定となり、自己分解を起こすことがわかっている。
【００６６】
（実施例１０）熱活性化機構
実施例７で得られた集菌した菌体の2培量のアルミナを加え,菌体を粉砕した後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を遠心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。
【００６７】
得られた好熱性プロリルエンドペプチダーゼを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．４）中で、０．６０ｍｇ／ｍｌとし、インキュベーションした。各時間ごとに、酵素をサンプリングし、Ac−Leu−Pnaを基質として、同バッファ中で８５℃にて活性を測定した。それぞれの活性を図１に示す。温度はそれぞれ６５℃（黒三角）、７５℃（白三角）、８５℃（黒丸）および９５℃（白丸）である。図に示されているように、９５℃での１８０分のインキュベーションにより、インキュベーションしなかった場合の約４倍もの比活性が得られた。９５℃にて１８０分間処理した熱活性化したプロリルエンドペプチダーゼ（HPEPh）は、９５℃での２４時間処理でも安定であった。さらに、HPEPhを４−２５℃に戻して同じ酵素反応を行っても、活性が落ちず、HPEPhが、不可逆的に活性化されていることがわかった。
【００６８】
それぞれの熱処理の温度における、酵素の比活性と時間との関係は、一次反応式に従う。速度定数（kact）は、図２に示すように、データを対数グラフにプロットすることで得られる。それぞれのプロットは、図１と同じ意味を表す。このグラフから、HPEPhは、熱処理をしていないプロリルエンドペプチダーゼ（PEPh）と比較して、酵素のモノマー分子のコンフォメーションが変化し、分子同士の凝集や解離を伴わずに、酵素活性が上昇していることがわかった。
【００６９】
次に、基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを使用し、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）中に一定量の酵素を加えて、各温度で１０分ずつ反応させ、HPEPhと熱処理していない好熱性プロリルエンドペプチダーゼ（PEPh）との相対活性を調べた。最大活性（至適温度）はいずれも95℃付近であったが、温度が上昇するにつれ、HPEPhが非常に高い活性を示し、その差が大きくなるがわかった。図３に各温度における、両酵素の比活性を表すグラフを示す。グラフの黒丸は、HPEPhを示し、白丸はPEPhを示す。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、反応の至適温度が95℃であり、プロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解開裂を触媒する新規な好熱性プロリルエンドペプチダーゼが提供できる。さらに、酵素分子が安定であるという事から耐有機溶媒性の向上も期待できる。本発明の酵素により、高温下での、ポリペプチドのアミノ末端分析等が可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の酵素を各温度でインキュベーションした場合の比活性の変化を示した図である。
【図２】 本発明の酵素活性の比活性の変化を、対数グラフで表した図である。
【図３】 熱処理した本発明の酵素と熱処理していない本酵素の比活性を温度により比較した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規好熱性プロリルエンドペプチダーゼ、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡにより形質転換された形質転換体、および形質転換体を用いる好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリルエンドペプチダーゼは、生理的条件下で、ペプチド中に存在するプロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解開裂を触媒する。この酵素は、反応条件と基質によって、縮合またはペプチド転移によるペプチド断片のカップリングも触媒することができる。従って、プロリルエンドペプチダーゼは、活性なペプチドを遊離させるための前駆体ペプチドの選択的開裂やペプチドのカップリングの触媒用に使用できる。
【０００３】
前駆体ペプチドの選択的開裂は、インビトロにおいては、例えば前駆体タンパク質あるいは融合タンパク質として発現させる遺伝子工学的手法により得られる組換え体ペプチドのインビトロでのプロセシング等に重要である。プロリルエンドペプチダーゼ特有の特異性の為に、非特異的ペプチダーゼにおいて見られる副反応を伴うことなく目的のペプチドを得られる利点から、この酵素の必要性は大きい。
【０００４】
プロリルエンドペプチダーゼは、ヒトの子宮において発見され、哺乳類の各臓器にも広く分布している。生体内において、この酵素は、生理活性ペプチドの代謝制御に関与し、重要な作用を有している。
【０００５】
哺乳類のプロリルエンドペプチダーゼと同じ基質特異性を示すエンドペプチダーゼが細菌のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）中にも発見された。しかしながら、Ｆ．メニンゴセプチカムからのプロリルエンドペプチダーゼの調製は、この細菌が病原性であること、およびこの細菌が、プロリルエンドペプチダーゼだけでなく相当量の他の特異的または非特異的ペプチダーゼも生産することから、不都合が伴っていた。
【０００６】
さらに、一般的にプロリルエンドペプチダーゼはペプチダーゼ触媒反応に通常使われる条件によって阻害または失活を非常に受けやすい。すなわち、前駆体ペプチドの開裂に使われる緩衝液中の変性剤あるいは可溶化剤に敏感である。また、カップリング生成物の形成を行うために通常用いられる条件、例えば高濃度の有機溶剤、極端なｐＨおよび／または高温にも敏感である。
【０００７】
プロリルエンドペプチダーゼをペプチドの工業生産用の触媒として多目的に利用できるようにするためにプロリルエンドペプチダーゼの安定性を改善することを目指して、熱安定性であるプロリルエンドペプチダーゼが見出された（特表平１０-５０１９８１）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまで見出されているいずれのプロリルエンドペプチダーゼも、至適温度は、３５℃から６０℃付近である。反応効率の観点から言えばさらにより高温で反応を行う方が望ましい。また、遺伝子工学的手法で本酵素を得る場合および得られた酵素を使用してペプチダーゼ反応を行わせる場合等に混入物を除去しあるいは混入物の反応への影響を除く為に、１００℃近い高温でもなお、安定かつ触媒活性を保持し得るプロリルエンドペプチダーゼ（以下、「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」という）が渇望されている。本発明の目的は、新規な好熱性プロリルエンドペプチダーゼ、そのアミノ酸配列、それをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを提供することにある。さらに、該ＤＮＡを含む発現ベクター、それを含む形質転換体、およびこのような好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意検討した結果、９０-１００℃で生育する超好熱性細菌に着目し、高温（100℃以上）で生育する好熱菌であるパイロコッカス・ホリコシ（JCM９９７４）から新規好熱性プロリルエンドペプチダーゼを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、以下の特性を有する新規なプロリルエンドペプチダーゼが提供される：
a．分子量約７０，０００;
b．至適温度９５℃以上１００℃以下；
c. 至適ｐＨ５．４；
d．安定性 約９５℃で２４時間安定。
【００１０】
１つの実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、パイロコッカス（Pyrocucous）属に由来する。
【００１１】
さらに、１つの実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
別の実施態様において、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明においてはまた、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１４】
別の実施態様では、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１５】
さらに別の実施態様では、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１６】
さらに別の実施態様では、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１７】
本発明においてはまた、好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む発現ベクター、このような発現ベクターにより形質転換された形質転換体、および形質転換体を用いた好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方法が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書中で使用するペプチドという用語は、短鎖ペプチドのみを意味するとは限らず、ペプチド結合によって結合したアミノ酸から構成されるすべての分子を示す。すなわち、本明細書において、ペプチドとは、短鎖ペプチド、オリゴペプチドのような短鎖ペプチドからたんぱく質を構成するようなポリペプチドまでを含む。
【００１９】
本明細書の用語「プロリルエンドペプチダーゼ」は、任意のプロリルエンドペプチダーゼ、即ちプロリン残基のカルボキシル末端で特異的にペプチドの加水分解的開裂を触媒する任意のプロテアーゼを意図する。そのようなプロリルエンドペプチダーゼのＥＣ番号は3.4.21.26である。
【００２０】
本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」は、９０℃から１００℃付近の高温下で安定でかつその温度領域を至適温度とするプロリルエンドペプチダーゼである。好ましくは、さらに以下の特性を有する：
a．分子量約７０，０００;
b．至適温度９５℃以上１００℃以下；
c. 至適ｐＨ５．４；
d．安定性 約９５℃で２４時間安定。
【００２１】
本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」には、熱により活性が高められたプロリルエンドペプチダーゼも含まれる。熱活性の条件は特に限定されないが、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ産生菌等から得られた酵素を、好ましくは、６０℃から１００℃、より好ましくは８０℃から１００℃、最も好ましくは９５℃の温度条件下、３０分から２００分、好ましくは６０分から２００分の間、処理することができる。
【００２２】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、原核生物、好ましくは、古細菌パイロコッカス（Pyrococcus）属、より好ましくは、超好熱性細菌で最適成長温度が９８℃である硫黄代謝好熱菌 パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii, 登録番号JCM９９７４JCM微生物株カタログ第７版，１９９９年１月発行）から得られ得る。
【００２３】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、例えば配列表の配列番号１に記載の天然型のアミノ酸配列を有する。あるいは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと実質的に同等の活性を有するポリペプチドも、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼに含まれる。
【００２４】
人為的に作製される機能的に同等の活性を有するポリペプチドには、多様な変異が導入され得る。このようなポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変し、改変したＤＮＡを発現させることにより得られ得る。得られたポリペプチドが天然型のポリペプチドと同等の活性を有するか否かは、その活性を測定することにより容易に決定され得る。
【００２５】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、融合タンパクとして調製することもできる。融合タンパクは、ペプチド結合により融合した第一のペプチドと第二のペプチドを含む。第一のペプチドは、本発明で定義される好熱性プロリルエンドペプチダーゼである。第二のペプチドは、特定のタンパク質またはその断片であり得る。そのような第二のペプチドになり得る特定のたんぱく質には、ベータガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等がある。
【００２６】
本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列である。あるいは、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００２７】
一般的に、ポリヌクレオチド配列の変異体またはホモログの人為的調製法は、当業者に周知であり、そのような技術を用いて、例えば天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性を保持する変異体またはホモログを調製することができる。このような変異体またはホモログも本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼに含まれる。
【００２８】
ここで、ハイブリダイズの為の「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃における０．２×ＳＳＣをいう。
【００２９】
天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼポリヌクレオチドは、例えば、パイロコッカス・ホリコシ培養後、BLAST探索法を使用して、本好熱性細菌の遺伝子配列からPyrococcus furiosusのプロリルエンドペプチダーゼ配列に類似し、本酵素活性を示すと思われる遺伝子（配列番号２）を、PCR反応で増幅し抽出して得られる。次に本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、培養物から好熱性アミノペプチダーゼを採取する。
【００３０】
用いるベクターは、特に限定されるものではないが、宿主細胞内で自立複製可能なものでも、染色体に１コピーもしくは複数のコピーが挿入されるものでも良く、上記ＤＮＡすなわち好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を組み込むことができる挿入部位を持ち、更にこの組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現させ得る領域が必要である。
【００３１】
なお、ベクターに組み込む好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子としては、ｃＤＮＡだけでなく、ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列をコードするように設計して合成されたＤＮＡでも良い。このようなアミノ酸配列を基にした遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結することなどにより、容易に行うことができる。
【００３２】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を発現させるプロモーターとしては、通常異種タンパク質の発現に用いられる強力なプロモーターを用いることができる。また、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の下流にはターミネーターを挿入することもできる。例えば、trp、tac、lac、trc、λPL、T7等のプロモーター、tpA、lpp、T4等のターミネーターが挙げられる。
【００３３】
また、翻訳の効率化のために、ＳＤ配列の種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組成、配列、長さを好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の発現に最適になるようにすることも可能である。
【００３４】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼ発現に必要なプロモーターから翻訳開始点までの領域は、従来公知のＰＣＲ法や化学合成法などにより調製することができる。
【００３５】
本発明の組換えＤＮＡは、所望の発現系に応じた公知の発現ベクターに、前記好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡを従来公知の方法によって挿入することにより得ることが可能である。ここで用いる発現ベクターは多コピーのものであることが望ましい。
【００３６】
本発明の組換えＤＮＡの調製に用いることのできる公知のベクターとしてはpUC18、pHSG299、Pet-11a等が挙げられる。
【００３７】
次に、前記組換えＤＮＡ、発現ベクターが挿入されて得られる種々の形質転換体について説明する。
【００３８】
該形質転換体となりうる細胞としては、E.coli等の細菌が挙げられる。E.coliの一具体例としては、JM109株（recA、endA1、gyrA96、thi、hsdR17、supE44、relA1、Δ(lac-proAB)/F'[traD36、proAB+、lacIq、lacZΔM15])がある。
【００３９】
この他の形質転換体となりうる宿主細胞には、枯草菌、酵母、麹菌等があり、これらのタンパク質分泌能を利用して、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼを培地中に生産させる方法も考えられる。さらには、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞も含まれる。
【００４０】
次いで、上記組換えベクターを宿主細胞内に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。コンピテントセル法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々のものが挙げられる。
【００４１】
このような形質転換体の内部で調製されたタンパク質または分泌されて得られるタンパク質を公知の方法で単離し、精製することにより、目的とする酵素が得られる。
【００４２】
E.coliを宿主とした場合には、不活性な会合体、すなわちタンパク質封入体として好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子産物を得た後、これを適当な方法で活性化することも可能であり、活性再生後、活性型タンパク質を公知の方法で分離精製することにより、目的の酵素を得てもよい。
【００４３】
形質転換体を培養する為の培地は公知であり、例えば、E.coliではLB培地などの栄養培地や、M9培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主に応じて、通常16−42℃、好ましくは25−37℃で5−168時間、好ましくは8−72時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌、通気を行ってもよい。
【００４４】
好熱性プロリルエンドペプチダーゼの単離、精製方法としては、形質転換体の抽出物より、公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法などが挙げられ、これらを組み合わせることにより精製が可能である。
【００４５】
あるいは、生産された酵素は、加熱処理にて簡単に単離精製できる。熱遺伝子組換えによる製造方法については、以下の実施例で詳細に説明するが、当業者にとっては、当分野における通常の技術を使用して本発明の記載に種々の変更等を加えることが可能であり、かかる変更等も本発明に含まれる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
(実施例１)
パイロコッカス・ホリコシの培養
パイロコッカス・ホリコシは公知の好熱菌であり、その培養条件なども知られているが、ここではその一例を挙げる。
【００４７】
13.5ｇのNaCl、4gのNa2SO4、0.7 gのKCl、0.2gのNaHCO3、0.1gのKBr、30 mgのH3BO3、10gのMgCl2・6H2O、1.5gのCaCl2、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを蒸留水1Lに溶かし、pHを6.8に調整した後、加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％となるように加え、この培地をアルゴンガスで飽和して嫌気性とした後、パイロコッカス・ホリコシOT３を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で２−4日培養した。
【００４８】
(実施例２)
染色体ＤＮＡの調製
培養後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌した。菌体を10mM Tris(pH 7.5)-1mM EDTA溶液で２回洗浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％N-ラウロイルサルコシン-1mg/mlプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAをAgaroseブロック中に分離調製した。
【００４９】
（実施例3）染色体ＤＮＡを含むライブラリークローンの作製
実施例2で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Hind III により部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断片を調整した。このＤＮＡ断片を、制限酵素Hind III によって完全分解したBacベクターpBAC108LまたはpFOS１に、T4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合には、結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold（ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBACライブラリーまたはFosmidライブラリーとした。ライブラリーからJCM９９７４の染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行った。
【００５０】
（実施例4）各BACクローンまたはFosmid クローンの塩基配列決定
整列化されたBAC或いはFosmid クローンについて順次以下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpＵＣ118のＨinc II 制限酵素部位に挿入したショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン当たり500クローン作製した。各ショットガンクローンの塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列読み取り装置373または377を用いて決定していった。各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定していった。
【００５１】
（実施例5）プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の同定
上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列の大型計算機による解析を行い、古細菌JCM9974のゲノム解析データと照合して、プロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子（配列表の配列番号２）を確認した。この遺伝子は、開始コドンから終止コドンまでで１８５４塩基対からなり、そのコードするアミノ酸（ ６１７アミノ酸）配列（配列番号１）は、パイロコッカスフリオシス（Pyrococcus furiosus） のプロリルエンドペプチダーゼと８６％の相同性を有していた。
【００５２】
（実施例6）発現プラスミドの構築
構造遺伝子領域の前後に制限酵素（Nde I とXho I ）サイトを構築する目的で、次の２種のDNAプライマーを合成した。プライマー１：５'-TTTTGAATTCTTGCATATGATGTCAATGATAGAGAAG-３'（上流用プライマー、配列表の配列番号３）プライマー２：５'-TTTTGGTACCTTTGGATCCTTATCCCTCCTAGAGCTCAAATGCTAA-３')（下流用プライマー、配列表の配列番号４）。このプライマー対を用いて、PCRでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。PCR反応後、制限酵素（Nde I とXho I ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。
【００５３】
ｐET-11ａ（Novagen社製）を制限酵素Nde I とXho I で切断・精製した後、上記の構造遺伝子とT4リガーゼで16℃,2時間反応させ連結した。連結したDNAの一部をE.coli-ＸＬ2−BlueＭＲＦ’（Stratagene社製）のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。
【００５４】
（実施例7）組換遺伝子の発現
大腸菌（E.coliBL21(DE3), Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL移した。その中に発現プラスミド溶液を0.005ｍLを加え氷中に30分間放置した後42℃でヒートショックを30秒間行い、ＳＯＣmedium0.9mLを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む2ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
当形質転換体をアンピシリンを含む2ＹＴ培地1Lで600ｎｍの吸収が1に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogaractopyranoside）100mＭ溶液を10ｍｌ加えさらに6時間培養した。培養後遠心分離（6,000ｒｐｍ、20ｍｉｎ）で集菌した。
【００５５】
（実施例8）好熱性酵素の精製
集菌した菌体の2培量のアルミナを加え,菌体を粉砕した後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を85℃で30分加熱後遠心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。
【００５６】
（実施例9）酵素の諸性質
（１）分子量
Phastシステム（ファルマシア社製）を用いて１０％から１５％のゲル勾配上でSDS-PAGEを実施した。溶出した画分はアミノ酸配列から計算される適当な分子量（７０ｋ）に相当する単一のバンドを示し、これを酵素の性状解析のために使用した。
【００５７】
測定分子量は、SDS-PAGEと共に、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＨＯ，東京）上で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って決定した。溶出は０．３M NaClを含む５０ｍM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６．８）で、流速0.8ｍｌ／分、室温で行った。溶出したタンパク質を280nmにおけるUV吸収で検出した。精製した酵素はSDS-PAGEでも、ゲルろ過の溶出液からも共に７０キロダルトンであることが解った。
【００５８】
（２）至適ｐＨ
酵素活性の至適ｐＨの測定は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液，５０ｍＭリン酸緩衝液及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ4〜9までの基質(Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val)3mM溶液を調整し、８５℃で酵素の加水分解活性の初速度を測定することにより求めた。ｐＨ5.4最大速度が得られたため、最適ｐＨは5.4と結論した。
【００５９】
（３）至適温度
基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを使用し、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）中に一定量の酵素を加えて１０分反応させ、相対活性を調べた。最大活性（至適温度）は95℃であった。
【００６０】
（４）耐熱性（安定性）
当該酵素溶液（0.1mg/mL）を50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.4）中、95℃で24時間加熱後、温度を85℃に低下させ残存活性を調べたが、活性の低下は見られなかった。
【００６１】
（５）基質特異性
基質特異性は、基質として、i) Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val、ii) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Pro-Leu-Gly-Pro、iii) Cbz-Ala-Pro-pNA(パラニトロアニリド) iv) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Ala-pNA を用いて測定した。さらに、v) Ala-Pro-pNA, vi) Gly-Pro-pNAも基質として使用した。すなわち、酵素溶液（0.1mg/mL）を各種の基質（２mM)を含む50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.4）中、８５℃で １時間インキュベートした後、触媒活性を調べた。
【００６２】
活性は、加水分解後に生じるα-アミノ酸をカドミウムニンヒドリンあるいは、p-ニトロアニリドの吸収から検出した。その結果、基質i) Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val、基質 ii) Cbz-Ala-Pro-Leu-Gly-Pro、基質iii) Cbz-Ala-Pro-pNAでは、プロリンのＣ末端側の開裂が確認された。基質 iv) Ala-Pro-pNAおよびv) Gly-Pro-pNAでは、加水分解した基質を得ることができなかったが、カルボベンゾキシルを結合させた同基質では、プロリンのＣ末端側の開裂が観察された。
これらをまとめた結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
従って、本発明の好熱性プロリルエンドペプチダーゼは、95℃の高温において、プロリンのＣ末端側の選択的な加水分解開裂を触媒することが確認された。
【００６５】
一方、遺伝子レベルでは、パイロコッカスホリコシ由来の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと高い相同性を有するパイロコッカスフリオシス由来のプロリルエンドペプチダーゼは、６５℃で不安定となり、自己分解を起こすことがわかっている。
【００６６】
（実施例１０）熱活性化機構
実施例７で得られた集菌した菌体の2培量のアルミナを加え,菌体を粉砕した後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を遠心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。
【００６７】
得られた好熱性プロリルエンドペプチダーゼを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．４）中で、０．６０ｍｇ／ｍｌとし、インキュベーションした。各時間ごとに、酵素をサンプリングし、Ac−Leu−Pnaを基質として、同バッファ中で８５℃にて活性を測定した。それぞれの活性を図１に示す。温度はそれぞれ６５℃（黒三角）、７５℃（白三角）、８５℃（黒丸）および９５℃（白丸）である。図に示されているように、９５℃での１８０分のインキュベーションにより、インキュベーションしなかった場合の約４倍もの比活性が得られた。９５℃にて１８０分間処理した熱活性化したプロリルエンドペプチダーゼ（HPEPh）は、９５℃での２４時間処理でも安定であった。さらに、HPEPhを４−２５℃に戻して同じ酵素反応を行っても、活性が落ちず、HPEPhが、不可逆的に活性化されていることがわかった。
【００６８】
それぞれの熱処理の温度における、酵素の比活性と時間との関係は、一次反応式に従う。速度定数（kact）は、図２に示すように、データを対数グラフにプロットすることで得られる。それぞれのプロットは、図１と同じ意味を表す。このグラフから、HPEPhは、熱処理をしていないプロリルエンドペプチダーゼ（PEPh）と比較して、酵素のモノマー分子のコンフォメーションが変化し、分子同士の凝集や解離を伴わずに、酵素活性が上昇していることがわかった。
【００６９】
次に、基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを使用し、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）中に一定量の酵素を加えて、各温度で１０分ずつ反応させ、HPEPhと熱処理していない好熱性プロリルエンドペプチダーゼ（PEPh）との相対活性を調べた。最大活性（至適温度）はいずれも95℃付近であったが、温度が上昇するにつれ、HPEPhが非常に高い活性を示し、その差が大きくなるがわかった。図３に各温度における、両酵素の比活性を表すグラフを示す。グラフの黒丸は、HPEPhを示し、白丸はPEPhを示す。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、反応の至適温度が95℃であり、プロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解開裂を触媒する新規な好熱性プロリルエンドペプチダーゼが提供できる。さらに、酵素分子が安定であるという事から耐有機溶媒性の向上も期待できる。本発明の酵素により、高温下での、ポリペプチドのアミノ末端分析等が可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の酵素を各温度でインキュベーションした場合の比活性の変化を示した図である。
【図２】 本発明の酵素活性の比活性の変化を、対数グラフで表した図である。
【図３】 熱処理した本発明の酵素と熱処理していない本酵素の比活性を温度により比較した図である。
Claims (3)
- パイロコッカス ホリコシ（Pyrocucous horikoshii）に由来する、下記の特性を有する好熱性プロリルエンドペプチダーゼであって、８０℃〜１００℃の温度条件下でのインキュベーションにより活性化されている好熱性プロリルエンドペプチダーゼを有効成分とする酵素製剤：
Ａ．分子量 約７０，０００;
Ｂ．至適温度 ９５℃以上１００℃以下；
Ｃ．至適ｐＨ ５．４；
Ｄ．安定性 約９５℃で２４時間安定；
Ｅ．８０〜１００℃の温度条件下でのインキュベーションにより活性化。 - 配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含み、下記の特性を有する好熱性プロリルエンドペプチダーゼであって、８０℃〜１００℃の温度条件下でのインキュベーションにより活性化されている好熱性プロリルエンドペプチダーゼを有効成分とする酵素製剤：
Ａ．分子量 約７０，０００;
Ｂ．至適温度 ９５℃以上１００℃以下；
Ｃ．至適ｐＨ ５．４；
Ｄ．安定性 約９５℃で２４時間安定；
Ｅ．８０〜１００℃の温度条件下でのインキュベーションにより活性化。 - 請求項１又は２に記載の酵素製剤を８０℃〜１００℃の温度条件下で作用させることを特徴とする、ポリペプチドにおけるプロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解解裂方法。
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