JP4292294B2 - ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents
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Description
Gene, 1996 June 12;172(1):149-53
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質
(b)配列番号1に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii(JCM10545))をL培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、SSC溶液 (0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム)10mL、0.5M EDTA、100mg/ml ニワトリ卵白リゾチーム 0.1mLおよび10%非イオン性界面活性剤Brij-58を0.5mL加え、0℃で30分間放置した後、プロテイナーゼK(Merck社製)5mgを10%SDS 0.2mLに溶かした溶液を加え、37℃で2、3日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、37℃で1時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてDNAを沈殿濃縮した。このDNAの沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0))10mLに溶解し、リボヌクレアーゼ0.25mL(最終濃度0.25mg/mL)を加えて、37℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、DNAをTE溶液5mLに溶解した後、260nmの吸光度より、DNA濃度を決定した(Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408参照)。
1.発現プラスミドの構築
耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素NdeIおよびBamHI、NotIサイトを含むDNAを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたPCRで耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。用いたDNAポリメラーゼはKOD Dash(東洋紡社製)であった。
Forward primer(配列番号3):5'-ATATCATATGCGTGTAAGCATCATCGGAGTAGGTAAGATA -3'
Reverse primer(配列番号4):5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTAATACATTTTATCGATCTC -3'
大腸菌 Rosetta-gami(DE3)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移した。その中に上記1.の精製発現プラスミドの溶液0.002mLを加え氷中に20分間放置した後、42℃でヒートショックを90秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地(5mL)で18時間培養し、耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離(13,000G、10分)で集菌した。集菌した菌体に,破砕液(20mM Tris-HCl、100mM KCl、pH7.5)を0.2mL加え,超音波発生器で細胞を破砕し,その懸濁液を0.1mLずつ2本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(13,000G、10分)して上清と沈殿に分け,沈殿は破砕液 0.1mLで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは,熱処理(70℃,10分)を施した後,遠心分離(13,000G、10分)して上清と沈殿に分け,沈殿は破砕液0.1mLで懸濁した。これらの試料の一部をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析し,発現を確認できた。この結果を、図2のSDS−PAGE写真に示す。
実施例2と同様にして調製したプラスミドDNA(pET−11aベクター) を用いて、大腸菌DH5α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌DH5αからアルカリSDS法を用いてプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ(Rosetta-Gami)(DE3)株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを3白金耳量とり、5mLのLBL培地(1%ペプトン、0.5%酵母抽出液、0.5%NaCl、0.1%ラクトース、50μg/mLアンピシリン、40μg/mLクロラムフェニコール)に植菌して、培養開始直前まで約6時間、37℃で前培養した。この前培養液を全量、3Lの4×LBL培地(4%ペプトン、2%酵母抽出液、 2%NaCl、50μg/mLアンピシリン)に加え、高密度培養槽(ABLE社製)にて37℃、pH7.2、圧力0.02Paでコンピュータプログラム制御し、培養した。pHは、オートクレーブ済みの2M HCl(和光純薬社製)および2M NaOH(和光純薬社製)で調整した。集菌約20時間前にオートクレーブ済みの300mL発現誘導液(10%ラクトース、20%グリセロール)を加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ(培養開始46時間後)で大型遠心分離機(Beckman社製AvantiHP-30I)を用い集菌した。回収した菌体は、−30℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8)、5mM β-メルカプトエタノール(和光純薬社製)に溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕した。この溶液を2等分し、一方を9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製DryThermounit DTU-1C)で10分間、加熱した後、9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら4種の上清および沈殿(沈殿は、菌体破砕液にて再縣濁)に変性剤(62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、10%グリセロール、2%SDS、2.4%β−メルカプトエタノール、0.005% ブロムフェノールブルー(和光純薬社製))を加え、95℃で5分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を12.5%または15%(発現させるタンパク質の分子量により異なる)ポリアクリルアミドゲルに加え、SDS−PAGEにて電気泳動を行った。染色液(Quick-CBB、和光純薬社製)を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
実施例3において、−30℃で保存してあった菌体を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8)、5mM β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕し、75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製、DryThermoUnit DTU-1C)で、10分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機(Beckman社製Avanti HP-30I)を用いて、100,000Gで1時間、遠心分離し、上清を回収した。
1.測定方法
つぎに、前記実施例4で精製したタンパク質について、下記の種々条件下で、その活性を測定した。この活性測定は、つぎの通りである。すなわち、100mMのKClと、20mMのNAD(オリエンタル酵母社製)と、20mMのL−プロリン (ナカライケミカルズ社製)と、500nMの実施例4の精製タンパク質とを含む100mMの グリシン−NaOH緩衝溶液(pH10.0)を60秒間反応させたときの、NAD(+)の NADHへの変換による吸光度(340nm)の増加を、HITACHI社製U-3000分光光度計によりモニターすることで測定した。
25、50、70、80、90、95℃の各温度において、前記測定を行い、相対活性を求めた。各温度での相対活性は、活性が最大であった80℃での測定値を基準(100%)として計算した。測定結果を、図3のグラフに示す。図示のとおり、至適温度が80℃であることが分かった。
pH4.28、4.95、5.36、6.04、6.56、7.41、8.52、9.76、10.16の各条件で、前記測定を行い、相対活性を求めた。反応温度は、80℃とした。各pHでの相対活性は、活性が最大であったpH9.76での測定値を基準(100%)として計算した。測定結果を、図4のグラフに示す。図示のとおり、pH8.5〜10で最大活性を示し、pH8以下では、ほとんど活性を示さなかった。
前記測定に先立ち、5μMの実施例4において精製したタンパク質溶液を、80℃および95℃で、0.5、1、1.5、2、2.5、3時間前処理した。前記前処理物を、遠心分離し、その上清を濾過したものを用いて前記測定を行い、相対活性を求めた。反応温度は、80℃とした。なお、前処理時間0時間は、前処理を行っていないものであり、これを基準(100%)として各前処理時間での相対活性を求めた。測定結果を、図5のグラフに示す。図示のとおり、80℃で前処理したものは、3時間処理したものでも活性を保持していたが、95℃で前処理したものでは、急速に活性を失っていくことが分かった。
0.4、1、2、4、5mMの各ATP濃度において、前記測定を行い、相対活性を求めた。反応温度は、80℃とした。なお、ATP濃度0mMは、ATPを加えていないものであり、これを基準(100%)として各ATP濃度での相対活性を求めた。測定結果を、図6のグラフに示す。図示のとおり、1mMのATPで、約50%活性が阻害されることが分かった。
配列番号2:耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼの塩基配列
配列番号3:耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeIおよびBamHI、NotIを導入するための順方向プライマーを示す。
配列番号4:耐熱性ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeIおよびBamHI、NotIを導入するための逆方向プライマーを示す。
配列番号5:N末端アミノ酸配列
Claims (3)
- 酵素反応により、NAD(P)Hの存在下に1−ピロリン−5−カルボン酸を還元してL−プロリンおよびNAD(P)(+)を生成するL−プロリンおよびNAD(P)(+)の製造方法であって、超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)(JCM10545)由来の下記(a)又は(b)の耐熱性タンパク質を用い、温度70〜90℃、pH8.5〜10の条件で前記酵素反応を行うことを含む、製造方法。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 酵素反応により、NAD(P)(+)の存在下、L−プロリンから1−ピロリン−5−カルボン酸およびNAD(P)Hを製造する方法であって、超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)(JCM10545)由来の下記(a)又は(b)の耐熱性タンパク質を用い、温度70〜90℃、pH8.5〜10の条件で前記酵素反応を行うことを含む、製造方法。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 温度70〜90℃で酵素反応を行った後、温度を95℃以上にして酵素反応を停止することをさらに含む、請求項1又は2に記載の製造方法。
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