JP2007068424A - 二機能性ホルムアルデヒド固定酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】 常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする遺伝子を提供する。
【解決手段】 ５’から３’の順に、常温で生育可能な細菌由来のヘキスロース６−リン酸シンターゼ遺伝子および常温で生育可能な細菌由来の６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ遺伝子の融合遺伝子を含み、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする単離遺伝子、および該遺伝子の遺伝子産物である二機能性ホルムアルデヒド固定酵素を提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ホルムアルデヒド固定酵素をコードする遺伝子に関する。本発明はさらに、該遺伝子によりコードされるホルムアルデヒド固定化酵素に関する。本発明はまた、宿主生物に対してホルムアルデヒド耐性を付与する方法を提供する。

メタノールあるいはメタンなどの還元型Ｃ_１化合物をエネルギー源や炭素源として利用できる微生物をメチロトローフと呼ぶ。メチロトローフにはＣ_１化合物からエネルギーを獲得するための酸化経路と細胞構成成分を合成するための資化経路があり、Ｃ_１化合物が酸化されて生じたホルムアルデヒドが酸化経路と資化経路の分岐点となる。メチロトローフの資化経路として細菌ではセリン経路とリブロースモノリン酸（ＲｕＭＰ）経路が、酵母ではキシルロースリン酸経路が知られており、これらの経路によってホルムアルデヒドが固定される。

これらのうちＲｕＭＰ経路は、ホルムアルデヒドの糖リン酸への固定、細胞構成成分合成のための糖リン酸の開裂、および糖リン酸の再生の３段階から構成されている（図１）。特に、ホルムアルデヒド固定には本経路特有の酵素群が関与する。すなわち、ホルムアルデヒドがリブロース５−リン酸とアルドール縮合してヘキスロース６−リン酸を合成するヘキスロース６−リン酸シンターゼ（ＨＰＳ）、続いて生じた３−ヘキスロース６−リン酸をフルクトース６−リン酸へ異性化する６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ）がＲｕＭＰ経路の鍵酵素である。

ＨＰＳおよびＰＨＩについては数種のメチロトローフ由来の遺伝子の特許が公開されている（特許文献１、および特許文献２）。数多くのメチロトローフは、このＨＰＳおよびＰＨＩをコードする遺伝子であるｈｐｓ、ｐｈｉをオペロン状で保持していることが知られている（例えば非特許文献１）。

ホルムアルデヒドを解毒する酵素を異種生物に導入して強制発現させることにより、その生物のホルムアルデヒド耐性を高め、さらにはかかる生物を用いて環境中からホルムアルデヒドを除去しようとする試みがある。従来このような手法に用いられてきた酵素としてもっとも一般的であるのが、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ）である。しかしながら、本酵素は反応産物としてギ酸を生じ、この毒性除去も考慮する必要があった。これに対し、メタノール資化性細菌をはじめとする多くの細菌がもつＨＰＳ−ＰＨＩ酵素系は、ＦＡＬＤＨとは異なりエネルギーやコファクターを必要とせず、ホルムアルデヒドは糖リン酸に固定されるので、毒性のある反応生成物は生じず、むしろホルムアルデヒドを固定することによりバイオマスを増加させることも可能である。

メチロトローフ由来のｈｐｓ、ｐｈｉを植物に導入することにより植物体へホルムアルデヒド耐性を与える技術について、本発明者らの一部が先に特許出願している（特許文献３）。

特許文献３では、ｈｐｓ, ｐｈｉそれぞれ独立に含む２つのDNAコンストラクトを植物へ導入し、これらを葉緑体内へ発現させることによって、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝させる経路を有する形質転換植物を得たことを報告している。

興味深いことに、RuMP経路に特徴的な酵素であるＨＰＳ、ＰＨＩと相同性の高い遺伝子が自然界に広く存在していることが報告されている。これらの遺伝子を持つ生物は、メタン生成菌や硫酸還元菌などの古細菌や、枯草菌などの真正細菌、マイコプラズマまで多岐にわたっている。
多くの微生物においては、上記のとおりｈｐｓ、ｐｈｉ遺伝子がオペロン状で保持されているのに対し、超好熱性アーキアPyroccocus horikoshiiでは、ｈｐｓとｐｈｉの完全な読み枠が一つのＯＲＦ（ＰＨ１９３８）にコードされていることを本発明者らは明らかにした（非特許文献２）。この融合酵素の配列は非特許文献２に開示され、またアミノ酸配列はデータベースＢ７１２０９で得られる。

しかしながらアーキア由来の融合酵素は、高温でのみ活性を示すものであり、常温付近で活性を示すＨＰＳ-ＰＨＩ融合酵素およびその遺伝子については知られていない。
特開平１１−127869 欧州特許公開第1170371号公報 国際公開公報ＷＯ２００５／０５４４７４ Mitsui et al., Journal of Bacteriology, vol. 182, No. 4 p944-948 (2000) Orita et. al., Journal of Bacteriology, vol. 187, No. 11, 3636-3642 (2005)

本発明は、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
本発明はまた、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素を提供することを目的とする。
本発明はさらに、本発明の遺伝子を含有する組み換えベクター、および本発明の遺伝子により形質転換された宿主生物を提供することを目的とする。
別の観点からは、本発明は、宿主生物へホルムアルデヒド耐性を付与し、さらにはホルムアルデヒド固定化能を付与する方法、および該方法によりホルムアルデヒド耐性が付与された生物を提供することを目的とする。

本発明は、５’から３’の順に、常温で生育可能な細菌由来のヘキスロース６−リン酸シンターゼ遺伝子および常温で生育可能な細菌由来の６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ遺伝子の融合遺伝子を含み、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする単離遺伝子を提供する。
本発明はまた、本発明の遺伝子によりコードされ、常温でヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素を提供する。
さらに本発明は、本発明の遺伝子を含む組換えベクター、および本発明の遺伝子にて形質転換された宿主生物を提供する。

本発明はさらに、本発明の遺伝子を用いて宿主生物を形質転換する工程を含む、該宿主生物へホルムアルデヒド耐性を付与する方法を提供する。

本発明の遺伝子は、ＨＰＳおよびＰＨＩ両方の活性を有する二機能性酵素をコードする。この遺伝子産物である酵素は、ホルムアルデヒド固定反応の触媒効率に優れている。また、従来は本反応系を異種生物に導入するためには２度の形質転換操作が必要であったが、当該融合遺伝子では１度の形質転換操作で反応系の異種生物への導入が可能となり、より簡便にホルムアルデヒド耐性を異種生物に与えることができる。この作用により、本遺伝子は安価なホルムアルデヒドを利用した形質転換系におけるマーカー遺伝子としての利用が可能である。
また、本発明の遺伝子を持つ生物は、ホルムアルデヒドなどのC1化合物をバイオマスとして資源化し、通常の糖リン酸変換経路と代謝上融合することにより生産性の増大や生育促進効果が期待できる。さらには環境中のホルムアルデヒドの除去にも利用可能である。

本発明の二機能性酵素は、常温で十分な反応効率を示す。従って、本発明の遺伝子を用いて形質転換された宿主生物は、上記の効果を常温下にて発揮することができる。

本発明において、「常温で生育可能な細菌」とは、約１０℃〜４５℃の条件下で生育可能な細菌であって、ＨＰＳおよびＰＨＩの相同遺伝子を有しているものをいう。常温で生育可能であるメチロトローフが例示されるが、メチロトローフ以外であってもよい。具体的にはBacillus subtilis、Methylomonas aminofaciens、Mycobacterium gastri、Methylococcus capslatus、Brevibacillus brevisなどが例示される。特に、Mycobacterium gastriおよびBacillus subtilisが好ましく用いられる。

ＨＰＳ遺伝子およびＰＨＩ遺伝子、およびそれぞれの発現産物のＤＮＡ配列、アミノ酸配列については、既に知られている。例えばMycobacterium gastri、Methylomonas aminofacience、Bacillus brevis、Bacillus subtilis由来のＨＰＳのＤＮＡ配列、アミノ酸配列、ＰＨＩのＤＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜１６に示す。

本発明において用いられるＨＰＳ遺伝子としては、配列表の配列番号１、５、９、１３に記載の配列、および常温で生育可能である細菌由来の遺伝子であって、かかる配列のいずれかと実質的に相同であり、かつ該遺伝子がコードするタンパク質がＨＰＳ活性を有する遺伝子が例示される。

本発明において用いられるＰＨＩ遺伝子は、配列表の配列番号３、７、１１、１５に記載の配列、および常温で生育可能な細菌由来の遺伝子であって、かかる配列のいずれかと実質的に相同であり、かつ該遺伝子がコードするタンパク質がＰＨＩ活性を有する遺伝子が例示される。

本発明において、「実質的に相同」の配列とは、対象とする配列と６０％以上の、好ましくは８０％以上の、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する配列をいう。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）、SOSUIプログラムURL< http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/~sosui/proteome/sosuiframe0.html>やBLAST検索により決定することができる。

常温で生育可能な細菌のゲノム遺伝子配列を得、該配列を公知のＰＨＩおよびＨＰＳ遺伝子配列と比較して、これらと実質的に相同の配列を有していることが確認された場合、該細菌由来のＨＰＳおよびＰＨＩ遺伝子を本発明において採用することができる。

本発明において用いられるＨＰＳ遺伝子はまた、配列表の配列番号２、６、１０および１４いずれかに記載のアミノ酸配列をコードするものであってもよい。

本発明において用いられるＰＨＩ遺伝子はまた、配列表の配列番号４、８、１２および１６いずれかに記載のアミノ酸配列をコードするものであってもよい。

本発明において、「融合遺伝子」とは、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子が同一のＯＲＦに含まれる遺伝子をいう。該ＯＲＦ内においてＨＰＳをコードする遺伝子と、ＰＨＩをコードする遺伝子は直接融合していてもよいし、両者の間に適当なリンカー、例えばグリシンリンカーを含むものであってもよい。

本発明の融合遺伝子の調製は、常温で生育可能なＨＰＳ遺伝子を有する細菌および常温で生育可能なＰＨＩ遺伝子を有する細菌よりそれぞれの遺伝子を切り出し、両者を結合させればよい。上記のとおり、ＨＰＳおよびＰＨＩ共にその遺伝子及びアミノ酸配列が解析されていることから、従来より当分野にて使用されている所望の遺伝子を切り出す手段、および切り出した遺伝子を連結する手段を適宜採用すればよい。例えば、Mycobacterium gastri MB19株のｈｐｓ、ｐｈｉ配列は、ｐｈｉの７３塩基下流にｈｐｓが同方向に存在するオペロンを形成しているが、ｈｐｓ、ｐｈｉ融合遺伝子を作成するにあたっては、ｐｈｉ配列、およびｈｐｓ配列Ｃ末端のストップコドンを除いたものをそれぞれ適当なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、５’→３’方向にＨＰＳ、ＰＨＩとなるようにライゲートすればよい。

本発明の融合遺伝子において、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子は同一菌株に由来するものであっても、それぞれ異なる菌株に由来するものであっても、どちらでもよい。同一菌株に由来するものである方が、より好ましく用いられる。

本発明はさらに、本発明の遺伝子によりコードされ、常温でＨＰＳ活性およびＰＨＩ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素を提供する。

本明細書において、「常温でＨＰＳ活性およびＰＨＩ活性を有する」とは、下記実施例に記載されるＨＰＳ／ＰＨＩアッセイにおいて３０℃にて測定した精製酵素の比活性が１０Ｕ／ｍg以上の活性を有することを意味する。

本発明の二機能性ホルムアルデヒド固定酵素は、例えばMycobacterium gastri M19株由来のＨＰＳ遺伝子およびＰＨＩ遺伝子を融合して得た遺伝子産物である場合には、配列番号１８記載のアミノ酸配列を有する酵素が得られる。また、本発明の二機能性ホルムアルデヒド固定酵素としては、配列表の配列番号２、６、１０、および１４で示されるＨＰＳ酵素のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと、配列表の配列番号４、８、１２および１６で示されるＰＨＩ酵素のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを連結したアミノ酸配列のものが例示されるが、これらに限定されるものではない。

本発明はさらに、本発明の遺伝子を含有する組み換えベクターを提供する。本発明のベクターは、形質転換の対象とする異種生物への発現を可能となるよう、適当なベクター系を用いて、これに常套法により本発明の遺伝子を組み込めばよい。

本発明の組み換えベクターには、必要に応じて、所望の宿主における発現を促進するためのプロモーター配列を含み、また形質転換の確認のためのマーカー配列を含んでいてよい。プロモーター配列、マーカー配列は従来から知られているものより、宿主生物に応じて適宜選択すればよい。

例えば、大腸菌に発現させる場合には、プラスミドベクターが好適に用いられる。

本発明はさらに、本発明の遺伝子により形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、特に限定的でなく、大腸菌、枯草菌、酵母、植物、動物細胞などが例示される。例えば本発明の遺伝子がMycobacterium gastriなどのグラム陰性菌由来のＨＰＳ遺伝子およびＰＨＩ遺伝子の融合遺伝子である場合、大腸菌に発現させるためにはプラスミドｐＲＡＲＥを有したRosetta(DE3)株を宿主として用いると、本発明の遺伝子を大腸菌中に効率よく発現させることができる。

宿主生物が植物である場合は、ＷＯ２００５／０５４４７４に開示された方法に準じて形質転換を行えばよい。例えば、本発明の遺伝子を発現させるためのＤＮＡコンストラクトとして、プロモーター配列、本発明の遺伝子および、該遺伝子を目的部位、例えば葉緑体で発現させるためのトランジットペプチドを有するものが例示される。植物へのかかるＤＮＡコンストラクトの導入は、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等、公知の方法のいずれを用いてもよい。本発明の遺伝子を導入することにより、カルビン酸回路を介してホルムアルデヒドを代謝させる経路を有する形質転換植物を得ることができる。

形質転換により得られる本発明の遺伝子を持つ宿主生物は、常温でホルムアルデヒドなどのC1化合物のバイオマスとしての資源化や、通常の糖リン酸変換経路と代謝上融合することにより生産性の増大や生育促進効果が期待でき、また環境中のホルムアルデヒドの除去もしくは低減にも利用可能である。

・Mycobacterium gastri MB19由来ＨＰＳおよびＰＨＩの大腸菌発現株の構築
M. gastri MB19株のｈｐｓ-ｐｈｉオペロン領域を含むプラスミドｐＵＨＭ１（Mitsui et al., J Bacteriol 182, 944-948 (2000)）を鋳型として用いた。ｈｐｓ（624 bp）の増幅にはプライマーgastri-HPS-NN+とgastri-HPS-EC+を用いて、またｐｈｉ（600 bp）の増幅にはプライマーgastri-PHI-NN+とgastri-PHI-EC+を用いて、Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ）により、＜98℃ 10秒−58℃ 30秒−72℃ 1分、25サイクル＞の条件でＰＣＲ反応を行った。アガロース電気泳動によりこれらのＰＣＲ産物を精製し、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで処理した。これらのＰＣＲ産物と制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで処理したｐＥＴ２３ａ(+)（Novagen）のライゲーションを行った。E. coli JM109の形質転換株を任意に選び、それぞれプラスミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで切断してこれらのＰＣＲ産物の挿入の確認を行った。これにより適当と思われたプラスミドの塩基配列の決定を行い、ＰＣＲ産物の挿入が確認されたプラスミドをｐＥＨＭＢ１９とｐＥＰＭＢ１９とした。さらにこのプラスミドをE. coli Rosetta(DE3)（タカラバイオ）に形質転換することにより、ＨＰＳおよびＰＨＩそれぞれの大腸菌発現株である、ＲＨＭＢ１９株、ＲＰＭＢ１９株を得た。

・ＰＨＩ-ＨＰＳおよびＨＰＳ-ＰＨＩ融合遺伝子の作成と大腸菌発現株の構築
ｐＵＨＭ１を鋳型とし、gastri-PHI-NN+とgastri-HPS-EC+を用いて、＜98℃ 10秒−58℃ 30秒−72℃ 1分30秒＞の条件で25サイクルＰＣＲ反応を行った。アガロース電気泳動によりこのＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで処理した。このＰＣＲ産物と制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで処理したｐＥＴ−２３ａ(+)のライゲーションを行った。E. coli JM109の形質転換株を任意に選び、それぞれプラスミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで切断してこのＰＣＲ産物の挿入の確認を行った。さらに、このプラスミドＤＮＡを鋳型とし、gastri-HPS-Nとgastri-PHI-C(stop-)を用いて、＜98℃ 10秒−58℃ 30秒−72℃ 2分＞の条件で25サイクル行った。アガロース電気泳動によりこのＰＣＲ産物を精製し、キナーゼ処理を行った。このＰＣＲ産物のセルフライゲーションを行った。E. coli JM109の形質転換株を任意に選び、それぞれプラスミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで切断してこのＰＣＲ産物の挿入の確認を行った。これにより適当と思われたプラスミドの塩基配列の決定を行い、ＰＣＲ産物の挿入が確認されたプラスミドをｐＥＰＨＭＢ１９とした。さらにこのプラスミドをE. coli Rosetta(DE3)に形質転換することにより、ＰＨＩ-ＨＰＳ融合遺伝子の大腸菌発現株である、ＲＰＨＭＢ１９株を得た。

ｐＥＰＭＢ１９を鋳型とし、gastri-PHI-NとpET-Nde(Rv)を用いて、＜98℃ 10秒−58℃ 30秒−72℃ ２分＞の条件で25サイクルＰＣＲ反応を行った。また、pEHMB19を鋳型とし、gastri-HPS-NN+とgastri-HPS-C(stop-)を用いて、＜98℃ 10秒−58℃ 30秒−72℃ 1分＞の条件で25サイクルＰＣＲ反応を行った。アガロース電気泳動によりこれら２種のＰＣＲ産物を精製し、それぞれ制限酵素Ｎｄｅ Ｉで処理し、キナーゼ処理後、ライゲーションを行った。E. coli JM109の形質転換株を任意に選び、それぞれプラスミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＮｄｅ Ｉで切断してこのＰＣＲ産物の挿入の確認を行った。これにより適当と思われたプラスミドの塩基配列の決定を行い、ＰＣＲ産物の挿入が確認されたプラスミドをｐＥＨＰＭＢ１９とした。さらにこのプラスミドをE. coli Rosetta(DE3)に形質転換することにより、ＨＰＳ-ＰＨＩ融合遺伝子の大腸菌発現株である、ＲＨＰＭＢ１９株を得た。

本実施例で使用したプライマーを下記に示す。
プライマー名 配列（5' - 3'）
gastri-HPS-NN+ GGAATTCCATATGAAGCTCCAAGTCGCCAT
gastri-HPS-EC+ GGAATTCTCAGGCGATCGCGGCGCGCAGTT
gastri-HPS-N ATGAAGCTCCAAGTCGCCATCGACCTGCTG
gastri-HPS-C(stop-) GGCGATCGCGGCGCGCAGTTCCTTCGC
gastri-PHI-NN+ GGAATTCCATATGACGCAAGCCGCAGAAGC
gastri-PHI-EC+ GGAATTCTCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG
gastri-PHI-N ATGACGCAAGCCGCAGAAGCCGACGGCGCC
gastri-PHI-C(stop-) CTCGAGGTTGGCGTGGCGCGTCCAGAGTTC
pET-Nde(Rv) CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC

・大腸菌発現株の培養
上記で得た各菌株および、コントロールとして形質転換していないE. coli Rosetta(DE3)菌株を、次のとおり培養した。LB培地（含アンピシリン50 μg/ml、クロラムフェニコール34 μg/ml）で前培養し、LB培地（含アンピシリン50 μg/ml、クロラムフェニコール34 μg/ml）に1％植菌し、3時間、37℃で振とう培養した後、0.5 mM IPTGを加えさらに３時間培養した。

・無細胞抽出液の調整
各大腸菌発現株の培養液を 5000 x g、4℃、10分間遠心し、20 mMトリス-塩酸緩衝液(Tris-HCl) pH 7.5 MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.15 mM, 10%gulycerin (バッファーA)で洗浄した後に、菌体湿重量の10％となるようにバッファーA に懸濁し、氷水で冷却しながらINSONATOR Model 201M（KUBOTA）により180 W で5分間超音波処理した。これを5000 x g、4℃、30分間遠心して得られた上清を無細胞抽出液とした。

得られた無細胞抽出液にSDS-PAGEを行うことにより発現の確認を行った。さらに、無細胞抽出液、可溶性画分、膜画分についてのWestern解析からも発現の確認を行い、また、各酵素の局在を確認した。

・精製酵素の調製
得られた無細胞抽出液19.6 mlを40,000 rpm、60分、4℃の遠心分離で沈殿を除去し、上清をDEAE-Toyopearlカラム(φ2.2×20 cm)を用いて、0から0.5 M KClの直線濃度勾配で溶出を行った。溶出速度は3 ml/min とし、溶出液は8 mlずつ回収した。
得られた画分24 mlに、撹拌しながら固形硫安を2.83 Mになるまで少量ずつ加え、30分氷冷後、10,000 g、15分、4℃の遠心分離により上清を除去し、沈殿をバッファーA 20 mlに懸濁した。これら全ての過程は4℃で行った。
なお、SDS-PAGEの結果、単一のバンドが得られたことから、上記各精製酵素は電気泳動的に均一であることが確認された。

・酵素活性の測定
Orita et al., J Bacteriol 187, 3636-3642 (2005)に掲載の方法で、ＨＰＳ活性、ＰＨＩ活性、ＨＰＳ/ＰＨＩ活性を測定した。その方法を簡単に記載する。

・ＨＰＳ活性の測定
ＨＰＳの酵素活性測定法を下記スキームに示す。

Ｒｉ５Ｐ：リボース−５−リン酸
Ｒｕ５Ｐ：リブロース−５−リン酸
Ｈｕ６Ｐ：へキスロース−６−リン酸
ＰＲＩ：ホスホリボイソメラーゼ

表１記載の試薬を混合し、30分間30℃にてプレインキュベーションした。次いで10mMのホルムアルデヒド溶液を0.1ml(最終濃度２ｍM)添加し、さらに5分間インキュベートした後、反応を0.1mlの0.5N HCｌを添加して反応を止めた。

反応液中のホルムアルデヒトの濃度を ナッシュ（Ｎａｓｈ）法により定量した（Ｎａｓｈ試薬：酢酸アンモニウム 15 g、酢酸 0.3 ml、アセチルアセトン 0.2 ml /100 ml）。反応液を水で20倍希釈し、ここへＮａｓｈ試薬2mlを添加した。410nmにおける吸光度を測定し、ホルムアルデヒド濃度を算出した。酵素単位は、１分間に1μmolのホルムアルデヒドを減少させる酵素量を１ユニット（Ｕ）とし、ＨＰＳタンパク質１ｍｇ当たりのユニット数を比活性 (U/mg・protein) とした。ブランクとしては、Ri5Pを水に置き換えたものを用いた。

・ＰＨＩ活性の測定
ＰＨＩの酵素活性測定法をスキーム２に示す。

Ｆｕ６Ｐ：フルクトース−６−リン酸
Ｇ６Ｐ：グルコース−６−リン酸
ＰＲＩ：ホスホリボイソメラーゼ
ＰＧＩ：ホスホグルコースイソメラーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ

アッセイ混合液１

アッセイ混合液２

ＰＨＩ活性は、生成されるＦｕ６Ｐの量を測定することにより求めた。初めにアッセイ混合液１を３０℃、５分、反応させることによりＲｕ５Ｐを作らせた。次にＨｕ６Ｐを合成するために、十分量の精製したＨＰＳを添加し、さらに反応混合物内に測定対象であるＰＨＩを加えた。このＨＰＳとＰＨＩの反応は３０℃、５分行い、反応混合物を氷上に置くことによって反応を止めた。

反応混合物中の生成されたＦｕ６Ｐの量を、Ｇ６ＰＤＨの補酵素であるＮＡＤＰ^＋による３４０ｎｍの吸光度変化を３０℃で測定することにより算出した。反応を止めた後のアッセイ混合液１へ、ＮＡＤＰ＋を加え、ここへＰＧＩとＧ６ＰＤＨ加えることにより反応を開始した。酵素単位は、１分間にＧ６ＰＤＨによってＧ６ＰをＰＧＲに酸化するＦｕ６Ｐを１μｍｏｌ生産する酵素量を１ユニット（Ｕ）とし、タンパク質１ｍｇ当たりのユニット数を比活性 (U/mg・protein) とした。

・ＨＰＳ/ＰＨＩ活性（オーバーオール活性）
オーバーオール活性は、ＰＨＩ活性の測定法に準じて行った。ＰＨＩ活性の測定においてアッセイ混合液１へ添加したＨＰＳおよびＰＨＩの代わりに、ＨＰＳ−ＰＨＩ融合酵素、ＰＨＩ−ＨＰＳ融合酵素あるいは測定対象であるＨＰＳおよびＰＨＩの混合物を添加し、３０℃で５分間反応させた。得られた反応混合物中のＦｕ６Ｐ量の測定を、上記と同様にして行った。１分間にＧ６ＰＤＨによってＧ６ＰをＰＧＲに酸化するＦｕ６Ｐを１μｍｏｌ生産する融合酵素あるいはＨＰＳとＰＨＩの合計酵素量を１ユニット（Ｕ）とし、タンパク質１ｍｇ当たりのユニット数を比活性 (U/mg・protein) とした。

・ＨＰＳ-ＰＨＩとＰＨＩ-ＨＰＳの活性の比較
ＲＰＨＭＢ１９株およびＲＨＰＭＢ１９株から得た無細胞抽出液のＨＰＳ／ＰＨＩ酵素活性を調べた。ＲＨＰＭＢ１９株の無細胞抽出液（ＨＰＳ−ＰＨＩ）は、17.6U/mgの比活性を示したが、ＲＰＨＭＢ１９株の無細胞抽出液（ＰＨＩ−ＨＰＳ）は活性が検出できなかった。

・ＲＨＭＢ１９株およびＲＰＭＢ１９株からそれぞれ得られたＨＰＳおよびＰＨＩを等モル量混合して用いた場合と、ＲＨＰＭＢ１９株より得られたＨＰＳ−ＰＨＩ融合酵素を用いた場合のＨＰＳ／ＰＨＩ反応における触媒効率を比較した。結果を図２に示す。ＨＰＳ−ＰＨＩ融合酵素では、単独酵素の混合物に比べて触媒効率が約２倍向上していた。

・至適ｐＨおよび至適温度の測定
各精製酵素を用いた。緩衝液のｐＨを調節して、酵素反応液中のｐＨを、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0（KPBでpH 6.0〜7.5、Tris-HClでpH 8.0〜9.0）とし、それぞれの条件で活性を測定した。また、酵素反応の反応温度を20、30、40、50、60、70、80℃とし、それぞれの条件での活性を測定して至適温度を調べた。結果を表４に示す。

・ホルムアルデヒドに対するＫｍ値
添加するホルムアルデヒド濃度を、2、4、6、8、10、12 mMとし、それぞれの条件でのＨＰＳ活性を測定し、Lineweaver-Burkプロットをとることにより、ホルムアルデヒドに対するKm値を求めた。結果を表４に示す。

非特許文献２記載の方法にて超好熱性アーキアPyroccocus horikoshii由来のＨＰＳ、ＰＨＩおよびＨＰＳ−ＰＨＩ（ＰＨ１９３８）を発現する大腸菌発現株を得、それぞれの無細胞抽出液を得、精製酵素を得た。各生成物の酵素活性、至適ｐＨ、至適温度およびホルムアルデヒドに対するＫｍ値を確認した。なお、Pyroccocus horikoshii由来の各酵素の生成物の酵素活性については、80℃で試験した。
各値を下記表４に示す。

P. horikoshii株由来rHps-Phiの至適温度は80℃と非常に高く、常温ではほとんど活性が見られなかったのに対して、M. gastri MB19株由来rHps-Phiの至適温度は30℃であり、常温で高い活性が認められた。

・ホルムアルデヒド耐性およびホルムアルデヒド除去能の確認
上記で得たＲＨＰＭＢ１９株（ＨＰＳ−ＰＨＩ遺伝子発現株）および、コントロールとしてｐＥＴ２３ａで形質転換した大腸菌Ｅ. coli Rosetta(DE3)菌株を、次のとおり培養した。LB培地（含アンピシリン50 μg/ml、クロラムフェニコール34 μg/ml）で前培養し、LB培地（含アンピシリン50 μg/ml、クロラムフェニコール34 μg/ml）に1％植菌し、3時間、37℃で振とう培養した後、0.5 mM IPTGを加えさらに３時間培養した。
次いで各培養物へホルムアルデヒドが１ｍＭとなるよう添加し、さらに培養した。ホルムアルデヒド添加前から経時的に各菌株の増殖をOD610にて測定し、および培地中のホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図３に示す。

図３より明らかなごとく、本発明の遺伝子にて形質転換された大腸菌は、ホルムアルデヒドを速やかに除去しつつ、生育することが可能である。

・ホルムアルデヒド耐性の付与
上記で得た各大腸菌株（ＨＰＳ遺伝子発現株（ＭＧｈｐｓ）、ＰＨＩ遺伝子発現株（ＭＧｐｈｉ）、ＨＰＳ―ＰＨＩ遺伝子発現株（ＭＧｐｓＭＧｐｈｉ）それぞれ、およびコントロールとしてｐＥＴ２３ａで形質転換した宿主菌株（ｐＥＴ２３ａ）を、上記と同様の条件下で培養した。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、ＨＰＳあるいはＰＨＩのいずれかを単独で発現した株は、コントロール株と同等のホルムアルデヒドに対する感受性を示したが、ＨＰＳおよびＰＨＩの両方を発現した株には、良好なホルムアルデヒド耐性が認められた。

また、ＨＰＳ―ＰＨＩ遺伝子発現株（ＭＧｐｓＭＧｐｈｉ）のホルムアルデヒド耐性を調べたところ、培地中にホルムアルデヒドが２ｍＭまで含まれていても良好な成長を示し、同時に培地中のホルムアルデヒドを除去することが可能であった。

リブロースモノリン酸回路の概略図である。 本発明の酵素（ＨＰＳ−ＰＨＩ）と、ＨＰＳおよびＰＨＩそれぞれの酵素の等モル混合物との、触媒効率を示すグラフである。 本発明の遺伝子を発現した大腸菌（ＨＰＳ−ＰＨＩ）のホルムアルデヒド耐性を示すグラフである。 本発明の遺伝子で形質転換した大腸菌（ＭＧＰｈｓＭＧＰｈｉ）およびＨＰＳ、ＰＨＩそれぞれ単独で形質転換した大腸菌（ＭＧｈｐｓ、ＭＧｐｈｉ）および宿主大腸菌（ｐＥＴ２３ａ）のホルムアルデヒド耐性を示すグラフである。

Claims (16)

1. ５’から３’の順に、常温で生育可能な細菌由来のヘキスロース６−リン酸シンターゼ遺伝子および常温で生育可能な細菌由来の６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ遺伝子の融合遺伝子を含み、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする単離遺伝子。
2. 常温で生育可能な細菌が、Bacillus subtilis、Methylomonas aminofaciens、Mycobacterium gastri、Methylococcus capslatusおよびBrevibacillus brevisからなる群から選択される、請求項１記載の遺伝子。
3. ヘキスロース６−リン酸シンターゼ遺伝子が、配列番号１、５、９および１３いずれかに記載のＤＮＡ配列、またはこれらのＤＮＡ配列と実質的に相同であり、ヘキスロース６−リン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配列を有する、請求項１または２記載の遺伝子。
4. ヘキスロース６−リン酸シンターゼ遺伝子が、配列番号２、６、１０および１４記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子。
5. ６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ遺伝子が、配列番号３、７、１１および１５いずれかに記載のＤＮＡ配列、またはこれらのＤＮＡ配列と実質的に相同であり、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードするＤＮＡ配列を有する、請求項１〜４いずれかに記載の遺伝子。
6. ６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ遺伝子が、配列番号４、８、１２および１６いずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、請求項１〜５いずれかに記載の遺伝子。
7. 配列番号１７記載のＤＮＡ配列、または配列番号２６記載のＤＮＡ配列と実質的に相同であり、常温にてヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする単離遺伝子。
8. 配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有し、常温でヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素をコードする単離遺伝子。
9. 請求項１〜８いずれかに記載の遺伝子によりコードされ、常温でヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素。
10. 配列番号１８記載のアミノ酸配列、または該配列と実質的に相同の配列を有し、常温でヘキスロース６−リン酸シンターゼ活性および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ活性を有する二機能性ホルムアルデヒド固定酵素。
11. 請求項１〜８いずれかに記載の遺伝子を含む、組み換えベクター。
12. 請求項１〜８いずれかに記載の遺伝子にて形質転換され、ホルムアルデヒド耐性を有する宿主生物。
13. 大腸菌である、請求項１２記載の宿主生物。
14. 植物である、請求項１２記載の宿主生物。
15. 請求項１１記載のベクターにより、宿主生物を形質転換する工程を含む、該生物へホルムアルデヒド耐性を付与する方法。
16. ホルムアルデヒドが存在する環境下において、常温にて請求項１２〜１４いずれかに記載の宿主生物を生育させることを含む、環境からホルムアルデヒドを除去する方法。
    

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