JP2010004763A - β−ケトチオラーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 野生型β−ケトチオラーゼ酵素のアミノ酸残基部位、Met−290、Met−379、Cys−380において単数または複数のアミノ酸を置換したβ−ケトチオラーゼの新規な酵素変異体をコードするDNAを用いて形質転換体を作製することにより、野生型を導入した場合と比較して、β−ケトチオラーゼの触媒活性が向上した形質転換体を創出した。該形質転換体を用いることにより、β−ケトアシル−CoAおよびポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の効率の良い製造方法が得られた。
【選択図】 なし
Description
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する、
(b)M290L、M379L、及び、C380Hから選ばれる少なくとも1以上の変異を有する、
(c)2個のアシル−CoAを縮合して、β−ケトアシル−CoAを生成する活性を有する、
であって、野生型β−ケトチオラーゼ遺伝子を導入した時よりも高い菌体当たりの触媒活性を示す形質転換体を与えるDNAに関する。さらに本発明は該DNAがコードするポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNAを有するベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、および該形質転換体を用いたβ−ケトチオラーゼ変異体の製造方法に関する。さらに本発明は該ポリペプチドもしくは該形質転換体を用いたβ−ケト脂肪酸またはβ−ケト脂肪酸−CoAの製造方法に関する。さらに本発明は該形質転換体を用いたポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
<β−ケトチオラーゼ遺伝子の破壊用プラスミドの作製>
プラスミドpJRD215を鋳型とし、配列番号13及び14に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCR反応を行い、約1.2kbpのカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を調製した。次にpMT5071を制限酵素BamHIで処理し、同酵素で処理した上記DNA断片を、プラスミドpMT5071上のクロラムフェニコール耐性遺伝子と入れ替える形でクローニングして、プラスミドpSACKmを作製した。
実施例1の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、KNK005株を親株としてpBlueASRUを用いて染色体置換株KNK005−AS株を作製した。KNK005−AS株の染色体上の遺伝子置換箇所周辺領域のDNA塩基配列を解析して、β−ケトチオラーゼ遺伝子がpBlueASRUの相同配列部分と置き換わって終止コドンと制限酵素NheI切断部位が生成していることを確認した。
<pCUP2ベクターの作製>
本発明においてβ−ケトチオラーゼ遺伝子を導入するプラスミドベクターとしては、Cupriavidus属細菌にて使用可能なものであれば特に制限はない。本発明に使用したプラスミドベクターpCUP2は以下のように作成した。プラスミドベクターは配列番号17に記載のCupriavidus metallidurans CH34株(DSM 2839)が保有するメガプラスミド(pMOL28)の複製開始点及を用いた。
まず、本発明で使用するβ−ケトチオラーゼ遺伝子を有しているCupriavidus necator H16株からDNA Purification Kit(Promega社製)を使用しゲノムを調製、このゲノムを鋳型に配列番号24及び25に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCR法によって増幅、配列番号26に記載の塩基配列からなるβ−ケトチオラーゼ遺伝子を含む増幅断片を得た。その条件は(1)94℃で2分、(2)98℃で10秒、60℃で10秒、68℃で2分、を30サイクル、(3)68℃で3分であった。ポリメラーゼとしてはLA Taq DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を使用した。次にこの増幅断片をBglII及びAflIIによって処理し、同じくBglII及びAflIIで処理した後、アルカリホスファターゼ処理を行いDNAを脱リン酸化処理したpJRD215−EE32d13とライゲーション処理を行い、pJRD215−EE32d13のBglIIとAflIIの間のDNA断片と入れ替える形でクローニングを行い、プラスミドpJRD215−EEbktBを作製した。ライゲーションにはLigation High(東洋紡社製)を用いた。
実施例3にて作製したpCUP2EEbktBを鋳型に配列番号27及び28に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCR法によって目的のDNA断片を増幅し、増幅断片を得た。その条件は(1)98℃で4分、(2)98℃で10秒、68℃で10分、を30サイクルである。ポリメラーゼとしてはKODplus(東洋紡社製)を使用した。
プライマーセットとして配列番号30及び31に記載の塩基配列からなるプライマーセットを使用した以外は実施例4と同様の操作により、配列番号32に記載の塩基配列を含むプラスミドベクターpCUP2EEbktBM379Lを作製した。変異導入箇所の塩基配列決定は、APPLIED BIOSYSTEMS社製のDNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzerを用いて行い、配列番号25に記載の塩基配列からなるβ−ケトチオラーゼ遺伝子の1135bp目のアデニン(A)がシトシン(C)に変わっている事を確かめた。この変異によって、379番目のメチオニンコドン(ATG)がロイシンコドン(CTG)に変換される。
配列番号34に記載の塩基配列を含むプラスミドベクターpCUP2EEbktBC380Hを作製した。変異導入箇所の塩基配列決定は、APPLIED BIOSYSTEMS社製のDNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzerを用いて行い、配列番号25に記載の塩基配列からなるβ−ケトチオラーゼ遺伝子の1138bp目のチミン(T)がシトシン(C)に、1139番目のグアニン(G)がアデニン(A)変わっている事を確かめた。この変異によって、380番目のシステインコドン(TGC)がヒスチジンコドン(CAC)に変換される。
エレクトロポレーション法による形質転換は、次のように実施した。エレクトロポレーションに使用した遺伝子導入装置はBio−rad社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくBio−rad社製のgap0.2cmを用いた。キュベットに、KNK005−AS株のコンピテント細胞400μlとプラスミドpCUP2EEbktB、pCUP2EEbktBM290L、pCUP2EEbktBM379L、または、pCUP2EEbktBC380Hの調製液5μlを注入してジーンパルサーにセットし、静電容量25μF、電圧1.5kV、抵抗値800Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をNutrientBroth培地(DIFCO社製)(以後NB培地とも記す)で30℃、3時間振とう培養し、選択プレート(Nutrient Agar培地(DIFCO社製)、カナマイシン100mg/L)で、30℃にて2日間培養して、形質転換体KNK005−AS+pCUP2EEbktB株、KNK005−AS+pCUP2EEbktBM290L株、KNK005−AS+pCUP2EEbktBM379L株、または、KNK005−AS+pCUP2EEbktBC380H株を取得した。コンピテント細胞は次の様に調製した。まず、KNK005−AS株のグリセロールストックをNB培地に接種して30℃で20時間前培養し、その培養液をさらにNB培地に接種した。接種量は接種する培地に対して1%(v/v)であった。接種後さらに30℃で3時間培養した。培養後の培養液適当な容器に移し、遠心分離により菌体回収した。回収した菌体に培養液の同量の滅菌水を入れ、懸濁し、再び遠心分離によって菌体を回収する事で菌体を洗浄した。その後、培養液50ml当たり1mlの滅菌水に再懸濁し、コンピテント細胞とした。
まず、前培養培地(1w/v% Meat−extract、1w/v% Bacto−Trypton、0.2w/v% Yeast−extract、0.9w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15w/v% KH2PO4、(pH6.8))5mlにKNK005−AS+pCUP2EEbktBM290L株、KNK005−AS+pCUP2EEbktBM379L株、または、KNK005−AS+pCUP2EEbktBC380H株を植菌して30℃で1晩培養したものを、5mlの酵素活性測定用培地(1.1w/v% Na2HPO4・12H2O、0.19w/v% KH2PO4、0.29w/v%(NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、0.5w/v% フラクトース、0.5v/v% 微量金属塩溶液(0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v% CuSO4・5H2O、0.012w/v% NiCl2・6H2Oを溶かしたもの))に対して0.05ml接種して、30℃で24時間培養した。この培養液2mlを4℃で10000xg、1分間の遠心分離する事で菌体を集めた。この菌体を緩衝液(100mM Tris−塩酸緩衝液、1mM EDTA、pH7.5)で2回洗浄し、1mlの同緩衝液に懸濁した。これを超音波処理して菌体を破砕した後、15000xg、4℃、5分間の遠心分離した上清を粗酵素液として用いた。
結果は表1に示した。
実施例7にて作製したKNK005−AS+pCUP2EEbktBM290L株、KNK005−AS+pCUP2EEbktBM379L株、または、KNK005−AS+pCUP2EEbktBC380H株を用いたポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造を行なった。
Claims (9)
- 以下の、(a)〜(c)の特徴を有するポリペプチドをコードするDNA;
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する、
(b)M290L、M379L、及び、C380Hから選ばれる少なくとも1以上の変異を有する、
(c)2個のアシル−CoAを縮合して、β−ケトアシル−CoAを生成する活性を有する。 - 配列番号1、2、または、3に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1または2のいずれかに記載のDNAがコードするポリペプチド。
- 請求項1または2のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を用いたβ−ケトチオラーゼ変異体の製造方法。
- 請求項3に記載のポリペプチドを用いた、β−ケト脂肪酸またはβ−ケト脂肪酸−CoAの製造方法。
- 請求項5に記載の形質転換体を用いた、β−ケト脂肪酸またはβ−ケト脂肪酸−CoAの製造方法。
- 請求項5に記載の形質転換体を用いた、ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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