CN107446871B

CN107446871B - 产d-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN107446871B
Application number: CN201710623316.XA
Authority: CN
Inventors: 杨欣伟; 黄建忠; 陶勇; 林白雪; 柯崇榕; 王鹏超
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: CN107446871A

Abstract

本发明公开了产D‑苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的包括如下步骤：将与D‑苯乳酸合成相关的基因导入宿主菌得到产D‑苯乳酸的重组菌；所述与D‑苯乳酸合成相关的基因为芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、D型乳酸脱氢酶的编码基因和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因。利用本发明所构建的产D‑苯乳酸的基因工程菌生产D‑苯乳酸，具有以下优点：构建了一个辅因子循环体系，增加还原力的供应；使用谷氨酸、α‑酮戊二酸等添加物提高了辅因子循环效率，进而进一步提高了D‑苯乳酸的合成量；全细胞催化方法简化了D‑苯乳酸生产过程，生产周期短，因而将在今后的D‑苯乳酸的生产中占据了重要的地位。

Description

产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

D-苯乳酸是一种新型的生物防腐剂，具有抑菌谱宽(对革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和真菌均具有抗菌活性)，理化性质好等优点。D-苯乳酸有着广泛的应用，比如，在食品行业，可以作为乳制品的添加剂，用于杀死其中的食源性致病菌，也可以应用于烘焙，抑制通过食品传播的各种霉菌，还可以被添加于饲料中，取代经典的抗生素；在药品行业，可以替代丹参，用于冠心病的临床治疗；也可以被添加于皮肤病治疗药物中，减少皮肤皱纹；在化妆品行业，具有除皱、亮肤的美容功效。自然界中，D-苯乳酸广泛存在于蜂蜜中，同时能够被多种微生物产生，特别是乳酸细菌。在乳酸细菌中，D-苯乳酸的合成主要来自于L-苯丙氨酸的分解代谢：L-苯丙氨酸首先经氨基转移酶(tyrosine aminotransferase，TyrB，EC:2.6.1.57)催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸再通过D型乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,D-LdhD，EC:1.1.1.28)作用合成D-苯乳酸。

目前，D-苯乳酸主要是由乳酸菌生产，通过高产菌的筛选，发酵条件的优化以及分离提取的改进，D-苯乳酸的产量有了较大的提高。但现今高产D-苯乳酸的菌株主要采用苯丙酮酸作为底物，该物质的化学性质不稳定，且费用较高，故用于大规模生产的成本太贵。

值得一提的是，在以L-苯丙氨酸为底物的D-苯乳酸合成过程中，将苯丙酮酸还原为D-苯乳酸需要提供NADH作为还原力。目前的研究主要是通过共表达甲酸脱氢酶(FDH)或者葡萄糖脱氢酶(GDH)同时在全细胞催化体系中添加大量的甲酸和葡萄糖，通过将甲酸(葡萄糖)在甲酸(葡萄糖)脱氢酶的作用下生成二氧化碳(葡萄糖酸)同时合成NADH作为辅因子的供体。这种方式为D-途径苯乳酸合成途径提供NADH存在两个问题：1、需要在反应体系中额外添加物质，提高了成本；2、产生副产物，可能对于D-苯乳酸的分离带来困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的制备产D-苯乳酸的基因工程菌方法，具体可包括如下步骤：将与D-苯乳酸合成相关的基因导入宿主菌得到产D-苯乳酸的重组菌；所述与D-苯乳酸合成相关的基因为芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、D型乳酸脱氢酶的编码基因和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因。

其中，所述宿主菌可为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。所述大肠杆菌的基因敲除突变体可为敲除大肠杆菌中苯乙醛脱氢酶的编码基因(feaB)和过氧化物酶的编码基因(katG)中的至少一个基因后得到的突变体。

所述苯乙醛脱氢酶的编码基因(feaB)的核苷酸序列如序列表中序列11所示；所述过氧化物酶的编码基因(katG)的核苷酸序列如序列表中序列12所示。

在本发明中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113、大肠杆菌BW25113ΔfeaB或大肠杆菌BW25113ΔkatG。

在所述方法中，所述芳香族氨基酸氨基转移酶具体可为如下任一：

(a1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

(a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芳香族氨基酸氨基转移酶活性的由(a1)衍生的蛋白质；

(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有芳香族氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

在所述方法中，所述D型乳酸脱氢酶为如下任一：

(b1)氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；

(b2)氨基酸序列为序列表中的序列2的蛋白质；

(b3)将序列表中序列3或序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D型乳酸脱氢酶活性的由(b1)或(b2)衍生的蛋白质；

(b4)与(b1)-(b3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有D型乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

在所述方法中，所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶具体可为如下任一：

(c1)氨基酸序列为序列表中的序列5的蛋白质；

(c2)氨基酸序列为序列表中的序列4的蛋白质；

(c3)将序列表中序列5或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶活性的由(c1)或(c2)衍生的蛋白质；

(c4)与(c1)-(c3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶活性的蛋白质。

对应于基因水平，所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因具体可为如下任一所示的DNA分子：

(A1)序列表中的序列6所示的DNA分子；

(A2)在严格条件下与(A1)限定的DNA分子杂交且编码所述芳香族氨基酸氨基转移酶的DNA分子；

(A3)与(A1)或(A2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述芳香族氨基酸氨基转移酶的DNA分子。

对应于基因水平，所述D型乳酸脱氢酶的编码基因具体可为如下任一所示的DNA分子：

(B1)序列表中的序列8所示的DNA分子；

(B2)序列表中的序列7所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述D型乳酸脱氢酶的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B4)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述D型乳酸脱氢酶的DNA分子。

对应于基因水平，所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因具体可为如下任一所示的DNA分子：

(C1)序列表中的序列10所示的DNA分子；

(C2)序列表中的序列9所示的DNA分子；

(C3)在严格条件下与(C1)或(C2)限定的DNA分子杂交且编码所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的DNA分子；

(C4)与(C1)-(C4)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的DNA分子；。

在所述方法中，所述与D-苯乳酸合成相关的基因可通过重组载体导入所述宿主菌。所述重组载体为含有所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、所述D型乳酸脱氢酶的编码基因和所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因的重组质粒。具体的，所述重组载体为将所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、所述D型乳酸脱氢酶的编码基因和所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因插入到pRB1s-GFP载体多克隆位点得到的重组质粒。

由所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。

所述基因工程菌在制备D-苯乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。

所述应用中，以L-苯丙氨酸为底物。

本发明还提供一种制备D-苯乳酸的方法。

本发明所提供的制备D-苯乳酸的方法，具体可包括如下步骤：发酵培养所述基因工程菌，得到表达芳香族氨基酸氨基转移酶、D型乳酸脱氢酶、NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的菌体细胞，用所述菌体细胞催化L-苯丙氨酸生成D-苯乳酸。

其中，在用所述菌体细胞催化L-苯丙氨酸的过程中，还包括向催化反应体系中加入α-酮戊二酸和/或L-谷氨酸和/或沸石的步骤。

本发明还要求保护如下重组载体及其应用。

所述重组载体为含有所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、所述D型乳酸脱氢酶的编码基因和所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因的重组质粒。

所述应用为所述重组载体在制备所述基因工程菌中的应用。

本发明利用大肠杆菌高效的蛋白表达系统，表达了从L-苯丙氨酸到D-苯乳酸所需的外源酶系，通过优化酶的表达，建立了一种通过全细胞催化合成D-苯乳酸的方法。在途径重构成功的基础上，继续共表达了NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶，实现了“自平衡”的辅因子循环，即通过NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶(GDH)偶联将L-苯丙氨生成苯丙酮酸的氨基转移反应与苯丙酮酸生成D-苯乳酸的脱氢反应；在此过程中NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸同时产生NADH，NADH又可以被乳酸脱氢酶(LDH)利用，将苯丙酮酸还原合成D-苯乳酸(图1)。通过这种方式GDH与LDH组合，形成辅因子循环体系，持续为D-苯乳酸合成途径提供还原力和氨基的受体，进而提高D-苯乳酸合成效率；同时除底物L-苯丙氨酸外无需再添加其他物质，降低了D-苯乳酸的生产成本和纯化难度。目前，尚无通过这种方法实现辅因子循环的报道。

附图说明

图1为D-苯乳酸生物合成途径与辅因子循环。

图2为PLA31K菌株表达D-苯乳酸合成途径中三种外源蛋白(D-LdhD^Y53L-TyrB-RocG)的电泳图谱。

图3为转化产物、转化底物与转化中间产物的标准品HPLC图谱。将100μM的L-苯丙酮酸(L-Phe)、200μM苯丙酮酸(PPA)以及200μM苯乳酸(D-PLA)标准品混合液进行检测，它们的出峰时间分别为1.750min、2.347min、3.667min。

图4为D-苯乳酸合成途径的优化结果。

图5为α-酮戊二酸、L-谷氨酸和沸石的添加促进D-苯乳酸的合成结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的全部定量实验，均设置3次以上的重复，结果取均值。

pRB1s-GFP载体：pRB1s是由pBADhisB载体(购自invitrogen公司)改造而来，将其中的氨苄青霉素抗性(979-1839bp)换成链霉素抗性基因aadA序列，如序列表中序列13所示，复制起始位点(1984-2657bp)换成RSF复制起始位点片段的序列，如序列表中序列14所示。GFP即绿色荧光蛋白，其基因序列见序列表中的序列15，插入在载体的NcoI和BglII这两个酶切之间：将载体pRB1s利用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段；使用T4连接酶将酶切回收后的pRB1s与上述gfp基因片段连接。

大肠杆菌BW25113：Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),lambda-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514。记载于“Tomoya Baba,Takeshi Ara1,Miki Hasegawa,etal.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006),doi:10.1038/msb4100050”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

大肠杆菌苯乙醛脱氢酶基因缺失株(BW25113ΔfeaB)：Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),lambda-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514,ΔfeaB。记载于“Tomoya Baba,Takeshi Ara1,Miki Hasegawa,et al.Construction of Escherichiacoli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.MolecularSystems Biology(2006),doi:10.1038/msb4100050”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

大肠杆菌过氧化物酶基因缺失株(BW25113ΔkatG)：Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),lambda-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514,ΔkatG。记载于“Tomoya Baba,Takeshi Ara1,Miki Hasegawa,et al.Construction of Escherichiacoli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.MolecularSystems Biology(2006),doi:10.1038/msb4100050”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、构建产D-苯乳酸的基因工程菌

一、构建协同表达芳香族氨基酸氨基转移酶以及D型乳酸脱氢酶重组质粒

1、构建重组质粒PLA21

以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12基因组为模板，设计一对引物(P1和P2)，扩增得到芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因(tyrB)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为WP_016230740.1的TyrB蛋白对应的基因序列相符，tyrB的基因序列如列表中的序列6所示，该核苷酸序列所编码的芳香族氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

P1：5’-CTCGAGAAGGAGATATAATGTTTCAA-3’

P2：5’-ATTCACCACTAGTACCAGATCTTTACATCACCGCAG-3’。

以保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842基因组为模板，设计一对引物(P3和P4)，扩增得到D型乳酸脱氢酶基因(D-ldhD)，片段大小约1000bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为WP_011543503.1的LdhD蛋白对应的基因序列相符，ldhD的基因序列如列表中的序列7所示，该核苷酸序列所编码的D型乳酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

P3：5’-CATGCCATGGGTACTAAAATTTTTGCTTACGC-3’

P4：5’-CCGCTCGAGTTAGCCAACCTTAACTGGAG-3’

将本实验室构建的载体pRB1s-GFP使用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pRB1s与上述tyrB基因片段和D-ldhD基因片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切和测序验证，结果表明D-ldhD基因和tyrB基因串联插入pRB1s的多克隆位点中。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为PLA21。

2、构建重组质粒PLA22

在克隆得到保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus ATCC的D型乳酸脱氢酶基因(D-ldhD)后，设计一对引物(P5和P6)，在该基因编码蛋白氨基酸的第53位引入突变，将酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(L)，得到D-ldhD^Y53L的基因序列如列表中的序列8所示，该核苷酸序列所编码的D型乳酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

P5：5’-AGCGGTGTAGTCAAGTTGTTGGAGAACAAC-3’

P6：5’-AACTTGACTACACCGCTGAAACTCTGCAAG-3’

将质粒PLA21中的D-ldhD基因用D-ldhD^Y53L基因进行替换。使用Gibson连接方法，将载体pRB1s-GFP利用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段将酶切回收后的pRB1s与tyrB基因片段和D-ldhD^Y53L基因片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切和测序验证，结果表明D-ldhD^Y53L基因插入了质粒当中。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为PLA22。

二、构建协同表达芳香族氨基酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶基因重组质粒

1、PLA31质粒的构建

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组为模板，设计一对引物(P7和P8)，扩增得到NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因(rocG)，片段大小约1300bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为AKC49347.1的RocG蛋白对应的基因序列相符，rocG的基因序列如列表中的序列9所示，该核苷酸序列所编码的NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

P7：5’-CGTTTGCTGCGGTGATGTAAGGCGCGCCAAGGAGATATAATGAGGAGGAGGAGAT-3’

P8：5’-ACCGAATTCACCACTAGTACCAGATCTTTAGACCCATCCGCGGAAA-3’

将本实验室构建的载体pRB1s-GFP使用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pRB1s与tyrB基因片段，D-ldhD^Y53L基因片段和上述rocG基因片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序后获得正确连接的质粒，命名为PLA31质粒。

2、PLA32质粒的构建

根据不解糖嗜胨菌Peptoniphilus asaccharolyticus的NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶(PaGDH)的氨基酸序列，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列。设计引物(P9和P10)，扩增得到NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因(paGDH)，片段大小约1300bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列翻译后的氨基酸序列与UniProtKB/Swiss-Prot上编号为P28997.1的PaGDH的氨基酸序列相同，基因序列如列表中的序列10所示，该核苷酸序列所编码的NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

P9：5’-CGTTTGCTGCGGTGATGTAAGGCGCGCCAAGGAGATATAATGACCGACACCCTGAAT-3’；

P10：5’-ACCGAATTCACCACTAGTACCAGATCTTCAGTACCAACCACGCAG-3’；

将本实验室构建的载体pRB1s-GFP使用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pRB1s与tyrB基因片段，D-ldhD^Y53L基因片段和上述paGDH基因片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序后获得正确连接的质粒，命名为PLA32质粒。

三、构建产D-苯乳酸的基因工程菌

1、宿主菌

以大肠杆菌E.coli BW25113作为出发菌株，根据实验的需要，选择实验室保存的BW25113的基因敲除库中的基因缺失菌株。其中包括苯乙醛脱氢酶基因缺失株(ΔfeaB)和过氧化物酶基因缺失株(ΔkatG)。所述苯乙醛脱氢酶的编码基因(feaB)的核苷酸序列如序列表中序列11所示；所述过氧化物酶的编码基因(katG)的核苷酸序列如序列表中序列12所示。各宿主菌的基因型如下表1所示。

表1各宿主菌的基因型

2、基因工程菌的构建

将上述的D-PLA系列重组质粒(PLA21、PLA22、PLA31和PLA32)用氯化钙法转化宿主大肠杆菌BW25113，在链霉素平板上筛选阳性克隆子。将筛选到的含有D-PLA系列重组质粒的重组大肠杆菌BW25113分别命名为PLA 21B、PLA 22B、PLA 31B和PLA 32B。分析不同重组菌株D-苯乳酸的产量，将产量最高的D-PLA重组质粒PLA31转入BW25113ΔfeaB和BW25113ΔkatG中，分别命名为PLA31F和PLA31K。(图2为PLA31K菌株表达D-苯乳酸合成途径中三种外源蛋白D-LdhD^Y53L-TyrB-RocG的电泳图谱)

实验同时设置向各宿主菌中转入pRB1s-GFP空载体的对照，所得菌株为空载对照菌(GFP/B)。

实施例2、利用产D-苯乳酸基因工程菌制备D-苯乳酸

一、利用产D-苯乳酸基因工程菌制备D-苯乳酸的具体步骤

1、产D-苯乳酸基因工程菌的诱导

自诱导培养：将产D-苯乳酸的基因工程菌划线到含有质量百分比浓度为1.5％的琼脂和含50μg/mL的链霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃过夜震荡培养，转速为220rpm；将过夜的培养物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，20℃震荡培养，转速220rpm，培养时间为24h。

自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.500×MgSO₄：1M MgSO₄

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

2、生物转化制备D-苯乳酸

诱导后细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃4200rpm离心10min，使用200μL转化液洗涤一次，弃上清后，再次重悬于200μL转化液中，使其最终OD值为30。

转化液：50mM Tris-HCl，50mM L-苯丙氨酸，5mM谷氨酸盐，pH＝8.0。

将得到的转化液，12000rpm离心10min，去上清，使用0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测D-苯乳酸产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：waters XBridge C-18 3.5μm 4.6*150mm Column；流动相：水+万分之一甲酸/乙腈+万分之一甲酸＝72/28(体积比)，流速：0.5mL·min^-1，柱温25℃；进样量5μL，检测波长214nm。D-苯乳酸、L-苯丙氨酸和苯丙酮酸标准品均为sigma公司产品。实验设置三次重复，结果取平均值。

结果：HPLC结果表明D-苯乳酸标准品的保留时间为3.667分钟。转化产物(D-苯乳酸)、转化底物(L-苯丙氨酸)与转化中间产物(苯丙酮酸)的标准品HPLC图谱如图3所示，从图中可见，保留时间为3.667处为D-苯乳酸的峰，1.75分钟处为L-苯丙氨酸的峰，2.34分钟处为苯丙酮酸的峰。

二、优化工程菌的D-苯乳酸合成能力

1、D-苯乳酸合成途径的构建

通过代谢工程的方法，在大肠杆菌中过表达芳香族氨基酸氨基转移酶(TyrB)以及外源的D型乳糖脱氢酶(D-LdhD)的编码基因，在大肠杆菌BW25113中构建了一条D-苯乳酸合成途径(PLA21B)。

通过连续监测全细胞催化过程中反应体系中的各代谢物的浓度，发现产物D-苯乳酸的合成量在1小时后就达到最高值，之后D-苯乳酸积累量就逐渐减少；底物L-苯丙氨酸的含量则在1小时内逐渐减少，之后变化不大；中间代谢产物苯丙酮酸在整个合成过程中浓度一直很低。

2、D-苯乳酸合成途径的优化

通过定点突变的方法，对D型乳酸脱氢酶进行了活性优化，即在该基因编码蛋白氨基酸的第53位引入突变，将酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(L)，得到D-ldhD^Y53L，这一改变让该酶对含有苯环的底物的亲和力增大，通过基因替换，构建了含有D-ldhD^Y53L基因的重组质粒，利用该含有重组质粒的大肠杆菌(PLA22B)进行全细胞催化，D-苯乳酸的合成量提高了2倍(图4)。

三、外源表达NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶提高工程菌D-苯乳酸合成能力

由于NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶(GDH)可以将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，同时产生NADH，NADH又可以在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下将苯丙酮酸还原合成苯乳酸，因此通过引进不同的GDH在系统中形成辅因子循环体系。引进循环后的质粒分别为PLA31与PLA32，通过比较含有这两个质粒的重组的大肠杆菌(PLA31B和PLA32B)，发现引进循环后D-苯乳酸的产量较没有引进循环(PLA22B)，分别提高了68％和54％，提示NADH依赖型的GDH的引入的确能够较大地够提高D-苯乳酸的产量。因此，共表达NADH依赖型的GDH对于D-苯乳酸合成有明显的促进作用(图4)。进而，将产量最高菌株的质粒PLA31转化入BW25113ΔfeaB和BW25113ΔkatG两个突变菌株中，由于阻断了L-苯丙氨酸和苯丙酮酸的分解途径，D-苯乳酸的产量又得到了小幅度的提高，即全细胞转化1h后苯乳酸的含量可达10.8mM,转化率约为21.6％(PLA31K)。

四、添加α-酮戊二酸、L-谷氨酸和沸石促进D-苯乳酸的合成

由于α-酮戊二酸和L-谷氨酸均为辅因子循环体系中的辅因子，因此少量添加可以有效的提高辅因子循环的效率，提高辅因子循环的有效性，因而可以提高D-苯乳酸的合成量。以重组菌株PLA31K为全细胞催化剂，添加5mM L-谷氨酸时，50mM L-苯丙氨酸为底物的反应体系中D-苯乳酸的浓度可以达到20mM左右，转化率为40％，比未添加又提高了近一倍。加入5mMα-酮戊二酸后，D-苯乳酸的产量与添加5mM L-谷氨酸相似(图5)。而加入20g/L沸石后，D-苯乳酸的产量比未添加增加14％左右。最终，在体系中加入5mM L-谷氨酸和20g/L沸石后，重组菌株PLA31K D-苯乳酸的产生量达到最高值(20.4mM)，其生产强度为3.39g/(L*h)(注：生产强度就是产量与时间的比值，产量是20.4mM，苯乳酸的摩尔质量是166.17g/mol，因此产量为3.39g，而转化时间为1小时)。

由上述数据可见，本发明通过在大肠杆菌中构建D-苯乳酸合成途径，开发了一套全细胞催化合成D-苯乳酸的方法。通过共表达NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶实现了辅因子的循环，提高了D-苯乳酸合成的效率，通过少量添加辅因子，如L-谷氨酸、α-酮戊二酸和沸石，进一步提高了D-苯乳酸的合成效率。通过上述方法实现D-苯乳酸的全细胞催化合成在国内外尚属首次。

<110> 福建师范大学

<120> 产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用

<130> GNCLN171188

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 397

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 1

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<212> PRT

<213> 保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

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<212> PRT

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

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gccccggagc cgccaagggt attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360

gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc acgtagcaat attcgccggg 420

gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480

aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540

tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600

attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660

ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720

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gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840

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gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020

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<212> DNA

<213> 保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）

<400> 7

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gttgacaaca tcgacatggc taaggctaag gaacttggct tccaaatcac caacgttcca 300

gtttactcac caaacgccat cgcagaacac gctgctatcc aagctgcccg catcctgcgt 360

caagacaagg ctatggacga aaaggttgcc cgtcacgact tgcgttgggc accaactatc 420

ggccgtgaag ttcgcgacca agttgttggt gttataggta ctggccacat cggtcaagtc 480

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<213> 人工序列

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<400> 8

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<400> 9

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gcacatagct ctgctgtcgg tccgtctaaa ggcggtgtgc gctttcaccc gaacgtcaat 240

atggatgaag tgaaagcgct gtctctgtgg atgacgttca aaggcggtgc cctgggtctg 300

ccgtatggcg gtggcaaagg tggcatttgc gttgatccgg cagaactgtc agaacgtgaa 360

ctggaacagc tgtcgcgtgg ttgggtgcgc ggcctgtata aatacctggg tgatcgcatc 420

gacattccgg ccccggatgt taacaccaat ggccaaatca tgagctggtt cgtggatgaa 480

tatgttaaac tgaacggtga acgtatggac attggcacct ttacgggcaa accggttgca 540

ttcggtggca gtgaaggccg caatgaagca accggttttg gcgtcgctgt ggttgtccgt 600

gaatccgcta aacgcttcgg tatcaaaatg gaagatgcga aaattgccgt gcagggtttt 660

ggcaacgttg gcaccttcac ggtcaaaaat atcgaacgtc aaggtggcaa agtttgcgcg 720

attgccgaat gggatcgcaa cgagggtaat tatgcgctgt acaacgaaaa tggcatcgac 780

tttaaagaac tgctggcgta taaagaagcc aacaaaaccc tgatcggttt tccgggcgcc 840

gaacgtatta ccgatgaaga attttggacg aaagaatacg acattatcgt tccggcggca 900

ctggaaaatg tcatcaccgg tgaacgcgca aaaacgatta acgctaaact ggtctgtgaa 960

gcagctaatg gtccgaccac gccggaaggc gataaagtgc tgaccgaacg tggcatcaac 1020

ctgaccccgg acattctgac gaatagtggt ggcgtcctgg tgtcctatta cgaatgggtg 1080

cagaaccaat atggttatta ctggaccgaa gcggaagttg aagaaaaaca ggaagcggat 1140

atgatgaaag ccattaaagg cgtttttgca gtcgctgacg aatacaatgt gacgctgcgc 1200

gaagcggtct atatgtatgc tatcaaatca atcgacgtgg caatgaaact gcgtggttgg 1260

tactga 1266

<210> 11

<211> 1500

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 11

atgacagagc cgcatgtagc agtattaagc caggtccaac agtttctcga tcgtcaacac 60

ggtctttata ttgatggtcg tcctggcccc gcacaaagtg aaaaacggtt ggcgatcttt 120

gatccggcca ccgggcaaga aattgcgtct actgctgatg ccaacgaagc ggatgtagat 180

aacgcagtca tgtctgcctg gcgggccttt gtctcgcgtc gctgggccgg gcgattaccc 240

gcagagcgtg aacgtattct gctacgtttt gctgatctgg tggagcagca cagtgaggag 300

ctggcgcaac tggaaaccct ggagcaaggc aagtcaattg ccatttcccg tgcttttgaa 360

gtgggctgta cgctgaactg gatgcgttat accgccgggt taacgaccaa aatcgcgggt 420

aaaacgctgg acttgtcgat tcccttaccc cagggggcgc gttatcaggc ctggacgcgt 480

aaagagccgg ttggcgtagt ggcgggaatt gtgccatgga actttccgtt gatgattggt 540

atgtggaagg tgatgccagc actggcagca ggctgttcaa tcgtgattaa gccttcggaa 600

accacgccac tgacgatgtt gcgcgtggcg gaactggcca gcgaggctgg tatccctgat 660

ggcgttttta atgtcgtcac cgggtcaggt gctgtatgcg gcgcggccct gacgtcacat 720

cctcatgttg cgaaaatcag ttttaccggt tcaaccgcga cgggaaaagg tattgccaga 780

actgctgctg atcacttaac gcgtgtaacg ctggaactgg gcggtaaaaa cccggcaatt 840

gtattaaaag atgctgatcc gcaatgggtt attgaaggct tgatgaccgg aagcttcctg 900

aatcaagggc aagtatgcgc cgccagttcg cgaatttata ttgaagcgcc gttgtttgac 960

acgctggtta gtggatttga gcaggcggta aaatcgttgc aagtgggacc ggggatgtca 1020

cctgttgcac agattaaccc tttggtttct cgtgcgcact gcgacaaagt gtgttcattc 1080

ctcgacgatg cgcaggcaca gcaagcagag ctgattcgcg ggtcgaatgg accagccgga 1140

gaggggtatt atgttgcgcc aacgctggtg gtaaatcccg atgctaaatt gcgcttaact 1200

cgtgaagagg tgtttggtcc ggtggtaaac ctggtgcgag tagcggatgg agaagaggcg 1260

ttacaactgg caaacgacac ggaatatggc ttaactgcca gtgtctggac gcaaaatctc 1320

tcccaggctc tggaatatag cgatcgctta caggcaggga cggtgtgggt aaacagccat 1380

accttaattg acgctaactt accgtttggt gggatgaagc agtcaggaac gggccgtgat 1440

tttggccccg actggctgga cggttggtgt gaaactaagt cggtgtgtgt acggtattaa 1500

<210> 12

<211> 2181

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 12

atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag 60

ggcggtcacg accagagtgc gggggcgggc acaaccactc gcgactggtg gccaaatcaa 120

cttcgtgttg acctgttaaa ccaacattct aatcgttcta acccactggg tgaggacttt 180

gactaccgca aagaattcag caaattagat tactacggcc tgaaaaaaga tctgaaagcc 240

ctgttgacag aatctcaacc gtggtggcca gccgactggg gcagttacgc cggtctgttt 300

attcgtatgg cctggcacgg cgcggggact taccgttcaa tcgatggacg cggtggcgcg 360

ggtcgtggtc agcaacgttt tgcaccgctg aactcctggc cggataacgt aagcctcgat 420

aaagcgcgtc gcctgttgtg gccaatcaaa cagaaatatg gtcagaaaat ctcctgggcc 480

gacctgttta tcctcgcggg taacgtggcg ctagaaaact ccggcttccg taccttcggt 540

tttggtgccg gtcgtgaaga cgtctgggaa ccggatctgg atgttaactg gggtgatgaa 600

aaagcctggc tgactcaccg tcatccggaa gcgctggcga aagcaccgct gggtgcaacc 660

gagatgggtc tgatttacgt taacccggaa ggcccggatc acagcggcga accgctttct 720

gcggcagcag ctatccgcgc gaccttcggc aacatgggca tgaacgacga agaaaccgtg 780

gcgctgattg cgggtggtca tacgctgggt aaaacccacg gtgccggtcc gacatcaaat 840

gtaggtcctg atccagaagc tgcaccgatt gaagaacaag gtttaggttg ggcgagcact 900

tacggcagcg gcgttggcgc agatgccatt acctctggtc tggaagtagt ctggacccag 960

acgccgaccc agtggagcaa ctatttcttc gagaacctgt tcaagtatga gtgggtacag 1020

acccgcagcc cggctggcgc aatccagttc gaagcggtag acgcaccgga aattatcccg 1080

gatccgtttg atccgtcgaa gaaacgtaaa ccgacaatgc tggtgaccga cctgacgctg 1140

cgttttgatc ctgagttcga gaagatctct cgtcgtttcc tcaacgatcc gcaggcgttc 1200

aacgaagcct ttgcccgtgc ctggttcaaa ctgacgcaca gggatatggg gccgaaatct 1260

cgctacatcg ggccggaagt gccgaaagaa gatctgatct ggcaagatcc gctgccgcag 1320

ccgatctaca acccgaccga gcaggacatt atcgatctga aattcgcgat tgcggattct 1380

ggtctgtctg ttagtgagct ggtatcggtg gcctgggcat ctgcttctac cttccgtggt 1440

ggcgacaaac gcggtggtgc caacggtgcg cgtctggcat taatgccgca gcgcgactgg 1500

gatgtgaacg ccgcagccgt tcgtgctctg cctgttctgg agaaaatcca gaaagagtct 1560

ggtaaagcct cgctggcgga tatcatagtg ctggctggtg tggttggtgt tgagaaagcc 1620

gcaagcgccg caggtttgag cattcatgta ccgtttgcgc cgggtcgcgt tgatgcgcgt 1680

caggatcaga ctgacattga gatgtttgag ctgctggagc caattgctga cggtttccgt 1740

aactatcgcg ctcgtctgga cgtttccacc accgagtcac tgctgatcga caaagcacag 1800

caactgacgc tgaccgcgcc ggaaatgact gcgctggtgg gcggcatgcg tgtactgggt 1860

gccaacttcg atggcagcaa aaacggcgtc ttcactgacc gcgttggcgt attgagcaat 1920

gacttcttcg tgaacttgct ggatatgcgt tacgagtgga aagcgaccga cgaatcgaaa 1980

gagctgttcg aaggccgtga ccgtgaaacc ggcgaagtga aatttacggc cagccgtgcg 2040

gatctggtgt ttggttctaa ctccgtcctg cgtgcggtgg cggaagttta cgccagtagc 2100

gatgcccacg agaagtttgt taaagacttc gtggcggcat gggtgaaagt gatgaacctc 2160

gaccgtttcg acctgctgta a 2181

<210> 13

<211> 792

<212> DNA

<213> 鲍氏不动杆菌

<400> 13

atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc 60

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc 120

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa 180

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc 240

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt 300

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt 360

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa 420

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag 480

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct 540

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc 600

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat 660

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc 720

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 780

gtcggcaaat aa 792

<210> 14

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggtgt 60

cagctcactc aaaagcggta atacggttat ccacagaatc aggggataaa gccggaaaga 120

acatgtgagc aaaaagcaaa gcaccggaag aagccaacgc cgcaggcgtt tttccatagg 180

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gccagaggtg gcgaaacccg 240

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 300

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 360

tctcatagct cacgctgttg gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 420

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 480

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccattgg taactgattt 540

agaggacttt gtcttgaagt tatgcacctg ttaaggctaa actgaaagaa cagattttgg 600

tgagtgcggt cctccaaccc acttaccttg gttcaaagag ttggtagctc agcgaacctt 660

gagaaaacca ccgttggtag cggtggtttt tctttattta tgagatgatg aatcaatcgg 720

tctatcaagt caacgaacag ctattccgtt 750

<210> 15

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

Claims

1.一种制备产D-苯乳酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与D-苯乳酸合成相关的基因导入宿主菌得到产D-苯乳酸的重组菌；所述与D-苯乳酸合成相关的基因为芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、D型乳酸脱氢酶的编码基因和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因；

所述宿主菌为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体；所述大肠杆菌的基因敲除突变体为敲除大肠杆菌中苯乙醛脱氢酶的编码基因和过氧化物酶的编码基因中的至少一个基因后得到的突变体；

所述芳香族氨基酸氨基转移酶为氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

所述D型乳酸脱氢酶为氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；

所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶为氨基酸序列为序列表中的序列4的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113、大肠杆菌BW25113ΔfeaB或大肠杆菌BW25113ΔkatG。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因为序列表中的序列6所示的DNA分子；

所述D型乳酸脱氢酶的编码基因为序列表中的序列8所示的DNA分子；

所述NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因为序列表中的序列9所示的DNA分子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述与D-苯乳酸合成相关的基因是通过重组载体导入所述宿主菌的；

5.由权利要求4所述的方法制备得到的基因工程菌。

6.权利要求5所述的基因工程菌在制备D-苯乳酸中的应用。

7.一种制备D-苯乳酸的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求5所述的基因工程菌，得到表达芳香族氨基酸氨基转移酶、D型乳酸脱氢酶、NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的菌体细胞，用所述菌体细胞催化L-苯丙氨酸生成D-苯乳酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在用所述菌体细胞催化L-苯丙氨酸的过程中，还包括向催化反应体系中加入α-酮戊二酸和/或L-谷氨酸和/或沸石的步骤。