JP4679785B2 - 新規な（ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（ｄ−フェニル乳酸）脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、光学活性２−ヒドロキシ酸誘導体、例えば（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（以下、「Ｄ−フェニル乳酸」と略記することがある）またはその誘導体を製造するための新規なＤ−フェニル乳酸脱水素酵素（以下、「Ｄ−ＰＬＤＨ」と略記することがある）およびその酵素をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
Ｄ−フェニル乳酸は、アゴノマイセタレス（Agonomycetales）に属する糸状菌ＰＦ１０２２株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）によって産生されるＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］（Sasaki,T.et al.,J.Antibiotics,45,692(1992)）の前駆物質である。最近、ＰＦ１０２２物質を直接生成する酵素およびその遺伝子が明らかにされた（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）。また、ＰＦ１０２２物質生産菌の液体培養期間中に、外部よりフェニル乳酸誘導体を添加すると、添加したフェニル乳酸誘導体を取り込んだ新規なＰＦ１０２２物質が産生されることが知られている（ＷＯ９７／２０９４５号）。この時、添加する前駆体は、（Ｒ）−２−ヒドロキシ体であることが望ましい。
【０００３】
微生物が産生するある種の酵素は、光学活性な化合物、例えばＤ−乳酸（Taguchi,H.et al.,J.Biol.Chem.,266,p.12588(1991)）を特異的に生成することが知られている。また、ある種の酵素または有用な酵素を産生する微生物を利用して産業上有用な化合物、例えば（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸等を製造する方法は多数報告されている（特許第２７５００１７号、同第２７５２７５４号、同第２７７４３４１号、同第２８７３２３６号、特公平６−６１２７１号、特開平６−１９７７７４号、特開平１０−７５７９７号）。酵素を用いた反応は、化学合成に比べると、目的とする化合物を選択的に効率良く製造できることが特徴であるが、その反面、酵素の持つ基質特異性が厳密であるために、目的とする化合物に特異的に作用する酵素の探索が必要である。これまでに微生物由来のＤ−フェニル乳酸に特異的な脱水素酵素が報告された例はない。
【０００４】
【発明の概要】
本発明者らは、フェニルピルビン酸を特異的に還元し、Ｄ−フェニル乳酸を生成する酵素、すなわち、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＰＬＤＨ）およびその遺伝子を単離することに成功した。また、この遺伝子を大腸菌において大量に発現させることに成功した。
【０００５】
本発明はＤ−フェニル乳酸脱水素酵素を提供することをその目的とする。
【０００６】
本発明はまた、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を提供することをその目的とする。
【０００７】
本発明は更にまた、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素を発現させるための組換えベクターおよび形質転換体並びにＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造法の提供をその目的とする。
【０００８】
本発明はまた、ＰＦ１０２２物質およびその誘導体の大量生産系およびその製造法の提供をその目的とする。
【０００９】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素は、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
【００１０】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子は、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
【００１１】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子はまた、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００１２】
本発明による組換えベクターは、本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子を含んでなるものである。
【００１３】
本発明による形質転換体は、本発明による組換えベクターを含んでなる宿主である。
【００１４】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から酵素を採取する工程を含んでなるものである。
【００１５】
本発明によるＰＦ１０２２物質の生産系は、本発明による組換えベクターにより形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌である。
【００１６】
本発明によるＰＦ１０２２物質の製造法は、本発明による組換えベクターにより形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌を培養し、培養物からＰＦ１０２２物質を採取する工程を含んでなるものである。
【００１７】
【発明の具体的説明】
微生物の寄託
実施例１ １．に記載されるＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１である。
【００１８】
実施例３ ３．に記載されるプラスミドｐＤＰＬＤＨ−１で形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、２０００年４月１２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−７５４５である。
【００１９】
遺伝子およびタンパク質
本発明によればＤ−フェニル乳酸脱水素酵素およびその遺伝子が提供される。
【００２０】
本発明による酵素は、２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸（以下「フェニルピルビン酸」ということがある）に作用してこれを還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸に変換する。基質であるフェニルピルビン酸をあらかじめ修飾しておくことによりＤ−フェニル乳酸の誘導体または類縁物質を製造できる。
【００２１】
Ｄ−フェニル乳酸の誘導体としては、例えば、ｐ−アミノフェニル乳酸、ｐ−ニトロフェニル乳酸、ｐ−ヒドロキシフェニル乳酸が挙げられる。この場合、Ｄ−フェニル乳酸誘導体の合成基質としては、例えば、ｐ−アミノフェニルピルビン酸、ｐ−ニトロフェニルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を使用できる。
【００２２】
Ｄ−フェニル乳酸の類縁物質としては、例えば、抗高血圧剤の原料として用いられる（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が挙げられる。この場合、Ｄ−フェニル乳酸類縁物質の合成基質としては、例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸を使用できる。
【００２３】
配列（ｂ）において、改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。
【００２４】
配列（ｅ）において、改変の数は、例えば１〜数十個であることができる。
【００２５】
配列（ｂ）および配列（ｅ）において改変が複数個存在する場合、導入された改変の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００２６】
配列（ｄ）において、配列番号１のＤＮＡ配列との同一性は、好ましくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも９０％、最も好ましくは少くとも９５％であることができる。
【００２７】
配列（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味する。
【００２８】
配列（ｂ）に関して、「Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有する」か否かは、例えば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の基質（例えば、フェニルピルビン酸）と、還元型補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とを準備し、被験タンパク質を作用させ、酵素反応によって生じる物理化学的変化、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の吸光度変化および／または生成物であるＤ−フェニル乳酸の量的変化を測定することにより評価することができる（実施例３参照）。
【００２９】
配列（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）に関して、「Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする」か否かは、例えば、被験ヌクレオチド配列を宿主にて発現させ、得られたタンパク質を、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の基質（例えば、フェニルピルビン酸）と、還元型補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）と作用させ、酵素反応によって生じる物理化学的変化、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の吸光度変化および／または生成物であるＤ−フェニル乳酸の量的変化を測定することにより評価することができる（実施例３参照）。
【００３０】
本発明による酵素のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３１】
本発明による酵素および遺伝子の起源は特に限定されるものではなく、本発明による酵素を産生しうる微生物であれば特に限定されないが、好ましくはＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
【００３２】
本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて酵素を泳動し、得られた酵素バンドを電気的にポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜等に移動させた後に、プロテインシークエンサーにて分析することで決定できる。
【００３３】
本発明による酵素の内部アミノ酸配列は、例えば、酵素をタンパク質分解酵素等で部分消化した後に、上記ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動以降の操作および逆相クロマトグラフィーによる分離操作を実施することにより決定できる。
【００３４】
本発明による遺伝子は例えば下記のようにして得ることができる。
【００３５】
ＰＦ１０２２物質生産菌からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。或いは、ＰＦ１０２２物質生産菌から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとした逆転写酵素反応にてｍＲＮＡに対応したｃＤＮＡを調製後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のｃＤＮＡからなるライブラリーを作製する。
【００３６】
Ｄ−ＰＬＤＨのＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、適当なプライマーを合成し、それを用いてＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。このようにしてＤ−ＰＬＤＨ遺伝子の全領域または発現に必要な領域を単離することができる。これらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、翻訳開始コドンの上流および翻訳終結コドンの下流に、ＰＣＲ等の手法により適当な制限酵素切断部位を導入し、Ｄ−ＰＬＤＨのみを含む遺伝子断片を得ることができる。
【００３７】
組換えベクター
本発明によればＤ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクターが提供される。
【００３８】
本発明による組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３９】
本発明において使用できるベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられ、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
【００４０】
本発明による組換えベクターは、例えば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列を作動可能に連結することにより作製できる。
【００４１】
本発明による遺伝子へのプロモーターおよびターミネーターの連結、および発現ユニットのベクターへの挿入は、公知の方法に従って行うことができる。
【００４２】
本発明に用いるプロモーターおよびターミネーターは特に限定されず、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子の制御配列、トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子の制御配列、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の加水分解酵素遺伝子の制御配列、硝酸還元酵素、オロチジン−５’−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等の酸化還元酵素遺伝子の制御配列、およびＷＯ０１／１８２１９Ａ１に記載のAbp1等のＰＦ１０２２物質生産菌中で高発現するＰＦ１０２２物質生産菌由来の遺伝子の制御配列が挙げられる。
【００４３】
本発明による遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４４】
遺伝子マーカーの導入は、例えば、制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結する事により行うことができる。
【００４５】
選択マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、ａｒｇＢ、ｐｙｒ４、ｔｒｐＣ、ＴＲＰ１、ｎｉａＤ、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
【００４６】
形質転換体およびＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造
本発明によれば前記ベクターにより形質転換された宿主が提供される。
【００４７】
本発明において使用できる宿主としては、遺伝子組換えの宿主として使用可能な微生物であれば特に限定されるものではない。使用できる宿主の例としては、任意の細菌類または真菌類の微生物が挙げられ、好ましくは大腸菌、乳酸菌、放線菌、酵母、糸状菌であり、より好ましくは、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌であり、特に好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）またはその変異株である。
【００４８】
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ＰＦ１０２２物質生産菌を宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
【００４９】
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等の有機または無機窒素化合物が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の核酸類、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、本発明による酵素の生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
【００５０】
培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。宿主によっては嫌気培養法により培養することができる。
【００５１】
培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気攪拌培養法により行うことができる。培養に適当な温度は、１５℃〜６０℃であるが、好ましくは２０℃〜４０℃付近で生育する。培養時間は、例えば６時間〜２４０時間、好ましくは８時間〜１６８時間程度である。
【００５２】
培養中のＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の量が最高になった時に培養を停止し、培養物からＤ−フェニル乳酸脱水素酵素を単離、精製する。
【００５３】
本発明による酵素の培養物からの単離、精製は、培養した微生物菌体を破砕し、得られた無細胞抽出液を通常の精製手段に付することにより行うことができる。例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって回収した菌体を、物理的破砕法、例えば超音波処理、海砂および乳鉢・乳棒を使った破砕、或いはボールミル、フレンチプレス、凍結破砕器、ブレンダーまたはミキサー等によって破壊し、遠心分離によって残渣を除くことで無細胞抽出液を得る。培養物から遠心分離またはろ過することによって回収した菌体をただちに破砕しない場合は、凍結または凍結乾燥により保存することができ、必要な時に破砕することができる。次に、無細胞抽出液を硫酸アンモニウム分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー法、ゲルろ過法等の通常の精製方法を単独でまたは組み合わせることにより、活性を保持した酵素を得ることができる。
【００５４】
本発明によれば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の大量生産系が提供される。Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の大量生産系として使用できる宿主としては、大腸菌、乳酸菌、放線菌、酵母、糸状菌が挙げられる。
【００５５】
本発明による酵素はフェニルピルビン酸をＤ−フェニル乳酸に変換する。一方、ＰＦ１０２２物質は４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、および２分子のＤ−フェニル乳酸から環状デプシペプチド合成酵素により合成される。従って、Ｄ−フェニル乳酸はＰＦ１０２２物質合成の際の原料物質に相当する。よって、Ｄ−フェニル乳酸をＰＦ１０２２物質生産菌において大量に発現させることができれば、ＰＦ１０２２物質を大量に生産させることが可能である。従って本発明によれば、本発明による酵素が発現するように形質転換されたことを特徴とするＰＦ１０２２物質の大量生産系が提供される。ＰＦ１０２２物質は動物用の駆虫薬として有用である（Sasaki, T. et al. J. Antibiotics., 45,692,(1992))。
【００５６】
ＰＦ１０２２物質の大量生産系として使用できるＰＦ１０２２物質生産菌は、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌が好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
【００５７】
ＰＦ１０２２生産菌は、本発明による酵素遺伝子以外の遺伝子により更に形質転換されていてもよい。例えば、ＰＦ１０２２物質の合成スキームにおいて作用する酵素遺伝子を場合によっては強力なプロモーターとともに導入することによりＰＦ１０２２物質の生産を向上させることができる。このような遺伝子としては環状デプシペプチド合成酵素（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）が挙げられる。
【００５８】
また、本発明による酵素が作用する基質、すなわち、フェニルピルビン酸、その誘導体、および類縁物質を合成しない宿主においては、不足する基質、基質の誘導体、または基質の類縁物質を添加して培養することにより、あるいは不足する基質、基質の誘導体、または基質の類縁物質をコードする遺伝子で宿主を形質転換することにより、Ｄ−フェニル乳酸およびその誘導体および類縁物質を生産させることが可能である。このような酵素遺伝子としてはコリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子（ＷＯ０１／２３５４２Ａ１）が挙げられる。
【００５９】
コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子が導入された宿主においては、ｐ−アミノフェニルピルビン酸が合成され、本発明による酵素がｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐ−アミノフェニル乳酸に変換する。その結果、変換されたｐ−アミノフェニル乳酸がＰＦ１０２２物質の原料となり、ベンゼン環のパラ位がアミノ基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体[シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−（４−アミノ−フェニル）ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］が合成される。アミノ基のような官能基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体はより高活性なＰＦ１０２２物質誘導体を製造するための原料として有用である。
【００６０】
形質転換に用いられる組換えベクターとしては、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を本発明による酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターが好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）において機能する制御配列を本発明による酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターである。発現を増強するための強力なプロモーターとしてはＡｂｐ１プロモーター（ＷＯ０１／１８２１９Ａ１）が挙げられる。
【００６１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
実施例１ Ｄ−ＰＬＤＨの単離・精製
１．菌体の調製
ＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対しＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を種培地［１％ イーストエキス、１％ マルトエキス、２％ ポリペプトン、２．５％ グルコース、０．１％ リン酸水素２カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）５０ｍｌの入った適当な容器に接種し、２６℃にて３日間振とう培養し一次種培養とした。この培養液をＷＯ９７／２０９４５号に記載の培地５００ｍｌの入った適当な容器に接種し、２６℃にてロータリーシェーカーを用いて３日間培養し二次種培養とした。この培養液を、同培地５００ｍｌの入った適当な容器に接種し２６℃にてロータリーシェーカーを用いて４日〜６日間培養した。培養終了後の培養液を、市販のナイロン製生地およびヌッチェを用いて吸引ろ過し、同時に脱イオン水にて菌体を洗浄した。得られた菌体ケーキを直ちにマイナス８０℃にて凍結させ、凍結乾燥器にて２晩乾燥させた。このようにして調製した凍結乾燥菌体は、密閉容器に入れてマイナス８０℃で保存可能であった。
【００６３】
２．Ｄ−ＰＬＤＨの抽出・精製
０．１Ｍフェニルピルビン酸 ２μｌ、０．１Ｍ ＮＡＤＰＨ ２μｌ、緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス−塩酸、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）および任意の量の酵素液試料を添加し全容を１００μｌとし、２６℃で２時間反応させた。加熱処理により反応を停止させた後、反応液をＨＰＬＣ（カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ４．６φ×１５０ｍｍ（化学品検査協会）、移動相：０．１Ｍ硫酸ナトリウム：アセトニトリル（３．９：１）アイソクラテック、流速１ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）にて分析し、フェニル乳酸の生成量をもって本酵素の活性とした。また、酵素反応産物の光学活性を分析するために、別にＨＰＬＣ（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６φ×２５ｃｍ（ダイセル化学工業）、移動相：２５ｍＭ硫酸銅水溶液、１ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）を用いた。
以下の操作は全て４℃で実施した。実施例１の１で得られた凍結乾燥菌体約７０ｇをボールミル（ポット外径２１０φｍｍ、ボール直径３５φｍｍ、東京硝子器械）を用いて１晩破砕した。微粉末になった菌体に抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸、１０ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ８）１．５Ｌを添加してよく懸濁させた。菌体懸濁液をマグネティックスターラーを用いて約１時間緩やかに攪拌した。次いで、菌体懸濁液を高速冷却遠心機ＳＣＲ２０Ｂ（ローターＮｏ．ＲＰＲ９、日立工機）８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄約１．２Ｌを回収した。回収した上澄を、担体としてレッドセファロースＣＬ６Ｂ（アマシャムファルマシア社）が充填されているカラム（２６φ×３００ｍｍ）に通した。非吸着画分が完全になくなるまで緩衝液Ａにてカラムを洗浄した後、１Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液Ａにて溶出するタンパク質を分画した。活性画分をまとめ、担体としてスーパーデックス２００（アマシャムファルマシア社）が充填されているカラム（２６φ×９５０ｍｍ）を用いてゲルクロマトグラフィーを実施した。活性画分を、直ちにＭｏｎｏＱ１０／１０（アマシャムファルマシア社）にかけた。緩衝液Ａでカラムを洗浄後、吸着しているタンパク質を０〜０．３Ｍ塩化カリウムグラジエント溶出した。活性画分をまとめ、緩衝液Ａで１０倍に希釈し、ＡＭＰアガロース（アマシャムファルマシア社）が充填しているカラム（１６φ×１００ｍｍ）にかけた。非吸着画分を回収し、直ちにヒドロキシアパタイトが充填されているカラム（５φ×５０ｍｍ）にかけた。非吸着画分を回収し、再びＭｏｎｏＱ１０／１０に吸着させた。タンパク質を０〜０．２Ｍ塩化カリウムグラジエント溶出させた。活性画分にはポリアクリルアミド電気泳動で、ほぼ単一の分子量約３８ｋＤａのタンパク質が含まれていた。
【００６４】
３．Ｄ−ＰＬＤＨの内部部分アミノ酸配列の決定
実施例１の２で得られたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で濃縮・単離し、ＰＶＤＦ膜に電気的に移動させた。ＰＶＤＦ膜上に移動したタンパク質をクマシーブリリアントブルーにて染色し、その存在と位置を確認した。タンパク質の存在する位置のＰＶＤＦ膜を切り抜きプロテインシーケンサーにてＮ末端アミノ酸配列を分析しようと試みたが、有効な解析ができなかった。
実施例１の２で得られたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で濃縮・単離し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。目的とするタンパク質を含むゲルを切り出した。これを小試験管中で脱色液（０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、５０％アセトニトリル、ｐＨ８．０）２００μｌで繰り返し洗浄しクマシーブリリアントブルーをゲルから洗い流したのち、ゲルを減圧下で乾燥させた。半乾燥したゲルに、緩衝液Ｂ（０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）５μｌを添加し、トリプシンをモル基準で１００分の１量となるように添加した。１０分ほど放置して酵素をゲル内に拡散させた後、更に２００μｌの緩衝液Ｂを添加し３７℃で４８時間、該タンパク質を酵素消化した。トリフルオロ酢酸で酵素反応を停止させ、反応液を回収した。ゲルを洗浄液（０．１％トリフルオロ酢酸、６０％アセトニトリル）２００μｌで良く洗浄し、洗浄液は先に回収した反応液に混合した。洗浄を更に２回繰り返しトリプシン消化物を回収した。回収したトリプシン消化物を減圧下で乾燥させた後に、６０μｌの蒸留水を加えこれをトリプシン消化されたペプチド断片試料とした。これをＭｏｄｅｌ１７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（パーキンエルマー アプライドバイオシステム社）を用いてクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８ ０．２１φ×２２０ｍｍ、０．１％トリフルオロ酢酸、５％アセトニトリル〜０．０８５％トリフルオロ酢酸、３５％アセトニトリル グラジエント）を行い分画した。得られたペプチド断片ピークのうちの２つのペプチド断片についてアミノ酸配列を分析し、次のような配列を決定した。
ペプチド断片１：ＡＮＶＡＧＦＶＴＴＳＥＰＫ（配列番号３）
ペプチド断片２：ＡＧＤＷＶＴＫ（配列番号４）
【００６５】
実施例２ Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡの単離
１．ｃＤＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの作製
ＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対しＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を、種培地［１％ イーストエキス、１％ マルトエキス、２％ ポリペプトン、２．５％ グルコース、０．１％ リン酸水素２カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）１０ｍｌの入った試験管に接種し、２６℃にて３日間振とう培養した。種培養液を、ＷＯ９７／２０９４５号に記載の培地培地５０ｍｌの入った適当な容器に接種し２６℃にてロータリーシェーカーを用いて６日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢および乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）により、添付の操作方法に従い全ＲＮＡを単離した。更に全ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）により、添付の操作方法に従い、ｍＲＮＡを精製した。
こうして得られたｍＲＮＡから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）により、添付の操作方法に従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをファージベクターのＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして作製した組換えファージベクターについて、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社）により、添付の操作方法に従ってインビトロパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーは、６．８×１０5 プラーク形成単位であった。更に、このｃＤＮＡライブラリーをＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩに添付の操作方法に従い増幅した。この増幅したｃＤＮＡライブラリー中の組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。
【００６６】
２．Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子の部分ＤＮＡ断片の単離
実施例１の３にて得られたペプチド断片１および２の配列から、以下の２種類のプライマーを合成した。
プライマー１：５'−ＧＴＩＧＴＩＡＣＲＡＡＩＣＣＮＧＣＮＡＣ−３'（配列番号５）
プライマー２：５'−ＧＣＩＧＧＩＧＡＹＴＧＧＧＴＮＡＣ−３'（配列番号６）
【００６７】
これらのプライマーを用い、ＷＯ０１／１８１７９Ａ１に記載の方法で単離されたＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１００μｌの反応液中、ゲノムＤＮＡ８０ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付の緩衝液およびｄＮＴＰ混合液、更に終濃度０．５μＭとなるように２種類のプライマーをそれぞれ添加し以下の条件で反応を行った。９４℃ ５分間［９４℃ １分間、５８℃ １分間、７２℃ ３０秒間］×４０回、７２℃ ７分間、４℃保存。続いて反応液を２％アガロース電気泳動にて分析したところ、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅したため、これを市販のＳｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片とｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用い、添付の操作方法に従って連結させた。
【００６８】
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い行った。その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、Ｄ−α−ケト酸特異的脱水素酵素と相同性を示し、目的とするＤ−ＰＬＤＨの遺伝子の一部であることが強く示唆された。
【００６９】
３．Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ全域のクローニング
実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片の塩基配列情報をもとに新たに以下の２種類のプライマーを合成した。
プライマー３：５'−ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡ−３'（配列番号７）
プライマー４：５'−ＧＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＡ−３'（配列番号８）
【００７０】
実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー３およびプライマー４を用いたＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用するプローブとした。ＰＣＲは、１００μｌの反応液中、実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片が挿入されているｐＴ７Ｂｌｕｅプラスミドベクター５００ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付の緩衝液およびｄＮＴＰ混合液、更に終濃度０．５μＭとなるように２種類のプライマーをそれぞれ添加し以下の条件で反応を行った。９４℃ ５分間［９４℃ １分間、６０℃ １分間、７２℃ ３０秒間］×４０回、７２℃ ７分間、４℃保存。続いて反応液を２％アガロース電気泳動にかけ、約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片を、ＥＣＬ ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシア社）を用い、添付の操作方法に従って標識を付加し、ハイブリダイゼーションに使用する核酸プローブとした。
【００７１】
実施例２の１にて作製したプラークの形成されたプレート上に、ブロッティングメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシア社）を載せ、プラークを写し取った。このメンブレンを真壁の方法（真壁和裕 著、細胞工学別冊目で見る実験ノートシリーズ バイオ実験イラストレイテッド４、１２５−１３３頁、１９９７年 秀潤社）に従って処理しＤＮＡをメンブレンに固定化させた。この時メンブレンの洗浄には５×ＳＳＣを用いた。ＥＣＬ ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシア社）を用い、添付の操作方法に従って標識核酸プローブおよびメンブレンに固定化されているファージＤＮＡをハイブリダイズさせ、続いて標識核酸プローブがハイブリダイズしたプラークを検出した。このようにして、プローブに相同な領域の５'上流および３'下流を含む陽性ファージを選抜した。
【００７２】
陽性ファージを、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社）に添付の操作方法に従って処理し、Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを調製した。
【００７３】
４．塩基配列の決定
このようにして単離されたＤ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを鋳型とし、プラスミド由来の配列である、プライマー５：５'−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３'（配列番号９）および／またはプライマー６：５'−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３'（配列番号１０）をプライマーとしてシークエンスを行った。シークエンスはＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い実施した。得られた結果から、塩基配列が未知の部分については、塩基配列解読の終了した部分から新たにプライマーを設計して、更なるシークエンスを繰り返した。これにより、プラスミドに挿入されたＤ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子１５０９ｂｐの塩基配列を決定した。
【００７４】
この配列を解析したところ、１０１１ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。このＯＲＦから予測されるタンパク質は３３６アミノ酸残基、分子量が３６．５ｋＤａであり、Ｄ−乳酸脱水素酵素等との相同性を示した。最も高い相同性を示したタンパク質はグリセレートデヒドロゲナーゼであり、その相同性は３７％であった。単離した本発明のＤ−ＰＬＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００７５】
実施例３ Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子の大量発現によるＤ−ＰＬＤＨの大量調製
１．遺伝子発現用のＤ−ＰＬＤＨ遺伝子の調製
実施例２の３で調製したプラスミドを鋳型とし、両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入したＤ−ＰＬＤＨ遺伝子を増幅させるために、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、またその直後にストップコドンを、更にその直後にリボゾーム結合部位を付加したプライマー７：５'−ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡ−３'（配列番号１１）、および５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位のみを付加したプライマー８：５'−ＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＣＴＡＴＡＣＴＴＧＧ−３'（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２０μｌの反応液中に８０ｎｇプラスミドＤＮＡを鋳型とし、１ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、添付の緩衝液、ｄＮＴＰミックス、２５ｍＭ塩化マグネシウム、および１００ｐＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃ １分間、［９８℃ １５秒間、６８℃ ３分間］×３０回、７２℃ １０分間。続いて反応液を１％アガロース電気泳動にかけて、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＰＣＲ産物およびｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用い、添付の操作方法に従って連結させた。Ｄ−ＰＬＤＨと連結したプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して増幅し、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
このように増幅したＤ−ＰＬＤＨの遺伝子配列を、実施例２の４にて用いたＤ−ＰＬＤＨ遺伝子由来のプライマーとｐＴ７プラスミドベクターの塩基配列由来のプライマーを用いて確認した。シークエンスはＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い実施した。
配列確認後、約１２μｇのＤ−ＰＬＤＨ遺伝子を連結したｐＴ７プラスミドベクターを含む２４μｌのＤＮＡ溶液と３μｌのＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡）および３μｌの添付の緩衝液を良く混合し、３７℃で１８時間反応させた。続いて反応液を１％アガロース電気泳動にかけて、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収し、発現用Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子とした。
【００７６】
２．遺伝子発現用のベクターの構築
市販のｐＵＣ１１９（宝酒造）約２．５μｇを含む溶液を、ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡）および添付の緩衝液と共に３７℃で１８時間反応させた後、フェノール抽出しＤＮＡを回収した。このＤＮＡに、３μｌのアルカリホスファターゼＣ７５（宝酒造）、３μｌの添付の緩衝液、および２４μｌの滅菌水を添加し５０℃で３０分間反応させ、末端のリン酸を除去した。脱リン酸したＤＮＡをフェノール抽出して回収し、３μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に溶解した。
実施例３の１にて調製した発現用Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子５μｌおよび、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９ベクター０．５μｌを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の操作方法に従って連結させて、プラスミドｐＤＰＬＤＨ−１を作製した（第１図）。
【００７７】
３．大腸菌でのＤ−ＰＬＤＨの発現
ｐＤＰＬＤＨ−１を添付の操作方法に従って導入した大腸菌ＤＨ５α（東洋紡）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で１８時間静置培養した後、生育した大腸菌ＤＨ５αを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地２ｍｌに接種し、３７℃で１８時間振とう培養して種培養とした。種培養液の一部を同様の培地２ｍｌの入った試験管10本に接種し３７℃で振とう培養を開始し、５時間後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して、更に２時間培養した。培養終了後、遠心分離で菌体を回収し、実施例１の２に記載の緩衝液Ａにて洗浄した後に、緩衝液Ａ２.５ｍｌに懸濁させた。この菌体懸濁液を、氷冷下超音波細胞破砕機にて処理し、遠心分離にて菌体残渣を除去して得られた上清を、粗酵素液とした。対照には、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子を含まないｐＵＣ１１９にて形質転換された大腸菌ＤＨ５αを用いた。
９６穴マイクロタイタープレートに２５０μＭ ＮＡＤＰＨ、２５０μＭフェニルピルビン酸を含む緩衝液Ａ１５０μｌを分注しておき、そこに粗酵素液５０μｌを添加し、ピペッティング操作により直ちに混合させ、２６℃での３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。測定には吸光度マイクロアッセイリーダーＢｉｏＬｕｍｉｎ９６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を用い、反応開始後から経時的に吸光度の減少を追跡した。この時、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが酸化される酵素量を１ｕｎｉｔとした。この結果を第１表に粗酵素液の酵素活性として示した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
このように、ｐＤＰＬＤＨ−１により形質転換された大腸菌ＤＨ５αは、Ｄ−ＰＬＤＨ活性が、ｐＵＣ１１９で形質転換された大腸菌ＤＨ５αと比べ、１３倍に向上した。また、生産物を光学分割カラムにて分析した結果、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子保持株の産生物質がＤ−フェニル乳酸であることを確認した。本発明による遺伝子がＤ−ＰＬＤＨ遺伝子であることが確認された。
【００８０】
また、得られた粗酵素液を、ＭｏｎｏＱ１０／１０を用い実施例１の２に示した条件に従って粗精製し、部分精製酵素液を調製した。この部分精製粗酵素液を用い９６穴マイクロタイ１タープレート上で、基質であるフェニルピルビン酸の濃度を変化させ、酵素活性を測定した。また、反応基質をフェニルピルビン酸からピルビン酸に代替した時の酵素活性も測定した。フェニルピルビン酸の反応速度を１００とした時の測定結果を第２表に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
このように、本発明による酵素は公知の乳酸脱水素酵素等（特許第２７５００１７号、Taguchi,H.et al.,J.Biol.Chem.,266,p.12588(1991)）とは、明らかに性質が異なることが示され、アミノ酸配列および酵素学的性質のいずれの点からも新規酵素であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＤＰＬＤＨ−１の作製方法を示した図である。
【配列表】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、光学活性２−ヒドロキシ酸誘導体、例えば（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（以下、「Ｄ−フェニル乳酸」と略記することがある）またはその誘導体を製造するための新規なＤ−フェニル乳酸脱水素酵素（以下、「Ｄ−ＰＬＤＨ」と略記することがある）およびその酵素をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
Ｄ−フェニル乳酸は、アゴノマイセタレス（Agonomycetales）に属する糸状菌ＰＦ１０２２株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）によって産生されるＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］（Sasaki,T.et al.,J.Antibiotics,45,692(1992)）の前駆物質である。最近、ＰＦ１０２２物質を直接生成する酵素およびその遺伝子が明らかにされた（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）。また、ＰＦ１０２２物質生産菌の液体培養期間中に、外部よりフェニル乳酸誘導体を添加すると、添加したフェニル乳酸誘導体を取り込んだ新規なＰＦ１０２２物質が産生されることが知られている（ＷＯ９７／２０９４５号）。この時、添加する前駆体は、（Ｒ）−２−ヒドロキシ体であることが望ましい。
【０００３】
微生物が産生するある種の酵素は、光学活性な化合物、例えばＤ−乳酸（Taguchi,H.et al.,J.Biol.Chem.,266,p.12588(1991)）を特異的に生成することが知られている。また、ある種の酵素または有用な酵素を産生する微生物を利用して産業上有用な化合物、例えば（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸等を製造する方法は多数報告されている（特許第２７５００１７号、同第２７５２７５４号、同第２７７４３４１号、同第２８７３２３６号、特公平６−６１２７１号、特開平６−１９７７７４号、特開平１０−７５７９７号）。酵素を用いた反応は、化学合成に比べると、目的とする化合物を選択的に効率良く製造できることが特徴であるが、その反面、酵素の持つ基質特異性が厳密であるために、目的とする化合物に特異的に作用する酵素の探索が必要である。これまでに微生物由来のＤ−フェニル乳酸に特異的な脱水素酵素が報告された例はない。
【０００４】
【発明の概要】
本発明者らは、フェニルピルビン酸を特異的に還元し、Ｄ−フェニル乳酸を生成する酵素、すなわち、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＰＬＤＨ）およびその遺伝子を単離することに成功した。また、この遺伝子を大腸菌において大量に発現させることに成功した。
【０００５】
本発明はＤ−フェニル乳酸脱水素酵素を提供することをその目的とする。
【０００６】
本発明はまた、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を提供することをその目的とする。
【０００７】
本発明は更にまた、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素を発現させるための組換えベクターおよび形質転換体並びにＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造法の提供をその目的とする。
【０００８】
本発明はまた、ＰＦ１０２２物質およびその誘導体の大量生産系およびその製造法の提供をその目的とする。
【０００９】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素は、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
【００１０】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子は、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
【００１１】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子はまた、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００１２】
本発明による組換えベクターは、本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素遺伝子を含んでなるものである。
【００１３】
本発明による形質転換体は、本発明による組換えベクターを含んでなる宿主である。
【００１４】
本発明によるＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から酵素を採取する工程を含んでなるものである。
【００１５】
本発明によるＰＦ１０２２物質の生産系は、本発明による組換えベクターにより形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌である。
【００１６】
本発明によるＰＦ１０２２物質の製造法は、本発明による組換えベクターにより形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌を培養し、培養物からＰＦ１０２２物質を採取する工程を含んでなるものである。
【００１７】
【発明の具体的説明】
微生物の寄託
実施例１ １．に記載されるＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１である。
【００１８】
実施例３ ３．に記載されるプラスミドｐＤＰＬＤＨ−１で形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、２０００年４月１２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−７５４５である。
【００１９】
遺伝子およびタンパク質
本発明によればＤ−フェニル乳酸脱水素酵素およびその遺伝子が提供される。
【００２０】
本発明による酵素は、２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸（以下「フェニルピルビン酸」ということがある）に作用してこれを還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸に変換する。基質であるフェニルピルビン酸をあらかじめ修飾しておくことによりＤ−フェニル乳酸の誘導体または類縁物質を製造できる。
【００２１】
Ｄ−フェニル乳酸の誘導体としては、例えば、ｐ−アミノフェニル乳酸、ｐ−ニトロフェニル乳酸、ｐ−ヒドロキシフェニル乳酸が挙げられる。この場合、Ｄ−フェニル乳酸誘導体の合成基質としては、例えば、ｐ−アミノフェニルピルビン酸、ｐ−ニトロフェニルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を使用できる。
【００２２】
Ｄ−フェニル乳酸の類縁物質としては、例えば、抗高血圧剤の原料として用いられる（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が挙げられる。この場合、Ｄ−フェニル乳酸類縁物質の合成基質としては、例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸を使用できる。
【００２３】
配列（ｂ）において、改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。
【００２４】
配列（ｅ）において、改変の数は、例えば１〜数十個であることができる。
【００２５】
配列（ｂ）および配列（ｅ）において改変が複数個存在する場合、導入された改変の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００２６】
配列（ｄ）において、配列番号１のＤＮＡ配列との同一性は、好ましくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも９０％、最も好ましくは少くとも９５％であることができる。
【００２７】
配列（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味する。
【００２８】
配列（ｂ）に関して、「Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有する」か否かは、例えば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の基質（例えば、フェニルピルビン酸）と、還元型補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とを準備し、被験タンパク質を作用させ、酵素反応によって生じる物理化学的変化、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の吸光度変化および／または生成物であるＤ−フェニル乳酸の量的変化を測定することにより評価することができる（実施例３参照）。
【００２９】
配列（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）に関して、「Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする」か否かは、例えば、被験ヌクレオチド配列を宿主にて発現させ、得られたタンパク質を、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の基質（例えば、フェニルピルビン酸）と、還元型補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）と作用させ、酵素反応によって生じる物理化学的変化、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の吸光度変化および／または生成物であるＤ−フェニル乳酸の量的変化を測定することにより評価することができる（実施例３参照）。
【００３０】
本発明による酵素のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３１】
本発明による酵素および遺伝子の起源は特に限定されるものではなく、本発明による酵素を産生しうる微生物であれば特に限定されないが、好ましくはＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
【００３２】
本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて酵素を泳動し、得られた酵素バンドを電気的にポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜等に移動させた後に、プロテインシークエンサーにて分析することで決定できる。
【００３３】
本発明による酵素の内部アミノ酸配列は、例えば、酵素をタンパク質分解酵素等で部分消化した後に、上記ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動以降の操作および逆相クロマトグラフィーによる分離操作を実施することにより決定できる。
【００３４】
本発明による遺伝子は例えば下記のようにして得ることができる。
【００３５】
ＰＦ１０２２物質生産菌からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。或いは、ＰＦ１０２２物質生産菌から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとした逆転写酵素反応にてｍＲＮＡに対応したｃＤＮＡを調製後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のｃＤＮＡからなるライブラリーを作製する。
【００３６】
Ｄ−ＰＬＤＨのＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、適当なプライマーを合成し、それを用いてＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。このようにしてＤ−ＰＬＤＨ遺伝子の全領域または発現に必要な領域を単離することができる。これらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、翻訳開始コドンの上流および翻訳終結コドンの下流に、ＰＣＲ等の手法により適当な制限酵素切断部位を導入し、Ｄ−ＰＬＤＨのみを含む遺伝子断片を得ることができる。
【００３７】
組換えベクター
本発明によればＤ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクターが提供される。
【００３８】
本発明による組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３９】
本発明において使用できるベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられ、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
【００４０】
本発明による組換えベクターは、例えば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列を作動可能に連結することにより作製できる。
【００４１】
本発明による遺伝子へのプロモーターおよびターミネーターの連結、および発現ユニットのベクターへの挿入は、公知の方法に従って行うことができる。
【００４２】
本発明に用いるプロモーターおよびターミネーターは特に限定されず、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子の制御配列、トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子の制御配列、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の加水分解酵素遺伝子の制御配列、硝酸還元酵素、オロチジン−５’−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等の酸化還元酵素遺伝子の制御配列、およびＷＯ０１／１８２１９Ａ１に記載のAbp1等のＰＦ１０２２物質生産菌中で高発現するＰＦ１０２２物質生産菌由来の遺伝子の制御配列が挙げられる。
【００４３】
本発明による遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４４】
遺伝子マーカーの導入は、例えば、制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結する事により行うことができる。
【００４５】
選択マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、ａｒｇＢ、ｐｙｒ４、ｔｒｐＣ、ＴＲＰ１、ｎｉａＤ、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
【００４６】
形質転換体およびＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造
本発明によれば前記ベクターにより形質転換された宿主が提供される。
【００４７】
本発明において使用できる宿主としては、遺伝子組換えの宿主として使用可能な微生物であれば特に限定されるものではない。使用できる宿主の例としては、任意の細菌類または真菌類の微生物が挙げられ、好ましくは大腸菌、乳酸菌、放線菌、酵母、糸状菌であり、より好ましくは、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌であり、特に好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）またはその変異株である。
【００４８】
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ＰＦ１０２２物質生産菌を宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
【００４９】
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等の有機または無機窒素化合物が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の核酸類、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、本発明による酵素の生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
【００５０】
培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。宿主によっては嫌気培養法により培養することができる。
【００５１】
培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気攪拌培養法により行うことができる。培養に適当な温度は、１５℃〜６０℃であるが、好ましくは２０℃〜４０℃付近で生育する。培養時間は、例えば６時間〜２４０時間、好ましくは８時間〜１６８時間程度である。
【００５２】
培養中のＤ−フェニル乳酸脱水素酵素の量が最高になった時に培養を停止し、培養物からＤ−フェニル乳酸脱水素酵素を単離、精製する。
【００５３】
本発明による酵素の培養物からの単離、精製は、培養した微生物菌体を破砕し、得られた無細胞抽出液を通常の精製手段に付することにより行うことができる。例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって回収した菌体を、物理的破砕法、例えば超音波処理、海砂および乳鉢・乳棒を使った破砕、或いはボールミル、フレンチプレス、凍結破砕器、ブレンダーまたはミキサー等によって破壊し、遠心分離によって残渣を除くことで無細胞抽出液を得る。培養物から遠心分離またはろ過することによって回収した菌体をただちに破砕しない場合は、凍結または凍結乾燥により保存することができ、必要な時に破砕することができる。次に、無細胞抽出液を硫酸アンモニウム分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー法、ゲルろ過法等の通常の精製方法を単独でまたは組み合わせることにより、活性を保持した酵素を得ることができる。
【００５４】
本発明によれば、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の大量生産系が提供される。Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の大量生産系として使用できる宿主としては、大腸菌、乳酸菌、放線菌、酵母、糸状菌が挙げられる。
【００５５】
本発明による酵素はフェニルピルビン酸をＤ−フェニル乳酸に変換する。一方、ＰＦ１０２２物質は４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、および２分子のＤ−フェニル乳酸から環状デプシペプチド合成酵素により合成される。従って、Ｄ−フェニル乳酸はＰＦ１０２２物質合成の際の原料物質に相当する。よって、Ｄ−フェニル乳酸をＰＦ１０２２物質生産菌において大量に発現させることができれば、ＰＦ１０２２物質を大量に生産させることが可能である。従って本発明によれば、本発明による酵素が発現するように形質転換されたことを特徴とするＰＦ１０２２物質の大量生産系が提供される。ＰＦ１０２２物質は動物用の駆虫薬として有用である（Sasaki, T. et al. J. Antibiotics., 45,692,(1992))。
【００５６】
ＰＦ１０２２物質の大量生産系として使用できるＰＦ１０２２物質生産菌は、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌が好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
【００５７】
ＰＦ１０２２生産菌は、本発明による酵素遺伝子以外の遺伝子により更に形質転換されていてもよい。例えば、ＰＦ１０２２物質の合成スキームにおいて作用する酵素遺伝子を場合によっては強力なプロモーターとともに導入することによりＰＦ１０２２物質の生産を向上させることができる。このような遺伝子としては環状デプシペプチド合成酵素（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）が挙げられる。
【００５８】
また、本発明による酵素が作用する基質、すなわち、フェニルピルビン酸、その誘導体、および類縁物質を合成しない宿主においては、不足する基質、基質の誘導体、または基質の類縁物質を添加して培養することにより、あるいは不足する基質、基質の誘導体、または基質の類縁物質をコードする遺伝子で宿主を形質転換することにより、Ｄ−フェニル乳酸およびその誘導体および類縁物質を生産させることが可能である。このような酵素遺伝子としてはコリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子（ＷＯ０１／２３５４２Ａ１）が挙げられる。
【００５９】
コリスミ酸からｐ−アミノフェニルピルビン酸への生合成経路に関与する遺伝子が導入された宿主においては、ｐ−アミノフェニルピルビン酸が合成され、本発明による酵素がｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐ−アミノフェニル乳酸に変換する。その結果、変換されたｐ−アミノフェニル乳酸がＰＦ１０２２物質の原料となり、ベンゼン環のパラ位がアミノ基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体[シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−（４−アミノ−フェニル）ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］が合成される。アミノ基のような官能基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体はより高活性なＰＦ１０２２物質誘導体を製造するための原料として有用である。
【００６０】
形質転換に用いられる組換えベクターとしては、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を本発明による酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターが好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）において機能する制御配列を本発明による酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターである。発現を増強するための強力なプロモーターとしてはＡｂｐ１プロモーター（ＷＯ０１／１８２１９Ａ１）が挙げられる。
【００６１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
実施例１ Ｄ−ＰＬＤＨの単離・精製
１．菌体の調製
ＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対しＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を種培地［１％ イーストエキス、１％ マルトエキス、２％ ポリペプトン、２．５％ グルコース、０．１％ リン酸水素２カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）５０ｍｌの入った適当な容器に接種し、２６℃にて３日間振とう培養し一次種培養とした。この培養液をＷＯ９７／２０９４５号に記載の培地５００ｍｌの入った適当な容器に接種し、２６℃にてロータリーシェーカーを用いて３日間培養し二次種培養とした。この培養液を、同培地５００ｍｌの入った適当な容器に接種し２６℃にてロータリーシェーカーを用いて４日〜６日間培養した。培養終了後の培養液を、市販のナイロン製生地およびヌッチェを用いて吸引ろ過し、同時に脱イオン水にて菌体を洗浄した。得られた菌体ケーキを直ちにマイナス８０℃にて凍結させ、凍結乾燥器にて２晩乾燥させた。このようにして調製した凍結乾燥菌体は、密閉容器に入れてマイナス８０℃で保存可能であった。
【００６３】
２．Ｄ−ＰＬＤＨの抽出・精製
０．１Ｍフェニルピルビン酸 ２μｌ、０．１Ｍ ＮＡＤＰＨ ２μｌ、緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス−塩酸、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）および任意の量の酵素液試料を添加し全容を１００μｌとし、２６℃で２時間反応させた。加熱処理により反応を停止させた後、反応液をＨＰＬＣ（カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ４．６φ×１５０ｍｍ（化学品検査協会）、移動相：０．１Ｍ硫酸ナトリウム：アセトニトリル（３．９：１）アイソクラテック、流速１ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）にて分析し、フェニル乳酸の生成量をもって本酵素の活性とした。また、酵素反応産物の光学活性を分析するために、別にＨＰＬＣ（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６φ×２５ｃｍ（ダイセル化学工業）、移動相：２５ｍＭ硫酸銅水溶液、１ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）を用いた。
以下の操作は全て４℃で実施した。実施例１の１で得られた凍結乾燥菌体約７０ｇをボールミル（ポット外径２１０φｍｍ、ボール直径３５φｍｍ、東京硝子器械）を用いて１晩破砕した。微粉末になった菌体に抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸、１０ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ８）１．５Ｌを添加してよく懸濁させた。菌体懸濁液をマグネティックスターラーを用いて約１時間緩やかに攪拌した。次いで、菌体懸濁液を高速冷却遠心機ＳＣＲ２０Ｂ（ローターＮｏ．ＲＰＲ９、日立工機）８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄約１．２Ｌを回収した。回収した上澄を、担体としてレッドセファロースＣＬ６Ｂ（アマシャムファルマシア社）が充填されているカラム（２６φ×３００ｍｍ）に通した。非吸着画分が完全になくなるまで緩衝液Ａにてカラムを洗浄した後、１Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液Ａにて溶出するタンパク質を分画した。活性画分をまとめ、担体としてスーパーデックス２００（アマシャムファルマシア社）が充填されているカラム（２６φ×９５０ｍｍ）を用いてゲルクロマトグラフィーを実施した。活性画分を、直ちにＭｏｎｏＱ１０／１０（アマシャムファルマシア社）にかけた。緩衝液Ａでカラムを洗浄後、吸着しているタンパク質を０〜０．３Ｍ塩化カリウムグラジエント溶出した。活性画分をまとめ、緩衝液Ａで１０倍に希釈し、ＡＭＰアガロース（アマシャムファルマシア社）が充填しているカラム（１６φ×１００ｍｍ）にかけた。非吸着画分を回収し、直ちにヒドロキシアパタイトが充填されているカラム（５φ×５０ｍｍ）にかけた。非吸着画分を回収し、再びＭｏｎｏＱ１０／１０に吸着させた。タンパク質を０〜０．２Ｍ塩化カリウムグラジエント溶出させた。活性画分にはポリアクリルアミド電気泳動で、ほぼ単一の分子量約３８ｋＤａのタンパク質が含まれていた。
【００６４】
３．Ｄ−ＰＬＤＨの内部部分アミノ酸配列の決定
実施例１の２で得られたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で濃縮・単離し、ＰＶＤＦ膜に電気的に移動させた。ＰＶＤＦ膜上に移動したタンパク質をクマシーブリリアントブルーにて染色し、その存在と位置を確認した。タンパク質の存在する位置のＰＶＤＦ膜を切り抜きプロテインシーケンサーにてＮ末端アミノ酸配列を分析しようと試みたが、有効な解析ができなかった。
実施例１の２で得られたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で濃縮・単離し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。目的とするタンパク質を含むゲルを切り出した。これを小試験管中で脱色液（０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、５０％アセトニトリル、ｐＨ８．０）２００μｌで繰り返し洗浄しクマシーブリリアントブルーをゲルから洗い流したのち、ゲルを減圧下で乾燥させた。半乾燥したゲルに、緩衝液Ｂ（０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）５μｌを添加し、トリプシンをモル基準で１００分の１量となるように添加した。１０分ほど放置して酵素をゲル内に拡散させた後、更に２００μｌの緩衝液Ｂを添加し３７℃で４８時間、該タンパク質を酵素消化した。トリフルオロ酢酸で酵素反応を停止させ、反応液を回収した。ゲルを洗浄液（０．１％トリフルオロ酢酸、６０％アセトニトリル）２００μｌで良く洗浄し、洗浄液は先に回収した反応液に混合した。洗浄を更に２回繰り返しトリプシン消化物を回収した。回収したトリプシン消化物を減圧下で乾燥させた後に、６０μｌの蒸留水を加えこれをトリプシン消化されたペプチド断片試料とした。これをＭｏｄｅｌ１７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（パーキンエルマー アプライドバイオシステム社）を用いてクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８ ０．２１φ×２２０ｍｍ、０．１％トリフルオロ酢酸、５％アセトニトリル〜０．０８５％トリフルオロ酢酸、３５％アセトニトリル グラジエント）を行い分画した。得られたペプチド断片ピークのうちの２つのペプチド断片についてアミノ酸配列を分析し、次のような配列を決定した。
ペプチド断片１：ＡＮＶＡＧＦＶＴＴＳＥＰＫ（配列番号３）
ペプチド断片２：ＡＧＤＷＶＴＫ（配列番号４）
【００６５】
実施例２ Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡの単離
１．ｃＤＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの作製
ＰＦ１０２２物質生産菌（Mycelia sterilia、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対しＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を、種培地［１％ イーストエキス、１％ マルトエキス、２％ ポリペプトン、２．５％ グルコース、０．１％ リン酸水素２カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］（ＷＯ０１／１８１７９Ａ１）１０ｍｌの入った試験管に接種し、２６℃にて３日間振とう培養した。種培養液を、ＷＯ９７／２０９４５号に記載の培地培地５０ｍｌの入った適当な容器に接種し２６℃にてロータリーシェーカーを用いて６日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢および乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）により、添付の操作方法に従い全ＲＮＡを単離した。更に全ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）により、添付の操作方法に従い、ｍＲＮＡを精製した。
こうして得られたｍＲＮＡから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）により、添付の操作方法に従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをファージベクターのＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして作製した組換えファージベクターについて、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社）により、添付の操作方法に従ってインビトロパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーは、６．８×１０5 プラーク形成単位であった。更に、このｃＤＮＡライブラリーをＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩに添付の操作方法に従い増幅した。この増幅したｃＤＮＡライブラリー中の組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。
【００６６】
２．Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子の部分ＤＮＡ断片の単離
実施例１の３にて得られたペプチド断片１および２の配列から、以下の２種類のプライマーを合成した。
プライマー１：５'−ＧＴＩＧＴＩＡＣＲＡＡＩＣＣＮＧＣＮＡＣ−３'（配列番号５）
プライマー２：５'−ＧＣＩＧＧＩＧＡＹＴＧＧＧＴＮＡＣ−３'（配列番号６）
【００６７】
これらのプライマーを用い、ＷＯ０１／１８１７９Ａ１に記載の方法で単離されたＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１００μｌの反応液中、ゲノムＤＮＡ８０ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付の緩衝液およびｄＮＴＰ混合液、更に終濃度０．５μＭとなるように２種類のプライマーをそれぞれ添加し以下の条件で反応を行った。９４℃ ５分間［９４℃ １分間、５８℃ １分間、７２℃ ３０秒間］×４０回、７２℃ ７分間、４℃保存。続いて反応液を２％アガロース電気泳動にて分析したところ、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅したため、これを市販のＳｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片とｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用い、添付の操作方法に従って連結させた。
【００６８】
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い行った。その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、Ｄ−α−ケト酸特異的脱水素酵素と相同性を示し、目的とするＤ−ＰＬＤＨの遺伝子の一部であることが強く示唆された。
【００６９】
３．Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ全域のクローニング
実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片の塩基配列情報をもとに新たに以下の２種類のプライマーを合成した。
プライマー３：５'−ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡ−３'（配列番号７）
プライマー４：５'−ＧＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＡ−３'（配列番号８）
【００７０】
実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー３およびプライマー４を用いたＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用するプローブとした。ＰＣＲは、１００μｌの反応液中、実施例２の２にて得られたＤＮＡ断片が挿入されているｐＴ７Ｂｌｕｅプラスミドベクター５００ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付の緩衝液およびｄＮＴＰ混合液、更に終濃度０．５μＭとなるように２種類のプライマーをそれぞれ添加し以下の条件で反応を行った。９４℃ ５分間［９４℃ １分間、６０℃ １分間、７２℃ ３０秒間］×４０回、７２℃ ７分間、４℃保存。続いて反応液を２％アガロース電気泳動にかけ、約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片を、ＥＣＬ ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシア社）を用い、添付の操作方法に従って標識を付加し、ハイブリダイゼーションに使用する核酸プローブとした。
【００７１】
実施例２の１にて作製したプラークの形成されたプレート上に、ブロッティングメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシア社）を載せ、プラークを写し取った。このメンブレンを真壁の方法（真壁和裕 著、細胞工学別冊目で見る実験ノートシリーズ バイオ実験イラストレイテッド４、１２５−１３３頁、１９９７年 秀潤社）に従って処理しＤＮＡをメンブレンに固定化させた。この時メンブレンの洗浄には５×ＳＳＣを用いた。ＥＣＬ ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシア社）を用い、添付の操作方法に従って標識核酸プローブおよびメンブレンに固定化されているファージＤＮＡをハイブリダイズさせ、続いて標識核酸プローブがハイブリダイズしたプラークを検出した。このようにして、プローブに相同な領域の５'上流および３'下流を含む陽性ファージを選抜した。
【００７２】
陽性ファージを、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社）に添付の操作方法に従って処理し、Ｄ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを調製した。
【００７３】
４．塩基配列の決定
このようにして単離されたＤ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを鋳型とし、プラスミド由来の配列である、プライマー５：５'−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３'（配列番号９）および／またはプライマー６：５'−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３'（配列番号１０）をプライマーとしてシークエンスを行った。シークエンスはＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い実施した。得られた結果から、塩基配列が未知の部分については、塩基配列解読の終了した部分から新たにプライマーを設計して、更なるシークエンスを繰り返した。これにより、プラスミドに挿入されたＤ−ＰＬＤＨのｃＤＮＡ遺伝子１５０９ｂｐの塩基配列を決定した。
【００７４】
この配列を解析したところ、１０１１ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。このＯＲＦから予測されるタンパク質は３３６アミノ酸残基、分子量が３６．５ｋＤａであり、Ｄ−乳酸脱水素酵素等との相同性を示した。最も高い相同性を示したタンパク質はグリセレートデヒドロゲナーゼであり、その相同性は３７％であった。単離した本発明のＤ−ＰＬＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００７５】
実施例３ Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子の大量発現によるＤ−ＰＬＤＨの大量調製
１．遺伝子発現用のＤ−ＰＬＤＨ遺伝子の調製
実施例２の３で調製したプラスミドを鋳型とし、両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入したＤ−ＰＬＤＨ遺伝子を増幅させるために、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、またその直後にストップコドンを、更にその直後にリボゾーム結合部位を付加したプライマー７：５'−ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡ−３'（配列番号１１）、および５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位のみを付加したプライマー８：５'−ＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＣＴＡＴＡＣＴＴＧＧ−３'（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２０μｌの反応液中に８０ｎｇプラスミドＤＮＡを鋳型とし、１ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、添付の緩衝液、ｄＮＴＰミックス、２５ｍＭ塩化マグネシウム、および１００ｐＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃ １分間、［９８℃ １５秒間、６８℃ ３分間］×３０回、７２℃ １０分間。続いて反応液を１％アガロース電気泳動にかけて、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＰＣＲ産物およびｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用い、添付の操作方法に従って連結させた。Ｄ−ＰＬＤＨと連結したプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して増幅し、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
このように増幅したＤ−ＰＬＤＨの遺伝子配列を、実施例２の４にて用いたＤ−ＰＬＤＨ遺伝子由来のプライマーとｐＴ７プラスミドベクターの塩基配列由来のプライマーを用いて確認した。シークエンスはＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、添付の操作方法に従い実施した。
配列確認後、約１２μｇのＤ−ＰＬＤＨ遺伝子を連結したｐＴ７プラスミドベクターを含む２４μｌのＤＮＡ溶液と３μｌのＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡）および３μｌの添付の緩衝液を良く混合し、３７℃で１８時間反応させた。続いて反応液を１％アガロース電気泳動にかけて、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を確認し、これをＳｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いてアガロースゲルから回収し、発現用Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子とした。
【００７６】
２．遺伝子発現用のベクターの構築
市販のｐＵＣ１１９（宝酒造）約２．５μｇを含む溶液を、ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡）および添付の緩衝液と共に３７℃で１８時間反応させた後、フェノール抽出しＤＮＡを回収した。このＤＮＡに、３μｌのアルカリホスファターゼＣ７５（宝酒造）、３μｌの添付の緩衝液、および２４μｌの滅菌水を添加し５０℃で３０分間反応させ、末端のリン酸を除去した。脱リン酸したＤＮＡをフェノール抽出して回収し、３μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に溶解した。
実施例３の１にて調製した発現用Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子５μｌおよび、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９ベクター０．５μｌを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の操作方法に従って連結させて、プラスミドｐＤＰＬＤＨ−１を作製した（第１図）。
【００７７】
３．大腸菌でのＤ−ＰＬＤＨの発現
ｐＤＰＬＤＨ−１を添付の操作方法に従って導入した大腸菌ＤＨ５α（東洋紡）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で１８時間静置培養した後、生育した大腸菌ＤＨ５αを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地２ｍｌに接種し、３７℃で１８時間振とう培養して種培養とした。種培養液の一部を同様の培地２ｍｌの入った試験管10本に接種し３７℃で振とう培養を開始し、５時間後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して、更に２時間培養した。培養終了後、遠心分離で菌体を回収し、実施例１の２に記載の緩衝液Ａにて洗浄した後に、緩衝液Ａ２.５ｍｌに懸濁させた。この菌体懸濁液を、氷冷下超音波細胞破砕機にて処理し、遠心分離にて菌体残渣を除去して得られた上清を、粗酵素液とした。対照には、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子を含まないｐＵＣ１１９にて形質転換された大腸菌ＤＨ５αを用いた。
９６穴マイクロタイタープレートに２５０μＭ ＮＡＤＰＨ、２５０μＭフェニルピルビン酸を含む緩衝液Ａ１５０μｌを分注しておき、そこに粗酵素液５０μｌを添加し、ピペッティング操作により直ちに混合させ、２６℃での３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。測定には吸光度マイクロアッセイリーダーＢｉｏＬｕｍｉｎ９６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を用い、反応開始後から経時的に吸光度の減少を追跡した。この時、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが酸化される酵素量を１ｕｎｉｔとした。この結果を第１表に粗酵素液の酵素活性として示した。
【００７８】
【表１】
このように、ｐＤＰＬＤＨ−１により形質転換された大腸菌ＤＨ５αは、Ｄ−ＰＬＤＨ活性が、ｐＵＣ１１９で形質転換された大腸菌ＤＨ５αと比べ、１３倍に向上した。また、生産物を光学分割カラムにて分析した結果、Ｄ−ＰＬＤＨ遺伝子保持株の産生物質がＤ−フェニル乳酸であることを確認した。本発明による遺伝子がＤ−ＰＬＤＨ遺伝子であることが確認された。
【００８０】
また、得られた粗酵素液を、ＭｏｎｏＱ１０／１０を用い実施例１の２に示した条件に従って粗精製し、部分精製酵素液を調製した。この部分精製粗酵素液を用い９６穴マイクロタイ１タープレート上で、基質であるフェニルピルビン酸の濃度を変化させ、酵素活性を測定した。また、反応基質をフェニルピルビン酸からピルビン酸に代替した時の酵素活性も測定した。フェニルピルビン酸の反応速度を１００とした時の測定結果を第２表に示す。
【００８１】
【表２】
このように、本発明による酵素は公知の乳酸脱水素酵素等（特許第２７５００１７号、Taguchi,H.et al.,J.Biol.Chem.,266,p.12588(1991)）とは、明らかに性質が異なることが示され、アミノ酸配列および酵素学的性質のいずれの点からも新規酵素であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＤＰＬＤＨ−１の作製方法を示した図である。
【配列表】
Claims (11)
- 下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１〜数個の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。 - 請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号１のＤＮＡ配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
- 下記からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつＤ−フェニル脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１〜数十個の改変を有し、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつＤ−フェニル乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。 - 請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
- 請求項５に記載の組換えベクターを含んでなる非ヒト宿主。
- Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素を発現している、請求項６に記載の非ヒト宿主。
- ＰＦ１０２２物質生産菌である、請求項６または７に記載の非ヒト宿主。
- 請求項６〜８のいずれか一項に記載の非ヒト宿主を培養し、培養物からＤ−フェニル乳酸脱水素酵素を採取する工程を含んでなる、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素の製造法。
- フェニルピルビン酸、ｐ−アミノフェニルピルビン酸、ｐ−ニトロフェニルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、または２−オキソ−４−フェニル酪酸を、請求項１に記載のタンパク質、または請求項６〜８に記載の非ヒト宿主、その抽出物、その培養物、もしくはその培養物から精製された酵素と反応させ、次いでＤ−フェニル乳酸、ｐ−アミノフェニル乳酸、ｐ−ニトロフェニル乳酸、ｐ−ヒドロキシフェニル乳酸、または（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を採取する工程を含んでなる、Ｄ−フェニル乳酸、ｐ−アミノフェニル乳酸、ｐ−ニトロフェニル乳酸、ｐ−ヒドロキシフェニル乳酸、または（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造法。
- 請求項８に記載の非ヒト宿主を培養し、培養物からＰＦ１０２２物質またはベンゼン環のパラ位がアミノ基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体を採取する工程を含んでなる、ＰＦ１０２２物質またはベンゼン環のパラ位がアミノ基により修飾されたＰＦ１０２２物質誘導体の製造法。
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