JP2002065271A - 新規コレステロールオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 熱安定性を有し、低濃度のコレステロールの
存在下で反応速度が最大となり、有機溶媒に溶解したコ
レステロール類の変換を高効率で実施できるという特徴
を有するコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝
子を提供する。 【解決手段】 上記特性を有するコレステロールオキシ
ダーゼのＮ末端アミノ酸配列を基に、バークホルデリア
属に属する菌株より該酵素をコードする遺伝子を単離し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規コレステロー
ルオキシダーゼ遺伝子に関し、さらに詳細にはコレステ
ロールオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ
配列を含有する組換えベクター、該組換えベクターによ
り形質転換された微生物、並びに該微生物によるコレス
テロールオキシダーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールオキシダーゼは、３β−
ヒドロキシステロイドと酸素の間の反応を触媒し、相当
する３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する酸化
酵素である。現在までに、体液中のコレステロール濃度
の測定（特開平６−１６９７６５号等）、コレステロー
ル誘導体の製造（特開平６−１１３８８３号等）、殺虫
剤（米国特許５，５５８，８６２号等）、洗剤（ＷＯ８
９／０９８１３号等）等に利用することを目的として研
究開発されている。

【０００３】該酵素はストレプトマイセス（特開昭６２
−２８５７８９号）、ブレビバクテリウム（特開平４−
２１８３６７号）、ロドコッカス（特表平３−５０３４
７８号）、シュードモナス（特表平６−１８９７５４
号）等多種の微生物により生産されることが知られてい
る。

【０００４】求められる酵素特性は用途により異なる
が、例えば体液中のコレステロール濃度測定のためには
熱安定性が重要であり、そのため新規酵素の探索（特開
平６−１６９７６５号等）や、タンパク質工学的手法を
利用して改変（特開平８−２４２８６０号）する試みが
なされている。また、コレステロール誘導体の製造には
有機溶媒耐性が、洗剤用途としては界面活性剤耐性が求
められている。

【０００５】以上のような個々の目的にあわせた特性に
加え、体液や食品中のコレステロール濃度測定をはじめ
とする多くの用途において、低基質（コレステロール）
濃度でコレステロール酸化反応が速いことが望ましい。
近年、ＷＯ９９／４５１０６号に記載された如く、低基
質（コレステロール）濃度で該基質の酸化反応が早い、
すなわち、最大反応速度（Ｖ_ｍａｘ：μｍｏｌｅ・ｍｉ
ｎ^-１・ｍｇ^-１）とミハエリス定数（Ｋ_ｍ：μＭ）の比
Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍが大きく、幅広いｐＨで作用し、熱に耐
性であり、さらに有機溶媒で強く活性化される新規コレ
ステロールオキシダーゼが発見された。しかし、上記特
性を有するコレステロールオキシダーゼをコードする遺
伝子の単離が、未だなされていないのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】該酵素の更なる生産性
を高めること、さらには酵素の特性を改変することを目
的として遺伝子操作技術が常用されることが望ましい。
そのため、上記特性を有する遺伝子の単離・配列の特定
が強く望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは鋭意研究した結果、バークホルデリア
セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
ａ）菌株ＳＴ−２００｛旧分類ではPseudomonas sp. 菌
株ＳＴ−２００であり、１９９８年２月４日付けで通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）
（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され
た。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６１である。｝
よりコレステロールオキシダーゼ遺伝子の単離及びその
配列を決定することで、本発明を完成した。

【０００８】該コレステロールオキシダーゼの特性はＷ
Ｏ９９／４５１０６号に記載されているが、下記の如く
である。該コレステロールオキシダーゼは、コレステロ
ールに対し、０．３％トライトンＸ−１００存在下での
最大反応速度（Ｖ_ｍａｘ：μｍｏｌｅ・ｍｉｎ^-１・ｍ
ｇ^-１）及びミハエリス定数（Ｋ_ｍ：μＭ）の比Ｖ_ｍａ
ｘ／Ｋ_ｍが０．２３、０．０３％トライトンＸ−１００
存在下でのＶ_ｍａｘ／Ｋ _ｍが３．２である。すなわち、
該コレステロールオキシダーゼは、低濃度のコレステロ
ールの存在下で反応速度が最大となるため、低濃度での
コレステロールの測定や誘導体の製造に特に有効であ
る。

【０００９】該コレステロールオキシダーゼは至適ｐＨ
を５．０〜８．５の間に有しｐＨ４〜１１の間で安定で
あり、至適温度が６０℃付近で、５５℃以下で安定であ
る。すなわち、現在までに知られている天然型のコレス
テロールオキシダーゼ以上の熱安定性がある。

【００１０】該コレステロールオキシダーゼは、ｌｏｇ
Ｐ_ｏｗが２．１以上、４．５以下の有機溶媒、例えばベ
ンゼン（２．１；ｌｏｇＰ_ｏｗ値を表す。以下同様）、
トルエン（２．６）、パラキシレン（３．１）、プロピ
ルベンゼン（３．７）、ジフェニルメタン（４．２）、
シクロオクタン（４．５）等に溶解したコレステロール
類の該酵素による変換を高効率で実施できる。

【００１１】ここで言うｌｏｇ Ｐ_ｏｗ値とは、水とｎ
−オクタノールとの二相間における任意の物質の分配係
数Ｐ_ｏｗ値の常用対数であり、物質の極性を表す。任意
の物質において、Ｐ_ｏｗ値は、（ｎ−オクタノール相に
おける濃度）／（水相における濃度）として算出される
ものである。従って、ｌｏｇ Ｐ_ｏｗ値が低い物質は極
性が高いことを示している。本発明で定義するｌｏｇ
Ｐ_ｏｗの数値は、各種有機溶媒の構造から算出されたも
のを使用する。算出の方法は、例えばＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ（Ｌｅｏ，Ａ．Ｊ．，Ｃａｌｃｕｌａｔ
ｉｎｇ ｌｏｇＰｏｃｔ ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ．９３；１２８１−１３０６．）に記載の方法やｌｏ
ｇ Ｐ_ｏｗ計算プログラムＣｌｏｇＰ（Ｂｉｏ−Ｂｙｔ
ｅ ｃｏｒｐ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）等を使用する
ことができる。

【００１２】コレステロールオキシダーゼの調製 本発明のコレステロールオキシダーゼ遺伝子によりコー
ドされるタンパク質の起原は、バークホルデリア属より
得ることができ、好ましくはバークホルデリアセパシア
菌株ＳＴ−２００より得ることができる。バークホルデ
リア セパシア菌株ＳＴ−２００の培養方法に特に制限
はなく、液体培養、固形培養とも利用できる。培地とし
ては適当な炭素源、窒素源を含み必要に応じてリン酸塩
及び／又は無機イオン等を適量含有する培地を使用す
る。培養時は撹拌や通気の条件を適当に調整することが
好ましい。さらに、バークホルデリア セパシア菌株Ｓ
Ｔ−２００はシクロヘキサンに耐性を有しているため、
培養時にシクロヘキサンを重層することによって、他の
微生物による汚染を防止することもできる。

【００１３】該酵素は、培養上清から粗酵素のまま用い
ることもでき、また各種精製工程で得られた精製酵素と
して使用しても良い。さらには各種精製手段を経て単離
精製された酵素として用いてもよい。酵素の精製は、慣
用されている分離、精製法を適宜組み合わせて実施する
ことができる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利
用する方法、塩沈殿及び溶媒沈殿のような溶解性の差を
利用する方法、透析、限外濾過、ゲルろ過のような分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
のような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、
疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのよ
うな疎水性の差を利用する方法、等電点電位泳動のよう
な等電点の差を利用する方法等が挙げられる。

【００１４】コレステロールオキシダーゼのアミノ酸配
列 コレステロールオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列は、
例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて本酵
素を泳動し、得られた酵素のバンドを電気的にポリビニ
リデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜等に転写させた後
に、プロテインシークエンサーにて分析することで知る
ことができる。また、コレステロールオキシダーゼの全
アミノ酸配列は、例えば、コレステロールオキシダーゼ
から化学的あるいは酵素的に調製したペプチド断片のア
ミノ酸配列を決定すること、あるいは該ＤＮＡの塩基配
列を解析することで知ることができる。

【００１５】コレステロールオキシダーゼ遺伝子 本発明によるＤＮＡは、天然由来のものであっても、化
学合成したものであってもよい。また、天然由来のもの
の一部を利用して合成を行ったものであってもよい。Ｄ
ＮＡの典型的な取得方法としては、バークホルデリア属
由来の染色体ライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーか
ら遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分
アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプ
ローブを用いてスクリーニングを行う方法等が挙げられ
る。また、前記した寄託菌より得ることも可能である。

【００１６】本発明によるコレステロールオキシダーゼ
をコードする遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸
配列又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含んでな
るものである。一般に、蛋白質のアミノ酸配列が与えら
れれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン
表を参照して容易に定まる。よって、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選
択することが可能である。

【００１７】従って、本発明において「配列番号２に示
されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列」とは、配
列番号１に示される塩基配列を有するもの、及び同一の
アミノ酸配列であって縮重関係にあるコドンを塩基配列
として有する配列も意味するものである。

【００１８】本発明の好ましい態様によれば、本発明に
よる遺伝子の好ましい具体例として、配列番号１に示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断
片が提供される。

【００１９】さらに、本発明による遺伝子がコードする
酵素には、配列番号１に示されるアミノ酸配列の誘導体
も包含するものである。前記アミノ酸配列の誘導体とし
ては、例えば１若しくは数個のアミノ酸の付加、挿入、
削除、欠失又は置換等の改変が生じた配列番号２に記載
されるアミノ酸配列を有するものであって、依然として
コレステロールオキシダーゼ活性を保持するものが挙げ
られる。

【００２０】コレステロールオキシダーゼをコードする
遺伝子の発現 また、本発明は、遺伝子組換え操作によって、本発明の
遺伝子によってコードされるタンパク質を微生物中で発
現させることを目的とする。すなわち、本発明のＤＮＡ
によりコードされるコレステロールオキシダーゼは、そ
れをコードするＤＮＡ断片によって形質転換された宿主
細胞において製造することができる。より具体的には、
本発明によるコレステロールオキシダーゼをコードする
ＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が
発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、組換えベクターの形
態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その
形質転換体を培養する。

【００２１】従って、本発明は、コレステロールオキシ
ダーゼをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ分子、特に組
換えベクターが提供される。このＤＮＡ分子は、ベクタ
ー分子に本発明によるコレステロールオキシダーゼをコ
ードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることが
できる。

【００２２】本発明において組換えに利用されるベクタ
ーは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイル
ス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択する
事ができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファ
ージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＥＴ
系のプラスミド、枯草菌の場合にはｐＵＢ系のプラスミ
ド、酵母の場合にはＴＥｐ、ＹＣｐ系のベクターが挙げ
られる。本発明の好ましい態様によれば、このベクター
はプラスミドである。

【００２３】このプラスミドは形質転換体の選択マーカ
ーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性
マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することが出
来る。その好ましい具体例としては、使用する宿主細胞
が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン
耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等であり、酵
母の場合にはトリプトファン合成遺伝子（ｔｒｐ１）、
ウラシル合成遺伝子（ｕｒａ３）、ロイシン合成遺伝子
（ｌｅｕ２）等があり、カビの場合はハイグロマイシン
耐性遺伝子（ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａ
ｒ）、硝酸還元遺伝子（ｎｉａｄ）等が挙げられる。

【００２４】さらに、本発明による組換えベクターとし
てのＤＮＡ分子は、コレステロールオキシダーゼ遺伝子
の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、翻訳開始コドン、翻訳停止コドン等の
転写調節領域、翻訳調節領域等を有しているのが好まし
い。

【００２５】プロモーターとしては、挿入断片に含まれ
る宿主内において機能することができるプロモーターは
もちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン
（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）等のプ
ロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝
子（ａｄｈ）、酸性ホスファターゼ遺伝子（ｐｈｏ）、
ガラクトース遺伝子（ｇａｌ）、グリセルアルデヒド三
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）等のプロモー
ター、カビではα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）、セロ
ビオハイドロラーゼＩ遺伝子（ｃｂｈＩ）等のプロモー
ターが好ましく用いることができるものとして挙げられ
る。

【００２６】また、宿主細胞が枯草菌、酵母、カビの場
合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に組換えコ
レステロールオキシダーゼを分泌させることも可能であ
る。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されて
いるものであれば何れも使用可能である。

【００２７】前記した形質転換体の生産する組換えコレ
ステロールオキシダーゼは、次のようにして得ることが
できる。まず前記宿主細胞を適当な条件下で培養し、得
られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により菌
体を得る。菌体の場合にはこれを適当な緩衝液中に懸濁
し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕
し、遠心分離又は濾過により組換えコレステロールオキ
シダーゼを含有する菌体抽出物を得る。

【００２８】コレステロールオキシダーゼの利用 本発明で得られるコレステロールオキシダーゼ遺伝子を
用い、低基質（コレステロール）濃度でも高い活性を示
し、幅広いｐＨで作用しさらに熱安定性に優れているコ
レステロールオキシダーゼを安価に提供できる。該コレ
ステロールオキシダーゼは体液や食品中でのコレステロ
ールの測定に特に適するものである。また、有機溶媒重
層下において強く活性化されることから、コレステロー
ル類の酵素変換を効率的に行える特徴を有している。そ
の他、本酵素を経口的に摂取させることにより殺虫剤と
しても使用でき、コレステロール類で汚染した衣類等の
洗剤として使用することもできる。さらには、本発明で
得られるコレステロールオキシダーゼを用い、タンパク
質工学等の手法によりさらに望ましい特性とすることが
できる。

【００２９】

【実施例】以下に、実施例により本発明を詳述するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３０】実施例１ コレステロールオキシダーゼの
取得 バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００を１２ｌ
のＬＢ培地にて、培養温度３０℃、撹拌速度１１０ｒｐ
ｍ、通気速度８ｌ／ｍｉｎの条件で２０時間液体培養し
た。培養液を遠心分離することによって菌体を除去し
た。続いて培養上清から硫安沈澱法によりタンパク質を
回収し、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィ
ー、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌセルロースカラム
クロマトグラフィー、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カ
ラムクロマトグラフィーによってコレステロールオキシ
ダーゼを精製した。回収率は２０％であった。

【００３１】実施例２ コレステロールオキシダーゼの
分解ペプチドの取得 得られた精製コレステロールオキシダーゼ０．１ｍｇを
７０％蟻酸１ｍｌに溶解した。ここにブロムシアン１ｍ
ｇを添加して、混合後室温で２４時間静置した。その後
スピードバックを用いた真空乾燥法にてブロムシアンと
蟻酸を除去し、さらに８０％アセトンで洗浄しコレステ
ロールオキシダーゼ分解ペプチドを得た。

【００３２】実施例３ Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例２により得られたコレステロールオキシダーゼ分
解ペプチド３０μｇを０．１％ＳＤＳ−１２．５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に供した。その後ＰＶＤＦ
膜に転写後、膜をクーマシーブリリアントブルーにより
染色し、ＰＶＤＦ膜より分子量約６０，０００のペプチ
ド（未分解）及び分子量約１４，０００のペプチドに相
当する領域をはさみで切り取り、Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ヒュー
レットパッカード社製）にてＮ末端アミノ酸配列を決定
した。

【００３３】分子量約６０，０００のペプチドのＮ末端
のアミノ酸配列はＡＤＡＰＰＰＧＦＰＡＤＩＰＬＹＫ
（配列番号３）であり、分子量約１４，０００のペプチ
ドのＮ末端のアミノ酸配列はＧＰＶＥＩＲＩＴＧＬ（配
列番号４）であった。前者はコレステロールオキシダー
ゼ酵素のＮ末端アミノ酸配列とも一致した。

【００３４】実施例４ バークホルデリア セパシア菌
株ＳＴ−２００の染色体ＤＮＡの調製 バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００を１００
ｍｌのＬＢ培地にて３０℃、１６０ｒｐｍの条件で２４
時間振とう培養した。培養液を遠心分離（６，０００ｘ
ｇ、４℃、１０ｍｉｎ）して菌体を得た。菌体をＳａｉ
ｔｏ−Ｍｉｕｒａ法によって処理し染色体ＤＮＡを得
た。

【００３５】実施例５ コレステロールオキシダーゼ遺
伝子のクローニングにプローブとして用いるＤＮＡ断片
のＰＣＲ法による増幅 実施例３で決定したアミノ酸配列をもとに、プライマー
として合成ＤＮＡを作成した。順方向は５'−ＧＣＩＧ
ＡＹＧＣＩＣＣＩＣＣＩＣＣＩＧＧＩＴＴ−３'（配列
番号５）、逆方向は５'−ＡＲＩＣＣＩＧＴＩＡＴＩＣ
ＫＩＡＴＹＴＣＩＡＣＩＧＧ−３'（配列番号６）とし
た。ここで、Ｉはイノシン、ＹはＣ又はＴ、ＲはＡ又は
Ｇ、ＫはＧ又はＴである。ＰＣＲ反応は、０．２ｍＭｄ
ＮＴＰ混合物、０．５μＭ各プライマー、０．１μｇ／
１００μｌ鋳型ＤＮＡ、２．５Ｕ／１００μｌ Ｅｘ
Ｔａｑ酵素（宝酒造社製）からなる組成の反応液を用い
てＰＣＲ反応を実施した。実施例４で調製したＳＴ−２
００の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣ
Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー社製）
を用いて、（熱変性を９６℃で１分、アニーリングを４
５℃で１分、伸長反応を７２℃で１．５分）のサイクル
を２５サイクル繰り返すことにより、コレステロールオ
キシダーゼ遺伝子断片を増幅した。

【００３６】ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片
は、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、約１．２
ｋｂであった。本ＤＮＡ断片を核酸精製試薬プレップ−
Ａ−ジーン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により回収した。ＤＮＡ
ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末
端を平滑化し、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍａ
Ｉ部位に本ＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＣｏｘ１
を構築した。本プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換
した。本大腸菌をＬＢ培地で３７℃、１６０ｒｐｍの条
件で２４時間振とう培養した。大腸菌を遠心分離（６，
０００ｘｇ，４℃，１０ｍｉｎ）により回収し、アルカ
リＳＤＳ法によってプラスミドｐＣｏｘ１を回収した。
得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断
し、アガロース電気泳動により約０．９ｋｂの断片を回
収した。回収したＤＮＡ断片に対してＤＩＧ ＤＮＡ
Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー社製）を用い
てジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｎｉｎ）標識し、実施
例６に示す実験でプローブとして用いた。

【００３７】実施例６ Ｓ−２００株染色体上のコレス
テロールオキシダーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図の作製 実施例４で得られたバークホルデリア セパシア菌株Ｓ
Ｔ−２００の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｋｐ
ｎＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、Ｘｈ
ｏＩで切断した後、０．７％アガロースゲル電気泳動に
供した。泳動後のＤＮＡ断片をニトロセルロース膜に転
写した。転写したニトロセルロース膜に、実施例５で得
られたジゴキシゲニン標識プローブを結合させた。

【００３８】続いて、アルカリホスファターゼ標識抗ジ
ゴキシゲニン抗体を結合させた。５−ｂｒｏｍｏ−４−
ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ
とｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍとを基質
としてホスファターゼ反応をおこなうことによって、実
施例５で作製したコレステロールオキシダーゼ遺伝子内
部配列と相補的なＤＮＡを検出した。その結果を基にし
て、該コレステロールオキシダーゼ遺伝子周辺のＳＴ−
２００株染色体の制限酵素地図を作製した（第１図）。

【００３９】実施例７ コレステロールオキシダーゼ遺
伝子のクローニング 実施例６で作製した制限酵素地図をもとにして、実施例
４で調製したバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２
００の染色体ＤＮＡをＳａｃＩ及びＸｈｏＩにより切断
した。アガロースゲル電気泳動により、約４ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収した。本ＤＮＡ断片をベクターｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＳａｃＩ及びＸｈｏＩ部位
に、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて挿入
した。本プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに常法に従い導入
し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）耐性を指標として
形質転換体を選択した。得られた形質転換体を、アンピ
シリンとコレステロールを含むＬＢ培地に接種した。３
７℃で培養し、コロニーの周囲にコレステロール酸化に
伴うハローを観察した。ハローを生じる形質転換体をＬ
Ｂ培地にて３０℃、１６０ｒｐｍの条件で２４時間振と
う培養した。回収した菌体から、アルカリ−ＳＤＳ法に
てプラスミドｐＣｏｘ４を回収した。第２図に、ｐＣｏ
ｘ４の制限酵素地図を示す。

【００４０】尚、プラスミドｐＣｏｘ４で形質転換され
た大腸菌ＤＨ５α、すなわちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＣｏｘ４）は、２０００年８月
２８日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８
００２である。

【００４１】実施例８ 塩基配列の決定及びアミノ酸配
列の決定 実施例７で得られたプラスミドｐＣｏｘ４を制限酵素Ｓ
ａｃＩ及びＸｈｏＩにより切断し、アガロースゲル電気
泳動した。プラスミドｐＣｏｘ４に挿入されていた外来
ＤＮＡは、制限酵素地図をもとにして予期されたように
約４．３ｋｂであった。本ＤＮＡの塩基配列をｄｙｅ−
ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法によって解析し、配列番号１に
示すような塩基配列を決定した。

【００４２】この配列を解析したところ１７４９ｂｐか
らなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中の構
造遺伝子が存在することが明らかとなった。また、最も
高い相同性を示したのはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍのＥ０３８５０との４５．２％
／４７３ＡＡでしかなかった。従って、公知のコレステ
ロールオキシダーゼ遺伝子と本発明のコレステロ−ルオ
キシダーゼ遺伝子とは相同性が極めて低く、該コレステ
ロ−ルオキシダーゼ遺伝子は新規の遺伝子である。

【００４３】実施例９ コレステロールオキシダーゼ組
換えプラスミドの作製 ｐＣｏｘ４を鋳型とし、コレステロールオキシダーゼを
コードする領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応
に用いるプライマーとしては、センスプライマーにはＮ
ｃｏＩ部位とＭｅｔがコレステロールオキシダーゼのＮ
−末端となるようにプライマーを（配列番号７：５'−
ＡＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣ−３'）、
アンチセンスプライマーには、ＸｈｏＩ部位を導入した
プライマー（配列番号８：５'−ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧ
ＣＧＴＴＡＣＧＧ−３'）を設計し用いた。ＰＣＲ反応
は、０．２ｍＭｄＮＴＰ混合物、０．５μＭ各プライマ
ー、０．１μｇ／１００μｌ鋳型ＤＮＡ、２．５Ｕ／１
００μｌ Ｅｘ Ｔａｑ酵素（宝酒造社製）からなる組
成の反応液を用いて行った。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲＳ
ｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー社製）を用い
て、（熱変性を９６℃で１分、アニーリングを４５℃で
１分、伸長反応を７２℃で１．５分）のサイクルを３０
サイクル繰り返すことにより、コレステロールオキシダ
ーゼ遺伝子断片を増幅した。調製したＰＣＲ産物を、ｐ
ＥＴ２１−ｄのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入すること
によってｐＥＴＣＯＸを作製した。

【００４４】実施例１０ 大腸菌でのコレステロールオ
キシダーゼの発現 ５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢＧ液
体培地を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（ｐＣｏｘ４）、又は常法に従いｐＥＴＣＯＸ
を大腸菌ＢＬ２１に導入して得られた形質転換体｛大腸
菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣＯＸ）｝を３０℃で２０時間培養
した。この培養液１ｍｌを回収し、氷上で菌体を超音波
破砕（２０ｋＨｚ、１分間）した。破砕した菌液を用い
て、Ａｌｌａｉｎ氏らの方法により、コレステロールオ
キシダーゼ活性を測定した。

【００４５】Ａｌｌａｉｎ氏らの方法は、コレステロー
ルオキシダーゼによりコレステロールが酸化される際に
生じる過酸化水素を、ペルオキシダーゼにより、４−ア
ミノアンチピリン及びフェノールと反応させ、生じた赤
色のキノンイミンを定量（５００ｎｍ）する方法であ
る。 試薬の組成 塩化カリウムリン酸緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ７．０） コール酸ナトリウム ６４ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．３４％ ４−アミノアンチピリン １．４ｍＭ フェノール ２１ｍＭ コレステロール ０．８９ｍＭ セイヨウワサビペルオキシダーゼ ５ユニット 上記の試薬１ｍｌ中に、５０μｌの上記で調製した菌液
を加え、３０℃で３分間、５００ｎｍの吸光度を測定
し、この初期速度からコレステロールオキシダーゼ活性
を算出した。上記の反応条件において１分間にコレステ
ロール１μｍｏｌを酸化するのに必要な酵素量を１ユニ
ット（Ｕ）と定義した。

【００４６】その結果、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５α（ｐＣｏｘ４）、大腸菌ＢＬ２１（ｐＥ
ＴＣＯＸ）ではコレステロールオキシダーゼ活性として
０．１０８Ｕ／ｍｌ、０．４０２Ｕ／ｍｌを示した。一
方、対照としてバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−
２００を同地で培養した場合には０．０１２Ｕ／ｍｌを
示した。従って、本発明の遺伝子にコードされるタンパ
ク質は、コレステロールオキシダーゼであることが分か
った。

【００４７】

【発明の効果】本発明は、本発明のコレステロールオキ
シダーゼ遺伝子を用い、低基質（コレステロール）濃度
でも高い活性を示し、幅広いｐＨで作用しさらに熱安定
性に優れているコレステロールオキシダーゼを安価に提
供することができる。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. <120> New cholesteroloxidase gene <130> PF593 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1749 <212> DNA <213> Burkholderia cepacia <220> <221> CDS <222> (1)..(1749) <220> <221> mat#peptide <222> (130)..(1476) <400> 1 atg agt caa gac ttc cga gac gaa cca gcg tcg cgc cgc gct ttc ctc 48 Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu -40 -35 -30 gcc gac atg gcg aag ctc gcg gcc gca ggc gtc gtc acc ggc tgg acg 96 Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr -25 -20 -15 ccg ctc tac cag att gcg gcc aat gcg cga acc gcc gac gcg ccg ccg 144 Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro -10 -5 -1 1 5 ccc ggc ttc ccg gcc gac atc ccg ctt tac aag cag gcg ttc cag aac 192 Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn 10 15 20 tgg agc ggt gaa atc gcc gtg cag gac gta tgg acc gcc gcg ccg cgc 240 Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg 25 30 35 tcg gcc gac gat gtc gtc gcg gcg gtc aac tgg gcg cgc gcg aac ggc 288 Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly 40 45 50 tac cgg atc cgc ccg cgc ggc tac atg cac aac tgg tcg ccg ctc acg 336 Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr 55 60 65 ctg gat ccg ggc gcc ggc gcc gcg aac gtg gtg ctg ctc gat acg acg 384 Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr 70 75 80 85 aaa tcg ctg acg gcc gtc tcg gtc gac acg tcg gca cgt ccg gcg cgc 432 Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg 90 95 100 gtc acc gcc caa acg ggc atc tcg ctg gag tcg ttg ctc gcg acg ctc 480 Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu 105 110 115 gaa cag tat ggc ctc ggc gtg att gcc gcg cct gcg ccg ggc gac atc 528 Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asp Ile 120 125 130 acg ctc ggc ggt gcg ctc gcg atc gat gcg cac ggc act gcc gtg ccg 576 Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro 135 140 145 gcg gtc ggt gaa acc ttg caa ccg gga cac acc tac ggc tcg ctg agc 624 Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser 150 155 160 165 aac ctc gtg gtc gcg ctc acc gcg gtc gtg tac gat ccg gcc cgg cag 672 Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln 170 175 180 caa tac gtg ctg cgc cgg ttc gaa cgc agc gat ccc gag atc ggc gcg 720 Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser Asp Pro Glu Ile Gly Ala 185 190 195 ttc ctc gcg cac atc ggg cgg gcg ttc gtc gtc gaa gtc acg ctg acg 768 Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val Val Glu Val Thr Leu Thr 200 205 210 gca ggc ccc aac cag cgc ctg cgc tgc cag agc tac gtc gac att ccg 816 Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro 215 220 225 gcc tcc gaa ctg ttt gcg ccg gcc ggc acg tcg ggc cgc acg atc acg 864 Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr Ser Gly Arg Thr Ile Thr 230 235 240 245 tcg ttt ctc gat cgc gcg ggc cgg gtg gaa gcc atc tgg ttt ccg ttt 912 Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe 250 255 260 acg tcc agc ccg tgg ctc aag gtc tgg acg ccc acg ccc agc aag ccg 960 Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro 265 270 275 ttc ctg tcg cgc gcc gtc acg cag ccg tac aac tat ccg ttc tcc gat 1008 Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp 280 285 290 tcg atc tcg cag tcc atc tcg gat ctc gtc aag cgg atc gtg atc ggc 1056 Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly 295 300 305 ggc gaa ggc gca ttg acg ccg ctg ttc ggc cag acg caa ttg gcc atc 1104 Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile 310 315 320 325 acg gcc gcc ggt ctc gcg ctc acg ctc agc ggg gat atc tgg ggc tgg 1152 Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Ile Trp Gly Trp 330 335 340 tcg cgc acc gtg ctg cag tac att cga ccg acg acg ctg cgc gtg acc 1200 Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro Thr Thr Leu Arg Val Thr 345 350 355 gcg aac ggc tat gcg gta ctg gcg cgg cgc gcc gac gtg cag cgc gtg 1248 Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg Ala Asp Val Gln Arg Val 360 365 370 atc agc gag ttc gtg cag ttc tat cag aac cgc gtc gac acg tac aag 1296 Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn Arg Val Asp Thr Tyr Lys 375 380 385 gcg cgc ggc gag tat ccg atg aac ggt ccc gtc gag atc cgc atc acc 1344 Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro Val Glu Ile Arg Ile Thr 390 395 400 405 ggt ctc gac aag ccg gcc gat gcc ggc gcc ggc gcg gcc gtg ccc agc 1392 Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ala Gly Ala Ala Val Pro Ser 410 415 420 ctg tcc gca ctc aag ccg cgc ccc gac cgg ccg gag tgg gac gtg gcc 1440 Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg Pro Glu Trp Asp Val Ala 425 430 435 gtg tgg ttc gat att ctg acg tta ccg ggc acg ccg tcc gcc gat cgc 1488 Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ser Ala Asp Arg 440 445 450 ttc tat cgc gag atc gag caa tgg atg ctc gcg aac tac acc ggt tcg 1536 Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu Ala Asn Tyr Thr Gly Ser 455 460 465 tat gcg acg ctg cgc ccc gaa tgg tcg aag ggt tgg ggc tat acc gat 1584 Tyr Ala Thr Leu Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly Trp Gly Tyr Thr Asp 470 475 480 485 acg gct gcc tgg caa gac gac acg atg ctc acc acc acg att ccg aac 1632 Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu Thr Thr Thr Ile Pro Asn 490 495 500 ctg caa cgt gaa ggg cag ccg gcg tcg agc acg tgg gat acg gcg cgc 1680 Leu Gln Arg Glu Gly Gln Pro Ala Ser Ser Thr Trp Asp Thr Ala Arg 505 510 515 gcg acg ctc gaa cgc tac gac ccg cac cgg atc ttc cgc tcg ccg ctg 1728 Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg Ile Phe Arg Ser Pro Leu 520 525 530 ctg gat cgg ttg atg ccg taa 1749 Leu Asp Arg Leu Met Pro 535 540 <210> 2 <211> 582 <212> PRT <213> Burkholderia cepacia <400> 2 Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu 1 5 10 15 Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr 20 25 30 Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro 35 40 45 Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn 50 55 60 Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg 65 70 75 80 Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly 85 90 95 Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr 100 105 110 Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr 115 120 125 Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg 130 135 140 Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asp Ile 165 170 175 Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro 180 185 190 Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln 210 215 220 Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser Asp Pro Glu Ile Gly Ala 225 230 235 240 Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val Val Glu Val Thr Leu Thr 245 250 255 Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro 260 265 270 Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr Ser Gly Arg Thr Ile Thr 275 280 285 Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe 290 295 300 Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro 305 310 315 320 Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp 325 330 335 Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly 340 345 350 Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile 355 360 365 Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Ile Trp Gly Trp 370 375 380 Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro Thr Thr Leu Arg Val Thr 385 390 395 400 Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg Ala Asp Val Gln Arg Val 405 410 415 Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn Arg Val Asp Thr Tyr Lys 420 425 430 Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro Val Glu Ile Arg Ile Thr 435 440 445 Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ala Gly Ala Ala Val Pro Ser 450 455 460 Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg Pro Glu Trp Asp Val Ala 465 470 475 480 Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ser Ala Asp Arg 485 490 495 Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu Ala Asn Tyr Thr Gly Ser 500 505 510 Tyr Ala Thr Leu Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly Trp Gly Tyr Thr Asp 515 520 525 Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu Thr Thr Thr Ile Pro Asn 530 535 540 Leu Gln Arg Glu Gly Gln Pro Ala Ser Ser Thr Trp Asp Thr Ala Arg 545 550 555 560 Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg Ile Phe Arg Ser Pro Leu 565 570 575 Leu Asp Arg Leu Met Pro 580 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Burkholderia cepacia <400> 3 Ala Asp Ala Pro Pro Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Burkholderia cepacia <400> 4 Gly Pro Val Glu Ile Arg Ile Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA, a PCR primer for the cholesteroloxidase gene <400> 5 gcngaygcnc cnccnccngg ntt 23 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA, a PCR primer for the cholesteroloxidase gene <400> 6 arnccngtna tncknatytc nacngg 26 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA, a PCR primer for the cholesteroloxidase gene <400> 7 aatgcgccca tggccgacgc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA, a PCR primer for the cholesteroloxidase gene <400> 8 gcgcctcgag cgttacgg 18

【００４９】

【図面の簡単な説明】

【図１】コレステロールオキシダーゼ遺伝子（ｃｈｏ
Ｓ）周辺のＳＴ−２００株染色体の制限酵素地図。図の
白色ｂａｒは、実施例５で調製したプローブに対応する
ＤＮＡを、黒色のｂａｒはＳＴ−２００株の染色体ＤＮ
Ａを示す。

【図２】組換えプラスミドｐＣｏｘ４の制限酵素地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） //(Ｃ１２Ｎ 9/04 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその
   誘導体を含んでなるポリペプチドをコードする、ＤＮＡ
   配列。
2. 【請求項２】ＤＮＡ配列が配列番号１に記載される塩基
   配列を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ配列
   を含んでなる、組換えベクター。
4. 【請求項４】請求項３に記載の組換えベクターで形質転
   換されてなる、宿主細胞。
5. 【請求項５】請求項４に記載の宿主細胞を培養し、その
   宿主及び／又はその培養物からコレステロールオキシダ
   ーゼを採取する工程を含んでなる、これらの製造法。