CN1891820B - 在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶 - Google Patents

在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶 Download PDF

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Abstract

在表面活性剂存在下具有稳定性的新的胆固醇氧化酶与编码该新胆固醇氧化酶的基因。

Description

在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶
技术领域
本发明涉及表面活性剂存在下具有稳定性的一种新的胆固醇氧化酶以及编码这种新的胆固醇氧化酶的基因。
背景技术
胆固醇氧化酶是一种催化3β-羟类固醇与氧之间的反应从而形成相应的3-氧类固醇与过氧化氢的氧化酶。到目前为止它的研究与开发目的是将其应用于测定体液的胆固醇浓度(例如，JP-A-6-169765)、生产胆固醇衍生物(例如，JP-A-6-113883)、杀虫剂(例如，美国专利5,558,862)、去污剂(例如，WO 89/09813)等。
众所周知所述酶由诸如链霉菌属(例如，JP-A-62-285789(对应于EP-A-0560983))、短杆菌属(例如，JP-A-4-218367(对应于EP-A-0452112))、红球菌属(例如，JP-T-3-503487(对应于WO 90/05788))与假单胞菌属(例如，JP-A-6-189754)的许多属的微生物产生。
从洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ST-200(根据旧的分类标准属于假单胞菌属ST-200，于1998年2月4日保藏National Instituteof Bioscience and Human Technology(NIBH)、Ministry of InternationalTrade and Industry(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，保藏号为FERM MP-6661)(例如，日本专利号3,241,712(对应于US-A-2003/153051))分离的胆固醇氧化酶的特征在于当胆固醇用作底物时与迄今已知的其他胆固醇氧化酶相比它的产物是不同的，它的反应机理是不同的，并且它具有较高的有机溶剂抗性和温度稳定性。因为来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇氧化酶的基因已经被克隆，所以可通过分泌或者细胞内的累积在不同的宿主中高水平生产重 组胆固醇氧化酶(例如，JP-A-2002-65271)。
在用于临床诊断的试剂中使用的酶所需的特性是在大多数情况下对对象的高反应性和特异性以及影响产物保存稳定性的热稳定性，但是在测定胆固醇的情况下，为了高特异性测定对象的目的，经常以高浓度表面活性剂开处方，因此除上述特性之外，与表面活性剂共存的保存稳定性对于所使用的酶同样非常需要。虽然来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇氧化酶具有上述的优良特性，但是这种酶在与表面活性剂共存的保存稳定性方面较差，因此难以将这种酶应用于胆固醇测定试剂。
在用于胆固醇测定系统的表面活性剂中，1-戊基磺酸盐、1-己基磺酸盐、1-庚基磺酸盐、1-辛基磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、十二烷基苯磺酸钠、胆酸盐(胆酸钠)、胆酸、脱氢胆酸盐、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基(gluconamidopropyl))胆酰胺、N，N-双-3-D-葡糖酰氨基丙基胆酰胺、十二烷基苯磺酸钠、月桂酰肌氨酸等用作阴离子表面活性剂(例如，JP-A-8-116996，日本专利2,799,835(对应于JP-A-7-13607)，JP-A-11-56395，JP-A-2000-60600(对应于EP-A-0964249)，JP-A-2002-142799(对应于EP-A-1342792)，日本专利3,529,081(对应于JP-A-10-232219)，JP-A-10-84997(对应于EP-A-0821239)。此外正-氯化十二烷基三甲铵、氯化十六烷基吡啶鎓等用作阳离子表面活性剂(例如，JP-A-10-84997(对应于EP-A-0821239))。
聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、酰基聚氧乙烯山梨聚糖酯、烷基聚氧乙烯醚、正-十二烷基-β-右旋麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯烷撑苯基醚、聚氧乙烯烷撑三苄基苯基醚、聚氧乙烯甘油p-t-辛基苯基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、 甘油脂肪酸酯、n-辛基-β-右旋硫葡糖苷、十六烷基醚(C16)、月桂基醚(C12)、油基醚、二十二烷基醚(C20)、聚氧乙烯单月桂酸酯等作为非离子型表面活性剂使用(例如，日本专利2,799,835(对应于JP-A-7-13607)，JP-A-11-56395，JP-A-2000-60600(对应于EP-A-0964249)，JP-A-2002-142799(对应于EP-A-1342792)，日本专利3,529,081(对应于JP-A-10-232219)，JP-A-10-84997(对应于EP-A-0821239)，JP-A-2000-325097，JP-A-2001-124780，JP-A-2000-116400，JP-A-9-299，JP-A-2001-346598，JP-A-9-224697，日本专利3,193,634(对应于JP-A-9-313200)，JP-A-10-210999)。
此外，甜菜碱衍生物、烷基甜菜碱衍生物、咪唑甜菜碱衍生物、硫甜菜碱衍生物、氨基羧酸衍生物、咪唑啉衍生物、胺oxanoide衍生物、胆汁酸衍生物等用作两性表面活性剂(例如，JP-A-2000-60600(对应于EP-A-0964249)，JP-A-10-84997(对应于EP-A-0821239)，JP-A-2000-325097，JP-A-2001-124780)。
发明内容
本发明的目的是通过克服来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的传统胆固醇氧化酶的缺点，提供在表面活性剂存在下具有高稳定性的胆固醇氧化酶与编码该酶的基因。
本发明的这个及其他目标通过在表面活性剂存在下具有稳定性的新胆固醇氧化酶与编码该新胆固醇氧化酶的基因得以实现。
附图说明
图1是显示本发明的氧化酶的最适pH的图表。
图2是显示本发明的氧化酶最适反应温度范围的图表。
图3是显示本发明的氧化酶的稳定pH值范围的图表。
图4是显示本发明的氧化酶的热稳定性的图表。
具体实施方式
为了解决上述问题本发明者进行了深入细致的研究并发现由经修饰的来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200(在JP-A-2002-65271中描述的)的胆固醇氧化酶基因可以获得在表面活性剂存在下具有高稳定性的新的胆固醇氧化酶并因此完成了本发明。
也就是说本发明涉及以下(1)至(3)：
(1)一种新的具有以下物理化学特性的胆固醇氧化酶，其中的胆固醇氧化酶对表面活性剂具有提高的稳定性：
(a)作用与底物特异性：其作用于胆固醇将其转换成胆甾-5-烯-3-酮；其作用于胆甾-5-烯-3-酮并将其转换成6β-全羟基胆甾-4-烯-3-酮；其作用于3β-甾醇而不作用于3α-羟基类固醇，以及(b)分子量：约60,000(SDS-PAGE)。
(2)一种具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质，所述蛋白质是选自以下(a)至(f)的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列组成并且具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质，
(c)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成并具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质，
(d)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质，
(e)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列组成并且具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质，以及
(f)由与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成并具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质。
(3)选自以下(a)至(f)的DNA的基因：
(a)包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA，
(b)严格条件下与由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的全长 DNA，与由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的DNA中连续15个或更多碱基，或与由其互补核苷酸序列组成的DNA杂交并编码具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质的DNA，
(c)与由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的全长DNA，或与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中的连续15个或更多碱基具有80％或更高同源性并且编码具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质的DNA，
(d)包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的DNA，
(e)严格条件下与由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的全长DNA，与由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的DNA中连续15个或更多碱基，或与由其互补核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质的DNA，以及
(f)与由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的全长DNA，或与由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的DNA中连续15个或更多碱基具有80％或更高同源性并且编码具有胆固醇氧化酶活性的蛋白质的DNA。
在本发明中提供了一种对表面活性剂具有进一步高的稳定性的胆固醇氧化酶，所述胆固醇氧化酶工业上可作为一种酶应用于试剂中用于临床诊断，本发明还提供了编码该酶的基因。
本发明的新胆固醇氧化酶(以下简称“本发明的氧化酶”)是具有以下物理化学特性的胆固醇氧化酶，其中其在表面活性剂存在下的保存稳定性得以提高：
(a)作用与底物特异性：其作用于胆固醇将其转化成胆甾-5-烯-3-酮；其作用于胆甾-5-烯-3-酮并将其转化成6β-全羟基胆甾-4-烯-3-酮；其作用于3β-甾醇，但不作用于3α-羟基类固醇，并且
(b)分子量：约60,000(SDS-PAGE)。
利用Multigel 10/20(Daiichi Pure Chemicals生产)通过SDS-PAGE常规方法获得分子量。
因此，本发明的氧化酶在物理化学的特性方面与任何一种传统胆固醇氧化酶均不同并因此是一种新的胆固醇氧化酶。所以，本发明的氧化酶作为一种具有优良保存稳定性的酶可用于试剂盒试剂用于临床诊断。
作为本发明的氧化酶，可以举例说明来源于通过从自然界筛选获得的不同生物的氧化酶与通过修饰传统已知的胆固醇氧化酶获得的氧化酶，并且可以引用例如下列本发明(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)的氧化酶：
(c)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的胆固醇氧化酶；
(d)由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶；
(e)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶；
(f)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的胆固醇氧化酶；
(g)由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶；
(h)由与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶。
在这方面，术语“至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入”是指一个到几个氨基酸的缺失、取代、添加和/或插入，例如从1到20个，优选从1到10个，更优选从1到5个氨基酸的缺失、取代、添加和/或插入。此外，术语“具有80％或更高的同源性”没有特定限制，只要它与由SEQ ID NO：2或者5所示的氨基酸序列的同源性是80％或更高，同源性是例如80％或更高，优选90％或更高，并且最优选95％或更高。
作为编码本发明新胆固醇氧化酶基因(以下简称“本发明的基因”)的胆固醇氧化酶基因可以进行引用编码上述本发明(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)的氧化酶的基因与包含以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的DNA，编码本发明的氧化酶的基因：
(a)包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA；
(b)由严格条件下与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列全长，与SEQID NO：4所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基，或者与其互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列组成的DNA；
(c)由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的全长或与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA；
(d)包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的DNA；
(e)由严格条件下与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的全长，在SEQID NO：6所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基，或者与其互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列组成的DNA；
(f)由与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的全长或与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA
在这方面，术语“严格条件下杂交的DNA”是指利用DNA作为探针通过使用集落杂交、噬斑杂交、Southern印迹杂交等获得的DNA，并且可以具体列举满足如下条件的DNA：通过利用其上固定有来源于集落或者噬菌斑或者DNA样本片段的DNA样本的滤膜在65℃进行杂交，然后在65℃冲洗滤膜进行鉴定的DNA。杂交可以根据在Current Protocolsin Molecular Biology(WILEY Interscience，1989)描述等方法进行。作为严格条件下杂交的DNA，可以具体列举与用作探针的DNA的核苷酸序列具有某一水平同源性的DNA。“由与核苷酸序列的全长或者与在核苷酸序列中连续15个或更多碱基具有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA”同源性根据本发明例如为80％或更高，优选90％或更高，最优选95％或更高。
接下来，描述获得本发明的氧化酶与本发明的基因的方法。
本发明的氧化酶可以通过筛选来源于微生物、动物或者植物的酶 从自然界获得。此外，本发明的氧化酶也可以通过利用遗传工程技术、突变处理等修饰具有不同于本发明的酶的物理化学特性的胆固醇氧化酶(以下简称“具有不同特性的氧化酶”)来获得。根据本发明的具有不同特性的氧化酶，可以列举上面描述的传统已知的氧化酶，但是同样可以是通过筛选新获得的胆固醇氧化酶或者通过遗传工程技术进行修饰获得的胆固醇氧化酶。例如来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200(描述在日本专利3,241,712(对应于US-A-2003/153051)中与JP-A-2002-65271中的)等可以作为传统已知的氧化酶引用。上述胆固醇氧化酶本来是具有信号序列的分泌性蛋白质，但是也可通过阻断信号序列来使用或者可以通过除去信号序列在细胞内生成。
修饰具有不同特性氧化酶的物理化学特性的方法的实例包括通过对能够生产氧化酶的微生物施用紫外线、X-射线或者辐射，或者通过使诸如甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-硝基亚硝基胍或者亚硝酸的诱变剂与微生物接触获得能够产生本发明修饰的氧化酶的微生物并由所获得的微生物获得本发明的氧化酶的方法。
然而，概括而言，本发明的氧化酶可以利用遗传工程通过修饰编码具有不同特性的氧化酶的基因来获得。作为编码具有不同特性用于本发明的氧化酶的基因，可以使用任一编码胆固醇氧化酶的基因，条件是通过其的修饰可以获得本发明的氧化酶的基因。
为了获得编码具有不同特性，用于本发明的氧化酶的基因，使用通常所用的基因克隆方法。例如，通过诸如在Current Protocols inMolecular Biology(WILEY Interscience，1989)描述的通常方法从能够产生具有不同的特性的氧化酶的微生物细胞或者多种其他细胞中提取染色体DNA或者mRNA。此外利用mRNA作为模板可以合成cDNA。制备因此获得的染色体DNA或者cDNA的文库。然后，可以通过在根据上述具有不同的特性的氧化酶的氨基酸序列合成合适的探针DNA，并利用这个探针从染色体DNA或者cDNA文库筛选的目的基因的方法或者通 过根据上述氨基酸序列制备的合适的引物DNA，利用这些引物通过实施合适的聚合酶链式反应(PCR)诸如5’RACE，3’RACE扩增包含目的基因片段的DNA片段然后连接这些片段的方法获得包含目的基因的全长DNA。作为以这种方式获得的编码具有不同特性的氧化酶的基因的优选实例，可以列举来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇氧化酶基因(JP-A-2002-65271中描述的)等。从处理的观点看需要这些基因以常规方法与不同的载体连接，并且可以利用例如QIAGEN(由Qiagen生产)从包含编码来源于分离的洋葱伯克霍尔德菌ST-200具有不同的特性的氧化酶的基因的重组质粒pCox4DNA(在JP-A-2002-65271中描述)中提取和纯化来获得。在这方面，可用于本发明的载体DNA不限于上述的质粒载体DNA，也可以使用诸如质粒载体DNA、噬菌体载体DNA等的其它质粒载体DNA。具体而言，优选例如pBluescript II SK+(由STRATAGENE生产)等。
其次，本发明的氧化酶可以通过修饰由上述方法获得的编码具有不同特性的氧化酶的基因来获得。也就是说，根据本发明，通过修饰编码具有不同特性的氧化酶的基因，由该基因翻译的具有不同特性的氧化酶的氨基酸序列得以修饰。结果，获得了与修饰之前的具有不同特性的氧化酶不同，包括本发明的氧化酶在内具有不同特性的多种胆固醇氧化酶。
编码具有不同特性的氧化酶的用于修饰的基因没有特定限制，但是来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200编码具有不同特性的氧化酶的基因(JP-A-2002-65271，SEQ ID NO：3)等可以作为本发明的实施方案的实例。此外，为了在宿主生物体中表达该基因，以氨基酸残基未添加、缺失、取代和/或插入，或者添加、缺失、取代、和/或插入的方式修饰的核苷酸序列的基因同样可以作为实例。
作为修饰上述基因的方法，可以使用任一传统已知的方法，并且其实例包括使诸如羟胺或者亚硝酸的化学诱变剂与上述重组质粒 pCox4DNA(描述在JP-A-2002-65271中)接触的方法，诸如利用PCR方法随机转化的点突变方法，通常已知的利用市售的试剂盒产生定位取代或者缺失突变的定位诱变方法，以及其中选择性切割重组质粒DNA，从其中除去或者向其中田间所选择的寡聚核苷酸，然后进行连接，即寡核苷酸诱变的方法。随后，在上述处理之后利用脱盐柱，QIAGEN(由Qiagen生产)等纯化重组DNA来获得不同的重组DNA样品。在这种情况下，使用通过从pCox4DNA除去编码胆固醇氧化酶的氨基末端侧信号序列并作为代替向其添加编码起始甲硫氨酸的ATG制备的重组DNA或者通过用氨基末端侧-编码的核苷酸序列取代适于在诸如大肠杆菌的宿主生物中表达的序列制备的重组DNA是有效的。
例如，利用以这样的方式获得的多种重组体DNA，通过转化或者转导大肠杆菌K12，优选大肠杆菌JM109或者DH5α(两者均由TOYOBO生产)、XL-Blue(由Funakoshi生产)等，可以获得包含具有修饰的胆固醇氧化酶基因片段的不同种类的重组DNA的转化或者转导产物。而后，对转化体而言，例如从所获得的转化体(其中包括含有不同种类的突变胆固醇氧化酶基因的重组质粒DNA分子)中选择在表面活性剂存在下具有稳定性的本发明的目的转化体(本发明的氧化酶生产菌株)。
下面，为了选择本发明的氧化酶生产菌株，例如可以采用下列的方法。首先，将所获得的上述转化体的菌落接种到无菌LB液体培养基中并在加入-氨苄青霉素的无菌96-孔平板上传代培养。当生长充分时，向其中加入诸如溶菌酶的裂解剂并在37℃静置大约1小时用于细胞裂解。当细胞裂解时，将含有合适的表面活性剂与0.2％小牛血清白蛋白的0.1M MES缓冲液(pH 7.0)以50μl分配在96-孔平板的孔内，向每个孔内加入裂解的培养液，并在37℃处理5小时。而后，加入含有作为底物的胆固醇、Triton X-100、胆酸钠、过氧化物酶、苯酚与4-aminoantipyrine的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)直至100μl，并观察红紫色颜色显色的程度。对在修饰之前的具有不同特性的氧化酶生产菌株通过相同的方法进行显色试验，并通过比较结果选择目的转化体。
所使用的表面活性剂可以是用于上述胆固醇测定系统的任一表面活性剂，优选的阴离子表面活性剂包括1-戊基磺酸盐、己基磺酸盐、1-庚基磺酸盐、1-辛基磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐(商品名：Emal20C、Emal NC-35(均由KAO生产)、十二烷基苯磺酸钠、胆酸盐(胆酸钠)、胆酸、脱氢胆酸盐、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基(gluconamidopropyl))胆酰胺、N，N-双-3-D-葡糖酰氨基丙基胆酰胺、十二烷基苯磺酸钠、月桂酰肌氨酸等。优选的阳离子表面活性剂包括正-氯化十二烷基三甲铵、hexadecylpyridiniumchloride及诸如此类。优选的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯烷基醚(商品名：Emalgen 220、Emalgen 104P、Emalgen 108、Emalgen 408等(KAO生产))、聚氧乙烯烷基苯基醚(商品名：Emalgen 903、Emalgen909、Emalgen 913等(KAO生产))、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物(商品名：Pluronic F88(由Asahi Denka生产)、酰基聚氧乙烯山梨聚糖酯(商品名Tween 21、Tween 81、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Tween 85、Emasol 4130等)、烷基聚氧乙烯醚(商品名：Atlas G2127、Brij36T、Briji 56等)、正-十二烷基-β-右旋麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂基醚(商品名：Emalgen 120等)、聚氧乙烯烷撑苯基醚(商品名：Emalgen A60等)、聚氧乙烯烷撑三苄基苯基醚(商品名：EmalgenB66等)、聚氧乙烯甘油p-t-辛基苯基醚(商品名：Triton X100)、聚氧乙烯高级醇醚(商品名：Emalgen 705、Emalgen 709等)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、甘油脂肪酸酯、n-辛基-β-右旋葡糖苷、聚氧乙烯乙二醇单十二烷基醚、n-辛基-β-右旋硫葡糖苷、十六烷基醚(C16)、月桂基醚(C12)、油基醚、二十二烷基醚(C20)、聚氧乙烯单月桂酸酯等。优选的两性表面活性剂包括甜菜碱衍生物、烷基甜菜碱衍生物、咪唑甜菜碱衍生物、硫甜菜碱衍生物、氨基羧酸衍生物、咪唑啉衍生物、胺oxanoide衍生物、胆汁酸衍生物等。其中，更优选非离子型表面活性剂。
用这样的方式可以获得具有生产本发明的氧化酶能力的转化体。实例包括通过以上所述的修饰方法处理具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇氧化酶所获得的包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的本发明的氧化酶，等。此外，如有必要，通过利用这种具有生产本发明的氧化酶能力的转化体通过以上所述修饰方法进一步重复本发明的基因修饰，同样可以获得具有对表面活性进一步提高的稳定性的本发明修饰的氧化酶以及具有生产该酶能力的转化体。也就是说，根据本发明，在SEQ ID NO：2或者5所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列的胆固醇氧化酶、由与SEQ ID NO：2或者5所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶等同样包括在本发明的氧化酶之内。例如可以具体列举在后面的实施例中显示的本发明的氧化酶(R7)等。在R7中，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被取代，并且它具有90％或更高的同源性。另外，作为由此获得的能够生产本发明氧化酶的转化体的实例，可以引用产生由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成并且在表面活性剂共存下具有80％的残留活性的本发明的氧化酶(R1)的大肠杆菌JM109(pNCP1)。
同样，以上所述本发明的氧化酶(R1)的基因(SEQ ID NO：6)可以作为本发明的基因的实例引用。包括含有编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：6的基因的质粒pNCP1作为已经以保藏号FERM BP-10343在2005年5月27日保藏在International Patent Organism Depositary、National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(独立行政法人产业技术综合研究所，特许生物保藏中心，日本，千叶)。另外，编码诸如由在SEQ IDNO：2或者5所示的氨基酸序列至少一个氨基酸缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶以及由与SEQ ID NO：2或者5所示的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的胆固醇氧化酶的本发明的胆固醇氧化酶的基因，以及诸如由严格条件下与SEQ IDNO：4或者6所示的核苷酸序列全长，与SEQ ID NO：4或者6所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基，或者与由其互补核苷酸序列组成 的DNA杂交的核苷酸序列组成的DNA，以及由与SEQ ID NO：4或者6所示的核苷酸序列全长或者与SEQ ID NO：4或者6所示的核苷酸序列中连续15个或更多碱基具有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA的编码本发明的胆固醇氧化酶的基因可作为本发明的基因的实例。“连续15个或更多碱基”的具体实例包括作为SEQ ID NO：6的部分序列的从4到186个碱基的核苷酸序列等。另外，其中SEQ ID NO：4从130到312位碱基的核苷酸序列被替换成SEQ ID NO：6从4到186位碱基的核苷酸序列的序列同样编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列，因此其同样可以引用为由具有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA的实例。
下面，通过利用培养基培养能够产生本发明的氧化酶的微生物并从培养混合物收集胆固醇氧化酶来生成本发明的氧化酶。任一微生物都可用于生产本发明的氧化酶，条件是所述微生物能够生成本发明的氧化酶。实例包括以上述方式获得的能够生成本发明的氧化酶的转化体或者转导产物。例如，可以通过利用能够生成本发明氧化酶的转化体并优选属于埃希氏杆菌属来产生本发明的氧化酶。在培养上述微生物中，可以通过固体培养方法培养，然而更优选通过采用液体培养法进行培养。另外，通过向酵母抽提物、蛋白胨、肉汤、玉米浆、大豆或者麦饼(wheat cake)汁等的一种或多种氮源中添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铁、硫酸铁、硫酸锰等的一种或多种无机盐，或任选添加糖、维生素等来制备用于培养上述微生物的培养基。在这方面，最好将培养基的初始pH值从6调节到9。需要通过充气搅拌浸没培养、振荡培养、静止培养等在从20℃到42℃的温度下优选在约25℃培养10到40小时进行培养。培养完成后，可以利用常规的酶收集方式从培养混合物收集本发明的氧化酶。通过例如过滤或者离心的操作从培养基中分离细胞，然后冲洗。需要从这样的细胞收集本发明的氧化酶。在这种情况下，可以就这样使用细胞，但是优选通过利用诸如超声粉碎器、弗氏压碎器与Dynomill的多种破碎装置破碎细胞的方法、利用诸如溶菌酶的细胞壁溶解酶溶解细胞壁的方法，或者利用诸如TritonX-100的表面活性剂从细胞提取酶的方法从细胞收集本发明的氧化酶。
为了从以这样的方式获得的粗酶液体中分离本发明的氧化酶，可以使用通常用于酶提纯的方法。需要通过例如硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法，吸附色谱法与电泳的任选组合来完成这种操作。以这样的方式，可以在直到通过SDS-PAGE几乎显示单一条带的纯化水平分离本发明的氧化酶。此外，可以通过任选组合上述的纯化方法根据用途制备具有不同纯化程度的酶制剂。
对于本发明氧化酶的酶活性测定方法，测定酶反应形成的过氧化氢的量的方法以及测定酶反应所消耗的氧的量的方法可以作为主要测定方法的实例。在下文中，除非另作说明，在本发明的酶活测定中胆固醇被用作底物。在这一点上，对于酶滴定度而言，当利用胆固醇作为底物进行测定时在1分钟之内形成1摩尔过氧化氢的酶的量被定义为1U。
A.试剂的制备
(1)试剂1：胆固醇溶液
首先，将500mg的胆固醇(由Wako Pure Chemical Industries生产)加入到5.0ml的Triton X-100中并通过在加热器上搅动溶解于其中。接着，向其中加入90ml的离子交换水，煮沸溶液然后在冰上冷却，向其中添加4.0g的胆酸钠(由Nacalai Tesque生产)并溶解于其中，然后将总体积调至100ml。
(2)试剂2：6.0％的酚溶液
在离子交换水中溶解6.0g的苯酚并将总体积调至100ml。
(3)试剂3：0.15％的过氧化物酶溶液
在100ml的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中溶解150mg的过氧化物酶。
(4)试剂4：4-aminoantipyrine溶液
在离子交换水中溶解1.76g的4-aminoantipyrine(由Wako PureChemical Industries生产)并将总体积调至100ml。
B.测定方法
在将4.0ml试剂1与51ml的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)混合之后，向其中顺次添加2.0ml的试剂2、2.0ml的试剂3与1.0ml的试剂4，然后混合。将这些液体以3.0ml分装到试管中并用冰冷却保存。测定时，在37℃温育5分钟其中的3.0ml液体，向其中加入50μl的每种酶液体然后混合，然后通过分光光度计(U-3010，由Hitachi生产)在500nm测定吸光度。测定值(ΔODtest)是在500nm从2分钟到4分钟后，每分钟吸光度的改变。在这一点上，对照液体(ΔODblank)以和上述相同的方法制备，除了加入50μl含有0.2％小牛血清白蛋白的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)代替酶液体。根据下列计算公式计算出的值用作酶活值(U/ml)。
13.78：在上述测定条件毫摩尔摩尔吸光系数(cm2/微摩尔)
1/2：基于由酶反应形成的2分子H2O2形成的醌亚胺(Quinoneimine)色素是1分子事实的因子
1.0：光程长(cm)
通过利用由本发明获得的胆固醇氧化酶基因，可以低成本提供在低底物(胆固醇)浓度显示高活性，在较宽的pH值范围内起作用并具有优良热稳定性的胆固醇氧化酶。因为胆固醇氧化酶对表面活性剂得以提高，使其尤其适于用来测定体液与食物中的胆固醇。同样，因为其在有机溶剂覆盖条件下可以被强烈激活，所以具有有效进行胆固醇的酶 促转化的特征。除这些优点之外，这种酶还可用作口服摄取的杀虫剂、以及用作衣服的去垢剂等用胆固醇染色的情况。
下面基于实施例对本发明进行详细描述，然而本发明并不限定于此。
实施例1
(A)重组质粒的制备
分别制备含有具有不同特性的氧化酶基因(编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的基因)的重组质粒DNA，以及用于提高这种基因在大肠杆菌中的表达量的另一个含有氧化酶基因的重组质粒DNA，其中编码该基因氨基末端区域的核苷酸序列被修饰以适于大肠杆菌的密码子的使用。在如下所述制备本发明氧化酶的过程中，这两种重组质粒DNA都可以使用，然而为了大量生产本发明的氧化酶，使用含有修饰的氧化酶基因的重组质粒DNA是有效的。
(1)重组质粒pCox4DNA的制备
根据JP-A-2002-65271实施例中制备含有上述氧化酶基因(编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)的大肠杆菌DH5α(pCox4)，并将其接种到20ml的LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物与0.25％的NaCl)并在37℃振荡器上培养20小时以获得培养液体。在7,000rpm对该培养液体离心5分钟以回收细胞。利用QIAGEN tip-100(由Qiagen生产)从细胞提取并纯化重组质粒pCox4DNA从而获得100μg的重组质粒pCox4DNA。
(2)氨基末端侧核苷酸序列被修饰的重组质粒pNCOP DNA的制备
具有在SEQ ID NO：7至14中描述的作为SEQ ID NO：6的部分序列的核苷酸序列的寡聚核苷酸通过Sigma Genosis的委托合成服务获得。利用T4多核苷酸激酶(由Takara Shuzo生产)对SEQ ID NO：7至14中的每 一个进行磷酸化。另一方面，通过利用具有SEQ ID NO：1的pCox4DNA作为模板，SEQ ID NO：15与16作为引物并利用Ex Taq聚合酶(由TakaraShuzo生产)进行PCR来制备编码C末端侧的基因片段。此外，用NdeI(由Daiichi Pure Chemicals生产)与NspI(由Daiichi Pure Chemicals生产)来处理这个片段。另外，用NdeI处理pKF19k DNA然后通过BAP处理(使用由Takara Shuzo生产的一种试剂)进行脱磷酸化。在由此获得的磷酸化寡聚核苷酸之中，将8个磷酸化寡聚核苷酸与pCox4DNA-衍生的基因片段以及合适量的pKF19k片段混合并使用连接试剂盒ver.2(由TakaraShuzo生产)进行连接，所获得的质粒命名为pNCOP。接着，通过(1)中描述的方法制备100μg的pNCOP DNA。
(B)本发明的氧化酶与能够生产本发明的氧化酶的转化体的制备
(1)修饰操作(突变的引入)
利用上述重组质粒pNCOP DNA作为模板，SEQ ID NO：17与25作为引物进行PCR。在这种情况下，通过添加10％DMSO诱导扩增差错引入突变。用限制性酶NdeI处理用这样的方式获得的DNA片段，然后与同样通过用NdeI处理质粒pKF19k并且通过BAP处理(使用由TakaraShuzo生产的一种试剂)进行脱磷酸化制备的片段混合，利用连接试剂盒ver，2(由Takara Shuzo生产)连接混合物，并利用连接产物根据D.M.Morrison(Methods in Enzymology，68，326-331(1979))转化大肠杆菌E.coliJM109(由TOYOBO生产)从而获得约2,500个携带修饰的质粒的转化体。
(2)选取产生本发明的氧化酶的菌株
首先，将所有上述获得的转化体接种到每个孔都包括含有1mM的IPTG和50μg/ml的卡那霉素的100μl无菌LB培养基的96-孔板中。将携带pNCOP的JM109接种到每一平板的1个孔内作为阴性对照。在25℃培养24小时。将含有因此获得的培养液体的产物平板放入-80℃的冰箱中并保存1小时用于细胞裂解。此后，平板上的每个孔与含有0.2％小牛血清白蛋白，补充有100μl的10％Emalgen 913的100mM MES-NaOH缓冲液 (pH7.0)混合，并且使混合物在37℃保持5小时。此后，取出50μl的每一经处理的液体并与50μl下列组分的反应试剂混合来进行反应，并选择与阴性对照相比颜色加深的液体对应的菌株。
胆固醇溶液，15m：
向5.0ml的Triton X-100中加入500mg的胆固醇(由Wako PureChemical Industries生产)，并通过在加热器上搅拌溶解于其中。向其中加入90ml的离子交换水后，煮沸溶液然后在冰上冷却，向其中加入4.04g的胆酸钠(由Nacalai Tesque生产)并溶解于其中，然后将总体积调节至100ml；
0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0，17.5ml；
1.76％4-Aminoantipyrine溶液，3.5ml；
6.0％苯酚溶液，7ml；
0.15％过氧化物酶溶液，7ml：
在100ml的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中溶解150mg的过氧化物酶。
在此选择的显色的10个菌株中的每一种都在2ml的LB培养基(添加50μg的卡那霉素)进行液体-培养，并产生由质粒编码的经修饰的胆固醇氧化酶。在培养之后，将由此获得的培养液通过超声波发生器进行破碎并在8,000rpm离心5分钟，并且将由此获得的0.5ml粗酶提取物与0.5ml的含有0.2％牛血清白蛋白，补充有10％Emalgen 913的100mMMES-NaOH缓冲液(pH7.0)混合，并且使混合物在37℃过夜反应。通过测量这种反应液与2倍稀释的未处理的粗酶提取物的活性，计算残留的活性比率(反应液体的活性/未经处理粗酶提取物的活性)。以相同的方式培养、提取与热处理具有不同特性的修饰之前的氧化酶，测定其活性，并比较残留的活性比率从而获得残留的活性比率从40％提高到80％的经修饰的胆固醇氧化酶及产生其的3种大肠杆菌菌株。其中编码1种(R1)基因的质粒pNCP1在2005年5月27日以保藏号FERM BP-10343保藏在International Patent Organism Depositary、 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Science and TechnologyScie
(3)突变发生区域的鉴定
回收携带经修饰的胆固醇氧化酶基因的质粒，利用CEQ2000XLDNA分析系统(Beckman Coulter生产)来测定核苷酸序列，并且在此基础上鉴定经修饰的氨基酸残基。
结果发现，如SEQ ID NO：2所示，在本发明的氧化酶(R1)的情况下，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中175位的天冬氨酸被天门冬酰胺取代。其对应于SEQ ID NO：5中的133位。以相同的方式，在本发明另一个氧化酶(R7)的情况下，发现SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中173位的脯氨酸被亮氨酸取代，220位的天冬氨酸被谷氨酸取代。此外，这些突变区域对应于SEQ ID NO：5中的131位和178位。
(4)突变点的分离与组合尝试将这些突变点的每一个独立地引入。也就是说，利用pNCOP DNA，SEQ ID NO：17和18的序列(以这样方式设计，用天门冬酰胺代替位于SEQ ID NO：5中133位的天冬氨酸)作为引物以及KOD plus聚合酶(TOYOBO生产)进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳证实对应于该质粒全长的DNA片段的扩增，用限制性内切酶(作用于甲基化DNA；由Daiichi Pure Chemicals生产)处理该片段。接着转化入大肠杆菌JM109中，然后利用补充有卡那霉素的LB琼脂培养基选择转化体。用含有卡那霉素的液体培养基培养生长的克隆以回收携带胆固醇氧化酶基因的质粒，并且测定其核苷酸序列来证实所需的突变已被引入。通过相同的方法利用在131位的SEQ ID NO：19和20，和在178位的SEQ ID NO：21和22还可以获得SEQ ID NO：5的131位(脯氨酸被亮氨酸代替)和178位(天冬氨酸被谷氨酸代替)的位点-特异性突变的胆固醇氧化酶基因。此外，利用携带如此获得的位点-特异性突变的胆固醇氧化酶基因的质粒作为模板可以获得双突变的胆固醇氧化酶基因。在这种情况下，因为位于131位和133位的突变位点彼此邻近，可以用SEQ ID NO：23和24来进行操作。就可以进一步携带三突变的胆固醇氧化酶基因的质粒。
(5)突变点以及表面活性剂抗性
将上述获得的携带含有具有不同突变点的突变型胆固醇氧化酶基因的质粒的任一大肠杆菌JM109菌株培养在10ml补充有1.0mM IPTG的LB-卡那霉素培养基中，30℃培养24小时，然后将由此获得的培养基在8,000rpm离心5分钟以收集细胞，然后将所述细胞悬浮于1ml的20mM磷酸钾缓冲液中(pH7.0)。尔后，用超声波发生器破碎这些细胞并在10,000rpm离心10分钟回收上清液。将每一200μl的这些粗酶提取物与补充有2％Emalgen 913的含有0.2％小牛血清白蛋白的200μl 100mMMES-NaOH缓冲液(pH7.0)混合，在30℃保存混合物7天，与没有实施表面活性剂处理的粗酶提取物30℃保存7天的情况比较(表1)残留的酶活性比率。
表1突变型胆固醇氧化酶的突变点以及与Emalgen 913共存时的保存稳定性
Figure S06191280720060627D000201
*：突变P131L：在131位用亮氨酸取代脯氨酸突变D133N：在133位用天门冬酰胺取代天门冬氨酸突变D178N：在178位用谷氨酸取代天门冬氨酸
此外，在对Emalgen 913观察到稳定效应的突变型胆固醇氧化酶上检验对其他表面活性剂(Emalgen 120，Emal 20C和Emal 20CM)的保存稳定性。在与上述试验相同的条件下通过将200μl的粗酶提取物与补充有2％的每种表面活性剂的含有0.2％小牛血清白蛋白的200μl的100mM MES-NaOH缓冲液(pH7.0)混合，并且使混合物在30℃保存3天(表2)
表2对表面活性剂的保存稳定性
Figure S06191280720060627D000211
(C)本发明中氧化酶的产生及其理化特性
将由此获得的可以产生本发明氧化酶(R1)的转化体大肠杆菌JM109(pNCP1)接种到含有1mM IPTG的10升LB-卡那霉素培养基中，以11/分的通风，600rpm搅拌，利用发酵罐30℃培养24小时。将由此获得的10升培养基在7,000rpm离心10分钟收集细胞，然后将所述细胞悬浮于1升的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。然后，用超声波发生器破碎细胞并于10,000rpm离心10分钟回收上清液作为粗酶液体。将该粗酶液体在60℃热处理30分钟，用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释10倍然后在10,000rpm离心10分钟回收上清液。在含有5mM EDTA的20mMTris-HCl缓冲液(pH8.8)中利用超滤膜AIP-2013(Asahi Chemical Industry生产)进行透析将上清液浓缩至500ml。然后，将混合物悬浮于用含有5mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.8)平衡的200mM的QAE-Sephadex A-50中，并回收通过用含有5mM EDTA的20mMTris-HCl缓冲液(pH8.8))洗涤残渣所获得的滤液和洗液作为活性级分。由此回收的本发明的氧化酶(R1)的比活性是4.0U/A280。
本发明获得的氧化酶(R1)的物理化学特性如下。
(1)作用
由上述酶活性测定方法证实了与作为酶底物的胆固醇的反应。
(2)最适pH值
用100mM乙酸盐缓冲液(pH5.5到6.0)，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0到8.22)，100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.58到9.5)以及100mMNaHCO3-NaOH缓冲液(pH9.43到11.0)作为缓冲液，在37℃各pH值进行酶促反应发现了图1所示的相对活性。从图1发现本发明的氧化酶的最适pH值是6.5到8.0。
(3)最适反应温度范围
利用由用于上述活性测定方法中的反应液体的相同组分组成的反应液体在不同温度下测量这种酶的活性，结果如图2所示。如图2所示，最适反应温度范围是55到65℃。
(4)稳定的pH范围
用100mM乙酸盐缓冲液(pH3.5到6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0到8.22)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.58到9.5)以及100mMNaHCO3-NaOH缓冲液(pH 9.43到11.0)作为缓冲液，在25℃，各pH值处理本发明的氧化酶20小时，然后测定残留的活性，结果如图3所示。如图3所示，稳定的pH范围是3.5到8.5。
(5)热稳定性
在各温度在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中处理所述酶15分钟来测定其热稳定性，结果如图4所示。在高达约70℃的温度，本发明的氧化酶仍然是稳定的。
(6)分子量
按照通常的方法通过SDS-PAGE用Multigel 10/20(由Daiichi PureChemicals生产)来获得分子量。分子量约为60,000。
(7)表面活性剂稳定性
将这种酶对表面活性剂的稳定性与来自原始的洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇氧化酶(CHO(WT))进行比较。然后，将补充有2％的每种表面活性剂的含有0.2％牛血清白蛋白的100mM MES-NaOH缓冲液(pH7.0)与等量的2U/ml的胆固醇氧化酶混合并且在37℃保藏24小时(表3)。
表3.纯化的酶对表面活性剂的保藏稳定性的比较
  CHO(WT)   CHO(R1)
  Emalgen 913   11.8   80.0
  Emalgen 120   10.5   65.0
  Emal 20C   40.6   90.8
  Emal 20CM   71.4   92.1
本申请是基于2005年6月8日提交的日本专利申请2005-167779，其全部内容在此引入作为参考。虽然已经对本发明及其具体的实施方案进行了详细描述，对于本领域技术人员显而易见的是在不背离本发明的精神与范围的条件下可以对本发明进行多种改变以及修改。此处引用的所有参考文献都在此处全文引用。
                 序列表 
<110>龟甲万株式会社(KIKKOMAN CORPORATION) 
<120>在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶 
(CHOLESTEROL OXIDASE STABLE IN THE PRESENCE OF SURFACTANT) 
<130>SPI062505-66 
<150>P2005-167779 
<151>2005-06-08 
<160>25 
<170>PatentIn Ver.3.1 
<210>1 
<211>582 
<212>PRT 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>1 
Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu 
  1               5                  10                  15 
Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr 
            20                  25                   30 
Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro 
         35                 40                   45 
Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn 
     50                  55                  60 
Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg 
 65                  70                  75                  80 
Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly 
                 85                  90                  95 
Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr 
            100                 105                 110 
Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr 
        115             120                     125 
Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg 
    130                 135                 140 
Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu 
145                 150                 155                 160 
Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asp Ile 
                165                 170                 175 
Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro 
            180                 185                 190 
Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser 
        195                 200                 205 
Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln 
    210                 215                 220 
Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser Asp Pro Glu Ile Gly Ala 
225                 230                 235                 240 
Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val Val Glu Val Thr Leu Thr 
                245                 250                 255 
Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro 
            260                 265                 270 
Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr Ser Gly Arg Thr lle Thr 
        275                 280                 285 
Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe 
    290                 295                 300 
Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro 
305                 310                 315                 320 
Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp 
                325                 330                 335 
Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly 
            340                 345                 350 
Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile 
        355                 360                 365 
Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Ile Trp Gly Trp 
    370                 375                 380 
Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro Thr Thr Leu Arg Val Thr 
385                 390                 395                 400 
Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg Ala Asp Val Gln Arg Val 
                405                 410                 415 
Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn Arg Val Asp Thr Tyr Lys 
            420                 425                 430 
Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro Val Glu Ile Arg Ile Thr 
        435                 440                 445 
Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ala Gly Ala Ala Val Pro Ser 
    450                 455                 460 
Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg Pro Glu Trp Asp Val Ala 
465                 470                 475                 480 
Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ser Ala Asp Arg 
                485                 490                 495 
Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu Ala Asn Tyr Thr Gly Ser 
            500                 505                 510 
Tyr Ala Thr Leu Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly Trp Gly Tyr Thr Asp 
        515                 520                 525 
Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu Thr Thr Thr Ile Pro Asn 
    530                 535                 540 
Leu Gln Arg Glu Gly Gln Pro Ala Ser Ser Thr Trp Asp Thr Ala Arg 
545                 550                 555                 560 
Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg Ile Phe Arg Ser Pro Leu 
                565                 570                 575 
Leu Asp Arg Leu Met Pro 
            580 
<210>2 
<211>582 
<212>PRT 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>2 
Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu 
  1               5                  10                  15 
Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr 
             20                  25                  30 
Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro 
         35                  40                  45 
Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn 
     50                  55                  60 
Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg 
65                  70                  75                  80 
Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly 
                 85                  90                  95 
Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr 
            100                 105                 110 
Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr 
        115                 120                 125 
Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg 
    130                 135                 140 
Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu 
145                 150                 155                 160 
Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asn Ile 
                165                 170                 175 
Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro 
            180                 185                 190 
Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser 
        195                 200                 205 
Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln 
    210                 215                 220 
Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser Asp Pro Glu Ile Gly Ala 
225                 230                 235                 240 
Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val Val Glu Val Thr Leu Thr 
                245                 250                 255 
Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro 
            260                 265                 270 
Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr Ser Gly Arg Thr Ile Thr 
        275                 280                 285 
Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe 
    290                 295                 300 
Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro 
305                 310                 315                 320 
Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp 
                325                 330                 335 
Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly 
            340                 345                 350 
Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile 
        355                 360                 365 
Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Ile Trp Gly Trp 
    370                 375                 380 
Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro Thr Thr Leu Arg Val Thr 
385                 390                 395                 400 
Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg Ala Asp Val Gln Arg Val 
                405                 410                 415 
Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn Arg Val Asp Thr Tyr Lys 
            420                 425                 430 
Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro Val Glu Ile Arg Ile Thr 
        435                 440                 445 
Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ala Gly Ala Ala Val Pro Ser 
    450                 455                 460 
Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg Pro Glu Trp Asp Val Ala 
465                 470                 475                 480 
Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ser Ala Asp Arg 
                485                 490                 495 
Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu Ala Asn Tyr Thr Gly Ser 
            500                 505                 510 
Tyr Ala Thr Leu Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly Trp Gly Tyr Thr Asp 
        515                 520                 525 
Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu Thr Thr Thr Ile Pro Asn 
    530                 535                 540 
Leu Gln Arg Glu Gly Gln Pro Ala Ser Ser Thr Trp Asp Thr Ala Arg 
545                 550                 555                 560 
Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg Ile Phe Arg Ser Pro Leu 
                565                 570                 575 
Leu Asp Arg Leu Met Pro 
            580 
<210>3 
<211>1749 
<212>DNA 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>3 
atgagtcaag acttccgaga cgaaccagcg tcgcgccgcg ctttcctcgc cgacatggcg 60 
aagctcgcgg ccgcaggcgt cgtcaccggc tggacgccgc tctaccagat tgcggccaat 120 
gcgcgaaccg ccgacgcgcc gccgcccggc ttcccggccg acatcccgct ttacaagcag 180 
gcgttccaga actggagcgg tgaaatcgcc gtgcaggacg tatggaccgc cgcgccgcgc 240 
tcggccgacg atgtcgtcgc ggcggtcaac tgggcgcgcg cgaacggcta ccggatccgc 300 
ccgcgcggct acatgcacaa ctggtcgccg ctcacgctgg atccgggcgc cggcgccgcg 360 
aacgtggtgc tgctcgatac gacgaaatcg ctgacggccg tctcggtcga cacgtcggca 420 
cgtccggcgc gcgtcaccgc ccaaacgggc atctcgctgg agtcgttgct cgcgacgctc 480 
gaacagtatg gcctcggcgt gattgccgcg cctgcgccgg gcgacatcac gctcggcggt 540 
gcgctcgcga tcgatgcgca cggcactgcc gtgccggcgg tcggtgaaac cttgcaaccg 600 
ggacacacct acggctcgct gagcaacctc gtggtcgcgc tcaccgcggt cgtgtacgat 660 
ccggcccggc agcaatacgt gctgcgccgg ttcgaacgca gcgatcccga gatcggcgcg 720 
ttcctcgcgc acatcgggcg ggcgttcgtc gtcgaagtca cgctgacggc aggccccaac 780 
cagcgcctgc gctgccagag ctacgtcgac attccggcct ccgaactgtt tgcgccggcc 840 
ggcacgtcgg gccgcacgat cacgtcgttt ctcgatcgcg cgggccgggt ggaagccatc 900 
tggtttccgt ttacgtccag cccgtggctc aaggtctgga cgcccacgcc cagcaagccg 960 
ttcctgtcgc gcgccgtcac gcagccgtac aactatccgt tctccgattc gatctcgcag 1020 
tccatctcgg atctcgtcaa gcggatcgtg atcggcggcg aaggcgcatt gacgccgctg 1080 
ttcggccaga cgcaattggc catcacggcc gccggtctcg cgctcacgct cagcggggat 1140 
atctggggct ggtcgcgcac cgtgctgcag tacattcgac cgacgacgct gcgcgtgacc 1200 
gcgaacggct atgcggtact ggcgcggcgc gccgacgtgc agcgcgtgat cagcgagttc 1260 
gtgcagttct atcagaaccg cgtcgacacg tacaaggcgc gcggcgagta tccgatgaac 1320 
ggtcccgtcg agatccgcat caccggtctc gacaagccgg ccgatgccgg cgccggcgcg 1380 
gccgtgccca gcctgtccgc actcaagccg cgccccgacc ggccggagtg ggacgtggcc 1440 
gtgtggttcg atattctgac gttaccgggc acgccgtccg ccgatcgctt ctatcgcgag 1500 
atcgagcaat ggatgctcgc gaactacacc ggttcgtatg cgacgctgcg ccccgaatgg 1560 
tcgaagggtt ggggctatac cgatacggct gcctggcaag acgacacgat gctcaccacc 1620 
acgattccga acctgcaacg tgaagggcag ccggcgtcga gcacgtggga tacggcgcgc 1680 
gcgacgctcg aacgctacga cccgcaccgg atcttccgct cgccgctgct ggatcggttg 1740 
atgccgtaa                                                         1749 
<210>4 
<211>1749 
<212>DNA 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>4 
atgagtcaag acttccgaga cgaaccagcg tcgcgccgcg ctttcctcgc cgacatggcg 60 
aagctcgcgg ccgcaggcgt cgtcaccggc tggacgccgc tctaccagat tgcggccaat 120 
gcgcgaaccg ccgacgcgcc gccgcccggc ttcccggccg acatcccgct ttacaagcag 180 
gcgttccaga actggagcgg tgaaatcgcc gtgcaggacg tatggaccgc cgcgccgcgc 240 
tcggccgacg atgtcgtcgc ggcggtcaac tgggcgcgcg cgaacggcta ccggatccgc 300 
ccgcgcggct acatgcacaa ctggtcgccg ctcacgctgg atccgggcgc cggcgccgcg 360 
aacgtggtgc tgctcgatac gacgaaatcg ctgacggccg tctcggtcga cacgtcggca 420 
cgtccggcgc gcgtcaccgc ccaaacgggc atctcgctgg agtcgttgct cgcgacgctc 480 
gaacagtatg gcctcggcgt gattgccgcg cctgcgccgg gcaacatcac gctcggcggt 540 
gcgctcgcga tcgatgcgca cggcactgcc gtgccggcgg tcggtgaaac cttgcaaccg 600 
ggacacacct acggctcgct gagcaacctc gtggtcgcgc tcaccgcggt cgtgtacgat 660 
ccggcccggc agcaatacgt gctgcgccgg ttcgaacgca gcgatcccga gatcggcgcg 720 
ttcctcgcgc acatcgggcg ggcgttcgtc gtcgaagtca cgctgacggc aggccccaac 780 
cagcgcctgc gctgccagag ctacgtcgac attccggcct ccgaactgtt tgcgccggcc 840 
ggcacgtcgg gccgcacgat cacgtcgttt ctcgatcgcg cgggccgggt ggaagccatc 900 
tggtttccgt ttacgtccag cccgtggctc aaggtctgga cgcccacgcc cagcaagccg 960 
ttcctgtcgc gcgccgtcac gcagccgtac aactatccgt tctccgattc gatctcgcag 1020 
tccatctcgg atctcgtcaa gcggatcgtg atcggcggcg aaggcgcatt gacgccgctg 1080 
ttcggccaga cgcaattggc catcacggcc gccggtctcg cgctcacgct cagcggggat 1140 
atctggggct ggtcgcgcac cgtgctgcag tacattcgac cgacgacgct gcgcgtgacc 1200 
gcgaacggct atgcggtact ggcgcggcgc gccgacgtgc agcgcgtgat cagcgagttc 1260 
gtgcagttct atcagaaccg cgtcgacacg tacaaggcgc gcggcgagta tccgatgaac 1320 
ggtcccgtcg agatccgcat caccggtctc gacaagccgg ccgatgccgg cgccggcgcg 1380 
gccgtgccca gcctgtccgc actcaagccg cgccccgacc ggccggagtg ggacgtggcc 1440 
gtgtggttcg atattctgac gttaccgggc acgccgtccg ccgatcgctt ctatcgcgag 1500 
atcgagcaat ggatgctcgc gaactacacc ggttcgtatg cgacgctgcg ccccgaatgg 1560 
tcgaagggtt ggggctatac cgatacggct gcctggcaag acgacacgat gctcaccacc 1620 
acgattccga acctgcaacg tgaagggcag ccggcgtcga gcacgtggga tacggcgcgc 1680 
gcgacgctcg aacgctacga cccgcaccgg atcttccgct cgccgctgct ggatcggttg 1740 
atgccgtaa                                                         1749 
<210>5 
<211>540 
<212>PRT 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>5 
Met Ala Asp Ala Pro Pro Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr 
  1               5                 10                   15 
Lys Gln Ala Phe Gln Asn Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val 
             20                  25                  30 
Trp Thr Ala Ala Pro Arg Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn 
         35                  40                  45 
Trp Ala Arg Ala Asn Gly Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His 
     50                  55                  60 
Asn Trp Ser Pro Leu Thr Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val 
65                   70                  75                  80 
Val Leu Leu Asp Thr Thr Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr 
                 85                 90                   95 
Ser Ala Arg Pro Ala Arg Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu 
            100                 105                 110 
Ser Leu Leu Ala Thr Leu Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala 
        115                 120                  125 
Pro Ala Pro Gly Asn Ile Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala 
    130                 135                 140 
His Gly Thr Ala Val Pro Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His 
145                 150                 155                 160 
Thr Tyr Gly Ser Leu Ser Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val 
                165                 170                 175 
Tyr Asp Pro Ala Arg Gln Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser 
            180                 185                 190 
Asp Pro Glu Ile Gly Ala Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val 
        195                 200                 205 
Val Glu Val Thr Leu Thr Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln 
    210                 215                 220 
Ser Tyr Val Asp Ile Pro Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr 
225                 230                 235                 240 
Ser Gly Arg Thr Ile Thr Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu 
                245                 250                 255 
Ala Ile Trp Phe Pro Phe Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr 
            260                 265                 270 
Pro Thr Pro Ser Lys Pro Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr 
        275                 280                 285 
Asn Tyr Pro Phe Ser Asp Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val 
    290                 295                 300 
Lys Arg Ile Val Ile Gly Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly 
305                 310                 315                 320 
Gln Thr Gln Leu Ala Ile Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser 
                325                 330                 335 
Gly Asp Ile Trp Gly Trp Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro 
            340                 345                 350 
Thr Thr Leu Arg Val Thr Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg 
        355                 360                 365 
Ala Asp Val Gln Arg Val Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn 
    370                 375                 380 
Arg Val Asp Thr Tyr Lys Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro 
385                 390                 395                 400 
Val Glu Ile Arg Ile Thr Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ala 
                405                 410                 415 
Gly Ala Ala Val Pro Ser Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg 
            420                 425                 430 
Pro Glu Trp Asp Val Ala Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly 
        435                 440                 445 
Thr Pro Ser Ala Asp Arg Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu 
    450                 455                 460 
Ala Asn Tyr Thr Gly Ser Tyr Ala Thr Leu Arg Pro Glu Trp Ser Lys 
465                 470                 475                 480 
Gly Trp Gly Tyr Thr Asp Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu 
                485                 490                 495 
Thr Thr Thr Ile Pro Asn Leu Gln Arg Glu Gly Gln Pro Ala Ser Ser 
            500                 505                 510 
Thr Trp Asp Thr Ala Arg Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg 
        515                 520                 525 
Ile Phe Arg Ser Pro Leu Leu Asp Arg Leu Met Pro 
    530                 535                 540 
<210>6 
<211>1623 
<212>DNA 
<213>Burkholderia cepacia ST-200 
<400>6 
atggcagatg cgccaccgcc aggttttccg gcagatattc cgctttataa acaagcgttt 60 
cagaattgga gcggtgaaat tgcagttcag gatgtttgga ctgcagcgcc gcgttctgca 120 
gatgatgttg ttgcggcggt taattgggcg cgtgcgaatg gttatcgtat tcgtccacgt 180 
ggttacatgc acaactggtc gccgctcacg ctggatccgg gcgccggcgc cgcgaacgtg 240 
gtgctgctcg atacgacgaa atcgctgacg gccgtctcgg tcgacacgtc ggcacgtccg 300 
gcgcgcgtca ccgcccaaac gggcatctcg ctggagtcgt tgctcgcgac gctcgaacag 360 
tatggcctcg gcgtgattgc cgcgcctgcg ccgggcaaca tcacgctcgg cggtgcgctc 420 
gcgatcgatg cgcacggcac tgccgtgccg gcggtcggtg aaaccttgca accgggacac 480 
acctacggct cgctgagcaa cctcgtggtc gcgctcaccg cggtcgtgta cgatccggcc 540 
cggcagcaat acgtgctgcg ccggttcgaa cgcagcgatc ccgagatcgg cgcgttcctc 600 
gcgcacatcg ggcgggcgtt cgtcgtcgaa gtcacgctga cggcaggccc caaccagcgc 660 
ctgcgctgcc agagctacgt cgacattccg gcctccgaac tgtttgcgcc ggccggcacg 720 
tcgggccgca cgatcacgtc gtttctcgat cgcgcgggcc gggtggaagc catctggttt 780 
ccgtttacgt ccagcccgtg gctcaaggtc tggacgccca cgcccagcaa gccgttcctg 840 
tcgcgcgccg tcacgcagcc gtacaactat ccgttctccg attcgatctc gcagtccatc 900 
tcggatctcg tcaagcggat cgtgatcggc ggcgaaggcg cattgacgcc gctgttcggc 960 
cagacgcaat tggccatcac ggccgccggt ctcgcgctca cgctcagcgg ggatatctgg 1020 
ggctggtcgc gcaccgtgct gcagtacatt cgaccgacga cgctgcgcgt gaccgcgaac 1080 
ggctatgcgg tactggcgcg gcgcgccgac gtgcagcgcg tgatcagcga gttcgtgcag 1140 
ttctatcaga accgcgtcga cacgtacaag gcgcgcggcg agtatccgat gaacggtccc 1200 
gtcgagatcc gcatcaccgg tctcgacaag ccggccgatg ccggcgccgg cgcggccgtg 1260 
cccagcctgt ccgcactcaa gccgcgcccc gaccggccgg agtgggacgt ggccgtgtgg 1320 
ttcgatattc tgacgttacc gggcacgccg tccgccgatc gcttctatcg cgagatcgag 1380 
caatggatgc tcgcgaacta caccggttcg tatgcgacgc tgcgccccga atggtcgaag 1440 
ggttggggct ataccgatac ggctgcctgg caagacgaca cgatgctcac caccacgatt 1500 
ccgaacctgc aacgtgaagg gcagccggcg tcgagcacgt gggatacggc gcgcgcgacg 1560 
ctcgaacgct acgacccgca ccggatcttc cgctcgccgc tgctggatcg gttgatgccg 1620 
taa                                                               1623 
<210>7 
<211>42 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>7 
tatggcagat gcgccaccgc caggttttcc ggcagatatt cc 42 
<210>8 
<211>39 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>8 
taaccacgtg gacgaatacg ataaccattc gcacgcgcc     39 
<210>9 
<211>48 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>9 
gctttataaa caagcgtttc agaattggag cggtgaaatt gcagttca 48 
<210>10 
<211>48 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>10 
caattaaccg ccgcaacaac atcatctgca gaacgcggcg ctgcagtc 48 
<210>11 
<211>48 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>11 
ggatgtttgg actgcagcgc cgcgttctgc agatgatgtt gttgcggc 48 
<210>12 
<211>48 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>12 
caaacatcct gaactgcaat ttcaccgctc caattctgaa acgcttgt 48 
<210>13 
<211>52 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>13 
ggttaattgg gcgcgtgcga atggttatcg tattcgtcca cgtggttaca tg 52 
<210>14 
<211>49 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Sequence 
<400>14 
ttataaagcg gaatatctgc cggaaaacct ggcggtggcg catctgcca     49 
<210>15 
<211>30 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>15 
cgtggttaca tgcacaactg gtcgccgctc                          30 
<210>16 
<211>34 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>16 
ggaattccat atgttacggc atcaaccgat ccag                     34 
<210>17 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence     
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>17 
cctgcgccgg gcaacatcac gctgggc 27 
<210>18 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>18 
ggcgagcgtg atgttgcccg gcgcagg 27 
<210>19 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>19 
gccgcgcctg cgctgggcga catcacg 27 
<210>20 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>20 
cgtgatgtcg cccagcgcag gcgcggc         27 
<210>21 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>21 
gcggtcgtgt acgagccggc ccggcag         27 
<210>22 
<211>27 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>22 
ctgccgggcc ggctcgtaca cgaccgc         27 
<210>23 
<211>33 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>23 
gccgcgcctg cgctgggcaa catcacgctc ggc  33 
<210>24 
<211>33 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>24 
gccgagcgtg atgttgccca gcgcaggcgc ggc 33 
<210>25 
<211>26 
<212>DNA 
<213>Artificial Sequence 
<220> 
<223>Artificially Synthesized Primer Sequence 
<400>25 
aggaggtttc atatggcaga tgcgcc         26 

Claims (2)

1.一种具有胆固醇氧化酶活性和对表面活性剂具有提高的稳定性的蛋白质，所述蛋白质是选自以下(a)至(c)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质，以及
(c)由仅含突变P131L和/或D178E的SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.选自以下(a)至(c)的DNA的基因，其所编码的蛋白质具有胆固醇氧化酶活性和对表面活性剂具有提高的稳定性：
(a)由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的DNA，
(b)由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的DNA，以及
(c)编码由仅含突变P131L和/或D178E的SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA。
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Doukyu N et al..Cloning, sequence analysis and expression of a geneencoding an organic solvent- and detergent-tolerantcholesterol oxidase of Burkholderia cepacia strain ST-200.Applied Microbiology and Biotechnology57 1-2.2001,57(1-2),146-152. *
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