CN110004121B - 一种胆固醇氧化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胆固醇氧化酶及其应用，属于酶工程技术领域。本发明首先构建得到胆固醇氧化酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑pET20b(+)‑COD，其发酵所得的粗酶液中胆固醇氧化酶酶活高达700U·L^‑1，纯化得到的胆固醇氧化酶比酶活为18.5U·mg^‑1，其分子量约60,000kDa，该胆固醇氧化酶具有良好的温度耐受性和有机溶剂耐受性。利用工程菌发酵液制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮和胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮，在有机相为甲苯的两相转化体系中，以胆固醇为底物制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮的转化率为30％；制备胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮的转化率为45％。

Description

一种胆固醇氧化酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种胆固醇氧化酶及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase；EC1.1.3.6；COD)属于黄素氧化酶类，能特异性氧化含3β-OH的类固醇底物。胆固醇氧化酶具有重要医学检测价值，可用于定量血样胆固醇的含量，如动脉粥样硬化性疾病需评估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及评估血栓形成的风险等，而将胆固醇氧化酶固定在膜上采用电化学生物传感器测定胆固醇的含量是最近研究的热潮；胆固醇氧化酶具有广泛的底物特异性，可以转化大量的3β-羟甾类化合物，为工业类固醇药物甾体激素或甾体类药物的合成生产提供有用的中间体。

甾醇的5-烯-3-酮衍生物、4-烯-3-酮衍生物、4-烯-3,6-二酮衍生物都具有良好的脂质代谢改善功能，可作为减肥药，在治疗肝病、动脉粥样硬化及抗肥胖等方面具有显著疗效。甾醇的烯酮衍生物主要通过化学合成或天然产物提取获得。例如胆甾-4-烯-3,6-二酮是以胆固醇为原料，经过Jones试剂氧化或PCC/二氯甲烷法化学合成，或是来源于海洋天然产物提取物；豆甾-4-烯-3,6-二酮可由植物提取物中获得；胆甾-4-烯-3酮可利用微生物所产的胆固醇氧化酶以胆固醇或其衍生物为底物获得。

目前已报道的产胆固醇氧化酶的微生物菌株主要有以下属：诺卡氏菌属、假单胞菌属、短杆菌属、红球菌属、链霉菌属、节杆菌属、棒杆菌属和芽孢杆菌属等。因甾醇类物质不溶于水，尤其是在甾体药物的生物催化过程中，需要高温和高比例有机溶剂促溶剂的参与，对酶和微生物的温度耐受性、有机溶剂耐受性提出了较高要求。目前研究较多的生产该酶的菌株主要为革兰氏阳性菌，所产生的胆固醇氧化酶热稳定性和有机溶剂耐受性不佳且酶活力较低，无法达到工业上生产的需求。因此，如何获得温度耐受性和有机溶剂耐受性好且酶活力高的胆固醇氧化酶显得十分重要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种胆固醇氧化酶，所述胆固醇氧化酶含有下述氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.1所示；或者，

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有胆固醇氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供所述胆固醇氧化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体、细胞、转化体。

本发明的第四个目的是提供一种产胆固醇氧化酶的重组菌，表达所述胆固醇氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pET28a(+)为载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明的第五个目的是提供一种用于临床诊断的试剂盒，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第六个目的是提供一种生物杀虫剂，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第七个目的是提供一种食品中的脂质代谢改善剂，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第八个目的是提供一种生产所述胆固醇氧化酶的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。

本发明的第九个目的是提供一种制备3β-OH甾醇的烯酮衍生物的方法，所述方法是应用所述的胆固醇氧化酶或所述重组菌以3β-OH甾醇为底物进行生产。

在本发明的一种实施方式中，所述3β-OH甾醇为胆固醇。

在本发明的一种实施方式中，所述烯酮衍生物为胆甾-4-烯-3-酮或胆甾-4-烯-3,6-二酮。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是在含有有机相的两相转化体系中进行。

在本发明的一种实施方式中，所述有机相包括甲苯、苯、正己烷。

本发明的有益效果：

(1)本发明的胆固醇氧化酶的热稳定性良好，熔解温度Tm值为71.03；本发明的胆固醇氧化酶在有机溶剂(乙酸乙酯、石油醚、丁醇、氯仿、苯、甲苯、对二甲苯、1,3,5-三甲苯、环己烷、正己烷、正辛烷)中的相对残留酶活高于水溶液中残留酶活，说明该酶具有良好的有机溶剂耐受性。

(2)本发明构建得到的胆固醇氧化酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET20b(+)-COD发酵所得的粗酶液中，胆固醇氧化酶酶活高达700U·L^-1。纯化得到的胆固醇氧化酶比酶活为18.5U·mg^-1。

(3)利用工程菌粗酶液在有机相为甲苯的两相转化体系中，以胆固醇为底物催化制备胆甾-4-烯-3-酮的转化率为30％，制备胆甾-4-烯-3,6-二酮的转化率为45％。

生物材料保藏

本发明所提供的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15，分类学命名为Burkholderia cepacia ZWS15洋葱伯克霍尔德菌ZWS15，已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017661，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1：蛋白纯化的SDS-PAGE鉴定；lane2：纯化得到的胆固醇氧化酶。

图2：胆甾-4-烯-3-酮结构式及质谱鉴定。

图3：催化产物中胆甾-4-烯-3-酮的¹³C-NMR鉴定。

图4：催化产物中胆甾-4-烯-3-酮的¹H-NMR鉴定。

图5：胆甾-4-烯-3,6-二酮结构式及质谱鉴定。

图6：催化产物中胆甾-4-烯-3,6-二酮的¹³C-NMR鉴定。

图7：催化产物中胆甾-4-烯-3,6-二酮的¹H-NMR鉴定。

图8：工程菌粗酶液转化产物粗品TLC分析图；Lane1，胆甾-4-烯-3,6-二酮标品；Lane2，胆甾-4-烯-3-酮标品；Lane3，甲苯/粗酶液转化产物；Lane4，苯/粗酶液转化产物；Lane5，正己烷/粗酶液转化产物。

图9：工程菌粗酶液转化产物纯品TLC分析图。Lane1，转化获得的胆甾-4-烯-3-酮纯品；Lane2，转化获得的胆甾-4-烯-3,6-二酮纯品。

具体实施方式

胆固醇氧化酶酶活的测定：利用胆固醇氧化酶与辣根过氧化物酶的耦合反应，胆固醇氧化酶氧化类固醇底物产生的H₂O₂，可以在辣根过氧化酶的作用下使苯酚与4-氨基-安替比林产生红色苯醌亚胺类化合物，在A500处有最大吸收峰。具体操作：比色管中加入3mL检测液A(4-氨基-安替比林，1mmol/L；苯酚，6mmol/L；叠氮钠，0.2g/L；过氧化物酶，5000U/L；磷酸钾缓冲液，25mmol/L，pH 7.5)+50μL酶液+150μL类固醇底物(异丙醇为溶剂)，三种组分振荡混匀后，37℃水浴15min，立即用沸水煮3min，使酶失活，放冷水中冷却；9000rpm，离心2min；取上清A500处测吸光值，平行实验测三次，取平均值。酶活标准曲线的测定参见文献(陈亦.胆固醇氧化酶亲和纯化及酶稳定性研究〔D〕.无锡.江南大学.2013)。

胆固醇氧化酶酶活力单位定义：在37℃下，每分钟催化1μmol类固醇底物催化成产物所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

转化率的计算公式：生成的产物摩尔量/消耗的底物摩尔量*100％＝转化率

实施例1：利用Burkholderia cepacia ZWS15制备胆固醇氧化酶

将洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15接种至发酵培养基中，于30℃、转速为200rpm的摇床中振荡培养20-28h。

发酵培养基：每1L蒸馏水中添加蛋白胨10g，酵母粉5g，K₂HPO₄ 2g，KCl 0.5g，NaNO₃2g，TritonX-100 3.4mL，MgSO₄ 100mM，葡萄糖0.1g，胆固醇2g，pH 7.0。

其中：胆固醇添加方式为与一定量培养基混合，添加TritonX-100后超声破碎处理10min。

将获得的发酵液在4℃下，8000rpm离心5-10min除去细胞，取上层清液即为粗酶液。测得粗酶液中胆固醇氧化酶酶活为200U·L^-1。

将获得的粗酶液通过质量百分比为50％的硫酸铵进行沉淀；收集沉淀物，用pH7.0的磷酸缓冲液溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓缩，通过DEAE离子交换柱层析获得纯胆固醇氧化酶。测得纯胆固醇氧化酶的比酶活为15U·mg^-1。

实施例2：胆固醇氧化酶基因工程菌的构建

细菌基因组试剂盒提取Burkholderia cepacia ZWS15的基因组作为模板，设计引物(见表1)进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃预变性4min，95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃再延伸10min。得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的胆固醇氧化酶的基因片段。

回收目的片段经EcoR I、Hind III双酶切，回收后与相同内切酶酶切后的质粒pET20b(+)在T4连接酶的作用下，16℃连接，得到重组质粒pET20b(+)-COD，将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得胆固醇氧化酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET20b(+)-COD。

表1引物序列表

实施例3：利用工程菌制备胆固醇氧化酶

(1)粗酶液的制备

种子液培养条件：采用250mL摇瓶培养，装液为20％的LB培养基，并在培养基中加入过滤除菌的100mg·mL^-1硫酸卡那霉素50μL，取工程菌E.coli BL21(DE3)-pET20b(+)-COD单菌落至培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

发酵培养条件：采用500mL摇瓶培养，装液为20％的发酵培养基，其中的MgSO₄·7H₂O，葡萄糖，甘油分别配成母液，单独灭菌，用时添加相应的量，并加入过滤除菌的100mg·mL^-1的硫酸卡那霉素100μL，加入5％的种子液，37℃，200rpm，培养8h，加入20％的乳糖诱导液，28℃，200rpm，诱导培养20h。

发酵培养基：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，KH₂PO₄ 2g·L^-1，K₂HPO₄ 4g·L^-1，Na₂HPO₄·12H₂O 7g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1.2g·L^-1，NH₄Cl 0.2g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 1g·L^-1，甘油10mL·L^-1。

菌体的收集及粗酶液的获得：将发酵液8000rpm离心5min，称得湿重，按1g湿菌体加入20mL pH7.5，20mmol·mL^-1的磷酸缓冲液的比例重悬菌体，进行超声破碎，使用过程破壁4min，停1min，并吹打菌液，防止破壁过程中因温度过高导致酶的失活，破壁30min后8000rpm离心10min，上清即为粗酶液。测得粗酶液中胆固醇氧化酶酶活为700U·L^-1。

(2)胆固醇氧化酶的纯化

以琼脂糖为基质，2-羟基-1,3-丙二胺连接臂，8-氯咯嗪为配体合成的介质进行亲和纯化。将上样粗酶液的电导率与20mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.5)的电导率调节到一致。15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端导管打开，装入3mL介质，静置沉淀，使柱中乙醇流出约至略高出介质界面。用20mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.5)平衡10个柱体积。取20mL粗酶液加到平衡好的亲和介质中。用20mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.5)洗10个柱体积，洗去未结合的蛋白，再用含0.1mol·L^-1NaCl的磷酸缓冲液(pH 7.5)洗去部分与介质结合不牢固的杂蛋白。以含0.5mol·L^-1NaCl的磷酸缓冲液(pH 7.5)为洗脱液，收集并测定COD活性用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。测得纯化得到的胆固醇氧化酶比酶活为18.5U·mg^-1，其分子量约60,000kDa。

表2不同菌株发酵得到的胆固醇氧化酶

实施例4：胆固醇氧化酶的有机溶剂分析及热稳定性分析

(1)胆固醇氧化酶的热稳定参数熔解温度(Tm)的测定

熔解温度通过差示扫描量热仪(DSC)进行测定。测定时，取实施例3制备得到的纯胆固醇氧化酶酶液，蛋白浓度为1.0mg/mL，缓冲液体系为Tris-HCl缓冲液(pH 9.0，20mM)。温度变化速率为10℃/min，温度变化区间为20～90℃。结果显示胆固醇氧化酶的熔解温度Tm值为71.03，表明该酶的热稳定性良好。

(2)胆固醇氧化酶的有机溶剂耐受性分析

取实施例3中得到的胆固醇氧化酶纯酶液2U/mL，与30％(v/v)不同种类(如乙酸乙酯、石油醚、丁醇、氯仿、苯、甲苯、对二甲苯、1,3,5-三甲苯、环己烷、正己烷、正辛烷)的疏水性有机溶剂混合，以添加30％(v/v)水的纯酶液作为对照，置于37℃、转速为200rpm的摇床中震荡培养24小时，使用胆固醇作为底物，测定混合后残留的酶活，结果如表3所示。表明胆固醇氧化酶在有机溶剂中的相对残留酶活高于水溶液中残留酶活，该酶具有良好的有机溶剂耐受性。

表3有机溶剂对胆固醇酯酶稳定性的影响

注：Log Pow(辛醇/水分配系数)：物质在辛醇/水之间的分配系数的对数。表征有机溶剂的一个参数，该值越大，说明有机溶剂的疏水性越强。

实施例5：甲苯/粗酶液两相体系中制备甾醇衍生物

甲苯/粗酶液两相体系：50mL粗酶液，2mg/mL胆固醇，10％(v/v)甲苯。

(1)取实施例3中制备得到的工程菌胆固醇氧化酶粗酶液50mL，加入2mg/mL胆固醇，10％(v/v)甲苯，37℃、200rpm振荡反应48h。将催化混合产物利用薄层层析法(TLC)检测产物的生成情况，结果表明在催化产物中含有两种产物：胆甾-4-烯-3-酮和胆甾-4-烯-3,6-二酮(见图8lane 3)。最终收集到胆甾-4-烯-3-酮的量约为底物添加量的20％，胆甾-4-烯-3,6-二酮的量约为底物添加量的35％。

(2)催化产物的纯化与鉴定

催化反应液用三氯甲烷萃取，于真空旋转蒸发仪中干燥，得到催化产物混合品。利用制备型TLC分离纯化，于真空旋转蒸发仪中干燥，得到各产物纯品。

将胆甾-4-烯-3-酮纯品经LC-MS(图2)、¹³C-NMR(图3)和¹H-NMR鉴定(图4)，结果表明该催化产物确实为胆甾-4-烯-3-酮；将胆甾-4-烯-3,6-二酮经LC-MS(图5)、¹³C-NMR(图6)和¹H-NMR鉴定(图7)，结果表明该催化产物确实为胆甾-4-烯-3,6-二酮，将获得的催化产物纯品进行TLC分析，结果表明，催化产物经纯化后分别得到纯品胆甾-4-烯-3-酮(图9lane1)和胆甾-4-烯-3,6-二酮(图9lane 2)。

实施例6：苯/粗酶液两相体系中制备甾醇衍生物

与实施例5中制备过程相同，所不同的是两相体系中的有机相为苯。

苯/粗酶液两相体系：50mL粗酶液，2mg/mL胆固醇，10％(v/v)苯。

取实施例3中制备得到的工程菌胆固醇氧化酶粗酶液50mL，加入2mg/mL胆固醇，10％(v/v)苯，37℃、200rpm振荡反应48h。将催化混合产物利用薄层层析法(TLC)检测产物的生成情况，结果表明在催化产物中含有两种产物：胆甾-4-烯-3-酮和胆甾-4-烯-3,6-二酮(见图8lane 4)。

实施例7：正己烷/粗酶液两相体系中制备甾醇衍生物

与实施例5中制备过程相同，所不同的是两相体系中的有机相为正己烷

正己烷/粗酶液两相体系：50mL粗酶液，2mg/mL胆固醇，10％(v/v)正己烷。

取实施例3中制备得到的工程菌胆固醇氧化酶粗酶液50mL，加入2mg/mL胆固醇，10％(v/v)正己烷，37℃、200rpm振荡反应48h。将催化混合产物利用薄层层析法(TLC)检测产物的生成情况，结果表明在催化产物中含有两种产物：胆甾-4-烯-3-酮和胆甾-4-烯-3,6-二酮(见图8lane 5)。

表4不同有机溶剂中产物的转化率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种胆固醇氧化酶及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu

1 5 10 15

Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Thr Gly Trp Thr

20 25 30

Pro Leu Tyr Gln Val Ala Ala His Ala Arg Thr Pro Gly Asp Thr Pro

35 40 45

Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Leu Asn

50 55 60

Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg

65 70 75 80

Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Thr Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly

85 90 95

Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Thr His Asn Trp Ser Pro Leu Thr

100 105 110

Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Leu Val Leu Leu Asp Thr Thr

115 120 125

Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg

130 135 140

Val Thr Ala Gln Thr Gly Val Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asp Ile

165 170 175

Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro

180 185 190

Ala Ala Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser

195 200 205

Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Phe Asp Pro Ala Arg Gln

210 215 220

Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Thr Asp Pro Glu Ile Gly Ala

225 230 235 240

Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Leu Val Val Glu Val Thr Leu Thr

245 250 255

Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro

260 265 270

Ala Ser Glu Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Arg Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe

290 295 300

Thr Thr Lys Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro

305 310 315 320

Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp

325 330 335

Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly

340 345 350

Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile

355 360 365

Thr Thr Ala Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Ile Trp Gly Trp

370 375 380

Ser Arg Thr Val Leu Gln Tyr Ile Arg Pro Thr Thr Leu Arg Val Thr

385 390 395 400

Ala Asn Gly Tyr Ala Val Leu Ala Arg Arg Ala Asp Val Gln Arg Val

405 410 415

Ile Ser Glu Phe Val Gln Phe Tyr Gln Asn Arg Val Asp Thr Tyr Lys

420 425 430

Ala Arg Gly Glu Tyr Pro Met Asn Gly Pro Val Glu Ile Arg Val Thr

435 440 445

Gly Leu Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Pro Gly Ala Ala Val Pro Ala

450 455 460

Leu Ser Ala Leu Lys Pro Arg Pro Asp Arg Pro Glu Trp Asp Thr Ala

465 470 475 480

Val Trp Phe Asp Ile Leu Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ala Ala Asp Arg

485 490 495

Phe Tyr Arg Glu Ile Glu Gln Trp Met Leu Ala Asn Tyr Thr Gly Ser

500 505 510

Tyr Ala Thr Val Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly Trp Ala Tyr Thr Asp

515 520 525

Thr Ala Ala Trp Gln Asp Asp Thr Met Leu Thr Thr Thr Ile Pro Asn

530 535 540

Leu His Arg Glu Gly Gln Pro Pro Ser Ser Ser Trp Asp Thr Ala Arg

545 550 555 560

Ala Thr Leu Glu Arg Tyr Asp Pro His Arg Ile Phe Arg Ser Pro Leu

565 570 575

Leu Asp Arg Leu Met Pro

580

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgagtcaag acttccgaga cgaaccagcg tcgcgccgcg ctttcctcgc cgacatggcg 60

aagctcgcgg cggccggcat cgtcaccggc tggacaccgc tctaccaggt tgcggcgcac 120

gcgcggacac ccggcgacac accgcccggc ttcccggccg acatcccgct ttacaagcag 180

gcgttcctga actggagcgg cgagatcgcc gtgcaggacg tatggaccgc cgcgccgcgc 240

tccgccgacg acgtcgtcgc aaccgtcaac tgggcgcgcg caaacggcta ccggatacgc 300

ccgcgcggct acacgcacaa ctggtcgccg ctgacgctgg acccgggcgc cggcgccgcg 360

aacctcgtgc tgctcgatac gacgaagtcg ctgacggccg tctccgtcga cacgtcggcg 420

cgtccggcgc gcgtcaccgc ccaaacgggc gtctcgctgg agtcgctgct cgcaacgctc 480

gagcagtacg gcctcggcgt gattgccgcg ccggcaccgg gcgacatcac gctcggcggc 540

gcgctcgcga tcgatgcaca cggcaccgcc gtgccggcgg ccggtgaaac cttgcagccg 600

ggccatacct acggctcgct gagcaatctc gtggtcgcgc tcacggcggt cgtgttcgat 660

ccggcccggc agcaatacgt gctgcgccgg ttcgagcgca ccgatcccga gatcggcgcg 720

tttctcgcgc acatcgggcg ggcgctcgtc gtcgaggtca cgctgacggc aggcccgaac 780

cagcggctac gctgccagag ctacgtcgat attccggcat ccgaactgtt cgccgcggcc 840

ggcgcgacag gccgcacgat cgcgtcgttt ctcgatcgcg cgggccgggt ggaagccatc 900

tggtttccgt ttacgaccaa gccgtggctc aaggtctgga cgccgacgcc cagcaagccg 960

ttcctgtcgc gcgccgtcac gcagccgtac aactatccgt tctccgattc gatctcgcag 1020

tccatctcgg atctcgtcaa gcggatcgtg atcggcggcg aaggcgcatt gacaccgctg 1080

ttcggccaga cgcagctggc catcacgacg gccggtctcg cactcacgct cagcggggac 1140

atctggggct ggtcgcgcac cgtgctgcag tacattcggc caacgacgct gcgcgtcacc 1200

gcgaacggct acgcggtact ggcgcggcgc gccgacgtgc agcgcgtgat cagcgaattc 1260

gtgcagttct atcagaaccg cgtcgacacg tacaaggcgc gcggcgagta tccgatgaac 1320

ggtcccgtcg agatccgcgt caccggtctc gacaagccgg ccgatgccgg cccgggcgcg 1380

gccgtacccg ccttgtccgc gctcaagccg cgccccgacc ggccggaatg ggataccgcc 1440

gtatggttcg acatcctgac gttgccgggc acgccggccg ccgatcgctt ctatcgcgag 1500

atcgagcaat ggatgctcgc gaactacacc ggctcgtatg cgacggtgcg cccggaatgg 1560

tcgaagggct gggcctatac cgacacggcc gcctggcagg acgacacgat gctcaccacc 1620

acgattccga acctgcatcg tgagggccag ccgccgtcga gcagctggga tacggcgcgc 1680

gcgacgctcg agcgctacga tccgcaccgg atcttccggt cgccgctgct ggatcggttg 1740

atgccgtaa 1749

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aattaccgga attcatgagt caagacttcc gaga 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aattaccgaa gctttcacca tcaaccgatc cag 33

Claims (10)

1.一种胆固醇氧化酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的胆固醇氧化酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.携带权利要求2所述基因的载体、细胞、转化体。

5.一种产胆固醇氧化酶的重组菌，其特征在于，表达权利要求1所述的胆固醇氧化酶。

6.一种用于临床诊断的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的胆固醇氧化酶。

7.一种生物杀虫剂，其特征在于，含有权利要求1所述的胆固醇氧化酶。

8.一种食品中的脂质代谢改善剂，其特征在于，含有权利要求1所述的胆固醇氧化酶。

9.一种生产权利要求1所述胆固醇氧化酶的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求5所述的重组菌进行发酵生产。

10.一种制备3β-OH甾醇的烯酮衍生物的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1所述的胆固醇氧化酶或权利要求5所述重组菌以3β-OH甾醇为底物进行生产。

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