WO2018126466A1 - 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1 - Google Patents

一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1 Download PDF

Info

Publication number
WO2018126466A1
WO2018126466A1 PCT/CN2017/070602 CN2017070602W WO2018126466A1 WO 2018126466 A1 WO2018126466 A1 WO 2018126466A1 CN 2017070602 W CN2017070602 W CN 2017070602W WO 2018126466 A1 WO2018126466 A1 WO 2018126466A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydroxy
steroid dehydrogenase
acid
cholanoic
oxo
Prior art date
Application number
PCT/CN2017/070602
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
傅荣昭
刘立辉
刘滔滔
曹磊
彭亭
Original Assignee
深圳市邦泰绿色生物合成研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 filed Critical 深圳市邦泰绿色生物合成研究院
Priority to CN201780001715.0A priority Critical patent/CN107995928B/zh
Priority to PCT/CN2017/070602 priority patent/WO2018126466A1/zh
Publication of WO2018126466A1 publication Critical patent/WO2018126466A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01159—7-Alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.159)

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology and biotechnology, and more particularly to a method for preparing 3d-hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid by using a biological enzyme catalytic technique and a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase for the preparation thereof.
  • 3d-hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid also known as 7-ketolithic acid, is an important intermediate for the preparation of ursodeoxycholic acid.
  • Ursodeoxycholic acid is the main active ingredient of the valuable Chinese medicine bear bile. It has the effects of increasing bile acid secretion, changing bile composition, lowering cholesterol and cholesterol in bile, and is mainly used for the treatment of gallstone disease.
  • bear bile is a very scarce resource, because the traditional way of obtaining it depends mainly on the method of artificially breeding live bears. At present, this traditional method with long cycle, low yield and inhumanity is gradually replaced by synthetic methods, and the known method of synthesizing ursodeoxycholic acid, 3d-hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholane Acids are extremely important intermediates.
  • Chinese invention patent application CN105368828A discloses a method for preparing 3ot-hydroxy-7 ox-5 ⁇ -cholanoic acid by whole cell catalysis, but this method requires cell fermentation culture, and the reaction period is long and the operation is cumbersome. The product is complicated and so on.
  • An object of the present invention is to provide a novel preparation method of 30C-hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid to solve the residual organic solvent existing in the prior preparation method mentioned in the above background art,
  • the present invention provides the biological enzyme to which the new preparation method is applicable, such as harsh conditions, long reaction time, cumbersome operation, high cost, and environmental pollution.
  • the biological enzyme and optimized on the basis of this sequence, obtains a mutant enzyme with increased activity and substrate inhibition, thereby eliciting a new method for preparing 3 ⁇ -hydroxy-7 ox-5 ⁇ -cholanoic acid , characterized by: using chenodeoxycholic acid as a substrate, in the presence of NAD, lactate dehydrogenase, sodium pyruvate and a buffer solution, catalyzing the synthesis of chenodeoxycholic acid with 7 ⁇ -steroid dehydrogenase 3d- Hydroxy-7 oxo-5 ⁇ choline acid, the 7oc-steroid dehydrogenase is derived from the genus Phytogali sp., the nucleotide sequence of the lactate dehydrogenase is SEQ ID
  • the concentration of the substrate is 50 to 100 mg/mL
  • the concentration of the NAD is 0.01 to 0.25 mg/mL
  • the concentration of the sodium pyruvate is 10 to 30 mg. /mL.
  • the specific forms of the two enzymes used in the above methods include liquid enzymes, solid enzymes, and various immobilized enzymes, either in the form of unpurified crude enzymes or in partially or completely purified form. .
  • the catalytic process is controlled at a temperature of 25 to 35 ° C and a pH of 7.5 to 8.5.
  • the buffer solution is a 50-100 mM potassium phosphate buffer.
  • the above preparation method further comprises the following purification step: after the end of the reaction of the catalytic process, the pH is adjusted to 1.0 to 2.0, stirred for 20 to 30 minutes, and after being cooled, filtered and dried to obtain 3oc- Finished product of hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid.
  • the above preparation method further comprises the following purification step: the obtained 3 ⁇ -hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid is obtained by using 8-15 times absolute ethanol 50-60. The mixture was stirred and refluxed for 0.5-lh under a water bath condition, filtered, and the filtrate was concentrated under vacuum to a volume of 1/4 to 1/5, and then stirred for 4 hours with 4-5 times of pure water, filtered, and the filter cake was vacuum dried overnight. A 3 ⁇ -hydroxy-7ox-5 ⁇ -cholanoic acid product is obtained.
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase used in the above preparation method is a protein of the following (a) or (b):
  • the 7ot-steroid dehydrogenase has at least one mutation selected from at least one of the following positions compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2: 67th, 68th Bit, 97th, 99th, 117th, and 192th.
  • the 7ot-steroid dehydrogenase has at least one of the following mutations: C67R, D68W, G97
  • the present invention also provides a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase derived from the genomonas
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase is a protein of the following (a) or (b):
  • the 7ot-steroid dehydrogenase has at least one mutation selected from at least one of the following positions compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2: 67th , 68th , 97th , 99th
  • the 7ot-steroid dehydrogenase has at least one of the following mutations: C67R, D68W, G97D, G99A, L117E, and T192E.
  • the method provided by the invention has the advantages of simple operation, mild and easy control of reaction conditions, short reaction time, and no use.
  • the organic solvent, non-toxic, non-polluting and low-cost advantages have been proved by practice that the reaction time of the method provided by the invention only needs 4 to 12 hours, and the conversion rate of the substrate is as high as 99.7% or more. The content is above 97.5%.
  • the present invention screens a 7ot-steroid dehydrogenase gene suitable for extracellular biocatalysis to prepare 3ot-hydroxy-7 ox-5 ⁇ -cholanoic acid, and optimizes on the basis of the sequence. Mutant enzymes with increased activity and removal of substrate inhibition, these mutant enzymes exhibit high selectivity such that the process does not form by-products The high catalytic activity and high specificity of these mutant enzymes make the 3 ⁇ -hydroxy-7 ox-5 ⁇ -cholanoic acid enzymatic mass production lower cost and have high industrial application value.
  • the chenodeoxycholic acid was suspended in 50-100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), the pH was adjusted to 8.0 with 10 M NaOH, and sodium pyruvate was added at a final concentration of 10 to 30 mg/mL and 10 M was used.
  • NaOH adjusts the pH to 8.0, adds 7 ⁇ -steroid dehydrogenase and lactate dehydrogenase, and finally adds NAD at a final concentration of 0.01 ⁇ 0.25mg/ml, the final concentration of the substrate is 50 ⁇ 100mg/mL, and the reaction is at temperature 25. ⁇ 35 ° C, 200 ⁇ 400 rpm and pH 7.5 ⁇ 8.5, the reaction time is 41! ⁇ 12h.
  • the reaction solution was diluted 50 to 100 times with the mobile phase at regular intervals, and the liquid phase was analyzed by microfiltration.
  • the um filter is filtered and used.
  • the column temperature was 40 ° C, the differential detector (RID), and the flow rate was 0.8 mIJmin.
  • hydrochloric acid is added to the pH of 1.0 ⁇ 2.0 with rapid stirring, and stirring is continued for 20 to 30 minutes.
  • the specific forms of the two enzymes used in the above methods include liquid enzymes, solid enzymes, and various immobilized enzymes, either in the form of unpurified crude enzymes or in partially or completely purified form. .
  • ATTCCACCGCAATGC3' was obtained by PCR amplification and digested, and inserted into the Nde I and EcoR I sites of the expression vector pET22b (+) and the EcoR I site and Xho I site to obtain a co-expression recombinant plasmid.
  • pET22b-AHSDH2-LDH was obtained by PCR amplification and digested, and inserted into the Nde I and EcoR I sites of the expression vector pET22b (+) and the EcoR I site and Xho I site to obtain a co-expression recombinant plasmid.
  • pET22b-AHSDH2-LDH was obtained by PCR amplification and digested, and inserted into the Nde I and EcoR I sites of the expression vector pET22b (+) and the EcoR I site and Xho I site to obtain a co-expression recombinant plasmid.
  • pET22b-AHSDH2-LDH
  • the nucleotide sequence of the cloned parent 7ot-steroid dehydrogenase is determined by DNA sequencing as shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 2; determining the cloned parental lactate
  • the nucleotide sequence of the hydrogenase is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the PCR system is: TaKaRa EX Taq HS 0.25ul; ⁇ Taq Buffer
  • the PCR procedure is: First 98. C2min; then 98. C10s, 55-56 ° C 30s, 72. C7min, 30 cycles; last 72 ° C for 10 min.
  • Example 3 The parental and mutant co-expression recombinant plasmids prepared in Example 1 and Example 2 were separately transferred into Escherichia coli Ro setta (de3), and the obtained recombinant Escherichia coli was inoculated into a small volume of LB medium (containing 10 (Vg/mL of Amp), after 30 ⁇ 37 °C overnight culture, transfer to a volume of LB medium (containing 10 (Vg/mL of Amp), in 30 ⁇ with an inoculation amount of 1 ⁇ 5 ⁇ 3 ⁇ 4
  • the OD 600 was further cultured at 37 ° C to reach 0.6 to 1.0, and isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG) was added at a final concentration of 0.1 mM to 1 M, and the expression was induced at 20 to 37 ° C for 10 to 20 hours.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • the cells are collected by centrifugation.
  • the fermenting cells are suspended in a volume of 50-100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) and ultrasonically disrupted, and centrifuged to contain lactate dehydrogenase and 7 ⁇ -steroid dehydrogenase parent or A crude enzyme solution of a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase mutant, which can be used for the determination of enzyme activity and biocatalytic preparation of 3d-hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid.
  • Lactate dehydrogenase enzyme activity assay method using sodium pyruvate as a substrate, in a 3mL reaction system, add 100uL of 50mM sodium pyruvate, lOOuL of diluted enzyme solution, NADH final concentration of 0.2mM, The reaction at pH 8. 0 and 25 ° C was constant, and the decrease in absorbance was measured at 340 nm.
  • the crude enzyme solution prepared in Example 3 is used, and the input amount of the enzyme solution accounts for the entire reaction system by the weight of the enzyme solution.
  • the volumetric meter, the final concentration of the control substrate chenodeoxycholic acid was 100 mg/mL, and the other specific parameters are shown in Table 3. Reaction 41! After ⁇ 12h, the substrate conversion rate was above 99.7%, the finished product content was above 97.5%, and the yield was 85 ⁇ 95%.
  • reaction solution was added with a hydrochloric acid solution to a pH of 1.2, and stirring was continued for 30 minutes, and then cooled, filtered, washed three times with water, and then dried in vacuo to give 60 g of 3oc-hydroxy-7-oxo-5?-cholane acid.
  • the product is stirred and refluxed with 900 ml of absolute ethanol under a water bath at 60 ° C for 1 h.
  • the filtrate is filtered and concentrated under vacuum to a volume of 200 ml, then 1 L of pure water is added and stirred for 1 h, filtered, and the filter cake is dried under vacuum overnight to obtain 3 ⁇ -hydroxy- 7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid refined product 52g.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用生物酶催化技术制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法及其制备用7α-类固醇脱氢酶。该方法以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，其中7α-类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌 Halomonas jeotgali sp.。该方法操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、对底物的转化率高达99.7%以上，所获得的产品的含量在97.5%以上。

Description

一种 3(x-羟基 -7氧代 -5β-胆垸酸的制备方法及其制备用酶 1
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 特别涉及一种利用生物酶催化技术制 备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法及其制备用 7α-类固醇脱氢酶。
背景技术
[0002] 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸又名 7-酮石胆酸， 是制备熊去氧胆酸的重要中间体。
而熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分， 具有增加胆汁酸分泌、 并使胆 汁成分改变、 降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效， 主要用于治疗胆石疾病。 众所周知， 熊胆是一种非常稀缺的资源， 原因在于其获取的传统途径主要是依 赖于人工养殖活熊取胆的方法。 目前， 这种周期长、 收率低且不人道的传统途 径逐渐被人工合成方法所取代， 而现知的人工合成熊去氧胆酸的方法中， 3d-羟 基 -7氧代 -5β-胆烷酸都是极为重要的中间体。
[0003] 目前 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的工业化生产多采用化学法， 但是存在操作条件 苛刻、 选择性低、 污染环境、 使用大量有机溶剂、 存在有机溶剂残留、 有毒有 害等缺点。 为了解决化学法存在的诸多缺点， 人们另辟蹊径， 寻找更好的生产 途径。 中国发明专利 CN1912192B公幵了一种采用电化学合成制备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法， 但是此种方法依然需要使用有机溶剂， 并且成本较高。 中国 发明专利申请 CN105368828A公幵了一种采用全细胞催化制备 3ot-羟基 -7氧代 -5β- 胆烷酸的方法， 但是此种方法需进行细胞发酵培养， 存在反应吋间长、 操作繁 琐、 产物复杂等缺点。
技术问题
[0004] 本发明的目的在于提供一种 30C-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的新的制备方法， 以解决 上述背景技术中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、 条件苛刻、 反应 吋间长、 操作繁琐、 成本较高、 污染环境等缺点， 本发明同吋提供了该新制备 方法适用的生物酶。
问题的解决方案 技术解决方案
[0005] 为实现上述目的， 发明人经过长期大量的实验摸索， 在经历上百次的失败尝试 之后， 终于筛选出适用于细胞外生物催化制备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的生物酶 ， 并在此序列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶， 从而幵发出一种新的制备 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法， 其特征在于： 以鹅去 氧胆酸为底物， 在 NAD、 乳酸脱氢酶、 丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下， 用 7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备 3d-羟基 -7氧代 -5β胆烷酸， 所述 7oc-类固 醇脱氢酶来源于盐单胞菌 Hal画觀 jeotgali sp.， 所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列 如 SEQ ID
NO : 3所示， 在整个催化反应体系中， 所述底物的浓度为 50〜100mg/mL， 所述 NAD的浓度为 0.01〜0.25mg/mL， 所述丙酮酸钠的浓度为 10〜30mg/mL。
[0006] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、 固态酶以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0007] 优选地， 控制所述催化过程在温度为 25〜35°C， pH值为 7.5〜8.5的条件下进行
[0008] 优选地， 所述缓冲溶液为 50〜100mM磷酸钾缓冲液。
[0009] 优选地， 上述制备方法还包括如下提纯步骤： 待所述催化过程反应结束后， 调 节 pH值为 1.0〜2.0， 搅拌 20〜30min， 待冷却后再经过滤水洗干燥后即得 3oc-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸成品。
[0010] 更优选地， 上述制备方法还包括如下精制步骤： 将获得的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆 烷酸成品用 8- 15倍无水乙醇 50-60。C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 过滤， 取滤液进 行真空减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 4-5倍纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真空干 燥过夜， 即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品。
[0011] 优选地， 上述制备方法中所使用的 7α-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋 白质：
[0012] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
[0013] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的 亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。
[0014] 更优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在 选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 67位、 第 68位、 第 97位、 第 99 位、 第 117位以及第 192位。
[0015] 更优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97
D、 G99A、 L117E以及 T192E。
[0016] 本发明还提供了一种 7α-类固醇脱氢酶， 所述 7α-类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌
Halomonas jeotgali
sp.， 用于催化鹅去氧胆酸制备 3α-羟基 -7氧代 -5β胆烷酸， 所述 7α-类固醇脱氢酶 为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
[0017] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
[0018] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的 亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。
[0019] 优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选 自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 67位、 第 68位、 第 97位、 第 99位
、 第 117位以及第 192位。
[0020] 优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97D 、 G99A、 L117E以及 T192E。
发明的有益效果
有益效果
[0021] 1、 与现有的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法相比， 本发明提供的方法具 有操作简单、 反应条件温和易控、 反应吋间短、 不使用有机溶剂、 无毒无污染 且成本低廉的优点， 经实践证明， 本发明提供的方法的反应吋长仅需 4〜12小吋 ， 其对底物的转化率高达 99.7%以上， 所获得的产品的含量在 97.5%以上。
[0022] 2、 本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的 7ot- 类固醇脱氢酶基因， 并在此序列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物 抑制的突变体酶， 这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不会形成副产物 ， 这些突变体酶的高催化活性和高专一性使得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸酶法大规 模生产的成本更低， 具有较高的工业应用价值。 本发明的实施方式
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例， 实施例中未注明具体条件者， 按常规条 件或者制造商建议的条件进行。
[0024] 本发明提供的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程如下：
[0025] 将鹅去氧胆酸悬浮于 50〜100mM磷酸钾缓冲液 （pH8.0) 中， 用 10M的 NaOH调 节 pH到 8.0， 再加入终浓度为 10〜30mg/mL的丙酮酸钠并用 10M的 NaOH调节 pH 到 8.0， 加入 7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶， 最后加入终浓度为 0.01〜0.25mg/m L的 NAD， 底物终浓度为 50〜100mg/mL， 反应在温度 25〜35°C、 200〜400rpm和 pH7.5〜8.5进行， 反应吋间为 41！〜 12h。 每隔一定吋间取反应液用流动相稀释 50 〜100倍， 微孔过滤后进样进行液相分析。 液相检测使用 Phenomenx Gemini
Figure imgf000005_0001
110Α 250x4.6mm为分析柱， 流动相为乙腈：缓冲溶液 （取磷酸二氢 钠 0.78g,溶解 1L水中， 用磷酸调 pH值为 3， 即可） ：甲醇 =30:37:40， 用 0.45um滤 膜过滤后备用。 柱温为 40°C， 示差检测器 （RID) ， 流速为 0.8mIJmin。 待催化 过程反应结束后， 在快速搅拌的情况下加入盐酸至 pH为 1.0〜2.0， 继续搅拌 20〜 30min , 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥后即得 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸 成品。 成品再用 8- 15倍无水乙醇 50-60°C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 过滤， 取滤 液进行真空减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 4-5倍纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真 空干燥过夜， 即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品。
[0026] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、 固态酶以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0027] 实施例 1
[0028] 含有亲本基因的共表达重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH的制备
[0029] 将来源于盐单胞菌 Halomonas jeotgali sp 的 7α-类固醇脱氢酶基因 AHSDH2 和来源于魏斯氏菌 （ Weissella sp) 的乳酸脱氢酶基因 LDH分别利用引物对 5'CGCCATATGATGTACGACCCGA AGAACTT3'和 5'
CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGAT3'以及弓 |物对 5'CCGGAATTCAAG
ATTCCACCGCAATGC3'通过 PCR扩增技术获得 PCR产物后经过酶切处理， 同吋 插入到表达载体 pET22b (+) 的 Nde I和 EcoR I位点以及 EcoR I位点和 Xho I位点 ， 得到共表达重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH。 经 DNA测序， 确定该被克隆的 亲本 7ot-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示； 确定该被克隆的亲本乳酸脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3 所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。
[0030] [0030]实施例 2
[0031] 含有 7α-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的制备
[0032] 通过反向 PCR技术对 7α-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变， 在突变位置通过设 计反向引物， 利用上下游突变引物扩增目的片段， 并在引物上引入相应突变， 以重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH作为模板进行反向 PCR， PCR产物经 Z¾?«I酶消 化模板处理后转化到大肠杆菌 RoSetta(de3)， 经过 Amp的筛选后挑取菌落送测序 。 突变位点及引物设计如表 1所示。
[0033] PCR体系为： TaKaRa EX Taq HS 0.25ul； ΙΟχΕχ Taq Buffer
5ul; 模板质粒 lul; dNTP (2.5mM each) 4ul; 上游引物 lul;下游引物 lul; 无菌 水 up to 50 ul。
[0034] PCR程序为： 首先 98。C2min; 然后 98。C10s， 55-56°C30s , 72。C7min， 30个循环 ； 最后 72°C10min。
[0035] 表 1
[] [表 1]
Figure imgf000007_0001
[0036] 实施例 3
[0037] 酶液的制备
[0038] 将实施例 1和实施例 2制备的亲本和突变体共表达重组质粒分别转入大肠杆菌 Ro setta(de3), 再将获得的重组大肠杆菌接种在小体积的 LB培养基 （含有 10(Vg/mL 的 Amp) ， 30〜37°C过夜培养后， 以 1〜5<¾的接种量转接到一定体积的 LB培养 基中 （含有 10(Vg/mL的 Amp) ， 在 30〜37°C继续培养 OD 600达到 0.6〜1.0加入终 浓度为 0.1mM〜lmM的异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)， 在 20〜37°C诱导表达 1 0〜20h后离心收集菌体。 发酵菌体悬浮于一定体积的 50〜100mM的磷酸钾缓冲 液 （pH8.0) 中并超声波破胞， 离心即得含有乳酸脱氢酶与 7α-类固醇脱氢酶亲本 或者与 7α-类固醇脱氢酶突变体的粗酶液， 可用于酶活力的测定以及 3d-羟基 -7氧 代 -5β-胆烷酸的生物催化制备。
[0039] 实施例 4
[0040] 酶活力的测定
[0041] 7ot-类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以鹅去氧胆酸为底物， 在一个 3mL的反应 体系中加入 lOuL的 150mM鹅去氧胆酸， lOOuL的稀释酶液， NAD +
终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定吸光值增加。 [0042] 乳酸脱氢酶的酶活测定方法： 以丙酮酸钠为底物， 在一个 3mL的反应体系中加 入 lOOuL的 50mM丙酮酸钠， lOOuL的稀释酶液， NADH终浓度为 0.2mM， 在 pH8. 0和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定吸光值减少。
[0043] 酶活力的测定结果如表 2所示， 其中 LDH为乳酸脱氢酶， 7ot-HSDH为 7ot-类固醇 脱氢酶。
[0044] 表 2
[] [表 2]
Figure imgf000008_0001
[0045] 实施例 5
[0046] 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备
[0047] 参照前述 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程， 使用实施例 3 制备的粗酶液， 酶液的投入量以酶液的重量占整个反应体系的体积计， 控制底 物鹅去氧胆酸的终浓度为 100mg/mL， 其余各具体参数如表 3所示。 反应 41！〜 12h 后测得， 底物转化率在 99.7%以上， 成品含量在 97.5%以上， 收率为 85〜95%。
[0048] 表 3
[] [表 3]
Figure imgf000009_0001
[0049] 实施例 6
[0050] 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备
[0051] 总体系 1L， 取 50g含量为 99%的鹅去氧胆酸， 悬浮于 lOOmM的磷酸钾缓冲液 （p H8.0) ，用 lO M NaOH的调节 pH到 8.0后加入终浓度 25g/L的丙酮酸钠， 并依次加 入 0.08g7ot-类固醇脱氢酶冻干粉 （L117E突变体酶） 和 0.07g乳酸脱氢酶冻干粉， 最后加入终浓度为 0.15g/L的 NAD， 底物终浓度为 50g/L。 在 25°C、 250rpm和 pH8. 0左右进行反应 6h， 转化率达 99.9%。 反应结束后， 反应液滴加盐酸溶液至 pH为 1 .2, 继续搅拌 30min后待冷却过滤、 经水洗三次后真空干燥得到 3oc-羟基 -7氧代 -5β -胆烷酸成品 60g。 成品用 900ml无水乙醇 60°C水浴条件下搅拌回流 lh， 过滤取滤 液进行真空减压浓缩至 200ml体积， 再加入 1L纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真空干 燥过夜即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品 52g。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征在于： 以鹅去氧胆 酸为底物， 在 NAD、 乳酸脱氢酶、 丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条 件下， 用 7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备 3α-羟基 -7氧代 -5β胆烷 酸， 所述 7α-类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌 Hatomwziw jeotgali sp. , 所 述乳酸脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3所示， 在整个催化反应 体系中， 所述底物的浓度为 50〜100mg/mL， 所述 NAD的浓度为 0.01 〜0.25mg/mL， 所述丙酮酸钠的浓度为 10〜30mg/mL。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征 在于： 控制所述催化过程在温度为 25〜35°C， ρΗ值为 7.5〜8.5的条件 下进行。
[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征 在于： 所述缓冲溶液为 50〜100mM磷酸钾缓冲液。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征 在于， 所述制备方法还包括如下提纯步骤： 待所述催化过程反应结束 后， 调节 ρΗ值为 1.0〜2.0， 搅拌 20〜30min， 待冷却后再经过滤水洗 干燥后即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸成品。
[权利要求 5] 根据权利要求 1至 4任一项所述的 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法
， 其特征在于所述 7α-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
(b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个 氨基酸并且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如 S EQ ID NO: 2所示的亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍 生的蛋白质。
[权利要求 6] 根据权利要求 5所述的 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征 在于所述 7ot-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比 在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 67位、 第 68位、 第 97位、 第 99位、 第 117位以及第 192位。
[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法， 其特征 在于所述 7ot-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97D、 G99A、 L117E以及 T192E。
[权利要求 8] 一种 7ot-类固醇脱氢酶， 其特征在于： 所述 7ot-类固醇脱氢酶来源于盐 单胞菌 Hal jeotgali sp.， 用于催化鹅去氧胆酸制备 3α-羟基 -7氧 代 -5β胆烷酸， 所述 7α-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
(b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个 氨基酸并且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如 S EQ ID N0: 2所示的亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍 生的蛋白质。
[权利要求 9] 根据权利要求 8所述的 7α-类固醇脱氢酶， 其特征在于所述 7α-类固醇 脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下 述位点处具有至少一个突变： 第 67位、 第 68位、 第 97位、 第 99位、 第 117位以及第 192位。
[权利要求 10] 根据权利要求 9所述的 7α-类固醇脱氢酶， 其特征在于所述 7α-类固醇 脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97D、 G99A、 L117 E以及 T192E。
PCT/CN2017/070602 2017-01-09 2017-01-09 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1 WO2018126466A1 (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201780001715.0A CN107995928B (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1
PCT/CN2017/070602 WO2018126466A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/070602 WO2018126466A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018126466A1 true WO2018126466A1 (zh) 2018-07-12

Family

ID=62039859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2017/070602 WO2018126466A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107995928B (zh)
WO (1) WO2018126466A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593812A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 中山百灵生物技术有限公司 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法
CN113025589B (zh) * 2021-04-21 2023-04-07 重庆第二师范学院 3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
CN105368828A (zh) * 2015-11-04 2016-03-02 南京普瑞特生物科技有限公司 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
CN105368828A (zh) * 2015-11-04 2016-03-02 南京普瑞特生物科技有限公司 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein [O] 28 June 2013 (2013-06-28), "7-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase [Halomonas jeotgali]", XP055518488, Database accession no. WP-017430300 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107995928A (zh) 2018-05-04
CN107995928B (zh) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106636285B (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶
CN109055327B (zh) 醛酮还原酶突变体及其应用
CN105274070A (zh) 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法
CN114015712A (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法
US20230287333A1 (en) Production method of recombinant escherichia coli and high-purity ursodeoxycholic acid
CN112813013A (zh) 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用
WO2018126466A1 (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1
CN110564652B (zh) 分枝杆菌及其应用
CN107995929B (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶1
CN107980064B (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2
WO2018126467A1 (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶2
CN109679978B (zh) 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用
CN106520889B (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶3
CN109694892B (zh) 制备红景天苷的方法和试剂盒
CN106609292B (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶
CN110004121B (zh) 一种胆固醇氧化酶及其应用
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
CN110791483B (zh) 一种短链还原酶及其制备方法和应用
CN113583983A (zh) 一种融合蛋白或其变体及其在制备骨化二醇中的应用
CN114875003B (zh) 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用
CN115786292B (zh) 一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用
CN107164286B (zh) 一种的微生物菌株及其选育方法和应用
CN117417867A (zh) 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）ZJUT16及其应用
CN117343948A (zh) 硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒及其应用
CN117448291A (zh) 一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码基因及应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17889588

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 22/11/2019)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17889588

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1