CN115786292B

CN115786292B - 一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用

Info

Publication number: CN115786292B
Application number: CN202211028698.9A
Authority: CN
Inventors: 林娟; 苏冰梅; 师艺冰; 许炼; 许鑫琦
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-08-25
Also published as: CN115786292A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种3β‑羟基甾体脱氢酶SfSDR及其在制备去氢表雄酮中的应用。本发明将3β‑羟基甾体脱氢酶SfSDR与葡萄糖脱氢酶BtGDH在大肠埃希氏菌中共表达，并以共表达工程菌的静息细胞作为生物催化剂协同酯酶Z03共同催化3‑乙酰氧基‑△3,5‑雄甾二烯‑17‑酮合成去氢表雄酮。该生物催化剂具有较高的催化活性、区域选择性和立体选择性，可以在6 h以内完全转化32.8 g/L的3‑乙酰氧基‑△3,5‑雄甾二烯‑17‑酮生成目标产物去氢表雄酮，无需添加有机溶剂且无副产物产生，经过分离纯化，产物回收率高达95%以上，说明该生物催化剂是去氢表雄酮绿色合成的高效催化剂。

Description

一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在去氢表雄酮制备中的应用。

背景技术

去氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）又名脱氢表雄酮、普拉睾酮、羟基雄烯醇、去氢皮质酮等，其化学名为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式为C₁₉H₂₈O₂，分子量288.41，其结构如下所示：

。

DHEA是人体肾上腺皮质网状层分泌一种肾上腺激素前体物质，它的生理活性涉及到防治肿瘤、防过敏、防治肥胖症、抗衰老和降低低氧的神经损伤等。此外，DHEA也是合成其他激素类药物的重要前体，如7α-羟基-去氢表雄酮、15α-羟基-去氢表雄酮、1α-羟基-去氢表雄酮和醋酸阿比特龙。其中醋酸阿比特龙是强生公司研制的CYP17-A1酶抑制剂，能够全面且持久地阻断雄性激素生成，进而控制前列腺癌细胞的生长与转移，是目前备受瞩目的抗前列腺癌的新型内分泌治疗药物。然而其高昂的价格限制了该药物的受众群体。DHEA作为醋酸阿比特龙的前体，其产业化水平的提高将进一步降低DHEA乃至醋酸阿比特龙的成本，也将推动整个甾体合成工业的发展。

DHEA在肾上腺中的天然合成途经已经被解析清楚，过程如下所示：

。

即胆固醇经两种P450酶（CYP11A和CYP17A）进行一系列的羟化和支链裂解的过程。然而高等动物来源的P450酶的异源表达困难限制了该天然途经的应用范围，使得DHEA起初只能来源于天然产物，存在效率不高且资源浪费的问题。

为了实现去氢表雄酮的工业化生产，化学家们进行了诸多尝试，先后以β-谷甾醇、薯芋皂苷、醋酸妊娠双烯醇酮和4-雄烯-3,17-二酮（androst-4-ene-3,17-dione，4-AD）为原料开发了许多合成路线。虽然以4-AD为起始物的路线已经实现了产业化（中国专利CN107698643 A、CN 107286214 A、CN 105017361 A和CN 102603841 A），但是合成过程步骤繁杂，条件严苛，产物中存在中间体和异构体待去除，且合成过程需要添加大量有机溶剂和/或惰性气体，因此目前DHEA的合成成本仍然居高不下。

为了降低DHEA的合成成本，研究人员开始将关注点转向微生物转化。得益于微生物降解植物甾醇合成4-AD的工艺取得的实质性进展，国内外开始利用微生物转化植物甾醇合成DHEA，过程如下所示：

Zhou等人以3-羟基保护的植物甾醇为起始物（25 g/L），经分枝杆菌Mycobacterium sp. NRRL B-3683发酵7天后经盐酸水解获得16.33 g/L的DHEA（AppliedBiochemistry & Biotechnology, 2018, 186(2): 496-506.）。虽然该法操作简单且产物单一，但是较长的周期和较低的底物转化率（60%左右）仍给DHEA的微生物转化合成留下很大的发展空间。

综合考量化学法的高速率和生物法的高立体选择性，研究学者试图开发出更为高效的化学-酶法。中国专利CN 105483198 A、CN 105695551 A和CN 106086148 A等以4-AD为原料，利用有机碱进行双键移位反应，合成5-雄烯-3,17-二酮（androst-5-ene-3,17-dione，5-AD），后者在羰基还原酶耦联辅酶循环系统的催化下转化为DHEA，反应式如下：

但是该法涉及到的中间体5-AD的合成效率并不高（仅32% 4-AD发生双键移位），而且其性质不稳定容易自发转化为4-AD。因此该路线开始进入改良阶段。中国专利CN113493814 A和CN 113621672 A利用化学法将4-AD转化为3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮，然后利用水解酶将其转化为5-AD，后者立刻被体系中的羰基还原酶耦合辅酶循环系统转化为DHEA。该法的转化效率和底物载量都能达到工业化要求，是目前最有前景的DHEA绿色合成路线。然而该法需要大量的有机溶剂，在反应结束后需要减压回收叔丁醇后再进行产物纯化。

发明内容

本发明针对现有的DHEA化学-酶法合成路线中的不足，公布了一条新的3β-羟基甾体脱氢酶及其编码基因，并提供了一种更为简单的DHEA合成方法，可进一步降低DHEA的生产成本，适合大规模的工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR，所述的3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种编码上述的3β-羟基甾体脱氢酶的基因sfsdr，所述基因sfsdr的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组表达载体，所述的重组表达载体含有编码上述的3β-羟基甾体脱氢酶的基因sfsdr，且在sfsdr下游连有编码葡萄糖脱氢酶BtGDH的基因btgdh。

其中，上述的重组表达载体的骨架为pET30a。

一种共表达工程菌株，所述的共表达工程菌株含有上述的重组表达载体。

其中，上述的共表达工程菌株为将如上所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌株。

上述宿主微生物为大肠埃希氏菌（E.coli）BL21（DE3）。

上述共表达工程菌株为BL21-SfSDR-BtGDH。

上述一种3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR在制备去氢表雄酮中的应用。

上述应用具体为：制备共表达工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH的静息细胞的湿菌体；取湿菌体重悬于磷酸缓冲液中，调节湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03（购买自福建省科特斯生物科技有限公司）1 %（m/v），加入底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4-32.8 g/L，吐温80 5-10 vol%，辅底物葡萄糖13.5-27 g/L，NAD⁺ 0-0.343 g/L，25-40℃、230 rpm反应2-6 h；反应结束后降温至8-10℃后离心收集反应液中的沉淀，经甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取，减压浓缩后得去氢表雄酮粗品，用水清洗后得去氢表雄酮纯品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明简单方便、催化反应条件温和，效率高（活力高且选择性好），将3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR与葡萄糖脱氢酶BtGDH共表达在大肠埃希氏菌（E.coli）BL21（DE3）中，并以共表达工程菌的静息细胞为生物催化剂，以化学法制备的3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮为底物，在高底物浓度下，短时间内即可将底物完全转化为目标产物DHEA，且无副产物产生。

（2）本发明的酶催化过程中无需添加有机溶剂，反应结束后直接进行产物回收。且下游产物回收率高（DHEA的回收率高达95%），涉及到的有机试剂（甲醇、乙酸乙酯或乙醇）容易回收、成本低、无污染物排放、对环境友好，可以实现DHEA的绿色合成。

附图说明

图1是SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M为蛋白标样；泳道1为SfSDR破碎上清（IPTG诱导）；泳道2为SfSDR破碎沉淀（IPTG诱导）；泳道3为SfSDR破碎上清（乳糖诱导）；泳道4为SfSDR破碎沉淀（乳糖诱导）；泳道5为SfSDR-BtGDH破碎上清（IPTG诱导）；泳道6为SfSDR-BtGDH破碎沉淀（IPTG诱导）；泳道7为SfSDR-BtGDH破碎上清（乳糖诱导）；泳道8为SfSDR-BtGDH破碎沉淀（乳糖诱导）。

图2是HPLC检测图谱。其中，1为4-AD标样；2为5-AD标样；3为3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮；4为DHEA标样；5为不加酶的对照；6为只加酯酶Z03的对照；7为只加SfSDR-BtSDR的对照；8为加有酯酶Z03和SfSDR-BtSDR的实验组。

图3是助剂对DHEA合成的影响。

图4是NAD⁺浓度对DHEA合成的影响。

图5是湿菌体浓度对DHEA合成的影响。

图6是pH对DHEA合成的影响。

图7是温度对DHEA合成的影响。

图8是酶催化合成DHEA的时间曲线。

实施方式

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。本领域技术人员应了解到，本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。

实施例1：3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR与葡萄糖脱氢酶BtGDH共表达工程菌株的构建

（1）PCR扩增3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR基因sfsdr并纯化

根据3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR的氨基酸序列（SEQ ID No.1），以（E.coli）BL21（DE3）为目标宿主进行密码子优化获得sfsdr基因（SEQ ID No.2），并委托厦门擎科生物技术有限公司合成。根据SEQ ID No.2所示的序列设计两条引物：

Sf-F（SEQ ID No.3）：

5‘-ATCGGATCCATGGCACGTCTGGCAGGTAAAG-3’ （下划线处为BamH I酶切位点）；

Sf-R（SEQ ID No.4）：

5‘-CAGCTCGAGTTAAGCAACTGCCAGGCTGGC-3’ （下划线处为Xho I酶切位点）。

以合成的sfsdr基因为模板，利用KOD one扩增目的基因片段。

PCR条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，60℃，10 s，68℃，5 s，循环30次；68℃，2min。

经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，后对PCR产物进行纯化，然后保存于-20℃冰箱中备用。

（2）双酶切反应，纯化及连接

将步骤（1）获得的sfsdr基因片段和载体pET30a分别进行BamH I-Xho I双酶切，利用DNA纯化试剂盒（OMEGA，美国）纯化各酶切产物，然后用T4连接酶将上述纯化后的基因片段和线性载体连接，并用热激法将上述连接产物转入感受态的（E.coli）BL21（DE3）中。

（3）阳性克隆验证

挑取单克隆，在含50 mg/mL卡那霉素的LB培养基中培养8 h，用taq DNA聚合酶和T7通用引物进行PCR验证。

PCR条件为：95℃，3 min；94℃，10 s，57℃，10 s，72℃，30 s，循环30次；72℃，5min。

PCR产物经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，选择条带大小约为1200 bp对应的阳性克隆，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，确证无误后，该单克隆被命名为BL21-SfSDR。

T7通用引物序列如下：

T7-F（SEQ ID No.5）：

5‘-TAATACGACTCACTATAGGG--3’；

T7-R（SEQ ID No.6）：

5‘-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。

（4）Megaprimer PCR构建共表达质粒pET30a-sfsdr-btgdh

①扩增rbs-btgdh片段

依照文献报道（Green Synthesis and Catalysis, 2020, 1(2) : 150–159）的葡萄糖脱氢酶BtGDH的氨基酸序列（如SEQ ID No.7所示），以（E.coli）BL21（DE3）为目标宿主进行密码子优化，确定其基因btsdr的序列（如SEQ ID No.8所示），并委托厦门擎科生物技术有限公司合成。为了将rbs序列添加到BtGDH的编码基因上游，依照SEQ ID No.8所示的序列设计了两条引物：

Bt-F（SEQ ID No.9）：

5‘-gGCACCACAAGAAGGAGATATACCTatgggttacagcgatctggaag-3’（下划线处为同源臂序列，粗体为rbs序列）；

Bt-R（SEQ ID No.10）：

5‘-tttgttagcagccggatctcaGTGTTAACCACGACCGGCCTGG-3’ （下划线处为同源臂序列）。

以合成的btgdh基因为模板，利用KOD one进行PCR扩增。扩增程序如上所述。

②扩增pET30a-sfsdr-rbs骨架

利用PCR扩增技术获得线性骨架片段pET30a-sfsdr-rbs。

30a-Sf-V-F（SEQ ID No.11）：

5‘-CACTGAGATCCGGCTGCTAACAAA-3’ （下划线处为同源臂序列）；

30a-Sf-V-R（SEQ ID No.12）：

5‘-AGGTATATCTCCTTCTTGTGGTGCcTCGAGTTAAGCAAC-3’ （下划线处为同源臂序列，粗体为rbs互补序列）。

以pET30a-sfsdr为模板，利用KOD one进行PCR扩增。

PCR 条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，60℃，10 s，68℃，30 s，循环30次；68℃，2min。

③PCR扩增共表达质粒pET30a-sfsdr-btgdh

分别以rbs-btgdh片段和pET30a-sfsdr-rbs为引物和模板，利用KOD one进行Megaprimer PCR。

PCR条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，60℃，10 s，68℃，40 s，循环30次；68℃，2min。

利用Dpn I对PCR产物进行消化（37 ℃，1 h）后采用热激法将PCR产物转入感受态的（E.coli）BL21（DE3）中。挑取单克隆培养，进行T7通用引物PCR验证，经1wt%琼脂糖凝胶电泳验证，选择条带大小约为2000 bp对应的阳性克隆，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，确证无误后，该单克隆被命名为BL21-SfSDR-BtGDH。

实施例2：共表达工程菌株静息细胞的制备(乳糖诱导)

挑取工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH单菌落至20 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm条件下培养8-12 h，作为种子液。按照2 vol%的接种量转接至装有300 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB培养基的1 L摇瓶中，继续培养直至OD₆₀₀为0.6-0.7，然后添加终浓度0.2%（m/v）的乳糖，置于25℃下继续震荡12 h以诱导目的基因的表达。然后将上述培养物于7000 rpm，16℃条件下离心3 min，弃上清，收集湿菌体，取适量菌体进行SDS-PAGE蛋白质电泳分析（图1），剩余的湿菌体于-20℃下保存备用。

实施例3：共表达工程菌株静息细胞的制备(IPTG诱导)

挑取工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH单菌落至20 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm条件下培养8-12 h，作为种子液。按照2 vol%的接种量转接至装有300 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB培养基的1 L摇瓶中，继续培养直至OD₆₀₀为0.6-0.7，然后添加终浓度0.1 mM的IPTG，置于25℃下继续震荡12 h以诱导目的基因的表达。然后将上述培养物于7000 rpm，16℃条件下离心3 min，弃上清，收集湿菌体，取适量菌体进行SDS-PAGE蛋白质电泳分析（图1），剩余的湿菌体于-20℃下保存备用。

实施例4 3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮的制备

取10 g 4-AD和1 g对甲苯磺酸于反应瓶中，缓慢加入5 mL醋酸异丙烯酯，缓慢搅拌过夜。将反应液冰浴至有固体析出。过滤后的固体水洗3次，正己烷洗1次，干燥，得到3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮11 g，其HPLC纯度为98%（图4）。

实施例5 HDEA酶催化合成的条件优化

按照实施例2或3的方法制备共表达工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH的静息细胞，并将其作为生物催化剂。

利用高效液相色谱仪对产物进行测定：依利特高效液相色谱仪，色谱柱：依利特Supersil ODS2 5μm C18（4.6 mm×250 mm），流动相：水/乙腈=30/70（v/v），柱温：30℃，流速：1 mL/min，检测波长：196 nm，上样量：10 μL。在该检测条件下，DHEA、4-AD、5-AD和3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮的出峰时间分别为：5.223 min、5.543 min、6.984 min和13.703 min （图2）。

（1）助剂对DHEA酶催化合成的影响

取湿菌体重悬于1 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.0），使湿菌体浓度为50 g/L，加入酯酶Z03 10 mg，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4 mg，不同的助剂50 µL或100µL，辅底物葡萄糖13.5 mg，NAD⁺ 0.137 mg，37℃、230 rpm反应2 h后，加入1 mL乙酸乙酯终止反应并萃取，减压除去溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，通过比较反应中各组分的比例，可以看出，分散剂吐温80更有利于底物向DHEA转化（图3）。

（2）NAD⁺浓度对DHEA酶催化合成的影响

取湿菌体重悬于1 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.0），使湿菌体浓度为50 g/L，加入酯酶Z03 10 mg，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4 mg，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖13.5 mg，不同的NAD⁺添加量（0、0.069 mg、0.137 mg、0.206 mg、0.274 mg和0.343mg分别对应0、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM和0.5 mM），37℃，230 rpm反应2 h后，加入1mL乙酸乙酯终止反应并萃取，减压除去溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，通过比较反应中各组分的比例，可以看出，当NAD⁺浓度≥0.2 mM时，DHEA的合成效率不再随NAD⁺浓度的增加而提高，说明0.2 mM的NAD⁺已经足够辅酶的高效循环（图4）。

（3）静息细胞投加量对DHEA酶催化合成的影响

取湿菌体重悬于1 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.0），调节不同的湿菌体浓度（25-200 g/L），加入酯酶Z03 10 mg，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4 mg，吐温80100 µL，辅底物葡萄糖13.5 mg，NAD⁺ 0.137 mg，37℃、230 rpm反应2 h后，加入1 mL乙酸乙酯终止反应并萃取，减压除去溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，通过比较反应中各组分的比例，可以看出，随着湿菌体细胞浓度的增加，DHEA的比例逐渐增多，当菌浓≥100 g/L时，底物完全被转化，且DHEA的比例变化并不明显，说明100 g/L的湿菌体已经可以满足反应的进行（图5）。

（4）pH值对DHEA酶催化合成的影响

取湿菌体重悬于1 mL不同pH的缓冲液（100 mM，pH=5.5-9.0），调节湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 10 mg，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4 mg，吐温80100 µL，辅底物葡萄糖13.5 mg，NAD⁺ 0.137 mg，37℃、230 rpm反应2 h后，加入1 mL乙酸乙酯终止反应并萃取，减压除去溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，通过比较反应中各组分的比例，可以看出，在磷酸缓冲体系中，随着pH的上升，DHEA的合成效率也逐渐提高，在pH8.0时达最高水平，但是当反应在甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系中进行时，DHEA的积累量却显著下降，还伴随着4-AD的产生，说明甘氨酸-氢氧化钠体系中5-AD容易自发转化为副产物4-AD，而降低DHEA的合成效率（图6）。

（5）温度对DHEA酶催化合成的影响

取湿菌体重悬于1 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=8.0），调节湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 10 mg，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4 mg，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖13.5 mg，NAD⁺ 0.137 mg，于不同的温度下（25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃），230 rpm下反应不同的时间后，加入1 mL乙酸乙酯终止反应并萃取，减压除去溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，通过比较反应中各组分的比例，可以看出，25-37℃更有利于DHEA的积累，尤其是在30℃条件下，体系生成的5-AD可以被及时的转化为DHEA，避免了中间体5-AD的积累，说明整个酶系（酯酶-3β-羟基甾体脱氢酶-葡萄糖脱氢酶）的最适温度为30℃（图7）。

实施例6酶催化反应合成DHEA

（1）50 mM底物

取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=8.0），使湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 1 g，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮1.64 g，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖1.35 g，NAD⁺ 13.7 mg，30℃、230 rpm反应2 h后，取200 μL反应液和1 mL乙酸乙酯混匀并离心，取上清减压除溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，转化率达98.9%，时空转化率为7.17 g/L/h（图8）。

（2）60 mM底物

取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=8.0），使湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 1 g，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮1.97 g，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖1.62 g，NAD⁺ 13.7 mg，30℃、230 rpm反应3 h后，取200 μL反应液和1 mL乙酸乙酯混匀并离心，取上清减压除溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，转化率达98.1%，时空转化率为5.69 g/L/h（图8）。

（3）80 mM底物

取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=8.0），使湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 1 g，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮2.62 g，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖2.16 g，NAD⁺ 13.7 mg，30℃、230 rpm反应5 h后，取200 μL反应液和1 mL乙酸乙酯混匀并离心，取上清减压除溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，转化率达98.7%，时空转化率为4.58 g/L/h（图8）。

（4）100 mM底物

取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=8.0），使湿菌体浓度为100 g/L，加入酯酶Z03 1 g，底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮3.28 g，吐温80 100 µL，辅底物葡萄糖2.7 g，NAD⁺ 13.7 mg，30℃、230 rpm反应6 h后，取200 μL反应液和1 mL乙酸乙酯混匀并离心，取上清减压除溶剂后，用甲醇溶解并适当稀释后进行HPLC检测，转化率达98.4%，时空转化率为4.76 g/L/h（图8）。

实施例7 DHEA的提纯

（1）调节实施例6中的100 mL反应液（100 mM底物）温度至8℃左右，过滤。收集固体，用10 mL乙酸乙酯萃取3次，每遍萃取30分钟，合并萃取液后减压浓缩至有大量晶体析出，水洗2次，干燥，得到DHEA 2.75 g，含量99.8%，收率95.0%。

（2）调节实施例6中的100 mL反应液（100 mM底物）温度至8℃左右，过滤。收集固体，用10 mL甲醇萃取3次，每遍萃取30分钟，合并萃取液后减压浓缩至有大量晶体析出，水洗2次，干燥，得到DHEA 2.82 g，含量99.5%，收率97.2%。

（3）调节实施例6中的100 mL反应液（100 mM底物）温度至8℃左右，过滤。收集固体，用10 mL乙醇萃取3次，每遍萃取30分钟，合并萃取液后减压浓缩至有大量晶体析出，水洗2次，干燥，得到DHEA 2.78 g，含量99.4%，收率95.9%。

Claims

1.一种3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR在制备去氢表雄酮中的应用，其特征在于：制备共表达工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH的静息细胞的湿菌体；取湿菌体重悬于磷酸缓冲液中，调节湿菌体浓度为100g/L，加入1wt%酯酶Z03，加入底物3-乙酰氧基-△3,5-雄甾二烯-17-酮16.4-32.8g/L，吐温80 5-10vol%，辅底物葡萄糖13.5-27g/L，NAD⁺ 0.069-0.343g/L，25-37℃、230rpm反应2-6h；反应结束后降温至8-10℃后离心收集反应液中的沉淀，经甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取，减压浓缩后得去氢表雄酮粗品，用水清洗后得去氢表雄酮纯品；

所述3β-羟基甾体脱氢酶SfSDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述共表达工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH的构建按如下步骤进行：

1）以核苷酸序列为SEQ ID NO.2的合成sfsdr基因为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4为引物，扩增sfsdr片段；

2）用限制性内切酶BamH I和Xho I对sfsdr片段和pET30a载体进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，得到pET30a-sfsdr载体；

3）以核苷酸序列为SEQ ID NO.8的合成btsdr基因为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10为引物，扩增rbs-btgdh片段；

4）以pET30a-sfsdr载体为模板，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物，扩增pET30a- sfsdr-rbs线性骨架片段；

5）分别以rbs-btgdh片段和pET30a-sfsdr-rbs线性骨架片段为引物和模板进行大引物PCR，利用Dpn I对PCR产物进行消化后热激转入感受态的E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆培养，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物进行PCR验证，经1wt%琼脂糖凝胶电泳验证，选择阳性克隆测序，测序结果正确的菌株即为共表达工程菌株BL21-SfSDR-BtGDH。