CN111500600A

CN111500600A - 3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用

Info

Publication number: CN111500600A
Application number: CN202010324122.1A
Authority: CN
Inventors: 苏正定; 成细瑶; 宋士奎; 周曦
Original assignee: Wuhan Emojiahua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Emojiahua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111500600B

Abstract

本发明提供了3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶及其基因序列和应用。一种用于表达3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶的基因序列，基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。本发明的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶能够高效催化雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)反应生成雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本发明获得了可溶性的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶，增加了酶的溶解度。

Description

3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用

技术领域

本发明涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用。

背景技术

当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。

传统的方法是应用化学法进行C1,2脱氢。尽管化学方法已用于Δ1-脱氢，将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专一修饰甾体中间体，反应产率为80％左右，反应专一性低，副产物多，环境污染等缺陷，而且底物与产物往往结构相似不易分离等问题，使得高端甾体药物工业生产化受到限制。从4-AD转化而来的ADD是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药、雌激素和孕激素。利用4-AD制备ADD就一直是甾体医药行业的关键技术。高效酶法工艺制备甾体中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。

利用3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD)进行酶促反应制备ADD和其它C1,2-脱氢甾体药物具有重大的应用前景。KsdD作为甾醇转化过程中的关键酶，对整个甾醇转化过程都起着很重要的作用。KsdD是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。如下所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1，4-雄烯二酮(ADD)。KsdD酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌、紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源KsdD酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。

近年来，利用基因工程系统表达3-甾酮-1,2-脱氢酶是其工艺用的难点之一，KsdD酶属于细胞膜结合蛋白，在细胞质中溶解度低。虽然KsdD在许多外源菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)等细菌中异源表达均有报道，但是表达量都较低，得不到有活性的纯酶。Pseudomonas testosterone的KsdD基因通过质粒pRG1在大肠杆菌中的表达，表达的蛋白仅有3.3％是可溶的，其余的都是以包涵体的形式存在。Arthrobacter simplex的KsdD基因通过大肠杆菌-链霉菌的穿梭质粒，在Streptomyces lividans中表达，在添加和不添加底物4-AD的情况下，酶活力提高了100倍。通过pDEX-3质粒将Rhodococcus rhodochrous的基因KsdD在大肠杆菌中表达，转化细胞表达出可溶性的KsdD，且表达量是出发菌株的30倍。将Rhodococcus erythropolis的基因KsdD通过pSDH305质粒和pET3b质粒实现了该基因在大肠杆菌中的表达，酶活分别为1.38U/mg和6.0U/mg。将Arthrobacter simplex的KsdD基因通过载体pWB980在枯草芽孢杆菌WB600中表达，胞内外酶活分别为110mU/mg和15mU/mg，约为出发菌的30倍，以4-AD为底物，转化40h达到最大转化率为45.5％。将Arthrobactersimplex的KsdD基因克隆到质粒pET22b和pET32a在E.coli BL21中的异源表达，酶活分别为35.29mU/mg和25.67m U/mg。将分枝杆菌NWIB-01的KsdD通过pUC18在E.coli DH5α中表达，酶活达21mU/mg。但这些酶活力较低。相比之下，重组大肠杆菌培养相对较容易，培养时间较短等优势。

获得得高活性的KsdD酶，高效的利用酶催化反应来生产C1,2-脱氢甾体类化合物，这将会在很大程度上提高甾体类化合物的生产效率，并且能够定向的生产某种甾体类化合物，降低成本，提高回收效率，减轻对环境的危害。因此，本发明不仅在3-甾酮-1,2-脱氢酶的规模化生产中具有实践意义，同时，对于重组蛋白类产品生产工艺的放大研究也具有重要的理论意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。

本发明还提供了一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.5，所述基因序列用于在酵母菌中表达。

本发明还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体包括上述任一种基因序列。

本发明还提供了上述表达载体表达得到的3-甾酮-1,2-脱氢酶。

在上述3-甾酮-1,2-脱氢酶中，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。

本发明还提供了3-甾酮-1,2-脱氢酶在制备1,4-雄烯二酮中的应用。

本发明获得了可以在大肠杆菌或酵母菌中高效表达的3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列。本发明的3-甾酮-1,2-脱氢酶能够高效催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本发明获得了可溶性的3-甾酮-1,2-脱氢酶，增加了酶的溶解度。

附图说明

图1示出了琼脂糖胶分析PCR扩增KsdD211基因产物，从右到左依次为温度梯度50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。

图2示出了琼脂糖凝胶图分析pRSV-KsdD211/DH5a菌落PCR，其中1#、3#、5#、7#、8#有目的条带，从中选取3#、7#摇菌测序。

图3示出了KstD211氨基酸序列与其它KstD酶的比较。DSM1381:Mycobacteriumsp.DSM1381；MC² 155:Mycobacterium sp.MC² 155；A.simplex:Arthrobacter simplex和SQ1:Rhodococcus erythropolis SQ1。

图4示出了KsdD725蛋白表达。其中CtrS为对照组上清，CtrP为对照组沉淀，同理后面的泳道分别为1#、2#、3#、4#样品的上清(S)和沉淀(P)。

图5示出了pRSV-MBP-KsdD211蛋白表达条件筛选。(a)、(b)为在不同的表达条件下pSZD-KsdD211蛋白SDS-PAGE胶图，其中S为上清，P为沉淀，8％为蛋白胶浓度。

图6示出了NI-NTA纯化pSZD-KsdD211蛋白。(a)：NI-NTA纯化后AKTA峰图；(b)：8L菌体分别表达蛋白SDS-PAGE胶图和NI-NTA纯化后胶图；泳道1/8-S，1/8-P：对应菌体的上清和沉淀；泳道CtrS/P：对照组菌体的上清沉淀；泳道Flow through：NI-NTA纯化流穿样；泳道Wash：NI-NTA洗涤；泳道5/10/16：NI-NTA洗脱峰蛋白样。

图7示出了阴离子纯化pSZD-KsdD211蛋白。(a)：两次阴离子纯化AKTA峰图；(b)：AKTA纯化后峰图SDS-PAGE检测；泳道M：蛋白Marker；泳道1-18/1-24p：第一次阴离子纯化后蛋白样；泳道2-18/2-24：第二次阴离子纯化后蛋白样。

图8示出了分子筛纯化MBP/KsdD725融合蛋白。分子筛纯化后蛋白样SDS-PAGE胶分析；泳道M：蛋白Marker；泳道5-12：蛋白样。

图9示出了MBP-KstD725催化AD转化成ADD。(a)：0h和12h反应情况；其中泳道1和4：分别为底物AD和产物ADD；泳道2和3：分别为0h和12h AD转化成ADD的情况。(b)：反应24h、36h、48h后反应情况；泳道1和5：分别为底物AD和产物ADD；泳道2、3、4：分别为反应24h、36h和48h后AD转化为ADD的情况。

图10示出了pSZD-KsdD211-S催化AD转化生成ADD。(a)、(b)、(c)、(d)：反应过程中各时间段：0h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、36h催化反应转化情况。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

野生型3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD211)来自于分枝杆菌分枝杆菌属Mycobacteriumsp.HGMS2，目前还未相关克隆、氨基酸序列和酶活力及应用报道。

本发明的3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD211)基因序列是来自分枝杆菌HGMS2。通过对分枝杆菌HGMS2的全基因组测序，从基因组中确认KstD基因序列(SEQ ID NO.1)。

本发明利用PCR对分枝杆菌HGMS2的的基因进行了扩增和测序，提供一种新型3-甾酮-1,2-脱氢酶基因(SEQ ID NO.1)和氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。

由于遗传密码子的简并性，本发明的3-甾酮-1,2-脱氢酶基因还可以是编码由SEQID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列。

通过比较KstD211与其他分枝杆菌KstD的氨基酸序列，对KstD211进行序列改造，优化设计，获得高活力KstD725突变体。KstD725突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3.

编码KstD725突变体氨基酸序列的DNA序列经过大肠杆菌偏爱密码子优化设计，适用于大肠杆菌高效表达，一种DNA序列为SEQ ID.4.

编码KstD725突变体氨基酸序列的DNA序列经过酵母菌偏爱密码子优化设计，适用于酵母菌高效表达，一种DNA序列为SEQ ID.5.

KstD725氨基酸序列与MBP蛋白融合，强化其溶解度，MBP可以放置在KstD725的N-端或者C-端，均不改变KstD725活性。

两种MBP与KstD725融合蛋白的N-端通过Tev蛋白酶位点连接His6标签。大肠杆菌和酵母菌异源表达得到的MBP/KsdD725融合酶的N-端带有His6标签，有利于亲和纯化，His-标签经Tev蛋白酶切除后，再经二次Ni-NTA亲和层析和阳离子交换柱层析制得高纯度MBP/KstD725酶液。成功实现了对3-甾酮-△1-脱氢酶突变体KstD725的高酶活、高表达，并表征了其酶特异性和选择性。酶比活为31.6U/mg。

MBP/KstD725能够催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，TLC分析验证了其高酶学活性。在8-10％底物浓度下，HPLC分析MBP/KsdD725催化反应表明，MBP/KsdD725在20h内完全转化AD生成ADD。

下面结合具体的实施例进行说明，以更好地理解本发明。

实施例1：PCR扩增KsdD211基因

从分支杆菌(Mycobacterium strain HGMS2GL)基因组中，利用PCR扩增KsdD211目的基因片段大小为1692bp，PCR引物为：前引物KsdD211-F和后引物KsdD211-R，做温度梯度PCR分别为：50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。跑琼脂糖胶分析结果如图1所示。

选取56℃和60℃条件下的PCR产物用于酶切连接。酶切反应体系为50μL：PCR产物：1ug；BamHⅠ2U；EcoRⅠ2U；10×K buffer 5ul；H₂O 1ul；37℃，时间：3h。反应产物用PCR纯化试剂盒(天根生物科技，北京)纯化，用于同pRSV载体纯化。pRSV载体采用上述同样方法和体系进行酶切和纯化。酶切后载体pRSV和目的片段KsdD211通过T4连接酶反应连接，20μL反应体系在4℃，过夜连接。表1示出了pRSV-KsdD211连接体系。

表1

连接反应液转化到大肠杆菌DH5a，冰上放置30min后，42℃水浴锅中热击90s，冰上再放置2min；均匀涂布到平板上，室温放置10min，将涂布好的平板放到37℃培养箱中，倒置过夜培养。第二天进行阳性重组子的挑选。

在平板上观察生长的菌体，选择个头大的菌体编号，选取10个单菌落；在超净台中取出10支1.5mL EP管，各加入100μL的LB培养基，对应10个菌落给EP管编号。用白色小枪头挑取单菌落先到对应的PCR液中涮3～5下，再将枪头打到对应的EP管中，依次挑取10个单菌落。将EP管放到37℃、200rpm摇床中培养1h取出；将PCR液(25μL反应体系)放到PCR仪中扩增，完成后跑1％的琼脂糖凝胶，判断克隆结果。用前引物SEQ-F 5’-GTAGGATCCATGACTGAACAGGACTAC-3’和后引物KsdD211-R:5’-GCAGAATTCTCAGGCCTTTCCAGCGAG-3’做PCR，PCR片段大小将近2200bp，电泳结果如图2所示。

实施例2：KsdD211基因测序

在武汉铂尚测序公司测序，测序结果分析正确，KsdD211基因见SEQ ID NO.1。KsdD211氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

实施例3：基于氨基酸序列和三维蛋白结构比较优化KsdD211酶结构

通过与其它KsdD氨基酸序列对比发现，KsdD211的氨基酸序列有很大区别，尤其在活性中心，不同KsdD酶有不同偏向性，主要区别为Leu136和Val364为疏水氨基酸(图3)，有利于底物结合，但不利于脱氢反应，因此，改变为进行氨基酸，改变Leu136为His、Thr、Ser、His、Glu或Asp氨基酸有利于脱氢反应。同样Val364改变为His、Thr、Ser、His、Glu或Asp氨基酸也有利于脱氢反应。KsdD211的三维结构表明，蛋白构象存在五个多余loop区域,即Asp161-S188、Pro253-Glu257、Arg340-Pro344、Gly377-G382和Asp471-Asn474(图3)，这些区域柔性强，不利于蛋白构象稳定性，也限制底物与蛋白的结合，我们对底物和辅酶周围的loop进行了删除。其中一种KstD211突变体定义为KsdD725，氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

实施例4：大肠杆菌表达KsdD725酶蛋白

对KsdD725的氨基序列(SEQIDNO.3)利用大肠杆菌偏爱密码子进行优化合成其DNA序列(SEQ ID NO.4)。合成好的DNA片段直接克隆到pRSV载体，链接成功的质粒命名为pRSV-KsdD725。质粒转化到大肠杆菌BL21细胞用于蛋白表达。转50mL过夜活化好的于1L的LB(K+)培养基中，在18℃条件下，加终浓度为0.4mM IPTG，培养4h，4000rpm、10min、4℃收集菌体。取上述菌体少许校正OD600＝1.0，离心去掉上清，加100μL 50mM Tris-HCl(10％甘油、pH8.0)，超声细胞破碎仪破碎细胞，13000rpm，10min，4℃离心，取40μL上清于1.5mL EP管中，加入10μL 5×loading buffer，vortex混匀；向沉淀中加入50μL 1×loading buffer，用枪头吹吸vortex混匀，置于95℃加热10min，13000rpm、10min离心，跑SDS-PAGE胶(蛋白Marker单位为：Kd，以下所有SDS-PAGE中都适用)，结果如图4所示。目的蛋白大小：63.2KD。结果分析：蛋白表达量少，重新优化蛋白表达条件，增加表达量。

实施例5：大肠杆菌表达可溶性KsdD725酶蛋白

KsdD酶属于细胞膜结合蛋白，在细胞质中溶解度低。要增加其溶解度，需要增加酶蛋白的极性氨基酸的数量，也不能有效KstD725的稳定性。因此，我们选择将KsdD725与溶解度很好且构象稳定的MBP蛋白进行融合，即在pRSV-KstD725直接引入MBP的DNA序列，MBP即可放在KsdD的N端或C端。同时为了进行亲和层析纯化，我们在MBP/KstD725融合蛋白的N-端引入His6标签。获得的融合蛋白表达质粒命名为pRSV-MBP-KsdD725。质粒转化到大肠杆菌BL21细胞用于蛋白表达。

取1mL过夜活化好的pRSV-MBP--KsdD211-BL21于50mL的LB(K+)培养基中，在37℃条件下，200rpm培养到菌液OD600nm＝0.8-1.0，分装到10支试管中，每支试管5mL菌液，分为两组：26℃和37℃，每组包括5个IPTG浓度分别为：0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM；各组分别在5h和9h取样1mL用于检测蛋白表达情况。SDS-PAGE胶分析如图5所示，目的蛋白大小为102KD。结果分析：由上图可以得到蛋白pSZD-KsdD211的最优表达条件为：26℃，1mMIPTG，5h。

实施例6：MBP/KstD725融合蛋白纯化

培养8L的菌体用于纯化。pSZD-KsdD211蛋白大小为102KD，带有His标签，选择用NI-NTA纯化，结果如图6所示。结果分析：NI-NTA纯化后峰图对应的蛋白样为：5#-10#，通过SDS-PAGE胶检测样品含有少许杂蛋白，进一步使用阴离子交换柱进行纯化。

收集混匀上述纯化后的5#-10#蛋白样，使用阴离子交换柱进行纯化，结果如图7所示。结果分析表明，阴离子层析柱纯化后蛋白纯度大大提高，最后利用分子筛进行纯化。

收集混匀上述阴离子纯化后的蛋白，分批次进行分子筛纯化，结果如图8所示。结果分析：纯化后的蛋白纯度较高，浓缩后用于酶反应，浓度为22mg/mL。

实施例7：MBP-KsdD725酶蛋白催化AD生成ADD反应

10mL酶液(缓冲液50mM Tris-Cl，pH 8.0，10％甘油，50μL 4-AD(甲醇溶液143mM)，反应条件：30℃、160rpm，反应一定时间后取1mL样加等体积乙酸乙酯萃取，挥干乙酸乙酯后加10μL乙酸乙酯溶解，点薄层色谱(TLC)板，如图9所示。结果分析：形成融合蛋白后蛋白有催化活性，随着反应时间的延长到36h时AD的转化率将近80％，反应48h时AD的转化率将近98％。

催化反应样品利用HPLC分析，流动相为：甲醇：水＝6:4。分析结果如图10所示，结果分析：在整个反应过程中都存在杂质1，反应18h时产生杂质3，反应20h时产生杂质2，并且随着时间的延长杂质2、3逐渐增多。底物AD在36h内未反应完，36h时AD的转化率为97％。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110> 武汉艾默佳华生物科技有限公司

<120> 3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用

<130> HP190990LZ

<141> 2020-04-22

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> 分枝杆菌HGMS2()

<400> 1

atgactgaac aggactacag tgtctttgac gtagtggtgg tagggagcgg tgctgccggc 60

atggtcgccg ccctcaccgc cgctcaccag ggactctcga cagtagtcgt tgagaaggct 120

ccgcactatg gcggttccac ggcgcgatcc ggcggcggcg tgtggattcc gaacaacgag 180

gttctgcagc gtgacggggt caaggacacc cccgccgagg cacgcaaata cctgcacgcc 240

atcatcggcg atgtggtgcc ggccgagaag atcgacacct acctggaccg cagtccggag 300

atgttgtcgt tcgtgctgaa gaactcgccg ctgaagctgt gctgggttcc cggctactcc 360

gactactacc cggagacgcc gggcggtaag gccaccggcc gcttggtcga gcccaagccg 420

ttcaatgcca agaagctcgg tcccgacgag aagggcctcg aaccgccgta cggcaaggtg 480

ccgctgaaca tggtggtgct gcaacaggac tatgtccggc tcaaccagct caagcgtcac 540

ccgcgcggcg tgctgcgcag catcaaggtg ggtgtgcggt cggtgtgggc caacgccacc 600

ggcaagaacc tggtcggtat gggccgggcg ctgatcgcgc cgctgcgcat cggcctgcag 660

aaggccgggg tgccggtgct gttgaacacc gcgctgaccg acctgtacct cgaggacggg 720

gtggtgcgcg gaatctacgt tcgcgaggcc ggcgcccccg agtctgccga gccgaagctg 780

atccgagccc gcaagggcgt gatcctcggt tccggtggct tcgagcacaa ccaggagatg 840

cgcaccaagt atcagcgcca gcccatcacc accgagtgga ccgtcggcgc agtggccaac 900

accggtgacg gcatcgtggc ggccgaaaag ctcggtgcgg cattggagct catggaggac 960

gcgtggtggg gaccgaccgt cccgctggtg ggcgccccgt ggttcgccct ctccgagcgg 1020

aactcccccg ggtcgatcat cgtcaacatg aacggcaagc ggttcatgaa cgaatcgatg 1080

ccctatgtgg aggcctgcca ccacatgtac ggcggtcagt acggccaagg tgccgggcct 1140

ggcgagaacg tcccggcatg gatggtcttc gaccagcagt accgtgatcg ctatatcttc 1200

gcgggattgc agcccggaca acgcatcccg aagaaatgga tggaatcggg cgtcatcgtc 1260

aaggccgaca gcgtggccga gctcgccgag aagaccggtc ttgcccccga cgcgctgacg 1320

gccaccatcg aacggttcaa cggtttcgca cgttccggcg tggacgagga cttccaccgt 1380

ggcgagagcg cctacgaccg ctactacggt gatccgacca acaagccgaa cccgaacctc 1440

ggcgagatca agaacggtcc gttctacgcc gcgaagatgg tacccggcga cctgggcacc 1500

aagggtggca tccgcaccga cgtgcacggc cgtgcgttgc gcgacgacaa ctcggtgatc 1560

gaaggcctct atgcggcagg caatgtcagc tcaccggtga tggggcacac ctatcccggc 1620

ccgggtggca caatcggccc cgccatgacg ttcggctacc tcgccgcgtt gcatctcgct 1680

ggaaaggcct ga 1692

<210> 2

<211> 563

<212> PRT

<213> 分枝杆菌HGMS2()

<400> 2

Met Thr Glu Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His Gln Gly Leu

20 25 30

Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly Ser Thr Ala

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val Leu Gln Arg

50 55 60

Asp Gly Val Lys Asp Thr Pro Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Leu His Ala

65 70 75 80

Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr Tyr Leu Asp

85 90 95

Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser Pro Leu Lys

100 105 110

Leu Cys Trp Val Pro Gly Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Thr Gly Arg Leu Val Glu Pro Lys Pro Phe Asn Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr Gly Lys Val

145 150 155 160

Pro Leu Asn Met Val Val Leu Gln Gln Asp Tyr Val Arg Leu Asn Gln

165 170 175

Leu Lys Arg His Pro Arg Gly Val Leu Arg Ser Ile Lys Val Gly Val

180 185 190

Arg Ser Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val Gly Met Gly

195 200 205

Arg Ala Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys Ala Gly Val

210 215 220

Pro Val Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Val Val Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro Glu Ser Ala

245 250 255

Glu Pro Lys Leu Ile Arg Ala Arg Lys Gly Val Ile Leu Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Phe Glu His Asn Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr Gln Arg Gln Pro

275 280 285

Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val Gly Ala Val Ala Asn Thr Gly Asp Gly

290 295 300

Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Asp

305 310 315 320

Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val Pro Leu Val Gly Ala Pro Trp Phe Ala

325 330 335

Leu Ser Glu Arg Asn Ser Pro Gly Ser Ile Ile Val Asn Met Asn Gly

340 345 350

Lys Arg Phe Met Asn Glu Ser Met Pro Tyr Val Glu Ala Cys His His

355 360 365

Met Tyr Gly Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Pro Gly Glu Asn Val

370 375 380

Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg Tyr Ile Phe

385 390 395 400

Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp Met Glu Ser

405 410 415

Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Thr

420 425 430

Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Thr Ala Thr Ile Glu Arg Phe Asn Gly

435 440 445

Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly Glu Ser Ala

450 455 460

Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn Pro Asn Leu

465 470 475 480

Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met Val Pro Gly

485 490 495

Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His Gly Arg Ala

500 505 510

Leu Arg Asp Asp Asn Ser Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn

515 520 525

Val Ser Ser Pro Val Met Gly His Thr Tyr Pro Gly Pro Gly Gly Thr

530 535 540

Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Leu His Leu Ala

545 550 555 560

Gly Lys Ala

<210> 3

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Thr Glu Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His Gln Gly Leu

20 25 30

Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly Ser Thr Ala

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val Leu Gln Arg

50 55 60

Asp Gly Val Lys Asp Thr Pro Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Leu His Ala

65 70 75 80

Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr Tyr Leu Asp

85 90 95

Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser Pro Leu Lys

100 105 110

Leu Cys Trp Val Pro Gly Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Thr Gly Arg Ser Val Glu Pro Lys Pro Phe Asn Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr Gly Lys Val

145 150 155 160

Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val Gly Met Gly Arg Ala

165 170 175

Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys Ala Gly Val Pro Val

180 185 190

Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Asp Gly Val Val

195 200 205

Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro Lys Leu Ile Arg Ala

210 215 220

Arg Lys Gly Val Ile Leu Gly Ser Gly Gly Phe Glu His Asn Gln Glu

225 230 235 240

Met Arg Thr Lys Tyr Gln Arg Gln Pro Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val

245 250 255

Gly Ala Val Ala Asn Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu

260 265 270

Gly Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Asp Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val

275 280 285

Pro Leu Val Gly Ala Pro Trp Phe Ala Leu Ser Glu Gly Ser Ile Ile

290 295 300

Val Asn Met Asn Gly Lys Arg Phe Met Asn Glu Ser Met Pro Tyr Ser

305 310 315 320

Glu Ala Cys His His Met Tyr Gly Gly Gln Tyr Gly Gln Glu Asn Val

325 330 335

Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg Tyr Ile Phe

340 345 350

Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp Met Glu Ser

355 360 365

Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Thr

370 375 380

Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Thr Ala Thr Ile Glu Arg Phe Asn Gly

385 390 395 400

Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly Glu Ser Ala

405 410 415

Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn Pro Asn Leu

420 425 430

Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met Val Pro Gly

435 440 445

Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His Gly Arg Ala

450 455 460

Leu Arg Asp Asp Asn Ser Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn

465 470 475 480

Val Ser Ser Pro Val Met Gly His Thr Tyr Pro Gly Pro Gly Gly Thr

485 490 495

Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Leu His Leu Ala

500 505 510

Gly Lys Ala

515

<210> 4

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaccgaac aggattactc ggttttcgac gtcgtggtcg tcggatctgg agcggcgggc 60

atggtggcag cgctgacggc tgcgcaccag gggttatcta cagtggtagt cgagaaagca 120

cctcactatg gcggttcgac cgcgcgttca ggtggggggg tatggatacc gaacaacgag 180

gtattacagc gggacggtgt gaaagatacg cctgctgagg cccgtaaata tttgcatgcc 240

atcattggcg atgttgttcc agcagaaaag atagatacgt atctggatcg cagtccagag 300

atgttgtctt ttgtactgaa aaactcgccg ttaaaactgt gctgggtccc cgggtacagt 360

gactattatc ctgaaacacc gggtggtaaa gctactggtc gcagcgtgga gccgaaaccc 420

ttcaatgcca aaaagttagg gccggatgag aaaggcttgg aacctccata cgggaaagtc 480

gtatgggcga atgctactgg caaaaattta gtcggcatgg gccgtgcgtt gattgctcct 540

ttacgtatag ggctgcagaa agcaggagta cccgtccttc ttaacactgc attaacagat 600

ttatatcttg aagacggcgt cgttcgtggc atctatgttc gggaagctgg agcgcctaag 660

ctgatacgtg cgcgcaaggg cgttatcctg ggcagtggcg gtttcgagca caaccaggaa 720

atgcggacca aataccagcg gcaacccatc accacagaat ggacggtcgg cgccgtagct 780

aacacgggag atggtattgt tgccgcggag aagttaggag ctgcgcttga gttgatggaa 840

gatgcgtggt ggggtcccac agtacctctg gtgggcgcac cgtggttcgc tctttctgag 900

ggtagtatca ttgttaatat gaacggaaag agatttatga acgaatctat gccttatagc 960

gaagcatgtc atcacatgta cggtggacag tatggtcagg agaatgttcc cgcttggatg 1020

gtttttgatc agcagtaccg ggaccggtac atatttgctg ggctgcaacc cgggcaacgg 1080

ataccgaaga agtggatgga gagtggggtg atcgtgaagg ccgattccgt tgctgagtta 1140

gccgaaaaga ccggtctggc cccggacgcc ttaacggcca cgatcgaacg cttcaatggt 1200

ttcgcaagaa gcggagtgga cgaggatttt cacagaggcg aatctgctta tgatcgctac 1260

tatggagatc caacgaataa acccaaccct aatctgggcg aaatcaaaaa tggaccattc 1320

tatgcggcta aaatggtgcc aggtgacctt gggaccaagg gcggaattag aacagatgtt 1380

catggaagag cactgcgcga cgacaacagc gtaatcgagg gattatacgc tgcagggaac 1440

gtcagctcac cggtgatggg acacacgtat ccgggaccag gaggcacgat aggacccgca 1500

atgacgtttg gctacttagc cgctctgcac ttagctggca aggcctga 1548

<210> 5

<211> 1379

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgactgagc aggactactc agtattcgac gtggtggtgg ttggaagtgg tgcagctggc 60

atggttgctg ctttaactgc agcccaccag ggtctgtcaa cggttgtcgt agaaaaggca 120

ccacactatg gtggctctac ggcccgtagt ggcggaggag tgtggatacc caataatgag 180

gttctacaaa gggatggtgt taaagacact cccgcagagg cccgtaaata cttacatgct 240

attatcggtg acgtagtgcc cgctgaaaag atcgatacgt atcttgatag gtctcctgag 300

atgttatcat ttgtattgaa gaacagtcca cttaaacttt gttgggtacc cggttatagt 360

gattattatc ctgaaacacc cggcggtaag gctactggac gtagtgtgga gcccaagccc 420

ttcaatgcta aaaaactagg ccctgatgag aaaggattag agcctccata tggcaaagtt 480

gtctgggcaa atgcaaccgg caaaaatctt gtaggaatgg gacgtgcttt aattgcacct 540

cttagaatcg gactgcagaa agctggtgta cccgtactat taaacacagc tttaacagac 600

ctgtatcttg aagacggtgt ggtccgtgga atctatgttc gtgaagccgg tgcccccaaa 660

ctaatcaggg ctaggaaagg cgtgattctg ggatcaggtg gctttgagca taatcaagag 720

atgaggacca aataccagag gcagcctata acgactgagt ggacagtggg cgctgtggca 780

aacactggcg acggcatagt agccgccgaa aagttgggtg ccgccctaga actgatggaa 840

gatgcctggt ggggccctac ggtgccactg gttggtgctc cctggtttgc tctgtctgaa 900

ggaagtataa ttgttaatat gaacggaaag aggtttatga acgagtccat gccatacagt 960

gaagcctgcc accatatgta tggaggccag tacggacaag agaacgttcc agcctggatg 1020

gtttttgacc agcagtacag ggatagatat attttcgctg gtctacaacc aggtcagaga 1080

atacccaaaa aatggatgga atccggcgta atagtgaaag ccgatagtgt ggcagaatta 1140

gccgaaaaga ctggattagc acccgacgct ttgacggcaa caatagaacg ttttaacggt 1200

tttgcccgtt ccggcgtcga cgaggacttt cacagaggtg aaagtgcata tgacagatat 1260

tatggagacc ccacaaacaa acctaatccc aacttaggcg agattaaaaa tggcccattt 1320

tacgctgcaa aaatggtacc cggagaccta ggaacgaagg gaggaatccg tacggacgt 1379

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtaggatcca tgactgaaca ggactac 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gcagaattct caggcctttc cagcgag 27

Claims

1.一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。

2.一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.5，所述基因序列用于在酵母菌中表达。

3.一种表达载体，其中，所述表达载体包括根据权利要求1或2所述的基因序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体表达得到的3-甾酮-1,2-脱氢酶。

5.根据权利要求4所述的3-甾酮-1,2-脱氢酶，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。

6.根据权利要求4所述的3-甾酮-1,2-脱氢酶在制备1,4-雄烯二酮中的应用。